Sgrin Newydd ar gyfer Mynegiant o Reolyddion Protein Telomerig TRF2 Moleciwlau Bach a Nodwyd Sy'n Amharu Ar Imiwnedd Dibynnol TRF2 A Thwf Tiwmor

Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth

Crynodeb Syml:Mae'r protein telomerig TRF2 (ffactor ail-rwymo Telomeric 2) yn cael ei uwchreoleiddio mewn canserau dynol ac yn gysylltiedig â phrognosis gwael. Mae priodweddau oncogenig TRF2 yn dibynnu ar ei rôl amddiffynnol telomere gynhenid, ond hefyd ar effeithiau cell-extrinsic trwy weithgareddau gwrthimiwnedd ac angiogenig. Felly, mae targedu TRF2 yn ymddangos fel strategaeth gwrth-ganser therapiwtig addawol. Yn yr astudiaeth hon, rydym wedi datblygu dull seiliedig ar gelloedd i sgrinio ar gyfer atalyddion TRF2 sy'n ein galluogi i nodi dau gyfansoddyn sy'n pylu priodweddau pro-oncogenig TRF2 in vivo.

Crynodeb: Mae ffactor ail-rwymo telomerig 2 (TRIF2) yn is-uned o'r cymhlyg protein lloches, sy'n clymu ac yn amddiffyn telomeres rhag actifadu ymateb difrod DNA (DDR) digroeso. Mae mynegiant TRF2 yn chwarae rhan ganolog mewn heneiddio a chanser, yn cael ei isreoleiddio yn ystod heneiddedd cellog a gor-fynegi yn ystod oncogenesis. Mae canserau sy'n gorfynegi TRF2 yn aml yn dangos prognosis gwael. Mewn celloedd canser, mae TRF2 yn chwarae swyddogaethau lluosog, gan gynnwys amddiffyn telomere a rolau ymreolaethol nad ydynt yn gelloedd, hyrwyddo neo-angiogenesis a gwrthimiwnedd.fitamin piwritaniaid cRydym yn cyflwyno yma strategaeth sgrinio wreiddiol, sy'n galluogi adnabod moleciwlau bach sy'n lleihau neu'n cynyddu mynegiant TRF2. Trwy sgrinio llyfrgell fechan o gyffuriau a gymeradwyir gan yr Asiantaeth Bwyd a Chyffuriau (FDA), fe wnaethom nodi dau foleciwl (AR-A014418 ac alexidine-2HCl) a oedd yn amharu ar dwf tiwmor, neo-angiogenesis ac imiwnedd trwy is-reoleiddio mynegiant TRF2 mewn llygoden model xenograft. Mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi'r strategaeth cemotherapiwtig o is-reoleiddio mynegiant TRF2 i drin tiwmorau dynol ymosodol a dilysu assay sy'n seiliedig ar y gell hon sy'n gallu sgrinio ar gyfer moleciwlau gwrth-ganser a gwrth-heneiddio posibl trwy fodiwleiddio lefelau mynegiant TRF2.

Geiriau allweddol:TRF2; canser; heneiddio; assay sgrinio yn seiliedig ar gelloedd; neo-angiogenesis; atal imiwnedd

Cliciwch yma i wybod mwy

1. Rhagymadrodd

Mae telomeres yn strwythurau niwcleoprotein arbenigol a geir ar bennau cromosomau llinol sy'n cael eu rheoleiddio gan ffactorau sy'n gysylltiedig â thelomeras megis telomerase, cymhlygion protein lloches ac RNA ailadroddol telomerig nad yw'n codio [1]. Pan gaiff ei reoleiddio'n gywir, mae telomeres yn amddiffyn cromosomau rhag ansefydlogrwydd a heneiddedd. Mae byrhau DNA telomerig yn digwydd fel rhan o ddatblygiad ffisiolegol a heneiddio wedi'i raglennu [2]. Fodd bynnag, mae byrhau DNA telomere gormodol yn gyrru syndromau progeroid prin, megis dyskeratosis congenita [3]. Ar ben hynny, mae taleithiau telomere wedi'u dadreoleiddio yn gysylltiedig â nifer o afiechydon sy'n gyffredin ledled y boblogaeth gyffredinol, gan gynnwys bron pob math o ganser a sawl clefyd dirywiol [4]. Felly, mae datblygu triniaethau ffarmacolegol i dargedu cydrannau telomere penodol yn addawol i atal a thrin clefydau o'r fath.

Cyn belled ag y mae telomere a chanser yn y cwestiwn, mae pwyntiau gwirio ymateb difrod DNA hanfodol (DDR) weithiau'n methu; gall hyn arwain at fyrhau DNA telomerig yn ormodol ac ad-drefnu cromosomau afreolaidd, a all yn ei dro gyfrannu at oncogenesis. Ar ben hynny, mae dadreoleiddio telomerase yn ddigwyddiad allweddol yn natblygiad tua 90 y cant o'r holl ganserau, gan y gall hyn roi twf diderfyn i gelloedd canser [5]. Am y rheswm hwn, mae ataliad telomerase wedi bod yn darged i sawl astudiaeth sy'n ceisio datblygu triniaethau canser [6]. Er gwaethaf cynnydd diweddar, mae rhai cyfyngiadau i'r defnydd clinigol o gyffuriau gwrth-telomerase. Er enghraifft, er mwyn atal amlhau celloedd canser, mae'n rhaid cyrraedd hyd DNA telomerig hollbwysig, a chollir effeithiau gwrth-oncogenig telomeres byrrach yn absenoldeb y genyn atalydd tiwmor p53 [7,8]. Mae'r cyfnod oedi hwn yn lleihau effeithiolrwydd therapiwtig ac yn cynyddu sgîl-effeithiau o blaid heneiddio trwy gyfyngu ar adnewyddu celloedd a ffafrio actifadu mecanweithiau ymestyn telomere amgen sy'n seiliedig ar ailgyfuno [9,10].sistancheFelly, efallai y bydd strategaethau gwrth-telomerase yn fwy addas ar gyfer targedu celloedd canser sydd eisoes yn cynnwys telomeres byr critigol [11].

Yn ogystal â thelomerase, mae newidiadau yn y mynegiant a gweithgareddau is-unedau cymhleth lloches (TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 a POT1) yn ymwneud â tumorigenesis, ac mewn rhai achosion yn annibynnol ar hyd telomere [12-16]. Felly, gallai targedu lloches ar gyfer triniaeth canser fod yn ddewis arall diddorol i ymyriadau gwrth-telomerase. Mae'r is-uned TRF2 lloches yn cynrychioli ymgeisydd diddorol; Mae TRF2 yn cael ei or- fynegi mewn sawl malaenedd dynol, mewn canser a chelloedd fasgwlaidd ac mae hyn fel arfer yn gysylltiedig â phrognosis gwael [17-20]. Yn nodedig, gall gorfynegiant TRF2 hyrwyddo tumorigenesis nad yw'n gell yn annibynnol, gan arwain at imiwnedd a neo-angiogenesis[13,18-20]Yn benodol, mae dadreoleiddio TRF2 yn creu micro-amgylchedd gwrthimiwnedd cryf. Trwy newid mynegiant proteoglycanau sylffad heparan, mae TRF2 yn recriwtio ac yn actifadu celloedd atal sy'n deillio o myeloid (MDSCs) yn uniongyrchol trwy lwybr TLR2 [21]. Er bod gorfynegiant TRF2 mewn celloedd canser yn atal recriwtio celloedd NK yn gryf yn y micro-amgylchedd tiwmor trwy reoleiddio synthesis HSPG [13], mae actifadu MDSC TLR2 a achosir gan orfynegiant TRF2 yn arwain at ataliad pwerus o imiwn-wyliadwriaeth celloedd NK gyda gostyngiad cryf. o ddirywiad celloedd NK, cynhyrchu a lladd IFNgamma [21].beth yw cistancheFelly, mae gorfynegiant TRF2 yn pylu'n gryf yng nghyfnod cynnar imiwn-wyliadwriaeth gwrth-tiwmor trwy atal recriwtio celloedd NK yn uniongyrchol ac yn anuniongyrchol ymarferoldeb celloedd NK trwy siapio micro-amgylchedd gwrthimiwnedd sy'n ddibynnol ar MDSC. O ganlyniad, gallai targedu TRF2 mewn canserau fod yn strategaeth aml-draw werthfawr trwy brosesau ymreolaethol celloedd a di-gelloedd trwy hyrwyddo heneiddedd yn ogystal ag amharu ar neo-angiogenesis a dianc imiwn.

gall cistanche gwrth-heneiddio

Hyd yn hyn, mae pob un o'r cyfansoddion bach a nodwyd sy'n targedu TRF2 yn amharu ar ei allu i amddiffyn pennau cromosom rhag DDR ac felly gyda sgîl-effeithiau posibl o blaid heneiddio [22]. Dangosodd ein gwaith blaenorol y gall gostyngiad rhannol mewn mynegiant TRF2 wrthdroi tiwmoredd mewn modelau llygoden trwy effeithiau ymreolaethol nad ydynt yn gelloedd, heb achosi DDR[13]. Fe wnaethom felly resymu y gallai canolbwyntio ar leihau TRF2 gormodol mewn canserau o ganlyniad i’w orfynegiant fod yn strategaeth ddiddorol i drin canser heb sgîl-effeithiau o blaid heneiddio. Yn yr astudiaeth hon, rydym yn cyflwyno llwyfan sgrinio gwreiddiol i nodi cyfansoddion bach sy'n targedu sefydlogrwydd TRF2. Rydym yn dangos bod dau drawiad uchaf wedi atal gweithgaredd tiwmorigenig gorfynegiant TRF2. Dangosodd yr astudiaeth hon y gellir modiwleiddio mynegiant TRF2 yn ffarmacolegol a bod ein asesiad sgrinio yn ddull dibynadwy ar gyfer dewis cyffuriau sy'n gallu modiwleiddio lefelau mynegiant TRF2, gyda phriodweddau gwrth-ganser a gwrth-heneiddio posibl.

2. Deunyddiau a Dulliau 2.1.Cells

Tyfwyd celloedd aren embryonig dynol (HEK)293-T (ATCC CRL-1573) a chelloedd BJ-HELTRas[13] yng Nghanolig Eryr Addasedig Dulbecco (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, Ffrainc) wedi'i ategu â Serwm llo ffetws 10 y cant (FCS), 100 IU/mL penisilin a streptomycin 100ug/ml (Invitrogen, Cergy Pontoise, Ffrainc).

2.2.SDS-PAGE a Western Blotting

Paratowyd cyfanswm y lysates celloedd, wedi'u gwahanu gan electrofforesis a'u blotio fel y disgrifiwyd yn flaenorol [14]. Yn gryno, cynaeafwyd celloedd a'u gosod mewn byffer lysis (8.76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7.2,0.1 y cant SDS,0.1 y cant Triton X -100,10 g/L sodiwm deoxycholate, 5 mM asid ethylenediaminetetraasetig (EDTA), 1{{50}} ug/mL leupeptin, 1 mM AEBSF a 19 ug/mL aprotinin). Yna cafodd samplau eu titradu gan ddefnyddio pecyn assay protein BCA (Interchim, Monlucon, Ffrainc). Cynheswyd samplau (60 ug/lôn) ar 95 gradd am 5 munud mewn byffer llwytho (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 y cant SDS, 0.1 y cant bromophenol glas, 10 y cant glyserol pH 6.8). Yna llwythwyd samplau ar geliau polyacrylamid 10 y cant a'u rhedeg am 45 munud ar 160 V. Yna trosglwyddwyd proteinau i bilenni Immobilon-FL (Millipore, Upstate Efrog Newydd, UDA) gan ddefnyddio Trans-Blot SD Semi-Sych Trosglwyddo Cell Trosglwyddo Electrofforetig (Bio- Rad, Hercules, CA, UDA).Cafodd pilenni eu rhwystro am 1 h mewn byffer Intercept Blocking (LI COR, Lincoln, NE, USA) cyn deoriad dros nos ar 4 gradd gyda chymysgedd o wrthgyrff cynradd (mouselgGl gwrth-TRF2 wedi'i wanhau yn 1: 250;a chwningen IgGanti-Beta-actin wedi'i wanhau ar 1:10,000) mewn byffer Intercept Blocking sy'n cynnwys 0.5 y cant Tween20. Ar ôl cael eu golchi yn PBS 0.1 y cant Tween20, deorwyd pilenni am 1 h ar dymheredd ystafell mewn byffer blocio Intercept yn cynnwys 0.25 y cant Tween20 gyda chymysgedd o wrthgyrff eilaidd: geifr gwrth-lygoden IRDye 680 ar gyfer gwrthgorff gwrth-TRF2 a gwrth-gwningen gafr IRDye 800CW ar gyfer gwrthgorff gwrth-Beta-actin (1:15,000 gwanhau).Cistanche gwrth heneiddioMae gwrthgyrff eilaidd cynradd ac IRDye a ddefnyddiwyd wedi'u rhestru isod yn y tabl gwrthgyrff (Tabl 1). Yn olaf, delweddwyd bandiau protein gan ddefnyddio system ddelweddu LiCor Odyssey 9120 (LI-COR). Mesurwyd mynegiant TRF2 trwy normaleiddio dwyster band TRF2 i ddwyster y band actin a'r cefndir.

2.3.Strategaeth Clonio

Cafodd y dilyniant cDNA TRF2 dynol ei glonio rhwng safleoedd cyfyngu BamHI / BclI o plasmid lentiviral SFFV-GPR sy'n ddeilliad HIV-SFFV-GFP-WPRE [23]. Mae plasmid SFFV-GPR yn cynnwys hyrwyddwr firws sy'n ffurfio ffocws dueg (SFV) sy'n rheoli genyn polycistronig GPR sy'n cynnwys dilyniannau cDNA ar gyfer protein fflwroleuol gwyrdd (GFP), protein ymwrthedd puromycin a phrotein fflworoleuol Tag-coch (RFP)-T (S158T Treiglad Tag -RFP), pob un wedi'i wahanu gan ddilyniannau E2 a T2 Piconaviridae. Mewnosodwyd hTRF2 cDNA yn rhanbarth C-terminal RFP-T, er mwyn galluogi mynegiant protein ymasiad RFP-TRF2.

2.4.Cynhyrchu Lentivirus

Ar gyfer cynhyrchu lentivirus, cafodd 5 × 10* HEK 293-gelloedd T eu trawsyrru gyda 8.6 ug o SFFV-GPR neu RFP-TRF gwag2-gan fynegi fector SFFV-GPR,8.6 ug o'r Grawys -Delta 8.91 a 2.8 ug o VSV-g trwy drawsnewidiad calsiwm ffosffad-gyfryngol. Cafodd celloedd trawslif eu meithrin mewn DMEM ynghyd â 10 y cant FCS ar 37 gradd gyda 5 y cant o CO2 mewn 10-cm dysglau. Casglwyd uwchnatyddion a oedd yn cynnwys y firysau newydd eu hadeiladu ar ôl 48 awr, yna eu pasio trwy hidlydd Millipore 0.45-μm. Ar ôl titradiad firws, defnyddiwyd cymhareb 1∶1 （firws∶cell） i heintio llinell gell BJ-HELTRas, a ddewiswyd am ei wrthwynebiad i ddiffygion TRF2[13].cistanche benefíciosYna cafodd clôn a fynegodd GFP a'r protein RFP-TRF2 ymdoddedig i lefelau cymedrol ei ynysu gan ddidoli celloedd wedi'i actifadu gan fflworoleuedd (FACS).

2.5.Sgrinio Sytometreg Llif

Cafodd celloedd llinell glonaidd BJ-HELTRas sy'n cynnwys y fector SFFV-GPR ac sy'n mynegi'r protein ymasiad RFP-TRF2 eu meithrin mewn 96-platiau ffynnon mewn cyfrwng DMEM wedi'u hategu â 10 y cant FCS ac 1 y cant penisilin/streptomycin. Ar ôl 24 h o driniaeth â chyffuriau, cafodd celloedd eu trypsineiddio wedyn a'u golchi mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) yn cynnwys 0.5 mM EDTA a 2 y cant FCS cyn eu gosod â 0.5 y cant o fformaldehyd (FA). Yna cafodd celloedd sefydlog eu darostwng i lifo sytometreg gan ddefnyddio samplwr trwybwn uchel FacsCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

2.6.Adwaith Cadwyn Polymeras Meintiol Amser Real (RT-qPCR)

Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu gan ddefnyddio RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, yr Iseldiroedd). Perfformiwyd trawsgrifiad gwrthdro gan ddefnyddio trawsgrifiad gwrthdro Superscript II (Invitrogen) gydag 1 ug o gyfanswm RNA. Roedd mynegiant pob genyn wedi'i normaleiddio i fynegiad GAPDH. Defnyddiwyd y paent preimio canlynol: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC{8}';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDH Rv 5'-CCGTTCAACCAACCCCTC{8}'; 14}}. 2.7.AlamarGlas

Mewn 96-plât gwaelod gwastad, cafodd 5 × 103 o gelloedd y ffynnon eu hadu mewn 200 uL DMEMsup-ychwanegol gyda 10 y cant FCS. Am 24 awr ar ôl triniaeth cyffuriau, ychwanegwyd 10 uL o AlamarBlue (Bio-Rad) a mesurwyd amsugnedd ar 570 nm a 600 nm am 36 h mewn darllenydd plât Nano Spectrostar (BMGLabtech, Ortenberg, yr Almaen). Penderfynwyd ar ganran lleihau ocsidiad AlamarBlue fel y disgrifiwyd gan y gwneuthurwr.

2.8.Anifeiliaid

Perfformiwyd arbrofion ar 8- i 12-llygod benywaidd noethlymun NMRI wythnos oed o Janvier Labs (Ffrainc). Cynhaliwyd yr holl arbrofion llygoden yn unol â chanllawiau sefydliadol lleol a rhyngwladol ac fe'u cymeradwywyd naill ai gan Bwyllgor Gofal Anifeiliaid yr IRCAN a'r rhanbarthol (CIEPAL Cote d'Azur #187 a #188) a chenedlaethol (Gweinyddiaeth Ymchwil Ffrainc #03482.01/02482.2 a #02973.01/02973.2)awdurdodau.

2.9.Arbrofion Twf Tiwmor

Chwistrellwyd pob llygoden noethlymun NMRI yn isgroenol yn y cefn gyda chelloedd 1 x 106 BJ-HELTRas wedi'u hatal mewn 100 μL o lygod PBS (n{4}} fesul grŵp). Cafodd y llygod eu trin ar ddiwrnodau 16, 18, 20 a 22 gyda phigiadau mewnperitoneol o 100 uL o DMSO (45 y cant), alexidine-2HCl (1 mg/kg) neu AR-A014418(5 mg/kg), yna dilynwyd hyn hyd at ddiwrnod 26. Aseswyd ymddangosiad y tiwmor gan grychguriad bob dydd. Roedd maint tiwmor yn cael ei fesur bob 2-3 diwrnod gan ddefnyddio caliper. Yna penderfynwyd cyfaint tiwmor gan ddefnyddio'r fformiwla hemi-ellipsoid: π × (L × 1 × h) / 6, lle mae L yn cyfateb i'r hyd, I i'r lled ac h i uchder y tiwmor, yn y drefn honno.

2.10.Matrigel Plygiau Profion

Cafodd celloedd BJ-HELTR eu trin â DMSO (1 y cant), alexidine-2HCl (1 uM) neu AR-A014418 (10 μM) am 2 ddiwrnod. Yna, cafodd 100 μL o gelloedd 1 × 10 gradd wedi'u trin wedi'u hatal yn PBS ynghyd â 400 uL o Matrigel wedi'i leihau gan ffactor twf (Corning, Efrog Newydd, UDA) eu brechu'n isgroenol i gefn llygod noethlymun NMRI o dan anesthesia isoflurane. Ar ddiwrnod 5 ar ôl y brechiad, cynaeafwyd y plygiau Matrigel, a chasglwyd celloedd ymdreiddio trwy ddaduniad ensymatig trwy waredu (Corning), collagenase A (Roche, Bale, y Swistir) a threuliad DNAseI (Roche) am 30 munud ar 37 gradd [13 ]. Roedd celloedd yn dirlawn am 15 munud ar rew gyda gwrthgyrff gwrth-CD16/CD32 Fe-Block (clôn 2.4G2) cyn eu staenio â gwrthgyrff cypledig am 30 munud ar 4 gradd . Mae'r gwrthgyrff cyfun a ddefnyddir wedi'u rhestru yn y tabl gwrthgyrff. Golchwyd celloedd mewn PBS gyda 0.5 mM EDTA, 2 y cant FCS a sefydlog gyda 0.5 y cant FA. Dadansoddwyd celloedd lliw gan ddefnyddio cytomedr ARIA III gyda meddalwedd DIVA6 (BD Biosciences) a FlowJo 10(LLC).

2.11.Ystadegau

Cynhyrchwyd yr holl graffiau a dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism (San Diego, CA, UDA). Cynrychiolir yr holl ganlyniadau fel y cymedr ± gwyriad safonol (sd) neu gymedr ± gwall safonol y cymedr (SEM). Canfuwyd gwahaniaethau sylweddol rhwng y moddau gan ddefnyddio prawf dwy gynffon Mann-Whitney. Defnyddiwyd y prawf log-rank (Mantel-Cox) i bennu cymeriant tiwmor. Am bob prawf, t<0.05 was="" considered="" statistically="">

3.Canlyniadau

3.1.Adnabod Moleciwlau Ataliol TRF2

Er mwyn sgrinio am gyffuriau sy'n gallu modiwleiddio lefelau protein TRF2, fe wnaethom ddefnyddio system lentiviral i gyd- drawsgrifio'r genyn GFP a'r RFP wedi'i asio i derfynfa N TRF2. Yn dilyn strategaeth gyffredinol a ddisgrifir mewn man arall [23], fe wnaethom adeiladu lentivirus GRT, lle'r oedd hyrwyddwr SFFV yn rheoli mynegiant genyn poly-cistronig yn amgodio GFP, protein ymwrthedd puromycin a naill ai RFP-TRF2 neu RFP yn unig fel rheolaeth (Ffigur 1A). O ganlyniad, mynegodd pob cell transduced GFP a RFP-TRF2. Dyluniwyd y system hon i nodi cyffuriau sy'n modiwleiddio mynegiant TRF2, trwy fesur dwyster RFP gan ddefnyddio cytometreg llif, tra bod dwyster GFP yn gweithredu fel rheolaeth fewnol ar gyfer trawsgrifio lluniad y gohebydd.

Trosglwyddwyd y lentiviruses GRT i mewn i ffibroblastau BJ-HELTRas dynol a anfarwolwyd gan SV40 a hTERT a'u rendro'n oncogenig gan Ras v12[13]. Er mwyn hwyluso mesuriadau i fyny ac i lawr-reoleiddio TRF2, cafodd clôn gwrthsefyll puromycin a fynegodd yn gymedrol broteinau GFP a RFP-TRF2 ei ynysu gan ddefnyddio didoli FACS a'i enwi'n GRI-BJ-HELTRas (Ffigur 1A). Fel rheolaeth gadarnhaol, gwnaethom drin celloedd GRT-BJ-HELTRas â 10 uM gemcitabine, modulator a ddisgrifiwyd yn flaenorol o sefydlogi TRF2 [24], am24h. Er na chanfuwyd unrhyw fodiwleiddio RFP mewn celloedd a drosglwyddwyd â fector gwag, gwelwyd gostyngiad sylweddol yn y gymhareb dwysedd fflworoleuedd cymedrig RFP / GFP (MFI) mewn celloedd GRT-BJ-HELTRas a driniwyd gan gemcitabine o'i gymharu â'r rheolaeth a driniwyd gan DMSO (82 y cant o'r rheolaeth;p<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Gan ddefnyddio cytometreg llif, fe wnaethom wedyn sgrinio 396 o gyfansoddion ffarmacolegol cymeradwy Gweinyddiaeth Bwyd a Chyffuriau (FDA) a oedd yn gallu targedu chwe phrif gategori o brosesau biolegol: sianeli ïon, ffosffatasau, cinesau, ffactorau epigenetig, ligandau derbynyddion niwclear a llwybr Wnt (Ffigur S1C). ).Cafodd celloedd GRT-BJ-HELTR eu trin gyntaf gyda 10 uM o bob un o'r 396 cyfansoddyn neu DMSO am 24 awr cyn y dadansoddiad cytometreg llif (Ffigur S1D). Yn yr achos hwn, canfuwyd bod 84 o gyfansoddion yn modiwleiddio lefelau protein TRF2 (Ffigur S1D, panel dde; Tabl S1), ac fe'u defnyddiwyd ar gyfer sgrin eilaidd (Ffigur S1E; ​​Tabl S1). Yn y sgrin eilaidd hon, yn ogystal â thrin celloedd GRT-BJ-HELTRas gyda 10 uM o'r cyfansoddion dethol, cafodd celloedd BJ-HELTRas heb eu trawsgludo neu gelloedd BJ-HELTRas a drosglwyddwyd â fector gwag eu trin yn yr un modd i daflu positifau ffug sy'n allyrru coch. neu awtofflworoleuedd gwyrdd neu sy'n effeithio ar broteinau RFP neu GFP. Yna dewiswyd y 18 com-punt gorau i bennu eu gallu i fodiwleiddio mynegiant endoge nous TRF2 mewn celloedd BJ-HELTRas heb eu trawsgludo, yn seiliedig ar blotio Gorllewinol (Ffigur S2A, Tabl B S1). Fe wnaethom ddiffinio trawiadau fel cyfansoddion yn modiwleiddio o leiaf 20 y cant o ddos ​​TRF2 (naill ai i fyny neu i lawr). Gan ddefnyddio'r meini prawf hyn, o'r 18 cyffur a werthuswyd gan blotio'r Gorllewin, gostyngodd 9 ohonynt a chynyddodd un lefelau protein TRF2 mewndarddol (Ffigur S2A, Tabl S1) Yna penderfynasom ddewis dau gyfansoddyn ymhlith y cyffuriau hyn ar gyfer arbrofion in vivo i benderfynu a allent. gwrthweithio effeithiau pro-oncogenig gorfynegiant TRF2. Er mwyn osgoi actifadu DDR a sgîl-effeithiau mewn celloedd nad ydynt yn diwmorigenig, gwnaethom ddewis cyfansoddion nad oeddent wedi lleihau i'r dos TRF2 uchaf nac i'r lefelau isaf. Yn eu plith, roedd AR ac AD yn cyfateb i'r meini prawf hynny. Roedd y ddau gyfansoddyn yn is-reoleiddio RFP-TRF2 mewn celloedd GRT-BJ-HELTRas fel y'u dadansoddwyd gan cytometreg llif (Ffigur 1C), lefelau protein TRF2 mewndarddol fel y dangosir gan ddadansoddiad blotio'r Gorllewin (Ffigur 1D; Ffigur S2A, B) a lefelau mRNA TERF2 fel y'u pennwyd trwy RT -qPCR (Ffigur 1E). Ar ben hynny, roedd triniaeth gyda chrynodiadau LD50 o AR ac AD wedi lleihau mynegiant mRNA TERF2 yng nghelloedd BJ-HELTRs ac mewn celloedd TRF gan or-fynegi BJ-HELTRas (Ffigur S3A-C).

3.2.AR-A014418 ac Alexidine-2HCl Gwrthdroi'r Tiwmorigenigrwydd a roddwyd gan Lefelau Mynegiant TRF2 Uchel

Y tro nesaf fe wnaethom werthuso effaith AR ac AD ar dwf tiwmor. Er mwyn rheoli eu gallu i dargedu canserau gorfynegi TRF, dadansoddwyd effeithiau gwrth-diwmorigenig posibl AR ac AD ar gelloedd safonol BJ-HELTRas a TRF2-yn gorfynegi celloedd BJ-HELTRas. Trosglwyddwyd celloedd BJ-HELTRas â fector TRF2lentviral neu fector gwag, yna eu chwistrellu'n isgroenol i lygod noethlymun. Yna cafodd y llygod eu trin â DMSO, 1 mg / kg AD neu 5 mg / kg AR ar ddiwrnodau 16,18,20 a 22 ar ôl y pigiad [26,27] (Ffigur 2A). Fel yr adroddwyd yn flaenorol [13,21], roedd gorfynegiant TRF2 yn hyrwyddo tiwmor ini. clymu a thwf in vivo (Ffigur 2B-D; t<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 ac Alexidine-2HCI yn Gwrthweithio TRF2-Imiwnedd Dibynnol a Neo-Angiogenesis

Er mwyn penderfynu a allai effeithiau gwrth-tiwmor AR ac AD dargedu priodweddau oncogenig ymreolaethol nad ydynt yn gelloedd TRF2, fe wnaethom archwilio ymdreiddiad ac actifadu celloedd imiwnedd yn ogystal ag angiogenesis mewn tiwmorau wedi'u trin. Fe wnaethom drin celloedd safonol a TRF2- yn gorfynegi celloedd BJ-HELTRas (Ffigur S3A) gydag 1 uM o OC, 10 uM o AR neu DMSO am 48 h cyn eu pigiad isgroenol gyda Matrigel i lygod noethlymun. Yna casglwyd plygiau matrigel 5 diwrnod ar ôl y pigiad i ddadansoddi'r micro-amgylchedd tiwmor yn ôl cytometreg llif (Ffigur 3A). Yn ôl y disgwyl [13,21], ni newidiodd gorfynegiant TRF2 ymdreiddiad celloedd imiwnedd byd-eang (CD45 ynghyd â chell) (Ffigur 3B; Ffigur S4A), ond roedd yn atal recriwtio celloedd lladdwr naturiol (NK) (Ffigur 3C; Ffigur S4B) a swyddogaeth NK -ality (Ffigur 3C-E; Ffigur S4C), a chynyddu ymdreiddiad MDSC (Ffigur 3F). Mewn TRF2-yn gorfynegi celloedd BJ-HELTRas yn benodol, cynyddodd triniaeth gyda’r naill gyffur neu’r llall ymdreiddiad imiwn byd-eang (Ffigur 3B; Ffigur S4A), yn ogystal â maint ac ymarferoldeb celloedd NK mewn-tumoral (Ffigur 3C-E; Ffigur S4B,C). Yn nodedig, achubodd y ddau gyffur yn llwyr ataliad gwyliadwriaeth imiwn NK-gyfryngol (CD107a plws a CD69 ynghyd â chell NK) a achoswyd gan orfynegiant TRF2 (Ffigur 3C). Roedd hyn yn gysylltiedig â gostyngiad dramatig mewn recriwtio MDSC (Ffigur 3F; Ffigur S4D) a chyda mwy o recriwtio monocytes a macrophages (Ffigur 3G).

Fel yr adroddwyd yn flaenorol [14,20], roedd angiogenesis tiwmor yn uwch mewn tiwmorau gorfynegol TRF o gymharu â thiwmorau rheoli. Er bod gorfynegiant TRF2 wedi cynyddu nifer y celloedd endothelaidd CD31 ynghyd â CD45-yn y gwely tiwmor (Ffigur 3H; Ffigur S4E), ni chanfuwyd unrhyw wahaniaeth rhwng fector gwag neu TRF2-yn gorfynegi tiwmorau ar ôl triniaeth gyda'r naill gyffur neu'r llall. ing TRF2 （ fector TRF2） neu fector gwag eu trin â 1uM o alexidine-2HCl neu 10 μM o AR-A014418 neu DMSO ar 2 ddiwrnod cyn pigiad isgroenol gyda Matrigel (celloedd 1 × 10 gradd) i mewn i lygod noethlymun NMRI ( n=8). Yna gwerthuswyd ymdreiddiad celloedd imiwnedd ac endothelaidd 5 diwrnod ar ôl y pigiad gan sytometreg llif. (BH). Dadansoddiad cytometreg llif o ymdreiddiad imiwn y plwg Matrigel. Dangosir nifer y celloedd imiwnedd sy'n treiddio i'r plygiau Matrigel ymhlith celloedd byw. Dangosir cyfanswm ymdreiddiad celloedd imiwnedd (CD45 plws celloedd) yn (B); dangosir ymdreiddiad cell lladd naturiol (NK) (NKp46 plws celloedd) yn (C); dangosir ymdreiddiad cell NK wedi'i actifadu (CD107a plws a CD69 ynghyd â chelloedd NK) yn (D, E); dangosir ymdreiddiad cell suppressor sy'n deillio o myeloid (MDSC; CD11b plws GR1 plws) yn (F); dangosir ymdreiddiad monosyt-macrophage yn (G) a dangosir ymdreiddiad celloedd endothelaidd yn (H).p Pennwyd gwerthoedd gan ddefnyddio'r Mann- Prawf Whitney (*t<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Trafodaeth

Yma, rydym yn adrodd ar ddatblygiad assay seiliedig ar gelloedd i sgrinio am gyfansoddion sy'n modiwleiddio mynegiant y protein telomerig TRF2. Trwy sgrinio llyfrgell fach o foleciwlau a gymeradwywyd gan FDA, fe wnaethom nodi cyfansoddion a allai naill ai gynyddu neu ostwng lefelau mynegiant TRF2. Fe wnaethom ddarganfod bod AD ac AR yn is-reoleiddio TRF2 ac yn arddangos gweithgaredd gwrth-tumorigenig yn benodol ar gyfer celloedd tiwmor sy'n gorfynegi TRF2. Yn dangos ymhellach eu gweithgaredd penodol TRF2-, triniaeth AR ac AD wedi'u hachub imiwnedd a neo-angiogenesis a roddwyd gan orfynegiant TRF2. Yn drawiadol, mae'r ffaith bod yr ymdreiddiad imiwn byd-eang yn cynyddu ar gyfer tiwmorau sy'n gorfynegi TRF2 ar ôl triniaeth AR neu AD yn awgrymu bod y cyffuriau hynny'n fwy grymus i wella ymateb imiwn pan fydd TRF2 yn cael ei or-fynegi. Mae'r cyffuriau hynny'n atal effaith gwrthimiwnedd gorfynegiant TRF2 trwy adfer ymarferoldeb celloedd NK (CD107a a CD69 ynghyd â chelloedd NK) ac yn lleihau ymdreiddiad MDSC yn gryf. Mae hyn yn awgrymu bod y cyffuriau hynny'n pylu'r rhaglen benodol dibynnol TRF sy'n sbarduno dianc imiwnedd a gwrthimiwnedd ac a allai wella rhyddhau Moleciwlau Cysylltiedig â Pherygl (DAMP) sy'n gwella ymateb imiwn yn benodol pan fydd TRF2 yn cael ei or-fynegi. O bwys, rydym yn sylwi bod AR ac AD wedi achub swyddogaethau gwrthimiwnedd a pro-angiogenig gorfynegiant TRF2, dwy nodwedd gorfynegiant TRF2 a ddangoswyd gennym yn flaenorol fel DDR annibynnol. Felly, gwnaethom ragdybio bod yr effeithiau AR ac AD ar dwf tiwmor yn annibynnol ar DDR, mecanwaith sy'n parhau i gael ei ddisgrifio'n llawn mewn astudiaethau pellach. Mae'r astudiaeth prawf-cysyniad presennol yn darparu tystiolaeth y gallai gostyngiad ffarmacolegol mewn mynegiant TRF2 fod yn strategaeth gwrth-ganser werthfawr.

Er bod y dull sgrinio yn ystyried lefelau protein TRF2 yn annibynnol ar lefelau trawsgrifio, gostyngodd y ddau gyffur lefelau mRNA TERF2 mewndarddol, gan awgrymu bod AR ac AD yn targedu lefelau lluosog o reoleiddio TRF2. Gan gefnogi hyn, mae AR yn atalydd signalau Wnt [28], sy'n ysgogydd trawsgrifio TERF2 [29]. Yn fwy cyffredinol, cyfoethogwyd y cyffuriau sy'n targedu llwybr signalau Wnt yn ystod y camau sgrinio (Ffigur S1B-D). Mae sut mae AD, asiant targedu mitocondria, yn effeithio ar fynegiant TRF2 eto i'w benderfynu. Gan fod gan ganserau sy'n dangos lefelau TRF2 uchel prognosis gwael ac yn dangos mwy o wrthwynebiad i gemotherapi [21], mae AR ac AD yn asiantau therapiwtig o ddiddordeb ar gyfer tiwmorau o'r fath. Mae'r potensial i ddatgysylltu gweithgareddau telomerig a pro-oncogenig TRF2[13] yn codi'r posibilrwydd o ddadreoleiddio TRF2 yn ffarmacolegol gan roi buddion gwrth-ganser aml-draw heb sgîl-effeithiau niweidiol o blaid heneiddio. Felly, mae angen astudiaethau yn y dyfodol i bennu effeithiau synergaidd y cyffuriau hyn ar lefelau mynegiant TRF2 mewn astudiaethau clinigol.

Er bod TRF2 wedi'i uwchreoleiddio mewn amrywiol ganserau dynol [13,21], mae ei fynegiant yn cael ei isreoleiddio yn ystod heneiddio arferol a phatholegol llawer o feinweoedd [30,31] Ar ben hynny, mae sawl adroddiad sy'n cynnwys modelau llygoden o ddadreoleiddio TRF2 yn pwysleisio pwysigrwydd TRF2 yn y croesffordd rhwng heneiddio a chanser [31-35]. Felly, mae'r moleciwlau a nodir gan y weithdrefn sgrinio a ddisgrifir yma yn ymgeiswyr cyffuriau diddorol, fel asiantau gwrth-ganser ar gyfer is-reoleiddio TRF2 fel y cadarnhawyd yn yr astudiaeth hon, ac o bosibl fel asiantau gwrth-heneiddio trwy uwchreoleiddio TRF2.

Daw'r erthygl hon o Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers