2.6. Mynegiad o Caspase-3 a Caspase-6

Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu chwilota cryf o radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH ac mae ganddo'r gallu i ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol ac atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhad ac am ddim thymin.

Cliciwch Yma I Wybod Cistanche Tubulosa Am Wrthocsidydd

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Dangosodd llygod TgAPP gynnydd mewn mynegiant genynnau caspase (Ffigur 8C1, H1), a oedd yn arwyddocaol ac yn fwy na 30 y cant o'i gymharu â hippocampi llygod WT (Ffigur 8H1; p <0.05). O ran mynegiant caspase-6, ni welwyd unrhyw wahaniaethau rhwng llygod trawsenynnol ac an-drawsgenig (Ffigur 8C2, H2).

Roedd triniaethau quercetin a rutin yn gallu gostwng lefelau mRNA caspase yn yr hippocampus mewn modd ystadegol arwyddocaol (Ffigur 8H1; p < 0.05), gyda chanrannau ataliad o tua 17 y cant a 27 y cant ar gyfer llygod benywaidd a gwrywaidd, yn y drefn honno. Yn y cortecs cerebral, dim ond gwahaniaethau sylweddol a welwyd yn y driniaeth â rwtin mewn dynion (Ffigur 8C1; p <0.05).

Ynglŷn â thriniaethau caspase-6, ni chafodd triniaethau quercetin a rutin unrhyw effaith ystadegol arwyddocaol yn y cortecs na'r hippocampus (Ffigur 8C2, H2), er yn yr olaf roedd y Caspase-6 yn TgAPP gwrywod yn dangos tuedd i gostyngiad (Ffigur 8H2).

2.7. Marcwyr Llid

Dangosir y canlyniadau a gafwyd ar gyfer mynegiant genynnau'r cyfryngwyr llidiol IL-1 , TNF- , ac IFN- yn Ffigur 9.

Yn y TgAPP, bu cynnydd sylweddol mewn mynegiant genynnau IL{{{{0}} y cant o tua 20 y cant yn y cortecs a hippocampus yn y ddau ryw o gymharu â llygod WT (Ffigur 9C1, H1; t < 0.05). O ran TNF- , er bod lefelau mRNA uwch yn cael eu dangos yn TgAPP, nid ydynt yn ystadegol arwyddocaol mewn llygod WT (Ffigur 9C2, H2). O ran IFN- , bu cynnydd o tua 30 y cant yn ei fynegiant mewn gwrywod, a oedd ond yn ystadegol arwyddocaol yn y cortecs (Ffigur 9C3; p < 0.05).

Roedd triniaethau â quercetin a rutin, mewn merched a gwrywod, yn gallu lleihau mynegiant IL{{0}} yn y cortecs cerebral a hippocampus o gymharu â rheoli llygod TgAPP (Ffigur 9C1, H1; p < {{8 }}.05), yn cael gwerthoedd tebyg i rai llygod WT, ac yn arbennig o is yn hippocampi llygod gwrywaidd (Ffigur 9H1; p < 0.05).

Ni sylwyd ar effaith gyffredinol y ddwy driniaeth flavonoid ar fynegiant IL{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{}}}}}}}) gyda TNF- na chyda INF- . Felly, bu gostyngiad sylweddol mewn gwrywod TgAPP, ar driniaeth quercetin, yn hippocampal TNF- (Ffigur 9H2; p < 0.05) ac mewn mynegiant cortigol IFN (Ffigur 9C3; p < 0.05).

2.8. Asesiad o Niwronau Dirywiedig a'u Rhagamcanion

Ni welwyd unrhyw arwyddion nodweddiadol o niwroddirywiad yn yr oedran y profwyd y llygod TgAPP trawsgenig, o gymharu â llygod WT, ac ni ddangosodd triniaethau â quercetin a rutin unrhyw newid am 4 wythnos o gymharu â TgAPP (Ffigur S1, Data Atodol).

2.9. Mynegiant o Dderbynyddion Glwtamad Ionotropig

Ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol mewn mynegiant derbynnydd, gan gymharu'r gwerthoedd a gafwyd ar gyfer y llygod TgAPP rheoli â'r rhai a gafwyd ar gyfer y llygod WT. Nid oedd unrhyw effeithiau nodedig ychwaith ar fynegiant y derbynyddion ionotropig hyn ym mhresenoldeb triniaeth quercetin neu rutin (Tabl S5, Data Atodol).

3. Trafodaeth

Pwrpas ein hastudiaeth bresennol oedd asesu effaith dau flavonoid, quercetin, a rutin, ar gamau cyntaf pathogenesis AD, waeth beth fo'u heffaith ar niwroddirywiad a / neu swyddogaeth wybyddol. Y cortecs a'r hippocampus oedd y rhannau o'r ymennydd a oedd yn cael eu dadansoddi, gan mai dyma'r strwythurau ymennydd yr effeithir arnynt fwyaf yn AD. Dylid cymryd i ystyriaeth bod quercetin a rutin yn cael eu rhoi trwy ddeiet wedi'i lunio sy'n cynnwys naill ai un o'r ddau flavonoid, i ddynwared, mewn model anifail AD, y cymeriant o ddeiet dynol iach, sy'n cynnwys cynhwysyn gweithredol.

Yn benodol, cafodd yr APPswe transgene yn y llygoden C57B6 effaith sylweddol ar gymhareb GSH/GSSG, lefelau MDA, cynhwysedd ensymau gwrthocsidiol, mynegiant APP, gweithgaredd BACE1, a mynegiant caspase-3 ac IL-1. Er bod treigladau APP mewn bodau dynol yn gyffredinol yn arwain at AD nodweddiadol, maent yn gysylltiedig yn bennaf â phatholeg amyloid yn unig mewn llygod trawsenynnol APP ac nid oes niwroddirywiad amlwg [14,15], gan na welwyd unrhyw arwyddion nodweddiadol yn ein llygod trawsgenig TgAPP, yn groes i y llygod WT (Data Atodol, Ffigur S1). Roedd gwrth-staenio â 40 -6-dimidino-2-phenylindole-2-phenylindole(DAPI) o niwronau hippocampal yn ein galluogi i arsylwi morffoleg niwclear, gan fod y cyfansoddyn hwn yn llifyn fflwroleuol ar gyfer asidau niwclëig. Ni welsom niwclysau tameidiog na llabedog, yn nodweddiadol apoptotig; ni welsom ychwaith unrhyw wahaniaethau rhyfeddol yn cymharu adrannau histolegol hippocampal y llinell reoli drawsgenig TgAPP ynghylch yr adrannau WT; ni welsom ychwaith unrhyw wahaniaethau rhwng y triniaethau quercetin a rutin yn ymwneud â llygod TgAPP rheoli.

Yn y panel o nodweddion biocemegol AD ​​i'w dadansoddi, fe wnaethom ganolbwyntio'n bennaf ar bennu'r gymhareb GSH / GSSG ar y naill neu'r llall o'r ddau ddeiet flavonoid, gan fod disbyddiad lefelau GSH yn cynrychioli un o'r marcwyr biocemegol cynnar pwysicaf yn AD [16,17 ] ac fe'i gwelwyd yn ystod ei bathogenesis a datblygiad afiechyd. Mae mesur lefelau GSH yr ymennydd [18] ac, yn fwy diweddar, lefelau GSH gwaed [19] wedi bod yn addawol fel marcwyr diagnostig ar gyfer cyfnodau cynnar AD. Ar ben hynny, gwnaed ymdrechion hefyd i ategu siopau GSH mewndarddol eu hunain neu eu rhagflaenwyr [20-22]. Yn ein hastudiaeth, gwelwyd gostyngiad yn y pŵer lleihau cellog (GSH / GSSG) yn y llygod TgAPP yn ymwneud ag anifeiliaid WT, mewn dynion a menywod, ac yn y ddau faes o'r ymennydd. Yng nghortecs a hippocampws llygod WT a TgAPP, roedd y gymhareb GSH/GSSG yn is mewn gwrywod nag mewn merched. Cynyddodd dietau quercetin a rutin y gymhareb GSH/GSSG yn sylweddol o gymharu â llygod TgAPP heb eu trin, ac roedd y cynnydd hwn yn fwy amlwg yn yr hippocampus. Roedd y newidiadau mewn lefelau GSH a GSSG a chymhareb GSH/GSSG ar driniaeth quercetin neu rutin i wrywod, o ran cynyddu pŵer rhydocs, yn fwy amlwg nag ymhlith menywod. Gall canlyniadau ein penderfyniadau ddatgelu sail bwysig sy'n sail i wahaniaethau sy'n gysylltiedig â rhyw yn llygod Tg2576 yn y tueddiad i ddifrod ocsideiddiol macromoleciwlau ar un llaw, gan fod y system glutathione yn lleihäwr amlbwrpas mewn swyddogaethau biolegol lluosog, ac yn effaith ataliol. dietau flavonoid wrth adfer ei statws ffisiolegol ar y llaw arall. Fel y byddwn yn gweld trwy gydol y drafodaeth hon, rydym wedi gosod y cynnydd yn y gymhareb GSH/GSSG fel y brif echel a allai egluro'r set o effeithiau a welwyd yn y llygod TgAPP.

Cynigiwyd yn ddiweddar y byddai'r gymhareb GSH/GSSG, yn hytrach na gweithredu fel byffer rhydocs yn unig, yn gweithredu fel prif fecanwaith rheoleiddio yn lle hynny, gan ganiatáu i broteinau gyrraedd eu cydffurfiad a'u swyddogaeth frodorol trwy reoli cydbwysedd thiol-disulfide y cellog yn dynn. proteome. Yn fyr, mae'r system glutathione yn hanfodol i gadw proteome iach, gan ddangos bod tarfu ar homeostasis redox glutathione (hy, yn enetig neu'n ffarmacolegol) yn cynyddu agregu protein oherwydd aflonyddwch yn effeithiolrwydd awtophagy [23]. Felly, efallai y bydd gan strategaethau sydd â'r nod o gynnal homeostasis redox glutathione botensial therapiwtig mewn clefydau sy'n gysylltiedig â chydgasglu protein, fel AD. Mae'r peiriannau diraddio ubiquitin-proteasome sy'n ymwneud â phathogenesis AD yn perthyn yn agos i gadw'r proteome. Mae'r proteasome yn diraddio swbstradau lluosog yn ddetholus sy'n hanfodol i gynnal homeostasis niwronaidd, gan gynnwys cataboliaeth proteinau ocsidiedig ac agregedig. Mae BACE1 yn mynd trwy hollbresennol, a dangoswyd y bydd rhwystro'r llwybr ubiquitin-proteasome yn atal diraddio BACE1 ac o ganlyniad yn arwain at gynhyrchu mwy o weithgaredd ensymatig BACE1, mwy o gynnyrch holltiad C99, a chynnydd yn A 1-40 ac A { {8}} mewn celloedd niwronaidd ac an-niwronaidd [10]. Mae ein hastudiaethau blaenorol wedi canfod bod flavonoids, quercetin, a rutin, yn effeithio ar wahanol lwybrau signalau a rhwydweithiau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â modiwleiddio swyddogaeth proteasome mewn celloedd niwroblastoma [9]. Yn ogystal, dangoswyd bod niwronau a ategwyd â llai o glutathione (GSH) wedi adennill y gweithgaredd proteasome a llai o ffurfiant cyfanredol [11] gan fod y swyddogaeth proteasome wedi'i rheoleiddio gan statws rhydocs [24]. Felly, mae'r cynnydd yn y gymhareb GSH/GSSG a brofir gan yr anifeiliaid ar ôl cael diet quercetin neu rutin yn gyson â modiwleiddio'r proteasome gan quercetin a rutin, a ddangoswyd ex vivo yn flaenorol.

Fel y crybwyllwyd yn flaenorol, mae anghydbwysedd rhydocs yn arwain at broteinau wedi'u haddasu'n ocsidiol iawn sy'n tueddu i gronni a chreu agregau gan arwain at nam proteasome [25]. Felly, o ystyried rôl hanfodol straen ocsideiddiol yn pathogenesis AD, aseswyd biomarcwyr straen ocsideiddiol, gan gynnwys perocsidiad lipid (lefelau MDA) ac ensymau gwrthocsidiol, yn y cortecs a hippocampus yn y llygod TgAPP a WT. SOD, CAT, GR, a GPx yw'r ensymau gwrthocsidiol pwysicaf sy'n gweithredu yn erbyn radicalau rhydd ocsigen ac yn rheoleiddio metaboledd radicalau rhydd yn y corff ac yn chwarae rhan yn y system chwilota radical rhad ac am ddim, gan amddiffyn y celloedd yn y corff rhag perocsidiad lipid . Yn ein hastudiaeth, o ganlyniad i orfynegiant APP, gwelwyd gostyngiad cyffredinol mewn gweithgareddau ensymau gwrthocsidiol mewn llygod TgAPP o gymharu â llygod WT, sy'n ystadegol arwyddocaol ar gyfer CAT. Yn gyson â llai o lefelau GSH, cynyddwyd perocsidiad lipid yn sylweddol yn y llygod TgAPP. Er bod ffynhonnell straen ocsideiddiol mewn AD dynol yn gymhleth iawn ac yn aml-ffactoraidd, mae'n ymddangos bod y patholeg amyloid a ddatblygwyd mewn llygod yn ddigonol i gychwyn y broses patholegol sy'n arwain at fwy o straen ocsideiddiol yn yr ymennydd [26]. Gwelodd anifeiliaid a gafodd eu trin â rutin gynnydd mewn gweithgaredd CAT yn y cortecs a gweithgaredd GR yn yr hippocampus, mewn dynion a merched. Dim ond anifeiliaid a gafodd eu trin â rwtin a brofodd newidiadau ym mynegiant genynnau CAT a GR yn y cortecs a'r hippocampus mewn gwrywod a benywod a GPx yn hippocampi llygod benywaidd. Yn y cyd-destun hwn, dangoswyd bod sawl cyfansoddyn naturiol yn effeithio ar y groes-siarad rhwng y rheoliad proteasome a rhydocs. Yn fwy manwl gywir, mae quercetin yn ysgogydd Nrf2 hysbys [27] sy'n arddangos eiddo gwrthocsidiol trwy ysgogi swyddogaeth proteasome, gan hyrwyddo ymwrthedd straen ocsideiddiol cynyddol a rhoi gwell hirhoedledd celloedd [28].

Mae mynegiant meinwe-benodol o BACE1 yn hanfodol ar gyfer prosesu APP arferol, a gall ei fynegiant dadreoleiddio chwarae rhan mewn pathogenesis AD. Mynegir BACE1 yn bennaf mewn niwronau hippocampal, y cortecs, a'r haen gronynnog cerebellar [10]. Dylid nodi bod astudiaethau cynharach wedi dangos bod llygod trawsgenig mutant APP Sweden wedi cynyddu lefelau ymennydd A yn sylweddol mewn cyflwr cyson [29], gan awgrymu bod BACE1 yn chwarae rhan hanfodol yn y llwybr amyloidogenig mewn pathogenesis AD ac mae'n darged therapiwtig da. ar gyfer triniaeth AD. Yn ein hastudiaeth, gwelsom ostyngiad sylweddol mewn gweithgaredd BACE1 ar driniaethau quercetin a rwtin, a allai gyfrannu at ostyngiad mewn dyddodiad A mewn llygod. Rydym yn dadlau y gallai mwy na gweithredu fel atalyddion BACE1 yr ensym, quercetin, a rutin yn unig achosi gostyngiad mewn gweithgaredd BACE1 sy'n gysylltiedig â chynnydd yn y gymhareb GSH/GSSG, yn seiliedig ar y ddamcaniaeth o wella adferiad gweithgaredd proteasom. Yn yr ystyr hwn, mae'n hysbys bod targedu atalyddion BACE1 i safle holltiad APPswe (treiglad Sweden) yn digwydd cyn iddo gyrraedd y bilen plasma, tra bod APPwt (math Gwyllt) yn cael ei brosesu mewn endosome cynnar sy'n tarddu o arwyneb y gell. Felly, mae BACE1 sy'n hollti APPwt weithiau'n rhwym i'r atalydd BACE1 ar wyneb y gell cyn prosesu APP, fodd bynnag, nid yw'r ensym sy'n prosesu APPswe [30]. Am y rheswm hwn y gallai lleoleiddio afreolaidd prosesu APPswe leihau nerth quercetin a rutin fel atalyddion BACE1 yn sylweddol. Felly, rydym yn fwy tueddol o gefnogi nad yw gostyngiad gweithgaredd BACE yn y model in vivo hwn i'w briodoli'n fawr i ataliad yr ensym ond i'r cynnydd yn y gymhareb GSH/GSSG. Beth bynnag, gellid dehongli llai o weithgaredd BACE1 fel ymgais tybiedig i leihau cynhyrchiant -amyloid yn llygod TgAPP. O ran effaith fwyaf rhyfeddol quercetin a rutin yn yr hippocampus ar wanhau gweithgaredd BACE1, mae'n werth nodi bod gan y cortecs ddwysedd niwron sylweddol uwch na'r hippocampus [31], ac mae nam detholus ar y proteasome mewn ffenoteip patholegol AD ​​yn gwneud y cortecs yn fwy agored i niwed ac yr effeithir arnynt na'r hippocampus [32].

Ar ôl pennu effaith y triniaethau ar weithgaredd ensymau BACE1, roedd gennym ddiddordeb mewn gwerthuso ei fynegiant. Yn rhyfedd iawn, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau sylweddol mewn mynegiant BACE1 rhwng llygod TgAPP o gymharu â llygod WT, ac ni welwyd unrhyw newidiadau amlwg gyda thriniaeth quercetin neu rutin. Felly, mae'n ymddangos nad yw'r cynnydd mewn gweithgaredd ensymau BACE1 yn gysylltiedig â chynnydd mewn mynegiant. Yn y cyd-destun hwn, mae'n rhyfeddol bod Apelt et al. Canfu [14] gynnydd mewn gweithgaredd cortigol BACE1 mewn llygod Tg2576 rhwng 9 a 13 mis tra nad oedd lefel mynegiant protein BACE1 a mRNA yn newid gydag oedran. Ar ben hynny, canfuwyd tystiolaeth sy'n cefnogi y gall amyloid ffibrilaidd A 1-42., yn hytrach nag amyloid hydawdd A 1-42, ddadreoleiddio mynegiant protein BACE1, ac felly gall addasiadau bach yn y gymhareb isoformau amyloid fodiwleiddio cydffurfiadau agregau amyloid a difrod celloedd [ 33]. Felly, gall absenoldeb newid yn y mynegiant BACE1 ar gynnydd yn ei weithgarwch a welsom fod yn gyfrifol am fynychder amyloid hydawdd A 1–42 dros yr isoform amyloid ffibrilaidd A 1–42 yn ein model llygoden TgAPP.

Yn dilyn pennu mynegiant genynnau'r ensymau sy'n ymwneud â phrosesu APP, gwnaethom werthuso effaith quercetin a rutin ar yr ensym -secretase sy'n ymwneud â phrosesu APP nad yw'n amyloidogenig. Fe wnaethom ganolbwyntio ar ADAM10 oherwydd dyma'r isoform cyfansoddol pwysicaf yn ffisiolegol o -secretase. Mae ADAM10 yn gwrthweithio'r broses o gynhyrchu placiau oligomeric A niwrowenwynig trwy hollti APP o fewn parth A i gynhyrchu darnau terfynell sAPP a C (-CTF) [34,35]. Er nad oedd y newidiadau mewn mynegiant ADAM10 a ddarganfuwyd yn ein hastudiaeth yn ystadegol arwyddocaol, gwelwyd gostyngiad bach mewn mynegiant ADAM10 mewn llygod TgAPP o gymharu â llygod WT. Yn bennaf, dangosodd triniaeth rutin duedd i gynyddu mynegiant genynnau ADAM10 yn y ddau faes ymennydd dan sylw. Mae Postina et al. [36] yn dangos bod uwch-reoleiddio ADAM10 math gwyllt yn hipocampws model llygoden AD yn cyfryngu secretion sAPP, gan arwain at atal cynhyrchu placiau A. Mae effaith quercetin wedi'i hastudio mewn model llygod mawr OC a achosir gan alwminiwm clorid sy'n dangos gwelliant sylweddol yn y -secretase (ADAM10 ac ADAM17) yn yr hippocampus o'i gymharu â rhai heb eu trin. Mae hyn yn dangos bod gan quercetin y potensial i gynyddu'r llwybr nad yw'n amyloidogenig trwy actifadu genynnau -secretase [37]. Mae data rhag-glinigol yn atgyfnerthu'r ddamcaniaeth bod gwella lefelau sAPP yr ymennydd yn strategaeth bosibl i wella symptomau sy'n gysylltiedig ag AD a gwanhau diffygion synaptig. Mae ADAM10 a BACE1 yn cystadlu am holltiad yr APP, felly gallai cryfhau gweithgaredd ADAM10 atal y genhedlaeth amyloid niwrowenwynig. Ar ben hynny, gall sAPP atal gweithrediad y llwybr signalau JNK straen, gan arwain at actifadu gweithgaredd ffosfforyleiddiad a achosir gan NF-κB, sy'n arwain at ddiraddiad proteasome [38]. Felly, mae ffurfio a chronni agregau protein sy'n gysylltiedig â chlefydau yn cael eu lleihau'n sylweddol, ac mae'r gweithgaredd proteasome cellog yn cael ei wella, a thrwy hynny ddarparu tystiolaeth ar gyfer swyddogaeth sAPP wrth reoleiddio proteostasis [39]. Ar ben hynny, dangoswyd bod sAPP yn dadreoleiddio synthesis derbynyddion AMPA glwtamad yn benodol a'i fasnachu mewn pobl [40]. Yn ein hastudiaeth, gwnaethom archwilio a yw'r cynnydd bach mewn mynegiant ADAM10 ar driniaeth rwtin yn dylanwadu rhywfaint ar drosglwyddiad synaptig glwtamatergig. Fel y dangosir yn yr adran Data Atodol, ni welwyd unrhyw effeithiau sylweddol ar fynegiant y derbynnydd ionotropig hwn ar ddeietau quercetin a rutin, efallai oherwydd cynnydd gwan mewn mynegiant ADAM10, nad yw'n ddigonol ar gyfer upregulation y derbynnydd AMPA (data atodol , Ffigur S2 a Thabl S5).

Dylid cymryd i ystyriaeth bod astudiaethau in vitro wedi dangos amrywiaeth eang o swbstradau ADAM10 [41], ac felly, gallai effeithiau annymunol a geir trwy dargedu ADAM amhenodol i'w canfod mewn amlhau canser, adlyniad celloedd, hyrwyddo rhagflaenydd cell T/NK-cell a llid, ac ati. [42]. Er mwyn osgoi'r cyfyngiad hwn, mae ein hastudiaeth yn awgrymu strategaeth sydd â'r nod o hyrwyddo rhyddhau sAPP yn fwy ffisiolegol. Gallai'r dull hwn fod yn seiliedig ar gymeriant hirdymor cynhwysyn gweithredol (quercetin neu rutin), sy'n cael ei fwyta trwy ddeiet dynol iach. Fodd bynnag, mae angen astudiaethau pellach i ddarganfod a yw'r cynnydd mewn ADAM10 yn ddibynnol ar ddos ​​flavonoid ac a yw'r effeithiau buddiol posibl yn gorbwyso'r sgîl-effeithiau tybiedig.

O ran mynegiant APPswe, er bod mewnosod y trawsgen APP dynol yn genom y llygoden yn gwarantu bod APPswe yn cael ei or-fynegi o enedigaeth, adroddwyd bod lefelau mRNA APP a hippocampal protein yn dangos amrywiadau sylweddol yn ystod datblygiad anifeiliaid, gan fod yn fwyaf posibl pan fo llygod yn cael eu geni. asymptomatig (1-mis oed) ac yn gostwng pan fydd symptomatoleg lawn yn digwydd [43]. Er gwaethaf y mater hwn, roedd mynegiant APP yn y cortecs a'r hippocampus yn sylweddol uwch o'i gymharu â mynegiant llygod WT yn ein hastudiaeth. Roedd triniaeth bellach gyda quercetin neu rutin yn gallu lleihau mynegiant o'r fath yn sylweddol ar gyfer llygod gwrywaidd a benywaidd, yn y ddau faes o'r ymennydd. Mae'r canfyddiadau hyn yn unol â'r rhai a adroddwyd gan Augustin et al. [44] a astudiodd ddyfyniad safonol o Ginkgo biloba (Egb761), sy'n gyfoethog mewn flavonols fel quercetin, mewn 4-llygod TgAPP benywaidd mis oed, gan ddod o hyd i lai o APP mRNA a lefelau protein. Gan ystyried bod dadreoleiddio APP trosiadol mewn llygod Tg2576 yn digwydd yn y cyfnodau prodromal a symptomatig cynnar [45], mae'n debygol y gallai adferiad cyfieithiad APP trwy quercetin neu rutin fod wedi digwydd yn ein llygod TgAPP ac, yn debygol, yn gynnar. cam symptomatig, gan arwain at ostyngiad yn lefelau cortigol a hippocampal o APP, gweithgaredd BACE1, ac actifadu caspase-3.

Ar ben hynny, adroddwyd mewn man arall, mewn llygod Tg2576 (yn absenoldeb colled niwronau) fod cynnydd mewn actifadu caspase-3 yn yr hippocampus [46], fel y canfuwyd yn ein hastudiaeth, ar ddechrau nam ar y cof , ynghyd â gostyngiad mewn pigau dendritig cyn dyddodiad amyloid allgellog [46]. Mae tystiolaeth i gefnogi rolau anapoptotig ar gyfer caspasau yn y system nerfol heb farwolaeth niwronaidd [47], ac mae gweithgarwch caspase-3 wedi'i leoleiddio i asgwrn cefn dendritig lle gallai godi lefelau calsinwrin. Yn ei dro, credir bod dadffosfforyleiddiad is-uned GluR1 o dderbynyddion tebyg i AMPA, a ysgogwyd gan galsinwrin, yn arwain at gamweithrediad postsynaptig. Mae ein gwerthoedd mynegiant caspase, o ganlyniad i drawsgenesis, yn cyd-fynd â'r rhai a gafwyd gan ymchwilwyr eraill a adroddodd gynnydd mewn mynegiant caspase ar lefel pigau dendritig yn hipocampws llygod TgAPP [48]. Gan fod APP yn cynnwys tri safle holltiad gwahanol ar gyfer caspase-3 yn ei ddilyniant asid amino, dau ohonynt wedi'u lleoli ar lefel y parth allgellog ac un yn rhan terfynell C mewngellol cynffon APP [49], hydrolysis o APP gan caspase-3 newid prosesu proteolytig APP o blaid y llwybr amyloidogenig [50], gan arwain at ryddhau peptid sytotocsig C-terminal o 31 asid amino o hyd (C31), ar gyfer enghraifft [51]. Mae hyn yn awgrymu, gan y gall caspase-3 gyfryngu ymhelaethu ar ryddhau darnau gwenwynig o APP, gallai gostwng mynegiant caspase trwy quercetin neu rutin ganiatáu ar gyfer clirio protein cyfanredol. Yn ogystal, fel y crybwyllwyd yn gynharach, rydym wedi archwilio dylanwad cynnydd a gostyngiad mynegiant caspase mewn trosglwyddiad synaptig glutamatergig, yn seiliedig ar allu caspase wedi'i actifadu gan galsinwrin-3 i ddadffosfforyleiddio'r is-uned GluR1 o dderbynyddion AMPA ar y lefel postsynaptig. Mae'r addasiadau moleciwlaidd hyn yn newid trosglwyddiad synaptig glutamatergig a phlastigrwydd niwronaidd ar lefel pigau dendritig yn yr hippocampus [48]. Yn ddamcaniaethol, gallai ataliad ffarmacolegol o weithgarwch caspase-3 mewn llygod TgAPP arbed y ffenoteipiau tebyg i AD rhag mecanwaith sy'n gyrru methiant synaptig. Fodd bynnag, er gwaethaf y cynnydd mewn mynegiant caspase-3 yn ein llygoden TgAPP, ni chanfuom unrhyw wahaniaethau arwyddocaol mewn mynegiant derbynnydd AMPA o'i gymharu â'r un mewn llygod WT, fel y crybwyllwyd yn gynharach. Mae'n bosibl nad yw'r newidiadau mewn mynegiant caspase-3 yn ddigon amlwg i gynhyrchu addasiadau sylweddol mewn mynegiant derbynnydd AMPA (Data atodol, Ffigur S2 a Thabl S5).

O ran gwerthoedd mynegiant caspase-6, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol rhwng llygod TgAPP a WT. Mae actifadu caspase-6 wedi'i nodi fel cyfryngwr pwysig o straen niwronaidd sy'n hollti proteinau cytoskeletal pwysig (Tau a -tubulin), gan amharu ar ddiraddiad ubiquitin-proteasome o broteinau wedi'u cam-blygu, a sawl dwysedd ôl-synaptig sy'n rheoleiddio actin. proteinau [52]. Mae'r mynegiant digyfnewid o caspase-6 yn ein hastudiaeth yn cytuno ag absenoldeb arwyddion nodweddiadol o niwroddirywiad yn yr oedran y gwerthuswyd y llygod trawsenynnol hyn, o'u cymharu â'r llygod WT (data atodol, Ffigur S1).

Gwelwyd cynnydd amlwg mewn cyfryngwyr niwrolidiol mewn cleifion AD, yn bennaf o amgylch placiau henaint [53-55]. Astrocytes yw prif gyflenwr GSH i ficroglia a niwronau. Yn ystod llid cronig a straen ocsideiddiol, mae astrocytes yn rhyddhau cyfryngwyr llidiol gwenwynig a radicalau rhydd, gan gyflymu actifadu microglia a niwroddirywiad [56]. Mae'n werth nodi bod gostyngiad mewn glutathione mewngellol yn gysylltiedig ag actifadu'r llwybrau llidiol, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-κB, mewn microglia dynol ac astrocytes [57]. Yn hyn o beth, penderfynwyd meintioli lefelau IL-1 , IFN- , a TNF- yn ein model anifeiliaid a phennu effaith quercetin a rutin arnynt. Fel y gwyddys, mae llid yn hyrwyddo prosesu diffygiol o peptid A ac APP, gan hyrwyddo cydgasglu peptid A ac yn ei dro addasu adweithedd A [58]. Felly, yn ein hastudiaeth, gwelsom fod llygod TgAPP wedi cynyddu lefelau mRNA y cyfryngwyr pro-llidiol IL-1 , TNF- ac IFN-, o gymharu â llygod WT, gan ddangos y gallai gorfynegiant APPswe achosi rhaeadrau niwro-llidiol. sbarduno cyfres o lwybrau moleciwlaidd mewn glia a niwronau, a fyddai'n actifadu'r ymateb llidiol. Roedd Quercetin a rutin yn gallu gwanhau mynegiant genynnau IL{-1 mewn gwrywod a benywod a'r ardaloedd ymennydd a astudiwyd. Mae sawl darn o dystiolaeth yn cefnogi'r effaith gwrthlidiol a roddir gan quercetin ar lefel CNS, gan y gallai atal actifadu ffactorau trawsgrifio fel y ffactor niwclear-kappa B (NF-κB) [59], sy'n ymwneud â sefydlu iNOS, a felly, lleihau rhyddhau cyfryngwyr megis IL-1 , TNF- ac IFN- [60]. O ran effaith GSH ar yr ymateb llidiol, dylid nodi bod GSH yn ymwneud â chynnal y lefelau cytocinau gorau posibl yn y fath fodd fel bod mynegiant cytocinau pro-llidiol (TNF- , IL-1, ac IL). -6) yn cynyddu oherwydd disbyddiad GSH, tra bod mynegiant cytocinau gwrthlidiol (hy, IL-10) heb ei newid. Mae'r newid homeostasis GSH hwn yn digwydd oherwydd upregulation yn llwybrau signalau NF-κB a JNK a allai fod yn llwybr apoptotig ymarferol tuag at farwolaeth celloedd niwronaidd [61]. Yn ein hastudiaeth, gallai is-reoleiddio NF-κB gan quercetin a rutin fod yn fecanwaith credadwy i adennill homeostasis GSH/GSSG ac felly achos y cydbwysedd rhwng cytocinau pro-lidiol a gwrthlidiol. Yn olaf, gan fod gan hyrwyddwr BACE1 safle rhwymo NF-κB, mae actifadu NF-κB a achosir gan lid yn hwyluso uwch-reoleiddio mynegiant BACE1, ac wedi hynny yn cynyddu cynhyrchiad A [62]. Felly, os bydd is-reoleiddio NF-κB yn digwydd ar ddeietau quercetin a rutin, byddai gweithgaredd BACE1 yn lleihau o ganlyniad i reoleiddio rhyddhau cytocinau pro-llidiol ac nid gwrthlidiol.

4. Deunydd a Dulliau

4.1. Anifeiliaid Arbrofol

Defnyddiwyd llygoden drawsgenig (Tg2576, B6; SJL-Tg (APPswe) 2576 Kha) sy'n mynegi treiglad dwbl Sweden o brotein rhagflaenydd amyloid dynol (hAPP) fel y model anifail o AD arbrofol [14]. Mae'r llygoden yn llinell heterosygote sy'n mynegi'r isoform dynol A PP695 gyda'r treiglad dwbl o Sweden (K670N/M671L; Lys670 → Asn a Met671→Leu) o dan reolaeth hyrwyddwr protein hamster prion [63]. O ganlyniad, mae'r llygoden hon yn arddangos lefelau o brotein rhagflaenydd amyloid dynol (A PP), chwe gwaith yn fwy na lefelau A PP llygoden. Yn ogystal, mae'r llygoden hon yn dangos lefelau uwch o A 40 ac A 42. Mae dyddodion A yn dechrau yn 9 mis oed [63]. O fewn hippocampus a cortecs Tg2576, mae mynegiant trawsgen APPswe yn niwronaidd yn bennaf [64].

Fel rheolaeth negyddol, defnyddiwyd llygod math gwyllt (WT) o'r un gytref [65,66]. Datblygwyd cytref llygod Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) yn ein labordy o wrywod heterosygaidd Tg2576 a benywod gwyllt. Rhoddwyd y rhieni trawsenynnol gan Dr Diana Frechilla o'r Is-adran Niwrowyddoniaeth yn y Ganolfan Ymchwil Feddygol Gymhwysol ym Mhrifysgol Navarra (Pamplona, ​​Sbaen) [67].

Câi anifeiliaid eu cadw mewn cewyll wedi'u hawyru'n unigol a'u cadw ar 22-24 ◦C ar gylchred golau/tywyll o 12-h mewn lleithder o 50-60 y cant. Cymeradwywyd protocolau anifeiliaid gan y Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol (IACUC) ym Mhrifysgol Complutense Madrid ac roeddent yn gwbl unol â Chyfarwyddeb Ewropeaidd 2010/63/ ar amddiffyn anifeiliaid a ddefnyddir at ddibenion gwyddonol a deddfwriaeth Sbaen ar Les Anifeiliaid ( Archddyfarniad Brenhinol 53/2013, 1 Chwefror 2013).

4.2. Genoteipio Dadansoddiadau o Lygod

Canfuwyd trawsgenedd o fewn 30 diwrnod o enedigaeth gan fiopsi cynffon. Cynhaliwyd dadansoddiadau genoteipio anifeiliaid gan PCR. O ystyried bod Tg2576 (TgAPP) yn llinell heterosygaidd, defnyddiwyd y genyn mewnosod (PrP, o brotein prion) fel rheolaeth adwaith cadarnhaol. Echdynnwyd DNA genomig o gynffonnau llygoden a dreuliwyd â phroteinas K (0.1 µg/µL) mewn byffer NID (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM MgCl2, gelatin 0.05 y cant, 0.45 y cant NP-40 a 0.4 y cant Tween 20) ar 56 ◦C am 3 h ac ysgwyd. Cafodd darnau DNA eu gwaddodi ag isopropanol a'u golchi â 70 y cant ethanol. Diddymwyd gwaddodion DNA mewn 30 µL o glustogfa TE (10 mM Tris-1 mM EDTA). Pennwyd purdeb a chrynodiad DNA ar 260 a 280 nm.

Cafodd y genynnau PrP ac APP eu chwyddo gan PCR. Roedd y dilyniannau o breimwyr a ddefnyddiwyd i sgrinio'r llygod trawsgenig fel a ganlyn: PrP ymlaen: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP gwrthdroi: GTGGATACCCCCCCCCCAGCCTAGACC; Gwrthdroi'r APP: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Roedd camau'r adwaith PCR fel a ganlyn: dadnatureiddio ar 94 ◦C am 90 s, 39 cylch ar 60 ◦C am 60 s a 72 ◦C am 90 s, yna estyniad terfynol ar 72 ◦C am 7 munud.

Ym mhob achos, ystyriwyd rheolaethau negyddol (heb lwydni DNA) a rheolaethau cadarnhaol o'r genyn APP. Gwahanwyd y cynhyrchion PCR a gafwyd gan electrofforesis mewn geliau agarose 1.5 y cant mewn byffer 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, yr Almaen) ar 70 V (foltedd cyson) ac yna eu delweddu trwy staenio â GelRed (Millipore).

4.3. Triniaethau Anifeiliaid

Cafodd llygod TgAPP a sbwriel tebyg i wyllt, y ddau rhwng 6 a 7 wythnos oed gyda phwysau corff cychwynnol o 16.2 ± 0.8 g, eu haposod i'r pedwar grŵp canlynol (n=8/grŵp): ( a) TgAPP heb ei drin; (b) TgAPP wedi'i drin â quercetin; (c) TgAPP wedi'i drin â Rutin; ac (ch) Math o wyllt heb ei drin. Ers i lygod gwrywaidd a benywaidd gael eu hastudio, sefydlwyd dwy set o grwpiau. Yn 45 wythnos oed, dechreuodd y llygod gael eu trin â quercetin neu rutin am 4 wythnos.

Roedd Quercetin (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavone) a rutin hydrate (quercetin-3-O-rutinoside hydrate) yn Fwy na neu'n hafal i 95 y cant yn bur ac wedi'u prynu gan Sigma-Aldrich. Ymgorfforwyd pob un o'r flavonoidau mewn diet safonol (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​​​Sbaen) mewn crynodiad o 200 ppm, sy'n cyfateb i gymeriant o 30 mg flavonoid / kg pwysau corff / dydd. Roedd y llygod heb eu trin yn derbyn y diet safonol heb ei ychwanegu yn unig. Darparwyd diet a dŵr ar gyfer cymeriant ad libitum.

4.4. Paratoi Meinwe'r Ymennydd ar gyfer Profion Biocemegol a Histolegol

Ar ddiwedd y driniaeth, cafodd llygod eu cyflymu dros nos, cawsant eu ewthaneiddio gan ddefnyddio datgymaliad ceg y groth, a chafodd yr ymennydd cyfan ei dynnu'n gyflym. Roedd yr ymennydd yn cael ei rinsio mewn halwynog ar 4 ◦C a chafodd y bilen arachnoid ei thynnu'n ofalus. Yna, cafodd yr hippocampus a'r cortecs eu hynysu. Roedd samplau'n cael eu storio ar unwaith ar −80 ◦C nes eu bod yn cael eu defnyddio ymhellach.

Defnyddiwyd ymennydd cyfan rhai anifeiliaid i gael adrannau histolegol, ac ar ôl iddynt gael eu ewthio gan ddefnyddio datgymaliad ceg y groth, cafodd yr ymennydd ei rewi trwy drochi mewn isopentane ar −80 ◦C. Yn syth wedi hynny, gwnaed rhannau coronaidd o'r ymennydd (30 µm o drwch) o'r bwlb arogleuol i'r cerebellwm, 120 µm ar wahân mewn cryostat (Leica CM1850, Nussloch, yr Almaen). Perfformiwyd y weithdrefn gyfan ar −20 ◦C. Casglwyd adrannau histolegol ar sleidiau a'u cadw ar −80 ◦C tan ddadansoddiad (Gweler Dulliau Atodol).

4.5. Glutathione

Ar gyfer profion glutathione, cafodd samplau cortecs cerebral a hippocampus eu homogeneiddio mewn byffer diffodd rhydocs-5 y cant asid asetig Trichloride (RQB-5 y cant TCA) (wedi'i fyrlymu yn flaenorol â N2 am 15 munud ar rew) mewn crynodiad o 25 mg/mL (w/v). Samplau eu hailddarlledu gan sonication am 10 s, yna centrifuged yn 12,000× g am 10 munud ar 4 ◦C, a supernatants eu casglu.

Yna, yn y supernatant a gafwyd, mabwysiadwyd dulliau sbectrofluorometrig i bennu lefelau GSH a GSSG gan ddefnyddio'r dull o-phthalaldehyde, a ddisgrifir gan Senft et al. [68]. Cywirwyd gwerthoedd GSH a GSSG ar gyfer adwaith digymell yn absenoldeb sampl biolegol. Yn y ddau achos, deorwyd uwchnaturiaid am 30 munud ar dymheredd yr ystafell ac wedi hynny, mesurwyd fflworoleuedd gan ddefnyddio darllenydd microplate FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, yr Almaen), gyda'r hidlydd cyffro wedi'i osod ar 360 nm (lled band 5 nm) a'r hidlydd allyriadau wedi'i osod ar 460 nm (lled band 5 nm). Roedd y crynodiad o GSH a GSSG ym mhob sampl wedi'i ryngosod o safonau GSH hysbys. Mynegwyd crynodiadau GSH a GSSG fel protein nmol GSH/mg, a oedd yn caniatáu ar gyfer cyfrifo'r gymhareb redox glutathione GSH/GSSG.

Cafodd y pelenni a oedd yn weddill eu fortecsio nes eu bod wedi'u toddi'n llwyr mewn 240 µL o 0.1 M NaOH i fesur crynodiad protein trwy'r dull asid bicinchoninig (BCA), gan ddefnyddio albwmin serwm buchol fel safon.

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】