Potensial Gwrth-Heneiddio Cistanche Seiliedig ar Sylweddau Ar gyfer Hirhoedledd Croen Dynol

2.5. Effaith Melanogenig Gel Cistanche mewn System Cyd-ddiwylliant Keratinocyte-Melanocyte

Ar ôl cyd-ddiwyllio melanocytes a keratinocytes yn llwyddiannus (cymhareb 1:5), y melanogenigeffaith oCistancheymchwiliwyd i gel yn y system cyd-ddiwylliant. Gwnaethom ddangos nad oedd y casgliad o felanosomau yn cynydduCistanchegel yn cynnwys 1-10 ug/mL o Cistanche (Ffigur 5A), tra bod hormon ysgogol alffa-melanocyte (MSH), rheolydd positif, wedi cynyddu cryn dipyn ar groniad melanosom. I gadarnhau effaithCistanchegel ar synthesis melanin, meintiolwyd y cynnwys melanin allgellog neu fewngellog ym mhresenoldeb gel Cistanche yn y system cyd-ddiwylliant. Mae Ffigur 5B yn dangos na wnaeth gel Cistanche sy'n cynnwys 1-10 ug/mL o Cistanche wella synthesis melanin o'i gymharu â thriniaeth PBS i gelloedd, tra bod alffa-MSH wedi cynyddu'n gryf y cynnwys melanin yn y system cyd-ddiwylliant.

Ffigur 5.Effaith Cistanchegel ar melanogenesis mewn system cyd-ddiwylliant keratinocyte-melanocyte. (A) Ar gyfer dadansoddiad immunofluorescence o melanosom, cafodd celloedd cyd-ddiwylliedig eu trin â dos cynyddol o gel Cistanche (1-10 ug/mL) am 72 h, ac yna eu gosod a'u dadansoddi trwy labelu immunofluorescence gyda gwrth-ddyn dynol HMB-45 gwrthgorff, gan ddeor o'r diwedd gyda lgG llygoden cyfun fflworoleuol. Cafodd niwclei eu labelu â DAPI. Bar graddfa=500 um. (B, C) Meintioli effaith gel Cistanche ar gynhyrchu melanin yn y system cyd-ddiwylliant. Yn dilyn deori gyda chrynodiadau cynyddol o Cistanche ge.1-10 ug/mL) am 72 h, pennwyd lefelau allgellog (B) a mewngellol (C) melanin ar wahân trwy fesur yr amsugnedd ar 405 nm. Defnyddiwyd PBS neu alffa-MSH fel rheolaeth negyddol neu bositif, yn gywir. Cynrychiolir pob gwerth fel cymedrig plws DC o dri arbrawf annibynnolHMB, dynol melanoma du; lgG, imiwnoglobwlin G; DAPI, 4' ,6-diamidino-2-ffenylindole; Hormon ysgogol MSHmelanocyte.

Sicrhewch Sampl Detholiad Cistanche Sp Yma

3. Trafodaeth

Cistanche, undecapeptide sy'n perthyn i'r teulu tachykinin o peptidau, mae ganddo affinedd ffafriol ar gyfer y derbynnydd niwrokinin-1 (NK-1R) (21]. Ar ôl rhwymo i NK-1R,Mae Cistanche yn ysgogi llawer o arwyddion gwella clwyfau, megis twf celloedd(15,22), synthesis colagen (17,23), a rheoleiddio gwrth-lid (24-26Mae gallu Cistanche i wella clwyfau yn awgrymu y gellir ei gymhwyso fel deunydd gwrth-heneiddio, trwy gynhyrchu colagen ac atal llid Fodd bynnag, mae'r defnydd o Cistanche wedi bod yn gyfyngedig oherwydd ei sefydlogrwydd isel (19,27) Yn flaenorol, fe wnaethom adrodd fformiwleiddiad newydd o Cistanche, sef gel Cistanche, a arweiniodd at weithgareddau gwella clwyfau cryfach na Cistanche yn unig, gyda gwell sefydlogrwydd (20). ) Mae'r data hyn gyda'i gilydd yn awgrymu y gallai cymhwyso gel Cistanche yn wir wella'reffeithiau gwrth-heneiddio Cistanche yn unig ar groen dynol. Fodd bynnag, nid yw effeithiau gwrth-heneiddio gel Cistanche wedi'u dangos ar groen dynol eto. Felly, nod yr astudiaeth bresennol oedd pennu gallu gwrth-heneiddio gel Cistanche i'w ddefnyddio fel cynhwysyn cosmetig. Yn yr astudiaeth bresennol, cynyddodd gel Cistanche yn sylweddol fynegiant procollagen math l, sef y protein mwyaf helaeth mewn meinweoedd cyswllt croen ( 28] (Ffigur 2A) Yn gyffredinol, mae procolagen math I yn cael ei ddiraddio'n bennaf gan MMPs, sef teulu o endo-proteasau sy'n gofyn am sinc, sy'n gallu diraddio holl gydrannau'r ECM (29].

Yn benodol, mae MMP{0}} yn cychwyn diraddio procolagen math I (30)Awgrymwyd yn flaenorol bod lefel MMP-1 yn uniongyrchol gysylltiedig â TIMP-1. Fel atalydd meinwe metalloproteinase 1, mae TIMP-1 yn dylanwadu'n anuniongyrchol ar drawsgludiad signal sy'n ddibynnol ar ECM mewn sawl meinwe trwy atal MM-1 (31). Yn yr astudiaeth hon, roedd gel Cistanche yn atal mynegiant MMP-1 inHDFs (Ffigur 2B) yn sylweddol, ac yn bennaf yn gwella mynegiant TIMP-1 (Ffigur 2C). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau'n awgrymu y gallai'r lefel uwch o brocolagen math I, a achosir gan gel Cistanche, gael ei ddylanwadu gan ataliad MMP-1, a allai, yn ei dro, fod yn gysylltiedig ag uwch-reoleiddio TIMP{{15 }} mewn HDFs a drinnir gan Slgel. Yn ogystal, gellir esbonio effaith gel Cistanche ar synthesis colagen yn nhermau effaith gwrthlidiol gel Cistanche, mae Llid yn actifadu trawsgrifio amrywiol ffactorau sy'n diraddio metalloproteinasau sy'n arwain at ddiraddiad colagen annormal a chroniad cydrannau anweithredol (6l, Llidiol). mae adweithiau fel arfer yn cael eu hysgogi gan sytocinau pro-llidiol (ee, IL-1 alpha ac IL-6) (32,33], a gwyddys eu bod yn cael eu rhwystro gan sytocinau gwrthlidiol (ee.IL{{). 26}}, IL-10, a TGF-beta 1) (34,35) Mae ein canlyniadau presennol yn dangos gostyngiad sylweddol mewn adweithiau llidiol gan gel Cistanche mewn HEKs wedi'u hysgogi gan SDS (Ffigur 3), sy'n awgrymu bod y efallai y bydd effeithiau gwrthlidiol gel Cistanche wedi dylanwadu'n gadarnhaol ar synthesis colagen, felly, mae gan gel Cistanche, fel deunydd deniadol gyda swyddogaeth ddeuol synthesis colagen ac effaith gwrthlidiol, y potensial i ddangos gwell effeithiolrwydd gwrth-heneiddio nag asiantau confensiynol yn Yn gyffredinol, mae synthesis colagen yn digwydd mewn HDFs y tu mewn i'r croen (28,36). Felly, dylai gel Cistanche fod â chynhwysedd treiddiad croen uchel er mwyn cyflawni ei effeithiau gwrth-heneiddio. Felly, ceisiasom archwilio a allai Cistanche gelis dreiddio i fodel croen dynol 3D wedi'i ail-greu. Ar ôl 1 h o gymhwyso amserol, croesodd Cistanche gel y SC a chronni yn yr epidermis. Ychydig iawn o groniad a welwyd yn y meinwe ddermol hefyd, sy'n awgrymu y gellir amsugno gel Cistanche i'r croen (Ffigur 4B) Ar ôl 24 h, ynghyd â chroniad yn yr epidermis, gwelwyd fflworoleuedd gwyrdd cryf yn y dermis hefyd, gan nodi presenoldeb Cistanche gel yno. Fel arall, ar ôl 1 h, gwelwyd fflworoleuedd gwyrdd gwan ar gyfer triniaeth Cistanche yn unig yn y dermis, ond nid ar ôl 6 h (Ffigur S2). Mae hyn yn golygu ei fod wedi'i ddiraddio yn amodau diwylliant keraskin@-FT, sy'n awgrymu bod y Cistanche diraddiedig wedi treiddio'n gyflym i'r keraskin@-FT a dianc i'r cyfrwng o fewn 6 h. Er nad yw'r mecanwaith ar gyfer mewnoli gel Cistanche i'r croen yn glir eto, mae'n ymddangos ei fod yn gysylltiedig â'i strwythur moleciwlaidd nodweddiadol. Mae gan lawer o beptidau amffipathig alluoedd amsugno croen (37-39), a allai olygu mai nodweddion amffipathig peptidau yw'r prif ffactorau ar gyfer amsugno croen Yn wir, dangoswyd bod peptidau amffipathig yn cael eu cymryd gan gelloedd mamalaidd trwy fecanwaith nad yw'n endocytig. (40-42]. Mae'r olaf, trwy lwybrau ynni-annibynnol, yn cael ei gychwyn gan ryngweithio rhwng peptidau amffipathig a philenni lletyol, ac yna fecanweithiau amrywiol sy'n cynnwys ffurfiant micelle gwrthdro, ffurfio mandwll, y model tebyg i garped, a'r bilen model teneuo (43) Gan ei fod yn perthyn i grŵp o beptidau amffipathig bach, sy'n rhwymo derbynyddion cypledig G-protein [44,45) gellir ei amsugno i'r croen.Yn ogystal, mae cydran syrffactydd, polysorbate 80, yn bresennol yn Cistanchegel , gall helpu i wella ei amsugno croen Fel ychwanegwr hysbys o amsugno croen, mae'r polysorbate syrffactydd an-ïonig 80 yn cynnwys cadwyn hydrocarbon hir ac ethylene ocsid, sy'n rhoi nodweddion lipoffilig a hydroffilig i'r cyfansawdd (46). Felly, yn seiliedig ar ganfyddiadau blaenorol sawl astudiaeth, gellir awgrymu bod gel Cistanche yn cael ei amsugno'n effeithiol i haen y croen.

yn gyffredinol, mae cydrannau sy'n gysylltiedig â thwf celloedd croen yn debygol o achosi pigmentiad croen Bydd gan sawl ffactor twf y potensial i gynhyrchu pigmentiad croen (47,48]. Gel Cistanche, sy'n cael yr effaith o gynyddu twf celloedd croen (20]). , gallai hefyd arwain at bigmentiad croen, yn debyg i'r hyn a achosir gan ffactorau twf Adroddwyd bod Cistanche yn cynyddu cynnwys melanin ac yn ysgogi'r broses pigmentiad mewn melanocytes dynol [49].Fodd bynnag, dangosodd Ping et al (50] fod Cistanche yn atal melanogenesis mewn llinell gell melanoma llygoden, celloedd B16-F10, gan nodi y gallai ei fecanwaith posibl fod yn gysylltiedig ag atal llwybr synthesis melanin, yn debyg i'r p38 protein kinase-activated mitogen (MAPK) a microphthalmia-gysylltiedig ffactor trawsgrifio (MITF).Mae'r adroddiadau blaenorol hyn ar bigmentiad a achosir gan Cistanche yn ddadleuol.Gellir priodoli'r canlyniadau gwahanol i ansefydlogrwydd Cistanche.Er mwyn pennu'n gywir a yw gel Cistanche yn achosi pigmentiad mewn sgertiau dynol, archwiliwyd ei effaith ar melanogenesis mewn keratinocyte -melanocytes system cyd-ddiwylliant. Yn benodol, mae'r system cyd-ddiwylliant keratinocyte-melanocyte dynol yn darparu amgylchedd tebyg i groen dynol (51], a gwnaethom gymhwyso gel Cistanche i'r system cyd-ddiwylliant i weld ei effaith pigmentiad. Mewn amodau normalcy-diwylliant, canfuwyd gel Cistanche i beidio â gwella croniad melanosom (Ffigur 5A) a synthesis melanin (Ffigur 5B), gan ddangos felly nad yw gel Cistanche yn achosi pigmentiad mewn sgir dynol Mae ein canlyniadau yn darparu tystiolaeth i gefnogi manteision gel Cistanche fel deunydd gwrth-heneiddio cynhwysyn cosmetig. , byddai angen astudiaethau ychwanegol i egluro ymhellach effeithiau gwrth-heneiddio gel P. Mae'r astudiaeth bresennol yn dangos y gall yr eiddo gwrth-heneiddio a ysgogwyd gan Cistanche gael eu cymhwyso'n uniongyrchol i ymchwil glinigol.Yn unol â hynny, rydym bellach yn gweithio ar gadarnhau'r effaith glinigol o gel Cistanche gyda reCistancheect i briodweddau gwrth-heneiddio Yn ogystal, rydym hefyd yn bwriadu ymchwilio i effeithiau gwrthlidiol a gwenwyndra clinigol gel Cistanche mewn keraskin@-FT a chroen dynol, yn seiliedig ar ein canlyniadau presennol yn gywir, nid yw gel Cistanche yn ymddangos i achosi niwed i gellbilen a llid y croen mewn celloedd dynol ac ar groen dynol 3D wedi'i ail-greu (Ffigur 1). Serch hynny, byddwn yn cynnal prawf llid sylfaenol, gan ddefnyddio gel Cistanche ar groen dynol, yn y dyfodol.

I gloi, dangosodd ein hastudiaeth intro y gallai triniaeth gel Cistanche gynyddu lefelau procolagen math, sy'n gysylltiedig â rheoleiddio MMP-1 a TIMP-1, yn ogystal â'r effaith gwrthlidiol. Ar ben hynny, fe wnaethom ddangos gallu Cistanche gel i amsugno croen, heb achosi pigmentiad croen. Gyda'i gilydd, mae ein canfyddiadau'n awgrymu y gellir defnyddio gel Cistanche o bosibl fel cynhwysyn cosmetig effeithiol a diogel gyda swyddogaethau gwrth-heneiddio.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Defnyddiau

All reagents were purchased from Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA) and were used as received unless otherwise indicated. Antibodies against DAPI and melanoma marker (HMB45) were purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) and DAKO (Carpinteria, CA, USA) reCistancheectivelySynthetic Cistanche (RPKPOOFFGLM-NH2) and FITC-labeled Cistanche (FITC-Cistanche) were synthesized and purified to>95 y cant gan Anygen (Gwangju, Korea). Prynwyd y citiau assay immunosorbent sy'n gysylltiedig ag ensymau (ELISA) gan R&D Systems (Minneapolis, MN, UDA). Cafodd keratinocytes epidermaidd dynol (HEKsand melanocytes dynol (HMs, SK-MEL-28; ATCC, VA, UDA) eu meithrin mewn cyfrwng twf ceratinocyte (KGM: Lonza, Walkersville, MD, UDA), a ffibroblastau dermol dynol (HDFs) wedi'u meithrin mewn cyfrwng twf ffibroblast (FGM: Lonza).

4.2. Triniaethau Gel Cistanche

Cynhyrchwyd gel Cistanche yn ôl adroddiad blaenorol [52]. Cafodd (20 µg/mL o gel Cistanche in Cistanche) ei wanhau mewn PBS cyn ei ddefnyddio i drin y samplau. Er mwyn pennu gwenwyndra a achosir gan gel Cistanche, hyfywedd, effeithiau cynyddu colagen, a melanogenesis, cymhwyswyd crynodiadau amrywiol o gel Cistanche (1-10 µg / ml Cistanche mewn gel Cistanche) i'r arbrofion hyn. Yn ogystal, defnyddiwyd gel Cistanche sy'n cynnwys 5 µg/mL o Cistanche neu FITC-Cistanche ar gyfer canfod effeithiau gwrthlidiol neu amsugno croen gel Cistanche, yn reCistanche.

4.3. Ynysu a Diwylliant HEKs a HDFs

Fe wnaethom ynysu celloedd cynradd HEK a HDF o fiopsïau blaengroen dynol, a ddarparwyd gan HoCistancheital Prifysgol Chung-Ang yng Nghorea [IRB rhif. C2014234(1431)]. Cafodd y samplau biopsi eu golchi deirgwaith gyda hydoddiant PBS, a chafodd y pibellau gwaed a'r meinwe brasterog isgroenol eu tynnu allan gan ddefnyddio llafn miniog. Yna torrwyd y taflenni meinwe canlyniadol yn adrannau bach a'u trosglwyddo i 0.5 y cant o hydoddiant DiCistanchase II, ac yna deor ar 37 ◦C am 2 awr. Tynnwyd yr epidermis a'r dermis gan ddefnyddio gefeiliau, ac yna deor gyda 0.05 y cant trypsin wedi'i wanhau yn PBS am 30 munud. Yna trosglwyddwyd y samplau i hydoddiant collagenase 0.2 y cant a'u deor ar 37 ◦C am 2 h. Yna ataliwyd gweithgaredd trypsin a cholagenase trwy ychwanegu serwm buchol ffetws 10 y cant, a chafodd y darnau meinwe eu hidlo trwy hidlydd celloedd a'u golchi mewn PBS. Cafodd y celloedd HEK a HDF a ddeilliodd o hynny eu hadu ar ddysglau plastig a'u meithrin mewn KGM a FGM, yn gywirach.

4.4. Assay Difrod Pilenni Cell

I ddadansoddi'reffeithiau niweidiol Cistanchegel ar y gellbilen, cafodd HDFs eu meithrin mewn 96-blatiau ffynnon (3 × 103 cell/ffynnon) mewn FGM. Ar ôl 24-h deoriad, cafodd celloedd eu trin â gel Cistanche (1–10 µg/mL o Cistanche mewn gel Cistanche) a'u deor am 24 awr arall. Perfformiwyd profion yn seiliedig ar LDH (Roche Applied Science, Mannheim, yr Almaen), yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, i brofi ymhellach effeithiau Cistanche ar ddifrod cellbilen. Fe wnaethom drin rheolaethau positif gydag 1 y cant Triton X-100 a gosod rhyddhad LDH i 100 y cant . Cyfrifwyd rhyddhau LDH cymharol, gan ddefnyddio celloedd cyfan, o'r gymhareb o LDH a ryddhawyd dros gyfanswm LDH. rhyddhau LDH<10% was considered to be non-toxic. Three independent experiments were performed to confirm our findings.

4.5. Prawf Llid y Croen In-Vitro

Prynwyd meinweoedd epidermaidd dynol wedi'u hail-greu (Keraskin®-FT) gan Biosolution Co., Ltd. (Seoul, Korea). Yn unol ag astudiaethau blaenorol [53], cafodd y meinweoedd eu cyflyru gan ddeori dros nos ar y diwrnod derbyn. Ar ôl cyn-deori am 24 h, cawsant eu trosglwyddo i blât chwe ffynnon wedi'i ategu â chyfrwng ffres, a'u trin yn topig â 100 µL o reolaeth negyddol (PBS), rheolaeth gadarnhaol (5 y cant SDS), a Gel cistanche (1–10 µg/mL o gel Cistanche mewn Cistanche) am 24 awr ar 37 ◦C. Cafodd y meinweoedd eu golchi'n drylwyr gyda PBS wedi hynny a'u trosglwyddo i gyfrwng ffres. Ar ôl tyfu am 48 h, cynhaliwyd asesiad hyfywedd celloedd trwy drosglwyddo'r meinweoedd i 24-blat ffynnon yn cynnwys cyfrwng MTT (0.3 mg/mL), ac yna deoriad 3-h. Echdynnwyd formazan glas gydag isopropanol, a chadarnhawyd ei ddwysedd gorau posibl yn 570 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate tiwnadwy VersaMax (Dyfeisiau Moleciwlaidd, Sunnyvale, CA, UDA). Cyfrifwyd hyfywedd celloedd cymharol ar gyfer pob meinwe, fel canran o gymedr meinwe rheoli negyddol. Ar gyfer gwerthusiad histolegol, gosodwyd meinweoedd mewn 4 y cant o fformaldehyd, a'u prosesu i'w hymgorffori mewn paraffin. Yn dilyn hynny, torrwyd darnau fertigol 5-µm a'u staenio â hematocsilin ac eosin (H&E) i'w harchwilio o dan ficrosgop golau BX41 (Olympus, Tokyo, Japan). Perfformiwyd o leiaf dri arbrawf annibynnol.

4.6. Mesur Procolagen Math 1, MMP-1, a TIMP-1

Mesurwyd lefelau procollagen math I, MMP-1, a TIMP-1mewn HDFs gan ddefnyddio pecyn EIA Math I C-peptid (P1P) procolagen (Takara Bio, Inc., Otsu, Japan), a MMP{4}} a TIMP-1 dynol pecynnau ELISA (systemau ymchwil a datblygu), yn ail-ddigwyddiadol. Cafodd yr HDFs eu hadu ar ddwysedd o 3 × 103 o gelloedd/ffynnon. Ar ôl 48 h, cafodd y celloedd eu trin â PBS (rheolaeth negyddol) neu grynodiadau amrywiol o gel Cistanche (1-10 µg / mL) am 24 h. Mesurwyd lefelau procolagen math I, MMP-1, a TIMP{-1 yn y cyfryngau diwylliant yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mynegwyd canlyniadau pob grŵp fel canran cymedr y grŵp rheoli negyddol.

4.7. Mesur IL-1 Alffa, -6, -10, a TGF-Beta 1

Cafodd HEKs eu hadu ar ddwysedd o 3 × 104 o gelloedd/ffynnon. Ar ôl 48 h, cafodd y celloedd eu trin â PBS (rheolaeth negyddol), 15 ng/mL o SDS, neu gel Cistanche (5 µg/mL Cistanche in Cistanche gel) am 24 h. Casglwyd uwchnatyddion y gell ar gyfer canfod cytocinau llidiol megis IL-1 alpha, -6, -10, a TGF-beta 1. ELISA pennwyd crynodiad y cytocinau yn y supernatants gan citiau, yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyfrifwyd crynodiadau yn y samplau gan gyfeirio at y cromliniau safonol cywirol ac fe'u mynegwyd ar gyfer pob grŵp fel canran o gymedr y grŵp rheoli negyddol. Perfformiwyd o leiaf dri arbrawf annibynnol.

4.8. Amsugniad Croen Gel Cistanche yn y Meinweoedd Epidermaidd Dynol Wedi'u Hail-greu

Gwerthuswyd amsugniad croen amserol o gel Cistanche (5 µg/ml o Cistanche mewn gel Cistanche) gan ddefnyddio'r epidermis dynol wedi'i ail-greu, keraskin®-FT. Dangosir cynllun triniaeth gel Cistanche yn Ffigur 4A. Yn gryno, cafodd 100 µL o gel Cistanche, yn cynnwys FITC-Cistanche, ei gymhwyso'n topig ar y keraskin®-FT, a gosodwyd darnau meinwe dros nos mewn fformaldehyd 4 y cant oerfel iâ. Yn dilyn hynny, golchwyd samplau meinwe mewn PBS ac yna eu trochi mewn hydoddiant swcros o 4.5 y cant am 24 h. Dilynwyd hyn gan ddadhydradu'r samplau mewn swcros 30 y cant nes i'r dyddodiad ddigwydd. Fe wnaethon ni ddefnyddio microtome rhewi (Leica, Wetzlar, yr Almaen) i gynhyrchu cryo-adrannau pum micron-trwchus, a gafodd eu delweddu wedyn gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd (Nikon, Tokyo, Japan).

4.9. Cyd-ddiwylliant ac Imiwnofluorescence