Mae Detholiad Diwylliannau Cell Oenothera Biennis Wedi'i Waddoli â Gweithgaredd Gwrth-Heneiddio'r Croen yn Gwella Priodweddau Mecanyddol Cell
Jul 06, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Mae heneiddio croen yn broses adnabyddus iawn sy'n gosod dirywiad graddol yn nodweddion mecanyddol y croen oherwydd dirywiad mewn cynhyrchu'r peiriannau matrics allgellog ac i newid cydamserol yn y broses crebachu. Er mwyn arafu'r dilyniant hwn, mae'n hanfodol ysgogi mynegiant nifer o broteinau sy'n gallu hyrwyddo ffurfio ffibrau elastig ac atgyweirio meinwe. Yma, mae detholiad dyfrllyd diwylliant celloedd Oenothera bi-Ennis wedi'i ymchwilio o safbwynt cemegol, ac yna fe'i profwyd in vitro, yn y gell, ac mewn arbrofion ex vivo fel cynorthwyol wrth wrthweithio heneiddio croen Yn unol â hynny, fe'i profwyd. dangoswyd bod detholiad Oenothera biennis yn gallu, trwy gynyddu mynegiant genynnau MYLK, hyrwyddo crebachiad colagen matrics, polymerization actin, a chynhyrchu proteinau ECM hanfodol.
Geiriau allweddol:metabolomeg; rhwydweithiau moleciwlaidd; dyfyniad hydroffilig o ddiwylliannau celloedd Oenothera biennis; crebachiad colagen matrics; heneiddio croen
1. Rhagymadrodd
Mae heneiddio croen yn broses adnabyddus iawn a achosir gan ffactorau mewndarddol ac alldarddol. Yn ystod henaint, mae'r holl swyddogaethau ffisiolegol croenol yn dirywio'n ddiangen, ac mae'r dirywiad cynyddol hwn yn niweidio'r croen [1]. Yn wir, mae'r croen yn gostwng ei nodweddion mecanyddol yn raddol, oherwydd y dirywiad yng nghynhyrchiant y proteinau matrics allgellog ac i'r newid cydamserol yn y broses grebachu [2]. Y cydrannau matrics allgellog dermis pwysicaf yw proteinau fel colagen I a IIl, laminin, periostin, tenascin, elastin, ffibronectin, a proteoglycans, gan fod eu swm cymharol a'u cyflwr plygu yn chwarae rhan allweddol yn y rhyngweithio rhwng y celloedd a'r matrics, gan warantu gwead cywir y dermis [3]. Er enghraifft, yn y gofod allgellog, mae ffibronectin yn chwarae rhan allweddol mewn cydosod matrics gan ei fod yn ffurfio pont rhwng derbynyddion arwyneb celloedd (ee, integrins) a cholagen, proteoglycans, a moleciwlau adlyniad ffocal eraill. Mae laminau yn cyfrannu at strwythur y matrics allgellog ac yn modiwleiddio adlyniad, gwahaniaethu, mudo, sefydlogrwydd ffenoteip, ac ymwrthedd i apoptosis. Mae elastin hefyd yn bwysig ar gyfer adlyniad celloedd a mudo celloedd, ac mae ganddo'r gallu i gymryd rhan mewn signalau celloedd. Yn yr un modd mae ffibrilinau yn rhyngweithio'n agos â tropoelastin ac integrinau, ac maent yn bwysig ar gyfer cydosod elastinau yn ffibrau elastig. Mae Fabulous wedi'i gysylltu'n dynn â philenni islawr, ffibrau elastig, a chydrannau eraill o'r matrics allgellog, ac yn cymryd rhan mewn ffurfio ffibrau elastig. Mae tenascinau yn glycoproteinau polymorffig matrics allgellog (ECM) sy'n cyfryngu prosesau ffibrotig i alluogi atgyweirio meinwe'n effeithiol [4] Yn ogystal, mae'r broses gyfangiad croen hefyd yn seiliedig ar weithred ffibroblastau, y celloedd mwyaf niferus yn y matrics dermol; maent yn sefydlu tensiwn cywir y croen, gan hyrwyddo'r cysylltiadau rhwng y cydrannau matrics, sydd yn eu tro yn gyfrifol am grynodeb, dwysedd a gwrthiant y dermis. Ar sail eu sefydliad cytoskeleton cellog, mae'r peiriannau actin-myosin, sy'n pennu newidiadau posibl yn eu siâp a'u strwythur. Yn wir, mae rhwymo actin a myosin yn achosi cydffurfiad cellog mwy cryno, gan ddod â'r ffibrau'n agosach at ei gilydd, gan warantu datblygiad meinwe iach a chryno, ac atal dadelfennu ffibr sy'n arwain at wrinkles. Fodd bynnag, mae gallu ffibroblast i gyfangu ac ymestyn yn cael ei golli'n rhannol dros flynyddoedd oherwydd nad yw'r celloedd oedrannus bellach yn gallu gweithredu'n gywir ac yn gyfan gwbl. Oherwydd grym mecanyddol is, mae ffibroblastau yn mynd i forffoleg fwy crwn ac ystumiedig na'r un hirgul [5]. Mae peth tystiolaeth wedi dangos bod synthesis protein o'r enw MYLK (Myosin Light Chain Kinase) wedi gostwng yn sylweddol yn ystod heneiddio. Mae MYLK yn meddu ar weithgaredd kinase a wneir gan ffosfforyleiddiad parth myosin penodol, a enwir yn gadwyn golau rheoleiddiol myosin, sy'n gallu cymell rhwymo actin ac felly hyrwyddo contractility cell [6].bioflavonoidauPan ganfuwyd gweithgaredd isel o'r protein hwn, er enghraifft, oherwydd mynegiant protein llai, mesurwyd gostyngiad cyfatebol mewn crebachiad colagen matrics [7] a pholymerization actin [8]. Mae cynulliad cytoskeleton Actin yn gysylltiedig nid yn unig â symudiad celloedd a'r gallu i gyfangu ond hefyd â chynhyrchu protein matrics ECM trwy actifadu'r derbynnydd TGF -II (TGFBRII)[9]. Mae TGFBRII yn perthyn i gyfadeilad derbynnydd arwyneb celloedd TGF sydd, trwy actifadu ffactorau trawsgrifio Smad, yn rheoleiddio mynegiant llawer o enynnau amgodio cydrannau ECM, gan gynnwys colagen, lamininau, ffibronectin, a proteoglycan [10]. Mae dadosod cytoskeleton Actin yn is-reoleiddio'r derbynnydd TGF -Il. Mae'r is-reoleiddio hwn, yn ei dro, yn lleihau cynhyrchiant colagen a phroteinau ECM eraill, gan arwain at golli màs dermal a breuder croen.
Mewn gwirionedd, mae llawer o gynhwysion cosmetig yn anelu at ysgogi synthesis nifer o ffactorau allweddol sy'n gyfrifol am gynnal crynoder cywir y matrics dermol a chrebachiad croen da. Yn y senario hwn, mae'r darnau sy'n deillio o'r rhywogaeth Oenothera biennis (Evening Primrose), sy'n perthyn i'r teulu Onagraceae, o ddiddordeb eang oherwydd eu cynnwys mewn cyfansoddion bioactif fel asidau brasterog, ffenolau, triterpenes, a flavonoidau, sydd eisoes wedi'u cynnwys. profi wrth drin clefydau croen patholegol amrywiol [11]. Adroddir bod rhai o'r metabolion hyn, yn eu tro, yn atal cyfryngwyr llid fel interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), cytocinau, a ffactor necrosis tiwmor (TNF-)[12 ]. Ar ben hynny, roedd darnau o rannau o'r awyr Oenothera biennis yn amddiffyn celloedd HaCaT rhag difrod DNA a achoswyd gan H, O, a marwolaeth celloedd trwy rwystro difrod cellog oherwydd straen ocsideiddiol trwy fecanwaith a oedd yn cynnwys dileu ROS a llwybr signalau Nrf2/HO-1 [ 13]. Ar ben hynny, mae olew Oenothera biennis, sy'n gyfoethog mewn lipidau, wedi'i gynnig fel lleithydd da ar gyfer cleifion ecsema diolch i'w allu i dreiddio'r croen yn hawdd [14]. Yn anffodus, gall paratoadau echdynnu planhigion wedi'u trin, sy'n ymwneud â cholur, gynnwys rhai anfanteision: yn gyntaf, gallant gael eu halogi gan sylweddau gwenwynig neu alergenaidd fel plaladdwyr, gwrtaith, neu lygryddion; yna, mae'r planhigion yn destun straen anrhagweladwy ac amodau tymhorol neu amrywiadau mewn argaeledd maetholion, a all gymell synthesis metabolion annisgwyl. Yn ogystal, gall y darnau gynnwys micro-organebau pathogenig, sy'n lleihau ansawdd y cynhyrchion terfynol. Mae'r holl anfanteision hyn, yn eu tro, yn cydgyfeirio i'r risg o gael cynnwys amrywiol o fetabolion eilaidd ac atgynhyrchedd isel. Er mwyn goresgyn y gwendidau hyn, mae'r defnydd o ddiwylliannau celloedd planhigion mewn colur yn dod yn fwy poblogaidd ac yn cael ei werthfawrogi'n fawr, gan ei fod yn goresgyn llawer o'r anfanteision uchod [15].
Yn yr astudiaeth hon, mae detholiad hydroffilig o ddiwylliannau celloedd Oenothera biennis (ObHEx) wedi'i nodweddu'n llawn gan ddulliau datblygedig sy'n seiliedig ar sbectrometreg màs, gyda chymorth biowybodeg, ac wedi'i brofi mewn profion biocemegol a biolegol lluosog. Mae'r cymysgedd yn cynnwys cyfansoddion bioactif o lignans a triterpenes yn bennaf, megis asid arjunolic ac Asitig, sydd wedi bod yn gysylltiedig yn flaenorol â chynhyrchu pro-colagen I mewn ffibroblastau dynol [16,17]. Ymchwiliwyd i'r dyfyniad am ei allu i gynyddu mynegiant MYLK, hyrwyddo crebachiad colagen matrics, polymerization actin, a chynhyrchu proteinau ECM a reoleiddir gan TGF, sy'n ffafrio crebachiad y dermis, gan arafu heneiddio'r croen.
2. Canlyniadau
2.1.Dadansoddiad Ansoddol a Meintiol o Detholiad sy'n Hydawdd mewn Dŵr o feithriniad celloedd Oenothera Biennis
Cynhaliwyd dadansoddiad UPLC-MS/MS o OBHex a defnyddiwyd data sbectrometrig cydraniad uchel ar gyfer y nodweddu cemegol gan ddefnyddio Rhwydwaith Moleciwlaidd Cymdeithasol Cynhyrchion Naturiol Byd-eang (GNPS), system sbectrometreg màs ar y we sy'n helpu i adnabod ac anodi cynhyrchion naturiol. (NPS)[18]. Ei nod yw bod yn sylfaen wybodaeth mynediad agored ar gyfer sefydliadau cymunedol cyfan ac ar gyfer rhannu data sbectrometreg màs darnio amrwd, wedi'i brosesu neu anodedig (MS/MS). Yn benodol, cynhaliwyd chwiliadau llyfrgell sbectrol GNPS a swydd Rhwydweithio Moleciwlaidd Seiliedig ar Nodweddion (FBMN): roedd y dadansoddiad cyntaf yn caniatáu inni nodi cyfansoddion naturiol, gan gymharu eu sbectra MS/MS â rhai metabolion â nodweddion strwythurol, yr ail un â rhai cysylltiedig â grŵp. NPs o fewn rhwydwaith ers i batrymau darnio MS/MS tebyg gael eu harddangos gan foleciwlau strwythurol debyg [19]. Fel y dangosir yn Ffigur 1 a Thabl 1, yn ddiamau, nodwyd bod llawer o NPS yn perthyn i sawl dosbarth o fetabolion eilaidd, yn bennaf lignans (Salvador o'r neilltu a liriodendron) a triterpenes (asid muriatig, asid ariunolig, asid Asiatig, a hederagenin). Neilltuwyd rhywogaethau cemegol nas nodwyd gan GNPS yn unol â'r llenyddiaeth.
Fel enghraifft o'r defnydd o GNPS, mae'r rhwydwaith sy'n deillio o ddadansoddiad FBMN wedi'i adrodd yn Ffigur 2a, sy'n dangos bod ObHEx yn cynnwys llawer o driterpenau annodweddiadol eraill yn ymwneud ag asid muriatig (18, m/z 503.3389, RT 21.89 min: mae adnabod asid muriatig wedi wedi'i gadarnhau trwy gymhariaeth â'i safon ddadansoddol). Er enghraifft, nodwyd bod amrywiaeth o rywogaethau heb eu nodweddu o'r blaen ar m/z 701 a 665 yn ffurfiau glycosylaidd sy'n gysylltiedig ag asid muriatig neu ei isomerau, wedi'u hydradu neu beidio â dau foleciwl o HO.
Ymhellach, mae ïonau a adroddwyd ar m/z 729, 703, 699,687,685, 683 yn deillio yn y drefn honno o'r glycosyliad plws dau foleciwl o H, O o rywogaethau ar m/z531, 505,501, 489,487, a 485: ni lwyddwyd i'w hadnabod yn unig, ond maen nhw i gyd i fod i fod yn driterpenes, gan eu bod yn gysylltiedig ag asid muriatig neu ei gongeners, oherwydd eu llwybr darnio MSMS, Yn ddiweddar, roedd llawer o driterpenau gyda m/ 501 a 485 wedi'u hynysu o rywogaeth arall o Oenothera, Oenothera Maritima, ac mae eu strwythur wedi wedi'i egluro ar sail data sbectrosgopig, gan gydberthyn yn dda â'n canlyniadau [20].
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Roedd dadansoddiad FBMN hefyd yn darparu gwybodaeth am y metabolion ar m/z 617.3862 (ïonau MS2 ar m/z 453,145 a 119) sy'n bresennol mewn rhwydweithiau moleciwlaidd a ddangosir yn Ffigur 2b ac nad ydynt wedi'u hadrodd yn y llenyddiaeth ar gyfer rhywogaethau Oenothera. Mae'r gwerth m/z hwn a'i ddarniad yn cyfateb i 2-asid apostolig OEp-coumaroyl neu ei isomerau, gan brofi, o leiaf, presenoldeb triterpene coumaroyl a hefyd esters caffeoyl yn y dyfyniad. Yn wir, dangosodd MS- sbectra rhywogaethau ar m/z 649 (RT 25.72 a 27.19) bresenoldeb ïonau ar m/z 179, 161, a 135 oherwydd holltiad lleithder asid caffeic, tra bod sbectra MS2 y rhywogaeth arall adroddwyd yn Ffigur 2b ar m/z 633 (RT 26.88,27.20,28.12 a 28.43), 649 (RT24.18,24.65,24.83), a 661 (RT 30.28) yn dangos ïonau ar m/z 145 a 119, a oedd yn nodweddiadol ar gyfer moiety couaroyl.
After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911)o fewn yr ystodau a brofwyd. Ar ben hynny, nododd y terfyn canfod (LOD) a'r terfyn meintioli (LOO) fod y dulliau a ddefnyddiwyd yn cael eu gwahaniaethu gan sensitifrwydd uchel. Roedd y canlyniadau a gafwyd o'r dadansoddiad meintiol (Tabl 3) yn dangos mai liriodendron a hederagenin oedd y prif lignan a triterpene a gynrychiolir, yn y drefn honno.
2.3.Dadansoddiad o Fynegiad Genynnau MYLK mewn HDF
Profwyd gweithgaredd ObHEx mewn HDF ar fynegiant y genyn MYLK, sy'n amgodio ar gyfer y kinase sy'n gyfrifol am ffosfforyleiddiad cadwyn ysgafn myosin (Ffigur 3a). Dangosodd y canlyniadau fod y driniaeth gyda'r dyfyniad yn y ddau grynodiad wedi cynyddu mynegiant genynnau MYLK tua 50 y cant, yn debyg i reolaeth gadarnhaol TGF-.
2.4. Dadansoddiad o Gynhwysedd Crebachu Matrics Collagen
Er mwyn gwerthuso gweithgaredd ObHEx ar gynhwysedd contractile ffibrau colagen, defnyddiwyd HDF wedi'i wasgaru mewn disgiau gel colagen [21]. Fel y dangosir yn Ffigur 3b, mae'r dyfyniad, ar y crynodiad is, wedi achosi cynnydd sylweddol yng nghyfangiad y disg colagen, gan awgrymu effaith bosibl ar gadernid colagen. Y driniaeth ag ML7(1-(5-iodonaphthalene-1-sulfonyl)-1H-hexahydro-1,4-diazepine), atalydd MYLK, diddymu'r cynnydd hwn, gan ddangos bod y dyfyniad a'r TGF yn gweithredu trwy MYLK ar gyfer cyfangiad disg colagen.
2.5.Mesur Lefel Polymerization Actin
Ymchwiliwyd i allu ObHEx i ysgogi polymerization actin trwy fesur lefel yr actin wedi'i bolymeru yn y celloedd, wedi'i drin â'r dyfyniad a'r rheolaeth gadarnhaol TGF-, yn unig ac ym mhresenoldeb ML7. Fel y dangosir yn Ffigur 3c, arweiniodd y driniaeth â chrynodiadau'r echdynion gynnydd o tua 50 y cant yn y swm o actin polymer, o'i gymharu â 33 y cant o TGF-.prynu cistancheUnwaith eto, diddymodd y cyn-deoriad gyda ML7com-yr effaith hon yn llwyr, gan awgrymu cyfranogiad MYLK yn y polymerization o ffilamentau actin.
2.6. Dadansoddiad o Lwybr TGF RII/SMAD mewn HDF
Er mwyn gwirio a oedd y cynnydd mewn polymerization actin a chrebachiad colagen mewn celloedd a gafodd eu trin ag ObHEx hefyd yn gysylltiedig ag actifadu'r llwybr trawsgludo signal a gyfryngwyd gan TGF RII, gwelsom yn gyntaf fynegiant genyn TGF RII ac yna trawsgludwyd HDF gyda'r SMAD{{ 0}}gohebydd luciferase plasmid a gwerthuso'r cynnydd mewn gweithgaredd luciferase mewn ymateb i driniaeth ObHEx. Roedd y canlyniadau, a adroddwyd yn Ffigur 3d,e, yn nodi bod y driniaeth ag ObHEx ar 0.002 y cant a 0.006 y cant wedi cynyddu mynegiant TGF RII mewn ffordd debyg i'r TGF- a ddefnyddir fel rheolaeth gadarnhaol ac, yn gyfochrog, cynyddwyd y gweithgaredd luciferase sy'n gysylltiedig â SMAD 80 a 40 y cant , yn y drefn honno. Cafwyd gostyngiad sylweddol yn y signal pan gafodd y celloedd eu trin â ML7, gan ddangos hefyd bod y gweithgaredd hwn yn gysylltiedig â MYLK.
2.7.Dadansoddiad o Pro-Colagen I, Tropoelastin, a Periostin
O ganlyniad i actifadu trawsgludiad signal TGF RII, dadansoddwyd synthesis y prif broteinau matrics allgellog fel procolagen math I, tropoelastin, a periostin mewn HDF a gafodd ei drin â ObHEx ar 0.002 y cant . Fel y dangosir yn Ffigur 3f, cynyddodd ObHEx gynhyrchu'r proteinau a nodwyd tua 98 y cant , 75 y cant , a 51 y cant , yn y drefn honno, yn debyg i reolaeth gadarnhaol TGF- . Perfformiwyd y mesurau gan assay ELISA, gan ddefnyddio gwrthgyrff penodol yn erbyn pro-colagen I, tropoelastin, a periostin.
2.8.Dadansoddiad o MYLK, Phospho-Myosin, Colagen I, a Tropoelastin ar Ehangiadau Croen Ex-Vivo
Fel y dangosir yn Ffigur 4a-c, cynhyrchodd ObHEx gynnydd sylweddol yn y broses o gynhyrchu MYLK a myosin ffosfforyleiddiedig mewn ecsglinyddion croen dynol.
Dadansoddwyd colagen I ac anwythiad tropoelastin hefyd mewn ecsbynnau croen a gafodd eu trin ymlaen llaw ag ObHEx ac yna eu trin â hydrocortisone am 8 diwrnod i efelychu heneiddio cronolegol [22]. Gostyngodd y driniaeth â hydrocortisone y swm o golagen I a tropoelastin fwy nag 100 y cant, ac adferodd presenoldeb 0.002 y cant ObHEx swm y tropoelastin bron i 91 y cant a colagen 120 y cant, o'i gymharu â'r ascorbate a ddefnyddir fel rheolydd positif (Ffigur 4d-f). Mae hyn yn awgrymu effaith gwrth-heneiddio bosibl ObHEx, sy'n arbennig o effeithiol wrth gynyddu cadernid y croen trwy weithredu ar y cydrannau matrics dermol.
2.9.Microsgopeg Grym Atomig (AFM) mewn Ehangiadau Croen
Er mwyn casglu mwy o wybodaeth am briodweddau biomecanyddol y croen a hyrwyddir gan y driniaeth ag ObHEx, fe wnaethom werthuso elastigedd, eiddo mecanyddol cynhenid samplau croen o ran modwli eu Young [23]. Fel y disgrifir yn Adran 4, i gyfrifo'r modwlws elastig, ar samplau croen wedi'i drin a heb ei drin, fe wnaethom gasglu cromliniau Grym gyda Microsgop Grym Atomig (AFM) a'u ffitio â model Hertz [24,25]. Fel y dangosir yn Ffigur 5, roedd gan driniaeth y samplau croen gyda'r dyfyniad werthoedd modiwl Young is o'i gymharu â samplau heb eu trin, gan awgrymu gwelliant yn eiddo elastig y croen. Yn benodol, datgelodd samplau croen heb ei drin werth modwlws cymedrig Young o 0.37±0.15 GPa, tra bod samplau croen a gafodd eu trin ag ObHEx yn dangos gwerth cymedrig is o 0.{{11 }}7±0.02 GPA. Roedd gwerthoedd modwlws Young o'r samplau croen yn unol â'r llenyddiaeth [26-28].
3. Trafodaeth
Diwylliannau celloedd planhigion yw'r dull mwyaf addawol ar gyfer cynhyrchu cynaliadwy o fetabolion eilaidd planhigion o ddiddordeb masnachol, gan gynnig cyflenwad parhaus o ddeunydd trwy ddiwylliant ar raddfa fawr ac sy'n ffurfio system gynaliadwy ac ecogyfeillgar [29,30]. Mae darnau o ddiwylliannau celloedd planhigion wedi dod o hyd i gymwysiadau addawol yn y sectorau gofal iechyd a chosmetig, gan eu bod yn cyflwyno rhai manteision perthnasol; (i) eu bod yn cynnwys metabolion wedi'u biosyntheseiddio mewn amodau labordy twf rheoledig; (i) maent yn deillio o brosesau cynhyrchu safonol, gan warantu'r yr un nodweddion ansoddol a meintiol â'r rhywogaeth a gafwyd; (ii) bod yr echdynion yn rhydd o halogion megis micro-organebau, chwynladdwyr, plaladdwyr a ffwngladdiadau; (iv) eu bod yn annibynnol ar amrywiadau daearyddol neu amgylcheddol a gellir gwarchod y rhywogaethau planhigion at y dyfodol cenedlaethau. Yn y gystadleuaeth hon, archwiliwyd echdynnyn dyfrllyd meithriniad celloedd Oenothera biennis (ObHEx) fel ffynhonnell addawol o foleciwlau bioactif a gynysgaeddwyd â gweithgaredd gwrth-heneiddio croen. Yn wir, mae ObHEx wedi cael ei ymchwilio gan ddadansoddiadau UPLC-MSMS cydraniad uchel ynghyd â dulliau biowybodeg i gyflawni nodweddiad strwythurol eang. Mae nodweddu cyfansawdd wedi'i wireddu'n bennaf trwy ddefnyddio GNPS i gyflymu'r broses adnabod, cymharu'r sbectra MS/MS â rhai metabolion â nodweddion strwythurol, ac, ar ben hynny, datgelu rhywogaethau annisgwyl newydd, gan grwpio NPs tebyg o fewn rhwydwaith. At hynny, cymharwyd amser cadw, mesuriadau màs cywir, a dadansoddiadau MS2 hefyd â rhai safonau, a pharwyd yr holl ddata â'r llenyddiaeth. Nodwyd lignans bioactif a triterpenes, megis Salvador o'r neilltu, liriodendron, asid my-anthemig, asid arjunolic, asid Asiatig, a hederagenin. Roedd Liriodendron [31] ac asid muriatig [32] yn arddangos gweithgaredd gwrthocsidiol cryf, tra bod hederagenin yn dangos eiddo gwrth-heneiddio croen oherwydd gostyngiad mewn ocsidiad cellog a gweithrediad swyddogaeth proteasome [33]. Fodd bynnag, ystyriwyd bod asidau arjunolig ac Asiatig yn bennaf gyfrifol am rai o'r gweithgareddau profedig canlynol, gan eu bod yn ysgogi synthesis colagen I. Yn wir, dangoswyd bod ObHEx wedi gwella priodweddau biomecanyddol y croen, sy'n dibynnu'n bennaf ar faint cymharol gwahanol gydrannau'r ECM a sut mae'r ffibroblastau yn gallu crebachu a darparu'r tensiwn cywir i'r ffibrau dermol.cistanchMewn gwirionedd, mae ObHEx yn hyrwyddo crebachiad matrics colagen a pholymeriad actin trwy gynyddu mynegiant y genyn MYLK, gan wella grym crebachu ffibroblastau dermol. Mae cydosod actin sytosgerbwd yn uwchreoleiddio derbynnydd math II TGF ac, yn gyson ag ysgogiad signalau TGF- /Smad, yn cynyddu lefelau proteinau ECM a reoleiddir gan TGF. Yn wir, mae ObHEx yn cymell cynhyrchu colagen math I, periostin, a tropoelastin. Felly, mae'r holl briodweddau hyn yn ei gwneud yn gynhwysyn ymgeisydd addawol da i'w ddefnyddio mewn fformwleiddiadau cosmetig i frwydro yn erbyn colli cadernid ac elastigedd croen sy'n gysylltiedig ag oedran. Ategwyd y dybiaeth hon gan y canlyniadau a gafwyd yn y dadansoddiad AFM, a ddangosodd fod trin sleisys croen ag ObHEx wedi arwain at welliant yn nodweddion mecanyddol y croen, a ganfuwyd fel gostyngiad ym modwlws Young, gan ddangos gostyngiad sylweddol mewn anystwythder ac anhyblygedd croen.
4. Defnyddiau a Dulliau
4.1.Diwylliannau Meinwe Planhigion a Pharatoi Echdynnu
Darparwyd planhigion Oenothera biennis gan GEEL Floricultura ss ac roeddent o darddiad Eidalaidd (gan osgoi cymhwyso protocol Nagoya). Cafwyd diwylliannau celloedd o ddail planhigion Oenothera biennis trwy ysgogi toreth o gelloedd meristematig ar blatiau agar solet nes cael calluses. Trosglwyddwyd y celloedd i'r cyfrwng twf hylifol (Gamborg B5, wedi'i ategu â 24 asid dichlorophenoxyacetig (1 mg / L), adenine (1 mg / L), a cinetin (0.01 mg / L)). , tyfwyd y celloedd fel diwylliannau atal o dan ysgwyd orbitol. Unwaith y cafwyd y diwylliannau o tua 150 g/L, casglwyd y celloedd a'u gosod mewn byffer ffosffad (PBS) ar pH7.4 i baratoi echdyniad hydawdd mewn dŵr, a gafodd ei lyoffileiddio. Diddymwyd y powdr mewn dŵr neu gyfryngau diwylliant celloedd ar y crynodiadau priodol i'w profi.
4.2. Dadansoddiad UPLC-MSMS ar gyfer Nodweddu Cemegol
Paratowyd ObHEx(5{{10}} mg/mL) a'i gyflwyno i echdyniad bwtanol/dŵr deuphasig. Cafodd y ffracsiwn bwtanol ei sychu a'i hydoddi mewn methanol (10mg/mL) cyn y dadansoddiad UPLC-MS/MS. Fe'i cynhaliwyd ar Sbectromedr Màs Clasurol Q-Exactive o Thermo-Scientific (Waltham, MA, UDA) gyda system UPLC Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000. Perfformiwyd yr holl rediadau cromatograffig gan ddefnyddio colofn Phenomenex Luna③C18 100 A （150 × 2.0 mm, maint gronynnau 3 μm） ar 40 gradd C a chyfradd llif o 0.200 mL/min. Cyfaint y pigiad oedd 5 μL. Roedd y cam symudol yn cynnwys A (dŵr o ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Caergrawnt, y DU ar 0.1 y cant o asid asetig) a B (100 y cant acetonitrile o ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Caergrawnt, DU) gan ddefnyddio elution graddiant o 5 y cant B am0-5munud,5-14 y cant B am5-8 mun,14-32 y cant B am 8-11 mun, 32-95 y cant ystlum {{ 26}}munud, 95-98 y cant Ystlumod32-33 mun, 98 y cant B am 33-38munud,98-5 y cant Ystlumod38-39 mun, a 5 y cant B am 33-38munud,98-5 y cant o Ystlumod{32}} mun, a 5 y cant B am { {34}} mun. Cynhaliwyd yr holl ddadansoddiadau MS a MSMS yn y modd negyddol ESI gyda'r gyfradd llif nwy gwain yn 30 (unedau mympwyol), y gyfradd llif nwy ategol yn 5 (unedau mympwyol), y foltedd chwistrellu yn 3.2 kV, a'r tymheredd capilari a tymheredd y gwresogydd nwy ategol ar 300 gradd. Cafwyd data gyda modd MS/dd-MS2 (Top5) Llawn. Y gosodiadau MS llawn oedd: datrysiad 70.000, targed AGC o 1 × 106, uchafswm TG o 200ms, a gallant amrywio o leoliadau 100 i 800 m/z.dd-MS2 oedd: datrysiad 17.500, targed AGC o 2 × 105, uchafswm TG o 65 ms, ffenestr ynysu o 1.5 m/z a NCE o 35.
a gafwyd eu gwirio â llaw. proseswyd data mzXML gan ddefnyddio Mzmine 2.53 cyn y swydd Rhwydweithio Moleciwlaidd Seiliedig ar Nodwedd (FBMN) ar GNPS. Cyflawnwyd y cam canfod màs gan ddefnyddio'r synhwyrydd màs centroid tra'n cadw lefel y sŵn ar 5 × 1{{1{0}}3. Gwireddwyd adeilad cromatogram Piblinell Dadansoddi Data Awtomataidd (ADAP) gyda'r gosodiadau canlynol: maint grŵp lleiaf mewn nifer o sganiau o 5, trothwy dwyster grŵp o 5 × 1{{2{0}}³, min dwysedd uchaf o 5×10 plws ,m/z goddefiant o 0.01 m/z neu 10 ppm. Cyflawnwyd y datgyfnewidiad cromatogram gan ddefnyddio Wavelets (ADAP) fel algorithm, trothwy S/N o 3, uchder nodwedd isaf o 1 × 105, cyfernod/trothwy arwynebedd o 5, ystod hyd brig o 0.{{ 18}}.00 mun, ac amrediad tonfeddi RT o 0.00-0.05. Cafodd cromatogramau eu deotopio gan ddefnyddio'r algorithm grwpiwr brigau isotopig gyda goddefgarwch m/z o 0.001 m/z neu 5.0 ppm a goddefgarwch RT o 0.10 munud. Perfformiwyd swydd FBMN gan ddefnyddio goddefgarwch màs rhiant o 0.02 Da a goddefgarwch ïon darn MS4 o 0.02 Da. Cafodd ymylon eu hidlo i gael trothwy sgôr o 0.7 ac isafswm o 2 gopa cyfatebol. Ar ben hynny, gosodwyd uchafswm nifer y nodau cymdogion ar gyfer pob nod i 10.
4.4. Dadansoddiad Meintiol o Lignans a Triterpenes
Defnyddiwyd yr un amodau UPLC a adroddwyd ar gyfer y dadansoddiad ansoddol ar gyfer dadansoddiad meintiol o lignans, tra ar gyfer triterpenau, cawsant eu hoptimeiddio er mwyn gwahanu dau bâr o isomerau, arjunolic ac asid Asitig. Perfformiwyd y dadansoddiad ar Sbectromedr Màs Clasurol Q-Exactive fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Cyflawnwyd y gwahaniad gan Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150 × 2.1 mm, maint gronynnau 5 μm）. Roedd y cam symudol yn cynnwys hydoddiant dyfrllyd A(5 mM amoniwm asetad, pH 9.00 wedi'i addasu gan amoniwm hydrocsid) a B(100 y cant acetonitrile) gan ddefnyddio elution graddiant o 17-28 y cant B am 0-18 mun, 28-65 y cant B am 18-22 mun, 65-75 y cant B am 22-26munud,75-95 y cant am 26-26 y cant }}, 5 munud, 95 y cant ar 26,5-30 mun, 95-17 y cant ar 30-30,1 mun,17 y cant ar 30,1-42 mun. Y gyfradd llif oedd 0.450 mL/munud a chyfaint y pigiad oedd 5 uL. Ar gyfer lignans a triterpenes, cafwyd data gyda modd MS-SIM a PRM Llawn. Gosodiadau MS-SIM llawn oedd: cydraniad o 70.000, targed AGC o 3×106, uchafswm TG o 200ms, a gall amrywio o 200 i 800 m/z ar gyfer lignans ac o 400 i 850 m/z ar gyfer triterpenes. Gosodiadau PRM oedd: cydraniad 70.000, targed AGC o 2 × 10 gradd , uchafswm TG o 100 ms, ffenestr ynysu o 1.0 m/z, a NCE o 35 yn achos lignans a 50 yn hynny o triterpenes.cistanche AwstraliaPrynwyd Salvador o'r neilltu (#{{0}}XS172930) gan Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, y Swistir), liriodendron (#SMB00181), ac asid arjunolic (#SMB00119) gan Sigma -Aldrich (St. Louis, MO, UDA), Asid Asiatig (#0027) o Extrasynthese (Genay, Lyon, Ffrainc) a hederagenin (#89706) o PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, yr Almaen). Rhodd gan yr Athro Maria Valeria D'Auria, Prifysgol Napoli, oedd asid myrianthic. Cafwyd y cromliniau graddnodi trwy chwistrellu hydoddiannau safonol yn yr ystod crynodiad o 0.25-25 μM ar gyfer lignans a 0.1-25 uM ar gyfer triterpenau. Dangosodd Salvador pur o'r neilltu a liriodendron ddau gopa LC-MSMS, mae'n debyg oherwydd yr ecwilibriwm cemegol a sefydlwyd yn yr hydoddiant. Penderfynwyd ar y terfyn canfod (LOD) a therfyn meintioli (LOO) ar gyfer safonau ar sail y gymhareb signal-i-sŵn (S/N).
4.5.Diwylliannau Celloedd Croen ac Ehangiadau
Cynhaliwyd ffibroblastau dermol dynol (HDF) yn Eryr Addasedig Canolig Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA) gyda 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, UDA) yn atodol. ) mewn 95 y cant o aer, 5 y cant CO, ac awyrgylch llaith ar 37 gradd. Cafodd ecstilau croen, a gafwyd o groen rhoddwyr benywaidd iach (44-47 oed) yn y ganolfan lawdriniaeth Villa Cinzia (Napoli, yr Eidal), eu meithrin mewn 24-blatiau transwell yn DMEM/FBS ynghyd â gwrthfiotigau mewn aer- amodau hylif ar 37 gradd gradd mewn 5 y cant CO2 aer llaith. Roedd pob rhoddwr wedi rhoi eu caniatâd gwybodus ysgrifenedig ar gyfer defnyddio meinweoedd y croen, yn ôl Datganiad Helsinki.
4.6. Prawf Sytowenwyndra
Roedd profion sytowenwyndra yn seiliedig ar y defnydd o'r MTTcompound [{{0}}(45-dimethyl thiazolyl)-2,{3}}diphenyltetrazolium-bromid][34]. Tyfwyd y celloedd mewn 96-platiau ffynnon yn y cyfrwng diwylliant DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), wedi'i ategu gan serwm buchol ffetws 145- y cant, am oddeutu 8 h. Ar ôl triniaeth ag ObHEx rhwng 0.05 y cant a 0.0004 y cant (500 ug/mL a 4 ug/mL) am 48 h, golchwyd y celloedd mewn PBS a'u deor â 100 μL/ffynnon o "byffer adwaith" yn cynnwys ∶ 10 mMof Hepes, 1.3 mM CaCl2, 1mM MgSO, 5 mM o glwcos, a 0.5 mg/mL o swbstrad lliwimetrig MTT mewn byffer PBS ar pH7.4. Ar ôl 3h o ddeor ar 37 gradd C mewn 5 y cant CO, ychwanegwyd 100 μLof hydoddiant hydoddol yn cynnwys 10 y cant o Triton-X100,0.1 N o HCl mewn isopropanol absoliwt at bob ffynnon. Ar ôl deori 16 h, mesurwyd yr adwaith lliwimetrig ar 595 nm gyda'r darllenydd plât Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, UDA).
4.7. Dadansoddiad o Fynegiad y Genyn MYLK a TGF6RII mewn HDF
Fesul ffynnon, tyfwyd gradd 1 × 10 o HDF mewn 6-blatiau ffynnon yn DMEM ar 2 y cant FBS, ar ôl i 24 h FBS gael ei wanhau ymhellach i 0.5 y cant , a'r cafodd celloedd eu trin â chrynodiadau o 0.002 y cant a 0.006 y cant o ObHEx a TGF- 2.5ng/mL, ac yna deoriad o2h ar gyfer MYLKand 48 ar gyfer TGFRII. Ar gyfer echdynnu RNA, defnyddiwyd y pecyn "GenEluteM Total RNA Purification" a brynwyd gan y cwmni Merck (Darmstadt, yr Almaen). Ar ôl y triniaethau a nodwyd, golchwyd y celloedd â PBS, eu casglu mewn byffer lysis, a'u dilyn i'r weithdrefn echdynnu fel yr adroddwyd. Cafodd y samplau eu trin â DNase I (Ambion, Austin, TX, UDA) ar 37 gradd am 30 munud i gael gwared ar yr halogydd DNA genomig. O bob sampl, llwythwyd 2 μL ar gel 1 y cant agarose ym mhresenoldeb llifyn llwytho dadnatureiddio at ddiben meintioli faint o RNA gan gyfeirio at farciwr penodol ar gyfer RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, UDA). Defnyddiwyd GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, UDA) fel meddalwedd ar gyfer meintioli. Nesaf, cafodd 300 ng o gyfanswm RNA ei ôl-drawsysgrifio gan ddefnyddio'r ensym trawsgrifiad gwrthdro (ThermoScientific, Waltham, MA, UDA). Cynhaliwyd RT-PCR lled-feintiol gan ddefnyddio'r pâr o preimio preimio cyffredinol 18S primer/cystadleuydd (Ambion, Austin, TX, UDA) fel safonau mewnol. Gwahanwyd y cynhyrchion PCR ar gel agarose 1.5 y cant, eu gweld gan ddefnyddio'r offeryn Reliance (PerkinElmer, Waltham, MA, UDA), a'u dadansoddi yn ôl densitometreg gan ddefnyddio meddalwedd Genetools. Roedd dilyniannau'r paent preimio a ddefnyddiwyd ar gyfer ymhelaethu fel a ganlyn: MYLK FW: ATCAAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.
4.8. Dadansoddiad o Gynhwysedd Crebachu Matrics Collagen
Ynglŷn â chelloedd HDF, cafodd gradd 2.0 × 10 eu haildynnu mewn cyfrwng twf 5x DMEM (Gibco, Waltham, MA, UDA) mewn 24-plât ffynnon, a 2 mg/ Ychwanegwyd toddiant mL o golagen o groen buchol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA) at bob ffynnon. Addaswyd pH yr hydoddiant i 7.2. Deorwyd y plât ar 37 gradd C am 45 munud i ganiatáu i'r gel colagen galedu. Ychwanegwyd DMEM gyda 10 y cant FBS a/neu ML7 25 uM, fel atalydd MYLKprotein, yn ddiweddarach. Ar ôl 16 h, cliriwyd ML7 ac ychwanegwyd ObHExat y crynodiad o 0.002 y cant yn DMEM gyda 2 y cant FBS. Defnyddiwyd TGF- 2.5 ng/mL fel rheolydd positif. Cafodd y ddisg o golagen a ffurfiwyd ei wahanu ar unwaith o'r ffynnon trwy ddefnyddio sbatwla micro di-haint er mwyn hyrwyddo ei grebachu. Mesurwyd ardaloedd disg pob triniaeth ar amser 0 a 5 h a'u dadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd Image.
4.9. Dadansoddiad o Radd Polymerization Actin
Nesaf, tyfwyd gradd 1.5 × 10 o gelloedd HDF fesul ffynnon mewn 24-plât ffynnon a'r diwrnod wedyn ychwanegwyd y cyfrwng gyda 2 y cant FBS a'r Cytochalasin B, sy'n atalydd actin polymeriad, ar 2 μM am 3{{1{{20}}} mun. Ar ôl 30 munud, ar y celloedd, ychwanegwyd ObHEx （0.002 y cant a0.006 y cant ） ynghyd â TGF- 2.5 ng/mL, a ddefnyddir fel rheolydd positif, a ML7 25μM, fel a rheolaeth negyddol ar y MYLKenzyme. Ar ôl 30 munud o driniaeth, gosodwyd y celloedd gyda 4 y cant o baraformaldehyd (PFA) mewn ffosffad byffer am 30 munud ar rew. Cafodd y celloedd eu golchi â PBS a'u treiddio â thoddiant o byffer ffosffad a Triton-X100 ar 0.2 y cant am 30 munud. Yn dilyn hynny, deorwyd y celloedd â hydoddiant o 0.4 μM o phalloidin wedi'i gyfuno â rhodamine (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, UDA) am 1 h yn y tywyllwch.buddion cistancheAr amser 0 ac ar ôl 18h, mesurwyd y fflworoleuedd ar 540/570 nm gan ddefnyddio darllenydd plât Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, UDA). 4.10.Dadansoddiad o Lwybr SMAD2
Cafodd celloedd HDF eu hadu ar ddwysedd o 3 × 103 mewn 96- platiau ffynnon ac ar ôl 16 h fe'u trawsffurfiwyd gan ddefnyddio adweithydd trawsyrru DNA X-tremeGeneTM HP (Roche Diagnostics, Basel, y Swistir) gyda fector gohebydd Smad2 yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Ar ôl 24 h, cafodd y celloedd eu trin ag ObHEx neu TGF- 2.5 ng/mL, ar eu pen eu hunain neu mewn cyfuniad ag ML7 25 μM am 24 h. Ar ddiwedd y deori, golchwyd y celloedd â PBS a phenderfynwyd gweithgaredd luciferase trwy ddefnyddio system assay SteadyGlo Luciferase (Promega Corporation, Madison, WI, UDA) yn y Darllenydd Plât Multiwell Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , UDA).
4.11.Dadansoddiad o Pro-Colagen I, Tropoelastin, a Synthesis Periostin
Fesul ffynnon, cafodd 8 × 103 HDF eu tyfu mewn 96-platiau ffynnon a'u trin â'r 0.002 y cant o ObHEx neu TGF 2.5 ng/mL. Ar ôl 24 h, proseswyd y celloedd ar gyfer ELISA gan ddefnyddio gwrthgyrff sylfaenol monoclonaidd gwrth-procolagen math I (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, UDA), ac yna deor gyda'r gwrthgorff gwrth-lygoden eilaidd wedi'i labelu gyda peroxidase (170-6516, Biorad, Hercules, CA, UDA). Roedd goruwchnafyddion y celloedd wedi'u gorchuddio ar blât arall ar gyfer canfod tropoelastin a pheriostin gan ddefnyddio'r gwrthgorff cwningen gwrth-tropoelastin (ab21600, Abcam, Caergrawnt, U neu wrthgorff llygoden gwrth-periostin(sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology) , Dallas, TX, UDA), ac yna deor gyda gwrthgyrff eilaidd gwrth-gwningen wedi'i labelu â peroxidase (170-6515, Biorad, Hercules, CA, UDA). OPD (O-phenylenediamine), 0.35 mg/mL mewn byffer citrad 50 mM, a 0.012 y cant hydrogen perocsid (H2O2) Ar ôl 30 munud, mesurwyd yr amsugnedd ar 490 nm gan ddefnyddio'r darllenydd lluosog Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, UDA).
4.12. Cyn Profion Vivo
Gwerthuswyd imiwnoHistoFlworoleuedd(IHF)o myosin ffosfforyleiddiedig MYLK a mewn hylifau croen {{0}}rhoddwyr mlwydd oed. Torrwyd elifion croen dynol gyda chiwretau biopsi dyrnu o 8 mm a'u meithrin mewn 24-platiau ffynnon yn DMEM gyda 10 y cant FBS a gwrthfiotigau. Cafodd y punches a gafwyd eu trin â 0.002 y cant a 0.006 y cant o ObHEx am 24 awr. Cawsant eu deor mewn swcros 15 y cant, yna mewn swcros 30 y cant, ac yn olaf wedi'u rhewi. Nesaf, cafwyd adrannau 10 μm gan ddefnyddio cryostat CM1520 (Leica Microsystems, Wetzlar, yr Almaen). Cafodd sleidiau gyda cryosections eu hydradu am 30 munud mewn PBS a'u rhoi mewn datrysiad "blocio" (6 y cant BSA, serwm 5 y cant, 20 mM MgCl,, 0.2 y cant Tween) am 1 h. Deorwyd cryosections gyda'r prif wrthgorff cwningen gwrth-MYLK (1: 100, GeneTex, Irvine, CA, UDA) a'r gwrthgorff cynradd gwrth-ffosffo-myosin (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, UDA) am 16 h yn 4 gradd. Golchwyd y sleidiau gyda PBS am 30 munud ac yna eu deor gyda'r gwrthgorff gwrth-gwningen eilaidd Alexa-Fluor 546 (1:1000; ThermoFisher A11035, Waltham, MA, UDA) am 1 h. Cafodd y cnewyllyn eu staenio â DAPI(4',6-5 diamidino-2-phenylindole)1 ug/mL yn PBS am 10 munud. Cafodd y delweddau eu caffael gyda microsgop fflworoleuedd a'u dadansoddi gyda meddalwedd ImageJ. Ar gyfer IHF tropoelastin a cholagen I, defnyddiwyd ecsbloetio croen 36-roddwyr benywaidd. Cafwyd biopsïau croen fel y disgrifiwyd uchod a'u trin ymlaen llaw gyda 0.002 y cant a 0.006 y cant o ObHEx am 24 h. Ychwanegwyd straen gyda hydrocortisone ar 10 ug/mL am 8 diwrnod ym mhresenoldeb ObHEx. Wedi hynny, cafodd biopsïau eu rhewi fel y disgrifir uchod a deorwyd yr adrannau â'r gwningen gwrth-tropoelastin gwrthgorff cynradd (1: 1000 ab21600, Abcam, Caergrawnt, y DU) a gwrth-colagen I (1: 100 C2456 Merck, Darmstadt, yr Almaen) ar gyfer 16 awr ar 4 gradd. Dadansoddwyd y sleidiau fel y disgrifiwyd uchod a chaffaelwyd a dadansoddwyd y delweddau gyda meddalwedd ImageJ.
4.13. Microsgopeg Grym Atomig (AFM) mewn Ehangiadau Croen
Gwerthuswyd hydwythedd samplau croen heb eu trin a'u trin ag ObHEx gan sicrhau modwli eu Young trwy ddull ar raddfa nanometrig yn seiliedig ar Ficrosgopeg Grym Atomig (AFM), a ddatblygwyd nid yn unig ar gyfer samplau biolegol ond hefyd ar gyfer rhai anorganig. Mae'r dulliau hyn yn seiliedig ar ragdybiaethau modelau Hertz ac yn ystyried y sampl a'r cantilifer fel dwy sbring mewn cyfres mewn lleoliad arbrawf AFM. Yn gryno, cyn-blanhigion croen a gafodd eu trin â 0.0Torrwyd 06 y cant o samplau OHEx a chroen heb ei drin gan cryostat mewn tafelli o 10 um o drwch. Roedd samplau yn cael eu storio ar 12 gradd , yna eu golchi â PBS a'u harchwilio ar dymheredd sefydlog a lleithder cymharol o 22 gradd a 55 y cant , yn y drefn honno. Ymchwiliwyd i bob sampl gan AFM NanoScope IIA mewn Modd Sengl Sbectrosgopeg Grym gan ddefnyddio blaen pyramid (RESP-20) gyda chysonyn sbring o 0.9 N/m. I gyfrifo modwlws Young, cafwyd deg cromlin Llu mewn deg pwynt gwahanol o'r un arwynebau sampl. Mae pob cromlin Grym yn gromlin gwyro (folt) yn erbyn dadleoli (nm) a gellir ei thrawsnewid yn gromliniau Grym (N) yn erbyn gwahaniad (nm). Yn wir, mae pob cromlin Heddlu yn adrodd cromliniau llwytho a dadlwytho. Maent yn cynrychioli tueddiad y domen mewn perthynas â'r sampl: pan fydd y domen ymhell o'r sampl pan fyddant yn dod i gysylltiad a'r blaen yn dechrau gwyro, a phan fydd yn symud i ffwrdd eto. Dim ond rhan gyntaf y cromliniau hyn y gellir eu harchwilio. Roedd pob un o'r rhannau hyn o'r cromliniau yn cyd-fynd â model Hertzian safonol, yn arbennig, yr Hertzequation nodweddiadol ar gyfer blaen pyramid, i echdynnu'r modwlws elastig a elwir yn fodwlws Young yn GPa.
4.14. Dadansoddiad Ystadegol
Roedd yr holl werthoedd a adroddwyd yn gyfartaledd o dri arbrawf annibynnol, pob un ohonynt yn cael ei berfformio mewn triphlyg. Mae'r seren yn dynodi arwyddocâd ystadegol wedi'i gyfrifo mewn cytundeb â'r prawf-t: *gwerth yn golygu Llai na neu'n hafal i 0.05;** gwerth p Llai na neu'n hafal i 0. 01;*** gwerth p Llai na neu'n hafal i 0.001.
Daw'r erthygl hon o Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites
