Mae Netrin Newydd-1-Peptid Deilliedig yn Gwella'r Amddiffyniad Rhag Marwolaeth Niwronaidd A Lliniaru Hemorrhage Mewn Ymennydd mewn Llygod Rhan 2

Ar ben hynny, canfuom fod peptid E1 yn gweithredu'r llwybrau signalau FAK a SFK yn benodol. Felly, gall peptid E1 gael effeithiau penodol iawn a bod yn effeithiol yn y broses adfer ar ôl ICH.

Mae perthynas rhwng penodoldeb uchel a chof. Mae penodoldeb uchel yn cyfeirio at y gweithgaredd cryfach mewn rhannau penodol o'r ymennydd pan fydd pobl yn cyflawni tasg. Mae cof yn cyfeirio at allu pobl i ddysgu a chofio gwybodaeth. Pan fyddwn yn dysgu defnyddio penodoldeb uchel i gyflawni tasg, bydd ein cof hefyd yn cynyddu.

Mae ymchwil yn dangos pan fydd gennym sgiliau a phrofiad arbenigol mewn tasg, bydd yr ymennydd yn raddol adeiladu cylchedau niwral arbenigol a phatrymau cof. Bydd y cylchedau a'r patrymau hyn yn cael effaith benodol ar yr ymateb i'r dasg, gan wella effeithlonrwydd y dasg. Ar yr un pryd, wrth gyflawni tasgau tebyg yn y dyfodol, bydd y cylchedau a'r patrymau hyn hefyd yn cael eu gweithredu i'n helpu i gofio a pherfformio'r dasg yn well.

Mae tasgau penodol iawn yn cynnwys cerddoriaeth, iaith, chwaraeon, ac ati, a gall dysgu'r sgiliau hyn wella ein cof. Er enghraifft, pan fydd pianydd yn ymarfer chwarae, bydd yr ymennydd yn dysgu sgiliau penodol y piano ac yn parhau i gryfhau'r cylchedau hyn yn ystod y broses ymarfer. Bydd sefydlu a chryfhau'r cylchedau hyn hefyd yn gwella dealltwriaeth a chof y pianydd o'r gerddoriaeth.

Felly, mae perthynas gadarnhaol rhwng penodoldeb uchel a chof. Gall dysgu sgiliau a phrofiadau penodol nid yn unig wella ein heffeithlonrwydd gweithredu ond hefyd gryfhau ein cof, gan ein helpu i ddysgu a chofio gwybodaeth amrywiol yn well. Gellir gweld bod angen i ni wella cof, a gall Cistanche wella'r cof yn sylweddol oherwydd bod ganddo effeithiau gwrthocsidiol, gwrthlidiol a gwrth-heneiddio, a all helpu i leihau ocsidiad ac adweithiau llidiol yn yr ymennydd, a thrwy hynny amddiffyn iechyd y system nerfol. Yn ogystal, gall Cistanche hefyd hyrwyddo twf ac atgyweirio celloedd nerfol, a thrwy hynny wella cysylltedd a swyddogaeth rhwydweithiau niwral. Gall yr effeithiau hyn helpu i wella cof, gallu dysgu, a chyflymder meddwl, a gallant hefyd atal camweithrediad gwybyddol a chlefydau niwroddirywiol rhag digwydd.

Cliciwch gwybod atchwanegiadau i hybu cof

Yn wahanol i peptid E1, gall peptid E2 actifadu signalau ERK, sy'n hyrwyddo marwolaeth niwronaidd. Gall hyn gael ei achosi gan fotiffin Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G E2 a all actifadu llwybr signalau ERK [28].

Mae hyn yn dangos bod peptidau sy'n deillio o Netrin-1-gwahanol yn cyflawni swyddogaethau gwahanol. Prif dderbynyddion Netrin-1 yw CSDd ac aelodau o deulu UNC5 [50]. Mae rôl DCC ac UNC5H2 yn ICH yn parhau i fod yn ddadleuol [51,52].

Mae'r dilyniant o Netrin-1a nodwyd gennym yn hollbwysig i ryngweithiad Netrin-1 â CSDd [19]. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall CSDd gymryd rhan mewn adferiad swyddogaethol a achosir gan Netrin ar ôl ICH.

Mae angen astudiaethau pellach i ymchwilio i fecanweithiau sylfaenol y prosesau hyn a'r llwybrau signalau cysylltiedig. Mewn arbrofion yn y dyfodol, byddwn yn asesu priodweddau biolegol peptid E1 i archwilio ei wenwyndra a'i hanner oes ar gyfer defnydd clinigol.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Anifeiliaid

Roedd y labordy yn labordy penodol heb bathogen (SPF). Cafodd yr holl lygod eu cartrefu o dan gylchred golau-tywyll 12-h gyda'r goleuadau ymlaen rhwng 6 am a 6 pm ac yn darparu mynediad i fwyd ad libitum. CSDd+/− cynhyrchwyd llygod fel y disgrifiwyd yn flaenorol [53].

Defnyddiwyd embryonau o DCC +/ - llygod ar gyfer diwylliant niwronau cortigol. Cynhaliwyd genoteipio gan adwaith cadwyn polymeras (PCR) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [53]. Prynwyd llygod C57BL/6J gan Beijing Huafukang Bioscience Co, Ltd (Beijing, Tsieina).

4.2. Yn adeiladu

Cynhyrchwyd lluniadau mynegiant yn amgodio DCC dynol (HGNC: 2701), Netrin dynol-1 (HGNC: 8029), ac UNC5A dynol (HGNC: 12567) yn ein labordy [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His ei gynhyrchu gyda Phecyn Clonio Cynulliad Di-dor (Clone Smarter, C5891, UDA). Gwelwyd dilyniant cDNA o hNetrin-1 (∆407–443) yn Nhabl Atodol S2.

Cafodd dilyniannau cDNA sy'n cyfateb i barth FN5 oDCC ac asidau amino 407–443 o Netrin-1 eu hadeiladu trwy glymu i mewn i'r fector pGEX-5x{-1i gynhyrchu proteinau ymasiad GST.

4.3. Casgliad o Netrin-1 Cyflwr Canolig

Cafodd y cyfrwng cyflyru netrin ei gasglu a'i ddilysu fel y disgrifiwyd yn ein hadroddiad blaenorol [13,14]. Yn gryno, mynegwyd Netrin dynol Myc-His-dagio-1 yn HEK293Tcells.

Ar ôl 24 h, golchwyd y celloedd 3 gwaith gydag Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, UDA) ac yna eu deor am dri diwrnod mewn Opti-MEM di-serwm.

Cyfoethogwyd y cyfryngau gan hidlo allgyrchol (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, UDA) a'i storio ar −80 ◦C. Cafodd Netrin Cyfoethog-1 ei imiwnoblotio â gwrth-His a'i fesur trwy gymharu â BSA fel rheolydd llwytho.

Yna aseswyd effaith Netrin{{0}} gan ffosfforyleiddiad FAK. Fel arfer, roedd 0.1 mg/mL o Netrin-1 yn achosi ffosfforyleiddiad FAK i bob pwrpas, a defnyddiwyd y crynodiad hwn yn ein hastudiaethau. Hyd ysgogiad Netrin oedd 20 munud ym mhob arbrawf oni nodir yn wahanol.

4.4. Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol

Perfformiwyd blotio gorllewinol fel y disgrifiwyd yn flaenorol [54]. Cafodd y samplau eu dadansoddi mewn byffer lysis (1% Nonidet P-40, 0.5% sodiwm deoxycholate, 0.1% SDS, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10% glyserol, 1% Triton X-100, 100 mM NaF, 1 mM vanadate, ac atalyddion proteas) i lyse celloedd a meinwe ymennydd ffres.

Y prif wrthgyrff a ddefnyddiwyd oedd: llygoden gwrth-DCC (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, UDA), llygoden gwrth-His(1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Beijing, Tsieina). ), llygoden gwrth-myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, Tsieina), llygoden gwrth-Netrin-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, Efrog Newydd, UDA), llygoden gwrth-faner (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, UDA), cwningen gwrth-ffosffo-FAK(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, UDA), cwningen gwrth-FAK (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, UDA), cwningen gwrth-phosphoSRC (Tyr418)(1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA) , Teulu gwrth-SRC cwningen (1:1000, #2123, CST, Danvers, MA, UDA), llygoden gwrth-GAPDH (1:5000, TransGene Biotech, Beijing, Tsieina), llygoden gwrth-beta actin (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, UDA), cwningen gwrth-ffosffo-ERK(Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, UDA), rabbitanti-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, UDA), prynwyd gwrthgyrff eilaidd cyfun HRP yn erbyn llygoden, gafr neu gwningen gan Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, UDA).

4.5. Rhwymo Arwyneb Cell

Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 ar blatiau gorchuddion â phlasidau Flag-DCC gan ddefnyddio'r dull ffosffad calsiwm fel y disgrifiwyd yn flaenorol [55]. Tua 40 h ar ôl trawsgludiad, deorwyd y celloedd â 100 µg/mL myc-Netrin-1 neu myc-Netrin-1 (∆407–443) am30 min cyn cael ei olchi am 5 munud gyda HBHA (20 mM HEPES, pH 7.0, a 0.5 mg/mLBSA yn HBSS), ei rinsio â 1 × PBS, a'i osod yn olynol gyda 4% paraformaldehyde mewnPBS am 10 munud. Y prif wrthgyrff a ddefnyddiwyd oedd gwrthgyrff gwrth-myc cwningen (1:200, Abcam, ab9106, Caergrawnt, MA, UDA) a gwrth-faner llygoden (1:100, Sigma Aldrich, F3165).

Y gwrthgyrff eilaidd a ddefnyddiwyd oedd gwrthgyrff asyn gwrth-gwningen cyfun Alexa Fluor (1:1000; Invitrogen, A21206) a Alexa Fluor 546-gwrth-lygoden gafr cyfun(1:1000; Invitrogen, A10036). . Cafodd y cnewyllyn eu staenio â 40,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, UDA). Cafwyd pob delwedd gyda microsgop confocal Zeiss LSM 880.

4.6. GST Tynnu i Lawr

Cafodd y protein ymasiad GST-DCC ei buro â gleiniau glutathione-SepharoseTM 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, Swydd Buckingham, DU) gan brotocol y gwneuthurwr.

Deorwyd tua 500 µg o lysate cell o gelloedd HEK293T a drosglwyddwyd gyda'r plasmidau a nodwyd gyda 2-5 µg o byffer inRIPA ymasiad protein ymasiad GST-DCC-FN5 ar 4 ◦C dros nos. Defnyddiwyd gleiniau Glutathi-un-SepharoseTM 4B i ddal y protein ymasiad GST-DCC-FN5 a'i broteinau rhyngweithiol. Rhyddhawyd y proteinau rhwymedig i'r byffer llwytho protein trwy ddadnatureiddio gwres.

4.7. Diwylliant Cortical Neuron Cynradd

Cafodd niwronau cortigol cynradd eu meithrin fel y disgrifiwyd yn flaenorol [56]. Yn gryno, tynnwyd embryonau (E17) o lygod beichiog a anestheteiddiwyd. Gwahanwyd y corticau cerebral a'u torri'n ddarnau bach.

Ar ôl deoriad yn {{0}.125% Trypsin Plus gyda 0.05%DNase yn HBSS ar 37 ◦C am 20 munud, trituriwyd y celloedd â phibedau Pasteur gwydr wedi'u sgleinio â thân a'u hidlo â hidlydd 40 µm.

Cafodd celloedd datgysylltiedig eu hatal mewn DMEM gyda 10% FBS a'u platio ar ddysglau poly-D-lysin neu orchuddion gwydr ar 37 ◦C mewn atmosffer CO2 5%. Ar ôl 4 h, disodlwyd y cyfrwng â chyfrwng niwro-basal wedi'i ategu â B27 a GlutaMAX.

4.8. Protocolau Diwylliant a Thriniaeth Celloedd NLT

Llygoden GnRH-mynegi celloedd niwronaidd (NLT) eu cynnal gan ein labordy. Tyfwyd celloedd NLT yn DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, UDA) yn cynnwys 10% FBS (Diwydiannau Biolegol, Kibbutz Beit Haemek, Israel) ac 1% penisilin / streptomycin (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, UDA) ar 37 ◦C o dan awyrgylch llaith o 95% aer a 5% CO2.

Er mwyn pennu niwrowenwyndra hemin, ychwanegwyd crynodiadau amrywiol (0, 10, 30, 60, 90, a 120 µM) o hemin (Sigma-Aldrich) at gelloedd NLT a'u trin am 6 h. O'r crynodiadau hyn, dewiswyd 60 µM (LD50) a'i ddefnyddio yn yr arbrofion dilynol.

Roedd grwpiau rheoli yn cael eu trin â cherbyd (DMSO) yn unig. Perfformiwyd hyfywedd celloedd a Chadw Byw / Marwolaeth 6 awr ar ôl triniaeth. Defnyddiwyd tair ffynnon ar gyfer pob grŵp. Ailadroddwyd arbrofion o leiaf 3 gwaith.

4.9. Model In Vitro o Farwolaeth Celloedd a Achosir gan Hemin

Ysgogwyd marwolaeth celloedd mewn niwronau cortigol cynradd a chelloedd NLT trwy driniaeth gyda 50µM a 60 µM hemin, yn y drefn honno, fel y disgrifiwyd yn flaenorol [57,58]. Cafodd Hemin ei doddi 0.1 M NaOH i gynhyrchu hydoddiant stoc. Ar gyfer yr astudiaethau niwro-amddiffyniad, cafodd celloedd eu trin â hemin 6h ym mhresenoldeb asiantau dynodedig neu ddŵr distyll diddymedig sodiwm selenit wedi'i doddi.

4.10. CCK-8 Assay

Mesurwyd hyfywedd celloedd gan assay CCK-8 (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japan) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [59]. Yn gryno, cafodd Neuronal eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 6000 o gelloedd/ffynnon mewn cyfrwng meithrin 100 µL a'u bwydo yn y deorydd dros nos.

Cafodd celloedd eu trin â Hemin am 6 awr. Cafodd y celloedd niwronaidd eu golchi mewn adweithydd PBS (37 ◦C) a CCK-8 wedi'u cynhesu ymlaen llaw (10 µL fesul 100 µL cyfrwng) ym mhob ffynnon.

Ar ôl hynny, fe wnaethom ddeor y platiau am 2 awr mewn awyrgylch 5% CO2, a mesurwyd yr amsugnedd ar 450 nm gan ddefnyddio darllenydd amicroplate. Cynrychiolwyd hyfywedd celloedd fel y cant o'r rheolaeth (celloedd heb eu trin).

4.11. Lliwio Byw / Marw

Gwiriwyd gallu'r assay CCK-8 i fesur hyfywedd trwy staenio â calceinAM/PI yn PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, China) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Roedd yr hydoddiant staenio yn cynnwys adweithydd 2 µM calcein AC ac adweithydd PI8 µM wedi'i gymysgu mewn PBS. Deorwyd samplau am 30 munud a'u delweddu gan ddefnyddio lens 20xobjective o ficrosgop fflworoleuedd (Olympus FSX100, Tokyo, Japan). Defnyddiwyd o leiaf 3 diwylliannau celloedd annibynnol ar gyfer y model in vitro o farwolaeth celloedd a achosir gan hemin.

4.12. Synthesis Peptid a Gweinyddu

Y Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2), TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC wedi'i labelu TE1 (NH{{2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC wedi'i labelu (Pe{PeFG3)) 27}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQQ-CONH2), Baner wedi'i labelu Pep Ctrl(NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2), Baner wedi'i labelu Pep E1 (NH{DHGAKDYKDYKDGGD-CDGDG TTGQ-CONH2) a'r Faner wedi'i labelu Prynwyd peptidau Pep E2 (NH{2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) gyda phurdeb o 99% gan gwmni Shanghai GL Biochem (Shanghai, China) a chwmni Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, China).

For more information:1950477648nn@gmail.com