Gwrth-Heneiddio - Mae Sgaffald Wedi'i Actifadu â Genynnau Klotho yn Hyrwyddo Ymateb Iachau Clwyfau Adnewyddol mewn Bôn-gelloedd sy'n Deillio o Adidos Dynol

Geiriau allweddol:wrth heneiddio; -Klotho; sgaffald a weithredir gan enynnau; bôn-gelloedd sy'n deillio o adipose; angiogenesis;dyddodiad matrics;iachâd adnewyddol

Cliciwch Yma I Gael Cistanche Perlysiau Ar Gyfer Gwrth-Heneiddio a Iachau Clwyfau

1. Rhagymadrodd

Mae iachau clwyfau yn broses fiolegol gymhleth sy'n gofyn am offeryniaeth dynn o ddigwyddiadau cellog lluosog [1]. Fodd bynnag, yn y boblogaeth sy'n heneiddio, amharir ar ddigwyddiadau cellog, gan arwain at oedi wrth wella [2]. Mae'r amhariad yn y mecanweithiau iachau yn deillio'n rhannol oherwydd bod llai o gartrefu yn y celloedd epil o'r mêr esgyrn a chlefydau metabolaidd cyffredinol eraill fel diabetes [3,4]. Wrth reoli clwyfau, mae cymhwyso sgaffaldiau biomaterial yn dod yn fwy cyffredin fel triniaeth. Sgaffaldiau bioddeunyddamddiffyn y clwyf rhag haint, amsugno exudates clwyfau, a chadw'r clwyf yn llaith i atal necrosis meinwe [5]. Gall therapiwteg hefyd gael ei lwytho i sgaffaldiau bioddeunydd a hyrwyddo iachâd cyflymach mewn clwyfau anodd eu gwella [1]. Fodd bynnag, efallai na fydd sgaffaldiau bioddeunydd yn unig yn trefnu'r rhaeadrau signalau lluosog sy'n digwydd o fewn y clwyf yn effeithiol. Weithiau cynigir cyflwyno bôn-gelloedd fel ateb ar gyfer cymedroli'r digwyddiadau signalau cymhleth yn y clwyf [6]. 

Mae bôn-gelloedd yn secretu ffactorau paracrine a gallant wahaniaethu i gelloedd o linachau meinwe lluosog [7]. Mae bôn-gelloedd fel arfer yn cael eu danfon i'r clwyf trwy bigiadau intradermal [6], chwistrellu amserol [8], neu fel impiadau wedi'u peiriannu â meinwe [9]. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae cymhwyso impiadau wedi'u peiriannu â meinwe ar gyfer iachâd clwyfau cronig wedi ennill derbyniad ehangach yn raddol oherwydd eu gallu i wella clwyfau yn gyflym [9–11]. Apligraf® a Dermagraft® yw dau o'r lluniadau biobeirianyddol a gymeradwyir gan Weinyddiaeth Bwyd a Chyffuriau (FDA) ar gyfer trin clwyfau cronig [12,13]. Fodd bynnag, mae cynhyrchu'r impiadau hyn yn gofyn am feithriniad celloedd hirfaith i gynhyrchu niferoedd uchel o gelloedd [14]. Wrth ddefnyddio bôn-gelloedd, gall meithriniad hirfaith gynyddu heneiddedd cellog a lleihau coesyn y bôn-gelloedd [15,16]. Felly, mae cynnal cadernid y bôn-gelloedd yn ganolog i sicrhau'r ymateb therapiwtig gorau posibl. Mae cyflenwi genynnau therapiwtig i'r bôn-gelloedd gan ddefnyddio fectorau anfeirysol yn strategaeth bosibl i wella ymarferoldeb bôn-gelloedd [17]. Yn draddodiadol, mae'r celloedd yn cael eu trawsblannu mewn diwylliannau 2 D ac yn ddiweddarach yn cael eu trawsblannu in vivo [18]. Fodd bynnag, mae llwyfannau fel y sgaffaldiau a weithredir gan enyn, sy'n cynnwys sgaffaldiau biomaterial yn gweithredu gyda nanoronynnau sy'n cario'r trawsgen therapiwtig [19], bod ein grŵp wedi bod yn arloesi i gynnig datrysiad amgen ar gyfer trawsnewid y celloedd o fewn amgylchedd 3-D. Canolbwyntiodd yr astudiaeth hon ar ddatblygu fersiwn wedi'i actifadu gan enynnau o'r sgaffald colagen-chondroitin sylffad 3D (coll-CS) sydd â photensial cyfieithu clinigol aruthrol, gan fod ei gyfansoddiad yn debyg i gyfansoddiad Templed Adfywio Dermol Integra (DRT), a gymeradwyir yn glinigol. sgaffald ar gyfer gwella clwyfau cronig [20]. Rydym yn bennaf yn defnyddio polymer cationig o'r enw polyethyleneimine (PEI) i gyddwyso amgodio plasmidau DNA ar gyfer genynnau ffactor twf fel y ffactor twf sy'n deillio o stromal -1 alffa a ffactor twf nerfau a'u cydosod yn nanoronynnau wedi'u gwefru [21–23]. Yna mae'r nanoronynnau gwefredig hyn yn cael eu socian i'n sgaffaldau coll-CS i gynhyrchu'r sgaffaldiau a weithredir gan enynnau. Mae ein hastudiaethau blaenorol hefyd wedi dangos y gall y sgaffald a weithredir gan enynnau sy'n seiliedig ar PEI achosi gorfynegiant dros dro o'r trawsgenyn therapiwtig mewn ystod o gelloedd iachau clwyfau a hyrwyddo eu galluoedd adfywiol [21,24,25]. Yn draddodiadol, datblygwyd y sgaffald a weithredwyd gan enynnau i dargedu celloedd gwesteiwr a hyrwyddo atgyweirio lleol [26]. Fodd bynnag, mae tystiolaeth sy'n dod i'r amlwg yn dangos bod sgaffaldiau sy'n llawn celloedd ac sy'n cael eu hysgogi gan enynnau yn fwy pwerus i adfywio strwythurau meinwe cymhleth na sgaffaldiau a weithredir gan enynnau yn unig [27]. 

Digonedd cellog yw un o'r gofynion hanfodol ar gyfer cynhyrchu impiadau wedi'u peiriannu â meinwe [28]. Mae'r meinwe adipose yn ffynhonnell gyfoethog a all gyflenwi nifer fawr o fôn-gelloedd. Mae'r meinwe adipose yn cynnwys cymaint â 500 gwaith y bôn-gelloedd ar gyfer yr un màs o fêr esgyrn, ffynhonnell feinwe traddodiadol ar gyfer echdynnu bôn-gelloedd [29]. Ar ben hynny, gellir echdynnu'r bôn-gelloedd o'r meinwe adipose gan ddefnyddio proses liposugno leiaf ymledol [29]. Canfu ein hastudiaeth ddiweddar fod bôn-gelloedd sy'n deillio o lygod dynol (ADSCs) yn dangos biogydnawsedd rhagorol â'r sgaffald coll-CS. Roedd defnyddio sgaffald wedi'i ysgogi gan genynnau pro-angiogenig wedi gwella ymatebion adfywiol ADSCs ymhellach [30]. Fodd bynnag, mae'r ADSCs yn dueddol o golli eu cryfder wrth ehangu [31]. Yn flaenorol, canfuom fod protein gwrth-heneiddio -Gallai Klotho wella'n sylweddol nifer yr ADSCs dynol iach a diabetig [32]. Yn gyffredinol, mae'r rhan fwyaf o astudiaethau'n defnyddio'r amrywiad cynradd -Klotho % 5b33–35] ac wedi dangos y gall y protein gynyddu hyd oes ADSCs trwy actifadu'r gweithgaredd trawsgrifio telomerase [33]. -Canfuwyd hefyd bod MSC sy'n gorfynegi Klotho yn cael effeithiau gwrth-ffibrotic cryf mewn anaf i'r arennau trwy atal Wnt/ -catenin signalau [36]. Fodd bynnag, mae rôl -Klotho mewn bôn-gelloedd yn parhau i fod yn gymharol heb ei archwilio.

Heblaw am y gwahaniaeth yn y ffocws ymchwil rhwng y - a -Klotho, y gwrth-heneiddioNid yw proteinau Klotho wedi'u hymgorffori'n llawn eto yn y strategaethau peirianneg meinwear gyfer gwella clwyfau. Felly, yn yr astudiaeth hon, ceisiwyd astudio effaith swyddogaethol a -Sgaffald a weithredir gan enynnau Klotho ar ADSCs dynol ar gyfer cymwysiadau gwella clwyfau. Rydym niymchwilio'n gyntaf i weithgareddau trawsgrifio'r ffactorau lluosogrwydd clasurol (Hydref-4,Nanog, a Sox-2), marciwr amlhau (Ki-67), a rheolyddion gwella clwyfau (TGF- 3 a TGF- 1) yn yr ADSCs. Yna fe wnaethom asesu bioactifedd y cyfryngau cyflyrua gynhyrchir gan y sgaffald a weithredir gan enynnau llawn ADSCs i werthuso ei botensial paracrine.Yn y pen draw, archwiliwyd adfywiad y bilen islawr (fibronectin, laminin,a cholagen IV) a phroteinau sy'n gysylltiedig â chreithiau ( -SMA ac elastin) yn yr ADSCs-llwythogsgaffald a weithredir gan enynnau i werthuso aeddfediad meinwe rheoledig.

2. Canlyniadau

2.1. -Mae Sgaffald Wedi'i Actifadu â Genynnau Klotho yn Gwella Coesynnedd ADSC Dynol a Genynnau Pro-Atadol Dros Dro

Dangosodd dadansoddiad mynegiant genynnau yn gyntaf fod yr ADSCs ar y sgaffald a weithredir gan enynnau yn gorfynegi'r -Klotho genyn dros 172-plyg (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1A). Cadarnhaodd y canfyddiad hwn ryngweithiad effeithlon yr ADSCs â'r sgaffald a weithredir gan enynnau. Cadarnhaodd dadansoddiad o'r marciwr amlhau Ki-67 ymhellach fod yr ADSCs ar y sgaffald a weithredir gan enynnau hefyd wedi cynnal gallu lluosogi cadarn dros 14 diwrnod (Ffigur1A). Ar ôl cadarnhau gorfynegiant y gwrth-heneiddio -Klotho genyn, rydym wedyn yn asesu adfywiad bôn-gelloedd 'trwy actifadu ffactorau "lluosogrwydd" yn yr ADSCs. Ar y cyfan, fe wnaethom nodi rheoliad dros dro o'r tri ffactor trawsgrifio dros y 14 diwrnod (Ffigur1B). Fodd bynnag, dim ond cynnydd sylweddol a ddangosodd yr ADSCs ym mynegiant y genyn Hyd-4 a oedd yn parhau tan ddiwrnod 14. Yn benodol, dangosodd yr ADSCs 2.5-plyg (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Lefelau'r TGF pro-fibrotig- 1 enyn yn y -Canfuwyd bod Klotho a oedd yn gorfynegi ADSCs yn cyfateb i rai'r grŵp sgaffald di-enyn dros y 14 diwrnod. Fodd bynnag, mae lefelau TGF gwrth-ffibrotic roedd 3 yn arwyddocaol (3.6-plyg,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Klotho Sgaffald Gene-Actifedig

Gwella Gallu Paracrine ADSCs Dynol2.2.1. Bioactifedd Pro-Angiogenig Dangosodd prawf bioactifedd y CM a gynhyrchwyd gan sgaffald a weithredir gan enynnau llawn ADSCs yn gyntaf y gallai reoli'r gweithgaredd metabolig mewn HUVECs dros dro. Fe wnaeth diwrnod 3 CM wella'r gweithgaredd metabolig mewn HUVECs yn sylweddol, tra bod defnyddio CM oed o ddiwrnod 14 wedi lleihau gweithgaredd metabolig HUVEC yn sylweddol (Ffigur2A). Ar ôl arsylwi hyn, fe wnaethom wedyn brofi effaith pro-angiogenig y CM o ddiwrnod 3 a 14 ar y HUVECs a hadwyd ar Matrigel. Fel y rhagwelwyd, diwrnod 3 CM o'r grŵp sgaffald a weithredir gan enyn yn arwyddocaol (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Fodd bynnag, ni chafwyd unrhyw gynnydd pellach yn y gweithgaredd angiogenig gyda diwrnod 14 CM o'i gymharu â diwrnod 3 CM. Hefyd, dangosodd y diwrnod 14 CM o'r ddau grŵp effeithlonrwydd pro-angiogenig tebyg (Ffigur2C). Gyda'i gilydd, mae ein canfyddiad yn dangos bod y sgaffald sy'n cael ei actifadu â genynnau yn hwyluso ymateb pro-angiogenig ADSCs dros dro.

TGF pro-ffibrotic- 1. ** a * yn dynodip < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± gwyriad safonol (n = 3).

Ffigur 2. Bioactifedd paracrine pro-angiogenig y sgaffald CM wedi'i actifadu â genynnau llawn ADSCs. (A) Dangosodd CM a gynhyrchwyd gan y sgaffald actifadu genynnau llawn ADSCs dros y 14 diwrnod y gallu i reoli gweithgaredd metabolig HUVECs dros dro. (B) Diwrnod 3 CM o'r grŵp sgaffald a weithredir gan enynnau yn gwella ffurfiant tiwbyn endothelaidd yn sylweddol a'i ganghennau o'i gymharu â'r grŵp sgaffald di-genyn. (C) Ffurfiant tiwbyn a changhennog celloedd endothelaidd 6hpost-amlygiad i CM o'r ADSCs sgaffald genyn wedi'i actifadu a heb genynnau, mae * yn dynodi p < 0.05. Mae data yn cynrychioli cymedr! gwyriad safonol (n=3)

2.2.2. Iachau Fibroblast Dermol ac Aeddfediad

Un o ganfyddiadau'r astudiaeth angiogenesis yw, wrth i'r sgaffald a weithredir gan enynnau llawn ADSCs aeddfedu, nad yw bellach yn hyrwyddo angiogenesis. At hynny, ar ddiwrnod 14 roedd eu gallu angiogenig yn debyg i allu’r grŵp sgaffald di-genyn (Ffigur 2B, C) Felly, fe wnaethom ymchwilio i ddylanwad CM diwrnod 14 oed ar gau clwyfau ffibroblast dermol. Yn debyg i ganlyniad yr astudiaeth angiogenesis, dangosodd y ddau grŵp lefelau tebyg o gau clwyfau ffibroblast gyda diwrnod 14 CM. Yn benodol, iachaodd y ddau grŵp y clwyf tua 40 y cant mewn 12 h (Ffigur 3A). Datgelodd y canfyddiad hwn, yn ystod aeddfedu, fod y grŵp sgaffald a ysgogwyd gan enyn yn cefnogi cau clwyf ffibroblast dermol ond nad yw'n hyrwyddo cau clwyfau ffibroblast dermol.

Serch hynny, wrth i'r ffibroblastau gael eu hysgogi gan CM oedrannus, fe wnaethom astudio a oedd dylanwadau mynegiant proteinau matrics sy'n gysylltiedig ag aeddfedu clwyfau. Fel y rhagwelwyd, mynegodd ffibroblastau dermol a ysgogwyd â CM o'r grŵp sgaffald di-genyn yn helaeth y protein colagen I pro-ffibrotic (Ffigur 3B). I'r gwrthwyneb, dangosodd ffibroblastau a ysgogwyd â CM o'r grŵp sgaffald a weithredwyd gan enynnau 50 y cant yn is (p <0.05) o'r protein colagen I. Yn y cyfamser, nid oedd gan y ddau grŵp y mynegiant o golagen gwrth-ffibrotic i gyd, ac ni welwyd unrhyw wahaniaethau rhwng y ddau grŵp. Gyda'i gilydd, mae'n awgrymu bod y sgaffald a weithredir gan enynnau yn gwella ymateb modiwlaidd ADSCswound yn ystod aeddfedu.

Ffigur 3. Dylanwad paracrine ar iachâd dermol ac aeddfedu. (A) Diwrnod oed 14 CM o'r ddau grŵp wedi cyflawni lefelau tebyg o weithgarwch cau clwyfau mewn ffibroblastau dermol oedolion dynol o tua 40 y cant mewn 12 h.(B) CM o'r sgaffald a weithredir gan genynnau wedi lleihau'r mynegiant yn sylweddol o golagen pro-ffibrotic yn y ffibroblastau. " yn dynodi p < 0.05Mae data yn cynrychioli=gwyriad safonol cymedrig (n=3). Yn Ffigur 3B, mae GAS a GFS yn sefyll am sgaffald a weithredir gan enynnau a sgaffald di-genyn yn y drefn honno

2.3. Mae Sgaffald Wedi'i Weithredu â Genynnau B-Klotho yn Gwella Adfywio Pilenni Islawr gyda Gwell Ymateb Gwrth-Fibrotig mewn ADSCs Dynol

Ar ôl arsylwi ysgogiad rheoledig y sgaffald a weithredir gan enynnau o weithrediad ADSCs, yn y pen draw fe wnaethom ymchwilio i ymateb yr ADSCs tuag at adfywio matricsau dermol a phroteinau. Roedd y sgaffald a weithredir gan enynnau yn gwella adfywiad pilen islawr ADSCs yn gadarn. Yn benodol, roedd y sgaffald a ysgogwyd gan enyn yn hyrwyddo'n sylweddol ddyddodiad cydrannau pilen islawr laminin a cholagen IVFigure 4A). Ar ôl y dadansoddiad lled-feintiol, fe wnaethom hefyd nodi bod y dyddodiad matrics yn dilyn tueddiad o'i gymharu â'r grŵp sgaffald di-genyn. Y duedd a welwyd oedd ffibronectin (1.0-plyg) < laminin (2.1-plyg, p < {{10}}.05) < colagen IV (8.8-plyg, p < 0.01). Unwaith y penderfynwyd ar y gallu i adfywio pilen yr islawr, fe wnaethom wedyn asesu mynegiant proteinau sy'n hanfodol ar gyfer iachâd ansoddol uwch, megis llai o greithiau. Roedd yr ADSCs ar y sgaffald a weithredir gan enynnau yn dangos mynegiant gostyngol sylweddol (p < 0.05) o'r protein contractile a-SMA sy'n gysylltiedig â chreithiau. Roedd y mynegiant a-SMA yn yr ADSCs yn is 50 y cant o'i gymharu â'r grŵp sgaffald di-genyn (Ffigur 4B). Yn olaf, ar ôl arsylwi ar y mynegiant llai o a-SMA, fe wnaethom asesu mynegiant y protein matrics elastig elastin. Roedd yr ADSCs ar y sgaffald a weithredir gan enynnau yn dangos mynegiant elastin ansoddol cymharol well trwy ddyddodiad rhwydwaith ffibrog aeddfed o elastin o'i gymharu â'r ADSCs ar y sgaffald di-genyn (Ffigur 4B).

Ffigur 4. Dyddodiad o broteinau matrics iachau pro-glwyf gan yr ADSCs yn y sgaffald a weithredir gan enynnau ar ddiwrnod 14.(A) Dangosodd yr ADSCs yn y sgaffald a weithredir gan enynnau adfywiad sylweddol. gweithrediad y bilen islawr o'i gymharu â'r ADSCs yn y sgaffald di-genyn. Roedd yr ADSCs yn bennaf yn dyddodi rhwydwaith cymharol aeddfed o broteinau colagen IV, ac yna laminin a ffibronectin.(B) Mynegodd yr ADSCs yn y sgaffald a weithredir gan enynnau hefyd 2-plyg yn is o'r protein SMA o'i gymharu â'r ADSCs yn y genyn. - sgaffald rhad ac am ddim. Ar y cyd â mem islawr. adfywio brane, y ADSCs yn y genyn-activated sgaffald dyddodi matrics elastig ansoddol well. Cafodd yr holl ddelweddau eu dal trwy amcan 20x gan ddefnyddio microsgop IX73 Olympus* ac mae * yn dynodi p < 0.01 a p < 0.05 yn y drefn honno. Graddfa bar 50um. Mae data'n cynrychioli gwyriad safonol cymedrig (n=3).-Cafodd SMA a ffibronectin eu himiwnostain dwbl.

E-bost:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plws 86 15292862950