Mae Paratoad Albwmin Serwm Dynol S-sulfhydradedig Newydd yn Atal Synthesis Melanin
Jan 30, 2022
Cyswllt:jaslyn.ji@wecistanche.com
Mayumi Ikedaa,1, Yu Ishimaa,⁎,1, Ryo Kinoshitab, Victor TG Chuangc, Nanami Tasakaa, Nana Matsuoa, Hiroshi Watanabeb, Taro Shimizua, Tatsuhiro Ishidaa, Masaki Otagirid, Toru Maruyamab,⁎
ABSENOLDEB
Mae cynhyrchion arbelydru uwchfioled (UV) fel rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) ac ocsid nitrig (NO) yn ysgogi synthesis melanin. Dangoswyd bod gan rywogaethau sylffwr adweithiol (RSS) effeithiau ROS cryf a DIM chwilota. Fodd bynnag, mae ansefydlogrwydd a chadw isel RSS yn cyfyngu ar eu defnydd fel atalyddion synthesis melanin. Mae'r thiol rhad ac am ddim yn Cys34 ar albwmin serwm dynol (HSA) yn sefydlog iawn, mae'n cadw'n hir ac mae ganddo adweithedd uchel ar gyfer RSS. Rydym yn adrodd yma ar ddatblygiad system gyflenwi RSS seiliedig ar HSA. Mae deilliadau sylffwr sylffwr sy'n cael eu rhyddhau o sodiwm polysulfides (Na2Sn) yn adweithio'n rhwydd â HSA. Dangosodd assay ar gyfer amcangyfrif dileu sylffid o polysulfide fod bron y cyfan o'r sylffwr a ryddhawyd o Na2Sn yn rhwym i HSA. Canfuwyd bod yr HSA a gafodd ei drin â Na2Sn yn ysbeilio ROS a NO a gynhyrchwyd o adweithyddion cemegol yn effeithlon. Canfuwyd hefyd bod yr HSA wedi'i drin â Na2Sn yn atal synthesis melanin mewn celloedd melanoma B16 ac roedd yr ataliad hwn yn annibynnol ar nifer yr atomau sylffwr ychwanegol. Mewn celloedd melanoma B16, roedd yr HSA a gafodd ei drin â Na2Sn hefyd yn atal y lefelau ROS a NO a achosir gan ymbelydredd UV. Yn olaf, roedd yr HSA a gafodd ei drin gan Na2Sn yn atal synthesis melanin o L-DOPA a tyrosinase madarch ac yn atal maint agregu pigmentau melanin. Mae'r data hyn yn awgrymu bod HSA wedi'i drin â Na2Sn yn atal gweithgaredd tyrosinase ar gyfer synthesis melanin trwy ddau lwybr; trwy atal signalau ROS yn uniongyrchol a thrwy chwilio am NO. Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod gan HSA wedi'i drin â Na2Sn y potensial i fod yn ymgeisydd deniadol ac effeithiol i'w ddefnyddio fel cyfrwng gwynnu croen.

Mae Cistanche yn asiant gwynnu croen.
1. Rhagymadrodd
Mae arbelydru uwchfioled (UV) yn cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) sy'n achosi marwolaeth celloedd yn y pen draw [1]. Er mwyn amddiffyn y croen rhag niwed UV, mae melanin, pigment lliw tywyll, yn cael ei gynhyrchu gan felanocytes [2]. Er bod melanin yn hanfodol ar gyfer iechyd y croen, mae galw am baratoadau sborion melanin. Mae cloasma (melasma) yn gyflwr lle mae'r croen yn datblygu mannau afliwiedig sy'n cael eu hachosi gan orgynhyrchu melanin ac sy'n cael eu hystyried weithiau fel trosiad o heneiddio. Yn ogystal, mae atalyddion synthesis melanin yn gosmetigau poblogaidd ar gyfer bywiogi'r croen, yn enwedig mewn gwledydd Asiaidd [3].
Mae Tyrosinase yn cataleiddio cynhyrchu melanin o tyrosine trwy DOPA a dopaquinone mewn melanocytes [4]. Mae ei weithgaredd yn cael ei reoleiddio gan amrywiaeth o ffactorau megis signalau ERK1/2 ac Akt [5]. ROS megis
hydrogen perocsid a gynhyrchir gan arbelydru UV, yn actifadu tyrosinase ac yn hyrwyddo synthesis melanin mewn melanocytes [2]. Mae UV hefyd yn achosi cynhyrchu ocsid nitrig (NO) ac yn ysgogi gweithgaredd tyrosinase trwy cGMP [6], ail negesydd NO.
Ar y llaw arall, mae cyfansoddion thiol ag effaith gwrth-ocsidydd wedi'u defnyddio'n eang fel atchwanegiadau, asiantau radioprotection ac asiantau pyrm [7]. Mae cyfansoddion sy'n cynnwys thiol yn cael hunan-ocsidiad i ffurfio asid sylffonig, asid sylfenig ac asid sylffonig [8]. Mae Thiol hefyd yn chwilota NO trwy S-nitrosation [8]. Oherwydd yr effeithiau hyn, defnyddir cyfansoddion sy'n cynnwys thiol yn aml wrth drin cloasma [7,9]. Fodd bynnag, mae effaith gwynnu croen thiols yn wan iawn, mae galw am ROS mwy effeithiol a DIM cyfryngau sborion.
Yn ddiweddar, adroddwyd bod gan rywogaethau sylffwr adweithiol (RSS) gan gynnwys persulfide cystein effeithiau gwrthocsidiol cryfach na thiols. Mae RSS yn cynnwys grŵp thiol adweithiol [10] ac mae pKa y rhan fwyaf o RSS yn llawer is na'r grŵp thiols [11]. Felly, gall RSS ymateb yn effeithiol gyda ROS a NO a rhagwelir y bydd yn lleihau maint y cynhyrchiad melanin. Mae polysulfides sodiwm (Na2Sn), diallyltrisulfide (DATS) a dimethyltrisulfides (DMTS) yn cael eu defnyddio'n gyffredin fel rhoddwyr RSS [12]. Fodd bynnag, mae gan Na2Sn gyfradd cadw isel ar pH niwtral ac mae ganddo arogl annymunol. Yn ogystal, mae DATS a DMTS, sy'n cael eu cynhyrchu gan garlleg a winwns hefyd yn arogl ac mae eu potensial ar gyfer triniaethau o'r fath yn gyfyngedig [13]. At hynny, mae hanner oes Na2Sn yn fyr iawn mewn serwm ac, yn seiliedig ar fodelau in vivo, mae angen pigiadau lluosog er mwyn iddynt fod yn effeithiol. Felly, byddai datblygu systemau cyflwyno RSS newydd yn ddymunol iawn.
Albwm serwm dynol (HSA) yw'r protein mwyaf helaeth mewn serwm ac fe'i defnyddir yn eang fel cludwr cyffuriau oherwydd ei fiogydnawsedd a'i briodweddau cadw plasma hir [14,15]. Mae HSA yn cynnwys cyfanswm o 35 o weddillion Cys ac mae un ohonynt, Cys34, yn bresennol ar ffurf grŵp thiol rhad ac am ddim [16]. Weithiau mae Cys34 yn darged ar gyfer safle rhwymo cyffuriau, oherwydd ei grŵp thiol adweithiol [17,18]. Er enghraifft, ym mhresenoldeb nitrig ocsid (NO) y grŵp Cys34 thiol yw S-nitrosated. Fe wnaethom ddatgan yn flaenorol bod HSA nitrosedig S (SNO-HSA) yn caniatáu NA i'w gadw am gyfnodau hir mewn serwm [19]. Mae gan SNO-HSA amrywiol swyddogaethau biolegol, gan gynnwys effaith amddiffynnol yr afu yn erbyn isgemia / atgyfnerthiad [20] ac effeithiau atal tiwmor [21].
O ganlyniad, roeddem yn rhagdybio y gallai HSA gael ei ddefnyddio fel cludwr RSS (fel SNO-HSA) trwy S-sylffhydradiad Cys34-SH. Fel ffynhonnell polysylffwr, mae DATS a DMTS yn gyfyngedig oherwydd eu lipohiledd a'u hanweddolrwydd. Felly, defnyddiwyd Na2Sn (Na2S, Na2S2, Na2S3 a Na2S4) sydd ar gael yn fasnachol yn yr astudiaeth hon. Mae Ogasawara et al. albwmin serwm wedi'i baratoi'n flaenorol â sylffwr wedi'i adweithio â sodiwm sylffid (NaHS) trwy gymysgu'r adweithyddion yn syml [22]. Ychwanegwyd y sylffwr o'r NaHS at Cys34 ac roedd y paratoad dilynol yn amddiffyn niwed i'r afu a achoswyd gan berocsidiad lipid. Mabwysiadwyd y dull hwn ar gyfer paratoi RSS-ychwanegol-HSA gan ddefnyddio Na2Sn ar gyfer cyflwyno RSS.
Yn y gwaith hwn, gwnaethom adrodd ar y gwaith o baratoi HSA wedi'i drin â Na2Sn a'i ddefnydd fel system gyflwyno newydd o RSS. Dadansoddwyd y sylffwr ychwanegol trwy gyfrwng chwiliwr sylffwr sylffwr [23] a dileu sylffid o polysulfide [24]. Er mwyn gwerthuso effaith HSA wedi'i drin â Na2Sn ar wynnu croen, astudiwyd effaith yr HSA a driniwyd gan Na2Sn ar synth esis melanin gan ddefnyddio llinell gell melanoma B16.
2. Deunydd a dulliau
2.1. Defnyddiau
Prynwyd albwmin serwm dynol (HSA) gan KAKETSUKEN (Kumamoto, Japan) a chafodd holl samplau HSA eu dihysbyddu gan driniaeth siarcol. Prynwyd sodiwm sylffid a sodiwm tetrasulfide o Labordy DOJINDO (Kumamoto, Japan). Paratowyd chwiliedydd sylffwr sylffwr 4 (SSP4) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [23]. Prynwyd L-DOPA, glu- tathione, (DTNB), asid asgorbig a sodiwm adweithydd Griess dychanol (sulfanilamide, naphthylethylenediamine-HCl) gan Nakarai Chemicals (Kyoto, Japan). Prynwyd colofn dadhalwyn Sephadex G-25 (φ 1.6 × 2.5 cm) oddi wrth GE Healthcare (Kyoto, Japan). Cafwyd cyfrwng Eagle addasedig Dulbecco (DMEM) a 2,2-diphenyl-1-pi- crylhydrazyl (DPPH) gan Wako Pure Chemical (Osaka, Japan). Prynwyd tyrosinase madarch gan Sigma-Aldrich. Roedd pob cemegyn arall o'r radd orau a oedd ar gael yn fasnachol, a pharatowyd yr holl doddiannau mewn dŵr wedi'i ddadïoneiddio a dŵr distyll.

dyfyniad cistanche
2.2. Assay protein BCA
Mesurwyd crynodiadau protein gan ddefnyddio assay protein BCA. Deorwyd 10 μL aliquots o samplau a safonau albwmin serwm buchol (BSA) mewn 100 μL o byffer adwaith ar 25 gradd am 30 munud. Ar ôl yr adwaith, defnyddiwyd darllenydd micro-plât i fesur amsugnedd 540 nm. Defnyddiwyd BSA i adeiladu cromlin safonol.
2.3. Synthesis o Na2Sn wedi'i drin-HSA
Deorwyd HSA (300 μM) ag 1 mM o sodiwm polysulfides (Na2Sn) mewn PBS (pH 7.4) am 1 h ar 37 gradd . Ar ôl yr adwaith, tynnwyd gormodedd o polysulfides sodiwm trwy hidlo gel gyda cholofn Sephadex G-25.
2.4. Pennu cyfradd rhwymo sylffwr trwy ddull dileu ar gyfer sylffid o polysulfide (EMSP)
Paratowyd EMSP fel y disgrifiwyd yn flaenorol (3 × EMSP trwy ychwanegu 792 mg o asid L-ascorbig i 5 mL o 3 N o NaOH) [24]. Deorwyd samplau (7.5 μM, 133 μL) gyda 66.7 μL o 3 × EMSP am 3 h ar 37 gradd . Yna ychwanegwyd hydoddiant asetad sinc 1 y cant (600 μL) at yr ateb ail-weithredu, ac yna vortexing ar unwaith. Cafodd y samplau eu centrifugio ar 8,000 × g am 5 munud a'u golchi â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) ddwywaith. Ar ôl tynnu'r supernatants, ychwanegwyd dŵr wedi'i ddadïoneiddio a'i ddistyllu (200 μL) at y gwaddodion. Ar ôl ychwanegu asetad sinc 1 y cant (300 μL), 50 μL o 20 mM N, N-dimethyl-p-phenylenedia- mine a 20 mM FeCl3 yn 7.2 N HCl, deorwyd yr ateb am 30 munud ar 25 gradd. Cafodd samplau eu centrifugio ar 8000 × g am 1 munud a'u trosglwyddo i 96-blatiau ffynnon a mesurwyd yr OD ar 665 nm. Defnyddiwyd Na2S i adeiladu cromlin safonol.
2.5. Canfod sylffwr sylffwr gyda SSP4
Cafodd pob sampl (20 μM) ei deor â 5 μM o SSP4 mewn 1 mM Cetyltrimethylammonium Bromid / PBS (pH 7.4) am 10 munud ar 25 gradd. Ar ôl deori, mesurwyd y fflworoleuedd gan sbectroffotomedr (JASCO Corporation) gyda chyffro yn 457nm, allyriadau ar 490-535 nm.
2.6. Profion radical DPPH
Cymysgwyd DPPH (250 μM) mewn ethanol gyda'r un faint o glustogi MES (50 mM, pH 7.4). Ychwanegwyd HSA (40 μM) a driniwyd gan Na2Sn at y datrysiad DPPH hwn, a gafodd ei ddeor wedyn am 30 munud ar 25 gradd a mesurwyd amsugnedd y radicalau DPPH ar 540nm. Troswyd cyfraddau radical wedi'u sgwario gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol;
Radical wedi'i sgwario ( cant )=( Abssample-Abspbs )/ Abspbs × 100
2.7. DIM a dadansoddiad SNO
Deorwyd HSA a driniwyd gan Na2Sn (50 μM) â rhoddwr NOC7 (200 μM), am 30 munud ar 25 gradd . Ar ôl yr adwaith, mesurwyd y crynodiad o NO ac SNO gan assay Griess gyda mân addasiadau [25]. Paratowyd hydoddiant adweithydd Griess trwy gymysgu 0.1 y cant N-1- Naphtylethylene-diamide dihydrochloride ac 1 y cant sulfanilamide mewn 2 y cant o asid ffosfforig. Roedd y byffer adwaith yn cynnwys 0.1 M NaCl, 0.5 mM DTPA a 10 mM AcONa・AcOH (pH 5.5). Adweithiwyd samplau (20 μM) gyda hydoddiant adweithydd Griess (60 μL) mewn byffer adwaith (110 μL) gyda 3 mM HgCl2 mewn 10 mM Na Asetad (pH 5.5). Ar ôl deoriad 15 munud, mesurwyd amsugnedd 540 nm trwy gyfrwng darllenydd microplate. Cafodd y gymhareb NO/SNO sy'n weddill (y cant) ei chyfrifo a'i chymharu â gwerthoedd PBS ar gyfer y samplau.
2.8. Diwylliant celloedd
Darparwyd celloedd melanoma B16 gan Fanc Adnoddau Ymchwil Canser Japan (JCRB, Tokyo, Japan), a chawsant eu meithrin mewn DMEM yn cynnwys serwm buchol ffetws 10 y cant a datrysiad gwrthfiotigau. Tyfwyd celloedd gyda 37 gradd mewn aer llaith yn cynnwys 5 y cant o CO2 mewn deorydd (rhif cyntedd 10-20).
2.9. Cynhyrchu melanin
Cafodd celloedd melanoma B16 eu hadu mewn 24 o blatiau ffynnon mewn crynodiad o 2.5 × 104 cell/ffynnon a’u meithrin o dan 5 y cant o CO2 ar 37 gradd am 24 h. Cafodd samplau eu trin â thyrosin 0.4mM a 10mM NH4Cl mewn DMEM yn cynnwys 10 y cant FBS ac yna deorwyd o dan 5 y cant CO2 ar 37 gradd am 72 h. Ar ôl y deoriad, golchwyd y celloedd ddwywaith gyda PBS a'u diddymu yn 1 N NaOH (200 μL). Ar ôl deoriad 2 h ar 60 gradd, mesurwyd yr amsugniad (405 nm) trwy gyfrwng darllenydd plât micro.

Mae Cistanche yn atal cynhyrchu melanin.
2.10. Ymbelydriadau UV
Defnyddiwyd lamp UV llaw i arbelydru'r samplau bellter o 5 cm oddi wrth blât y ffynnon. Mae'r lamp UV hon yn darparu dwyster UV o 614 neu 743 μW/cm2 yn y drefn honno gydag ymbelydredd 254 nm neu 365 nm o bellter o 5 cm.
2.11. Roedd gweithgarwch chwilota Na2S4-wedi trin HSA yn erbyn ROS mewngellol, NO, RSS
Mesurwyd ROS a NO mewn celloedd melanoma B16 gan bob un o'r chwilwyr fflworoleuedd, CM-H2DCF-DA a DAF-FM-DA, yn y drefn honno. Cafodd celloedd melanoma B16 eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon ar grynodiad o 1 × 104 o gelloedd/ffynnon a'u meithrin mewn 37 gradd, 5 y cant CO2 am 24 awr. Ar ôl diwyllio, tynnwyd y cyfryngau a'u disodli gan CM-H2DCF-DA (5 μM) neu DAF-FM-DA (10 μM) yn PBS. Cymerwyd y stilwyr gan y celloedd trwy eu deor ar 37 gradd am 30 munud. Ar ôl yr adwaith, tynnwyd yr uwch-natants, gwanhawyd y samplau yn PBS a mesurwyd y fflworoleuedd ar unwaith. Cafodd celloedd eu pelydru gan lamp UV am 15 munud. Ar ôl yr arbelydru, mesurwyd y dwyster fflworoleuedd (Ex. 485 nm, Em. 535 nm) trwy gyfrwng darllenydd micro-plât fflworoleuedd.
2.12. Gweithgaredd tyrosinase madarch a agregu melanin
Paratowyd atebion Tyrosinase a L-DOPA yn PBS (pH 7.4) yn union cyn yr assay. Defnyddiwyd Tyrosinase, wedi'i ynysu oddi wrth fadarch, i archwilio gweithgaredd ataliol HSA wedi'i drin â Na2Sn. Cymysgwyd cyfran 20 μL o tyrosinase madarch (537 U/mL) a 100 μL o HSA wedi'i drin â Na2Sn (40 μM) yn dda â PBS (60 μL) mewn 96 o blatiau ffynnon a 20 μL o L-DOPA (5 mM) yn yna ychwanegodd. Ar ôl deoriad 30 munud, dadansoddwyd lefel y melanin wedi'i syntheseiddio trwy fesur yr OD 490 nm. Ar gyfer assaying melanin agregu, centrifuged y cymysgedd ar 20,000 g, 15 munud am 3 h. Mae'r saeth wen yn dangos y deunydd cyfanredol. Mesurwyd melanin heb ei agregu yn yr uwchnatant ar OD o 490 nm.
2.13. Profion diogelwch
Paratowyd yr hufen amserol a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon trwy gymysgu dŵr (30 mL) Jojoba Oil (15 mL) a 5 g o gwyr emwlsio ar 60 gradd . Ar ôl oeri, roedd y Na2S4-trin HSA (20 μM) a'r ataliad dilynol wedi'u cymysgu'n dda. Cynhaliwyd y Prawf Llid y Croen yn dilyn Canllaw Prawf 439 yr OECD gan ddefnyddio'r LabCyte Epi-Model (model croen dynol diwylliedig 3D).
2.14. Dadansoddiad ystadegol
Gwerthuswyd arwyddocâd ystadegol y data a gasglwyd gan ddadansoddiad ANOVA ac yna dull Newman-Keuls am fwy na 2 fodd. Gwerthuswyd y gwahaniaethau rhwng y grwpiau gan brawf-t Myfyrwyr. Ystyriwyd bod P < 0.05="" yn="" ystadegol="">


Ffig. 1 .Rhwymo polysylffwr i HSA trwy ddeor â sodiwm polysulffitde.
3. Canlyniadau
3.1. Paratoi HSA wedi'i sylffadu gan S
Paratowyd HSA wedi'i drin â Na2Sn o HSA a oedd wedi'i ddeor â Na2Sn ac a gafodd ei hidlo'n gel ar ôl yr adwaith. Er mwyn asesu faint o sylffwr sylffwr yn y sampl, defnyddiwyd EMSP, dull meintiol newydd a ddatblygwyd gennym yn flaenorol [24]. Felly, paratowyd HSA a driniwyd gan Na2S o HSA a Na2Sn trwy ganiatáu i'r adweithyddion adweithio am 1 awr ar 37 gradd . Caniatawyd gwahanol symiau o sodiwm poly-sylffidau i adweithio â HSA. Yna, deorwyd y samplau HSA â hydoddiant EMSP, a baratowyd ar adeg eu defnyddio, am 3 h ar 37 gradd . Yn seiliedig ar y dadansoddiadau EMSP, cynyddodd lefel y sylffwriad S yn annibynnol ar faint o sylffwr (Ffig. 1A). Ar y llaw arall, fel y dangosir yn Ffig. 1B, roedd y driniaeth Na2S3- neu Na2S{4-wedi gwella dwyster fflworoleuedd SSP4 (chwiliwr fflworoleuedd ar gyfer sylffwr sylffwr) o gymharu â'r Na2S- neu Na2S{{24 }}triniaethau, sy'n awgrymu bod SSP4 o bosibl wedi adweithio â polysulfide y protein mewn modd aflinol (Ffig. 1 B).
3.2. Effaith gwrthocsidiol a DIM effaith ataliol HSA wedi'i drin â Na2S
Fe wnaethom ddatgan y byddai HSA wedi'i drin â Na2Sn yn atal cynhyrchu melanin oherwydd ei weithgaredd gwrthocsidiol. Felly, cynhaliwyd prawf radical DPPH [26,27] i ddadansoddi'r gweithgaredd gwrthocsidiol in vitro. O ganlyniad, mae'r Na2Sn-drin HSA Roedd cryn dipyn yn uwch con- centration o sylffwr ychwanegol (Ffig. 2 A). Er mwyn egluro effaith NO, cafodd NOC7 (rhoddwr NO) ei ddeor ar y cyd â Na2S4-wedi trin HSA ar 25 gradd . Ar ôl cyfnod magu o 30 munud, cafodd y crynodiad NO sy'n weddill ei feintioli gan assay Griess. Fel y gwelir ym marrau caeedig Ffig. 2B, roedd yr HSA a driniwyd gan Na2S wedi ysbeilio llawer mwy o NO o'i gymharu â'r rheolydd a'r HSA (Ffig. 2B). Mae'n hysbys bod mercwri elfennol (Hg) yn lleihau SNO ac yn rhyddhau NO2-. Pan ychwanegwyd Hg at hydoddiant o Na2S a driniwyd gan HSA, rhyddhawyd NO2-, sy'n awgrymu bod yr HSA a oedd wedi'i drin gan Na2S wedi'i ysbwriel trwy S-nitrosation.


Ffig. 2 .Priodweddau gwrthocsidiol Na2Sn-trin HSA.
3.3. Effaith atal melanin HSA wedi'i drin â Na2Sn
Cafodd celloedd melanoma llygod B16 eu meithrin a hyrwyddwyd synthesis melanin trwy ychwanegu tyrosin i'r cyfryngau. Fel y dangosir yn Ffig. 3, roedd yr HSA a driniwyd gan Na2Sn yn atal synthesis melanin ac roedd yr ataliad yn dibynnu ar y cynnwys sylffwr. Dangosodd delweddau celloedd o gelloedd melanoma B16 ar ôl cymhwyso'r HSA a driniwyd gan Na2Sn hefyd fod HSA a driniwyd gan Na2Sn wedi lleihau cymhareb cynhyrchu melanincelloedd positif (Ffig. 3).
3.4. Effaith gwrthocsidiol Na2S4-trin HSA ag arbelydru UV
Er mwyn archwilio a oedd yr HSA a driniwyd gan Na2Sn yn atal ffurfio ROS a achosir gan UV neu NO, cynhaliwyd prawf straen ocsideiddiol gan ddefnyddio celloedd melanoma B16 fel modelau. Mesurwyd cynhyrchiad ROS gan Na2S4-trin HSA mewn celloedd melanoma B16 trwy arbelydru gyda 2 ddyfais UV wahanol am 15 munud gan CMH2-DCF-DA. Mae'r canfyddiadau'n dangos bod yr HSA a driniwyd gan Na2S wedi achosi gostyngiad sylweddol yn fflworoleuedd CMH2-DCF-DA i PBS a HSA trwy arbelydru ar 254 nm a 365 nm (Ffig. 4AB). I'r gwrthwyneb, roedd yr HSA a gafodd ei drin gan Na2S hefyd yn atal cynhyrchu NO mewn celloedd melanoma B16 trwy arbelydru â 254 nm UV (Ffig. 4CD). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod HSA wedi'i drin gan Na2Sn yn atal synthesis melanin trwy atal ROS a NO a gynhyrchir gan arbelydru UV.
3.5. Ataliad uniongyrchol o agregiad tyrosinase a melanin gan HSA wedi'i drin â Na2Sn
Mae'n hysbys bod rhai asiantau gwrth-melanin masnachol yn atal gweithgaredd tyrosinase yn uniongyrchol. Felly, gwnaethom brofi a oedd yr HSA a gafodd ei drin gan Na2Sn wedi newid gweithgaredd tyrosinase. Mae'r canfyddiadau yn dangos bod y Na2Sn- trin HSA llesteirio madarch tyrosinase i raddau mwy na heb ei drin HSA (Ffig. 5 A). Ar ôl cael ei gynhyrchu, mae melanin yn hawdd dadelfennu agregu ac yn ysgogi ffurfio medwla [28]. Felly, aethom i'r afael â'r mater nesaf ynghylch a yw HSA wedi'i drin â Na2Sn yn atal agregu melanin. O ganlyniad, pan ddeorwyd tyrosinase a L-DOPA gyda'i gilydd am 3 h, daeth pigmentau melanin yn agregedig, ond rhwystrodd yr HSA a driniwyd gan Na2Sn y agregiad (Ffig. 5 B). Ar y naill law, canfuwyd bod HSA hefyd yn atal agregu, gan nodi y gallai HSA ei hun atal rhwymo L-DOPA i tyrosinase.

Ffig. 3.Effect o Na2Sn-trin HSA ar synthesis melanin mewn celloedd melanoma B16.
3.6. Prawf diogelwch HSA wedi'i drin â Na2Sn gan ddefnyddio croen dynol meithrin 3D
Perfformiwyd profion llid y croen ar gyfer HSA a driniwyd gan Na2S gan ddefnyddio celloedd croen dynol 3D meithrin yn unol â chanllawiau'r OECD. O ganlyniad, ni chafodd nifer y celloedd sydd wedi goroesi eu lleihau gan Na2S4-wedi trin HSA â/heb ddefnyddio hufen amserol (Ffig. 6A). Datgelodd y defnydd o becyn canfod sytowenwyndra LDH hefyd nad oedd celloedd croen wedi'u difrodi gan yr HSA a driniwyd gan Na2S (Ffig. 6B). Roedd y data hyn yn dangos bod HSA wedi'i drin â Na2Sn yn ddiogel iawn i'w ddefnyddio yn erbyn croen dynol o dan y crynodiadau a archwiliwyd yn yr astudiaeth hon.

Ffig. 4.ROS a DIM sborion effects o Na2S4-trin HSA o dan arbelydru UV.
4. Trafodaeth
Mae melanin yn cael ei syntheseiddio gan ocsidiad tyrosin. Mae tyrosine yn cael ei ocsidio i L-DOPA, ac yna dopaquinone trwy weithred tyrosinase. Mae dopaquinone yn cael ei ocsidio'n ddigymell i melanin. Mae melanin yn ysgogi ffurfio pigmentau du a brychni haul, ond mae hefyd yn chwarae rhan wrth amddiffyn y croen rhag cael ei niweidio gan ymbelydredd UV. Mewn croen dynol, mae melanocytes yn cynhyrchu ROS a NO o'u hysgogi gan ymbelydredd UV [2,29,30]. Mae ROS yn hyrwyddo synthesis melanin trwy actifadu tyrosinase trwy weithred ATP synthase, hydroxylase phenylalanine, a ffosfforyleiddiad MAPKs [31,32]. Mae NO yn actifadu tyrosinase trwy gynyddu lefel cellog cGMP [6]. Felly, mae gwasgarwyr ROS a NO yn cael eu hystyried yn gyfryngau gwrth-melanogenesis. Yma, buom yn ymchwilio i effaith synthesis gwrth-melanin HSA a driniwyd gan Na2Sn. Roedd HSA wedi'i drin â Na2Sn yn atal yn gryf lefelau cellog ROS a NO a gynhyrchir gan ymbelydredd UV (Ffig. 4). Ar ben hynny, Na2Sn-drin HSA wedi cael effaith uniongyrchol ar atal y camau gweithredu o tyrosinase (Ffig. 5 A) a agregu melanin (Ffig. 5 B). Nid oeddem yn gallu egluro'r mecanwaith ar gyfer sut y trosglwyddwyd sylffwr o'r HSA a gafodd ei drin â Na2Sn i gell. Felly, mae natur sut mae effeithiau uniongyrchol swyddogaeth HSA a driniwyd gan Na2Sn yn parhau i fod yn aneglur. Mae Yamashita et al. dangos bod dopaquinone yn rhwymo i broteinau thiol trwy weddillion cystein [33]. Gyda'i gilydd, gall atal agregu melanin gan HSA a HSA wedi'i drin â Na2Sn hefyd gynnwys ffurfio bondiau disulfide â dopaquinone neu felanin. Ar y llaw arall, roedd ataliad tyrosinase yn dibynnu ar gynnwys sylffwr ychwanegol (Ffig. 5A). Mae'n hysbys bod GSH yn rhwymo tyrosinase ac yn lleihau ei weithgaredd [34]. Oherwydd bod gan cystein sylfhydradedig S adweithedd cryfach na cystein arferol [11], gall glutathione persulfide (GSSH) atal gweithrediad tyrosinase yn fwy na GSH. Mae angen astudiaethau pellach ynghylch a yw HSA a driniwyd gan Na2Sn yn cynyddu GSSH mewngellol yn y dyfodol.
Mae ROS yn cael eu cynhyrchu gan arbelydru UV neu straen allanol sy'n achosi arwyddion o heneiddio, nid yn unig ar ffurf synthesis melanin ond hefyd gan ymddangosiad crychau a chroen sagging, a achosir gan ddifrod DNA a ffurfio colagen traws-gysylltiedig. Mae'n hysbys hefyd bod ROS yn ffactor gwaethygu mewn gwahanol fathau o lid fel pimples a soriasis. Mae asiantau gwynnu croen amrywiol, megis asid tranexamic [35] ac arbutin [36], wedi'u cynllunio i fynd i'r afael â'r materion hyn. Fodd bynnag, mae'r cyfansoddion hyn yn atal synthesis melanin yn unig ac nid ydynt yn cael unrhyw effaith ar straen ocsideiddiol. Felly, roedd risgiau gwenwyndra a achosir gan ROS yn parhau. Mantais defnyddio HSA wedi'i drin â Na2Sn yw ei fod yn chwilio am ROS yn effeithlon (Ffig. 2 a 4).
Mae hydrogen sylffid wedi'i astudio fel trydydd moleciwl hanfodol ar ôl ocsid nitrig a charbon monocsid. Dangoswyd bod effeithiau therapiwtig hydrogen sylffid yn berthnasol i drin isgemia / atlifiad [37], atherosglerosis [38], sepsis [39] a gwenwyndra uchel mewn braster a achosir gan ddeiet [40]. Yn ogystal, mae gan hydropersulfide weithgaredd uwch na hydrogen sylffid. Er enghraifft, mae Na2S4 yn dadwenwyno methyl mercwri yn effeithiol ac yn atal gwahaniaethu celloedd niwroblastoma, tra nad yw Na2S yn [12,41]. Felly, nid yn unig effaith gwynnu croen ond hefyd effeithiau cadarnhaol eraill HSA wedi'i drin Na2Sn yn bosibl.
I gloi, adroddwyd ar ddatblygiad system ddosbarthu RSS newydd gan ddefnyddio albwmin serwm fel cludwr sefydlog. Roedd sylffwr adweithiol, o'i gyfuno â HSA, yn cael effaith gwrthocsidiol gryfach na HSA ac yn atal synthesis melanin mewn celloedd melanoma. Mae mecanwaith gwrth-melanogenesis yn cynnwys nid yn unig sborion ROS a NO, ond hefyd atal gweithgaredd tyrosinase a chydgrynhoi melanin. Felly, mae gan HSA wedi'i drin â Na2Sn botensial sylweddol i'w ddefnyddio fel asiant gwynnu croen diogel.
Dyma ein cynnyrch.
Am fwy o wybodaeth, cliciwch ar y llun.

