Pilenni Nanocellwlos Bacteriol Bioactif Wedi'u Cyfoethogi Gyda Labill Ewcalyptws Globulus. Dail Dyfyniad dyfrllyd Ar gyfer Cymwysiadau Gofal Croen Gwrth-Heneiddio
Jun 09, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Daeth pilenni nanocellwlos bacteriol (BNC), gyda phriodweddau ffisegol a mecanyddol rhyfeddol, i'r amlwg fel cludwr biopolymerig amlbwrpas o gyfansoddion bioactif ar gyfer cymwysiadau gofal croen. Yn yr astudiaeth hon, cafodd bilen BNC eu llwytho â glyserol (fel plastigydd ac asiant humectant) a dosau gwahanol (1-3 ug cm-2) o echdynnyn dyfrllyd a gafwyd o hydro-ddistyllu Ewcalyptws globulus Labill. dail (HDE), i'w defnyddio fel masgiau wyneb dalen. Mae pob pilen yn wrthiannol ac yn hydrin iawn mewn cyflwr sych a gwlyb, gyda phriodweddau mecanyddol tebyg neu hyd yn oed yn well na rhai mwgwd BNC masnachol. Ar ben hynny, canfuwyd bod yr HDE yn rhoi gweithgaredd gwrthocsidiol dos-ddibynnol i BNC pur. Yn ogystal, ar ôl 3 mis o storio ar 22-25 gradd a 52 y cant o leithder cymharol (RH) neu ar 40C a 75 y cant RH, cadarnhawyd bod y gweithgaredd gwrthocsidiol ac agwedd macrosgopig y bilen gyda 2 ug cm{{10 }} o HDE yn cael eu cynnal. Dangoswyd hefyd nad oedd pilenni'n sytotocsig tuag at gelloedd HaCaT a NIH/3T3, ac achosodd y bilen â 2ug cm-2 o HDE ostyngiad sylweddol yn y gweithgaredd -galactosidase sy'n gysylltiedig â heneiddedd mewn celloedd NIH/3T3. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu addasrwydd a photensial y pilenni a gafwyd fel masgiau wyneb bioactif ar gyfer cymwysiadau gwrth-heneiddio.
Geiriau allweddol:nanocellwlos bacteriol; Ewcalyptws globulus Labill. dail; dyfyniad dyfrllyd; gweithgaredd gwrthocsidiol; mygydau wyneb dalennau; wrth heneiddio; cymwysiadau gofal croen
1. Rhagymadrodd
Mae poblogaeth y byd yn sylweddol hen oherwydd y gostyngiad yn y gyfradd genedigaethau a'r gwelliant mewn goroesiad, a chynnydd dilynol yn y disgwyliad oes cyfartalog, sy'n gysylltiedig â'r datblygiadau meddygol a thechnolegol a gyflawnwyd dros y degawdau diwethaf [1,2]. Disgwylir i’r boblogaeth fyd-eang 60 oed neu hŷn gyrraedd tua 2.1 biliwn erbyn 2050, sy’n cynrychioli cynnydd o tua deublyg o 2017, a disgwylir i nifer y bobl 80 oed neu hŷn bron i dreblu yn yr un cyfnod 3]. Fodd bynnag, er gwaethaf hirhoedledd gwell, mae heneiddio'r croen yn broses anochel, ac felly, disgwylir galw cynyddol am gynhyrchion gofal croen gwrth-heneiddio.
Mae heneiddio croen yn broses fiolegol gymhleth sy'n cyfuno mecanweithiau mewndarddol ac alldarddol [4]. Mae heneiddio mewndarddol yn cael ei bennu'n bennaf gan ffactorau genetig a newidiadau hormonaidd sy'n digwydd gyda'r broses heneiddio arferol [4]. Ar y llaw arall, mae heneiddio alldarddol yn cael ei gyfryngu gan ffactorau allanol (ee, gor-amlygiad i ymbelydredd uwchfioled (photoaging), disgyrchiant, ysmygu, llygredd, a maethiad gwael)[5]. Yn y ddwy broses heneiddio, ond yn enwedig yr un alldarddol, derbynnir yn dda bod y straen ocsideiddiol cynyddol, a achosir gan rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) ac sy'n deillio o'r anghydbwysedd rhwng cynhyrchu ROS ac amddiffyn gwrthocsidiol, yn chwarae rhan hanfodol [{{3} }]. Gydag oedran, mae gostyngiad hefyd yng ngallu celloedd croen dynol i atgyweirio DNA sydd wedi'i ddifrodi, sy'n cyfrannu at heneiddio'r croen hefyd [8].Detholiad Cistanche Gwrth YmbelydreddFelly, mae'r broses heneiddio yn achosi nifer o newidiadau biocemegol yng nghyfansoddiad y croen, gydag effeithiau ar ei strwythur a'i swyddogaeth [9], gan arwain at arwyddion gweladwy fel crychau, sychder, colli elastigedd, teneuo, gwead garw, neu bigmentiad afreolaidd [7,10] . Felly, gyda'r ymgais cynyddol am iechyd a lles, lle mae iechyd y croen ac estheteg hefyd yn cael eu cynnwys, mae datblygiad colur sy'n cynnwys cyfansoddion bioactif i atal neu wanhau heneiddio'r croen a'i arwyddion allanol, gan wella golwg y croen, wedi bod yn y fantol. flaen y gad o ran ymchwil ac arloesi yn y diwydiant cosmetig dros y degawdau diwethaf. Yn y cyd-destun hwn, ac ymhlith colur ar gyfer triniaeth amserol, mae masgiau harddwch, ac yn enwedig masgiau wyneb dalen, yn farchnad sy'n tyfu, gyda chyfradd twf blynyddol cyfansawdd disgwyliedig (CAGR) o 8.1 y cant rhwng 2019 a 2027 [11]. Mae'r math hwn o fasg yn arbennig o ddeniadol i ddefnyddwyr modern, yn bennaf oherwydd ei gymhwysiad syml a hawdd, ei ddefnydd cyflym, a'i effeithiolrwydd]12. Gellir defnyddio sawl defnydd fel matrics cynnal y masgiau dalennau hyn, sef polymerau synthetig (ee, poly (alcohol finyl) a silicon, ffabrigau (ee, heb ei wehyddu a chotwm), hydrogeliau (ee, hydrogeliau colagen a sidan )neu nanoffibrau cellwlos, fel nanocellwlos bacteriol(BNC)[13] Gyda'r galw cynyddol am gynhyrchion gofal croen sy'n deillio'n naturiol, mae BNC wedi dod yn berthnasol ac mae bellach yn ddeunydd bio-seiliedig uwchraddol, sydd eisoes wedi'i archwilio a'i fasnacheiddio gan rai o'r rhain. y prif gwmnïau colur (ee, Lancome, Elizabeth Arden, a DHC)[14] sy'n dilyn y duedd o alw defnyddwyr gwyrdd.
Bacterial nanocellulose is an extracellular polysaccharide produced by several non-pathogenic bacteria from different genera (e.g., Komagataeibacter (formerly Gluconacetobacter), Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, and Aerobacter), through fermentation in the presence of oxygen and carbon sources(e.g., glucose)[1516]. BNC is synthesized in the air-culture medium interface as an ultrafine 3D nanofiber network, showing high water content(>90 y cant), hydrophilicity uchel, a strwythur nanoporous [17]. Pan gaiff ei gynhyrchu mewn diwylliant statig, mae BNC yn cael ei sicrhau fel pilen gelatinaidd tebyg i hydrogel gyda thrwch amrywiol a siâp y llestr diwylliant (hy mowldadwyedd in situ), sy'n fantais pan ddymunir siâp wedi'i ddiffinio ymlaen llaw [18]. Mae set o briodweddau unigryw BNC hefyd yn cynnwys crisialu a phurdeb uchel, cryfder mecanyddol rhyfeddol, a sefydlogrwydd thermol [19]. Yn ogystal â bod yn fioddiraddadwy, mae BNC hefyd wedi dangos goddefgarwch croen da a biogydnawsedd mewn sawl astudiaeth in vivo [20-22], gan ei wneud yn ddeunydd delfrydol ar gyfer cynhyrchion gofal croen. Yn hyn o beth, ac oherwydd ei nanostrwythur mandyllog, mae cymhwysedd ac effeithiolrwydd BNC fel cludwr ar gyfer dosbarthu cyfansoddion gweithredol croen wedi bod yn ffocws i sawl gwaith, er enghraifft, ar gyfer danfon caffein [23], sidan-sericin [24], retinol [25], neu rutin [26]. I'w ddarllen ymhellach, mae adolygiad diweddar yn darparu trosolwg cynhwysfawr o amlochredd a chymhwysedd BNC mewn colur gwyrdd, gan gynnwys fel cludwr sylweddau gweithredol croen [27].
gall cistanche gwrth-heneiddio
Defnyddir cyfansoddion bioactif naturiol yn eang mewn colur gofal croen gwrth-heneiddio [28].cistanche herbaMae echdynion planhigion, yn arbennig, yn ffynhonnell gyfoethog o gyfansoddion bioactif (ee, polyffenolau, terpenoidau, fitaminau, ymhlith eraill) gyda gweithredoedd lluosog posibl ar y croen, gyda gweithgareddau gwrthocsidiol a gwrthficrobaidd effeithiau atal tyrosinase yn brif fuddion a adroddwyd hyd yn hyn [ 29]. Felly, o ystyried y duedd bresennol ar gyfer cynhyrchion naturiol mewn colur, mae darnau planhigion yn ymddangos ymhlith y cynhwysion mwyaf addawol ar gyfer datblygu cynhyrchion gofal croen. Ar ben hynny, ymchwiliwyd hefyd i ymgorffori echdynion naturiol i bilenni BNC at ddibenion cosmetig. Enghreifftiau yw'r gweithiau sy'n adrodd am ymgorffori detholiad propolis, y gwyddys bod ganddo weithgareddau antiseptig ac astringent[13,30], darnau o geirch a rhosmari ag effeithiau lleithio [13], neu'r fformiwleiddiad cosmetig sy'n cynnwys ffrwythau Adansonia digitata, blodyn Hibiscus sabdariffa, Cacen hadau Coffea arabica, ffrwythau Kigelia Africana, a darnau bwlb Acacia a Crocws chrysanthus, gydag eiddo gwrth-heneiddio, sef llyfnu wrinkle [21]. Yn ddiweddar, gwnaeth adolygiad fewnwelediad beirniadol i bwysigrwydd cysylltu BNC â ffenolig planhigion i atal niwed croen a achosir gan UV [31].
Ewcalyptws globulus Labill. mae'r goeden fythwyrdd yn ffynhonnell adnabyddus o gyfansoddion bioactif, sef cyfansoddion ffenolig megis asidau ffenolig, flavonoidau, neu danninau hydrolyzable [32-36]. Mae gweithgareddau gwrthocsidiol a gwrthficrobaidd darnau E.globulus sy'n cynnwys y cyfansoddion hyn wedi'u dangos mewn sawl astudiaeth [34,35]. Ynglŷn â chymhwyso yn y maes cosmetig, dangosodd astudiaeth ddiweddar yr effaith amddiffynnol, in vitro (mewn ffibroblastau dermol dynol) ac in vivo (llygod di-flew), o echdyniad ethanolig 50 y cant o fiomas masnachol sych E.globulus yn erbyn lluniadu a achosir gan UV. , gyda chanlyniadau addawol o ran atal ffurfio wrinkle a sychder croen [37]. Fodd bynnag, hyd eithaf ein gwybodaeth, nid yw echdynion E.globulus erioed wedi cael eu harchwilio, mewn cyfuniad â swbstrad polymerig, i gynhyrchu masgiau croen bioactif ar gyfer gofal croen gwrth-heneiddio.
Gyda'r persbectif hwn, pwrpas y gwaith presennol oedd cynhyrchu mem-branes BNC wedi'u llwytho â echdynnyn dyfrllyd yn deillio o'r hydro-ddistyllu (detholiad hydro-distyllu, HDE) o ddail E.globulus. Mae hydro-distyllu yn ddull a ddefnyddir yn gyffredin gan y diwydiant ar gyfer echdynnu olewau hanfodol [38]. Yn ogystal, cafodd glyserol (G), cynhwysyn humectant a ddefnyddir yn eang mewn colur [39], hefyd ei ymgorffori yn y pilenni BNC (7.5 mg cm-2) i gynyddu eu hyblygrwydd ac, ar yr un pryd, eu cydymffurfiad â y croen. Felly, nod y gwaith hwn oedd cael deunydd bio-seiliedig yn gyfan gwbl gyda phriodweddau swyddogaethol i'w gymhwyso o bosibl fel mwgwd wyneb gwrth-heneiddio. Nodweddwyd pilenni BNC wedi'u llwytho â gwahanol ddosau o'r echdyniad hydro-ddistyllu o ran eu morffoleg, priodweddau mecanyddol, sefydlogrwydd thermol, a gallu cymryd lleithder. Ar ben hynny, gwerthuswyd gweithgaredd gwrthocsidiol cemegol y gwahanol bilenni hefyd, yn ogystal â'u cytotoxicity in vitro (mewn keratinocytes dynol a llinellau celloedd ffibroblasts llygoden). Yn ogystal, mae sefydlogrwydd gweithgaredd gwrthocsidiol ar ôl 3 mis o storio, yn y tywyllwch, ar 22-25 gradd a 52 y cant o leithder cymharol (RH) neu ar 40 gradd a 75 y cant RH o'r bilen gyda 2 ug cm{{19} } o HDE ei asesu. Yn olaf, ymchwiliwyd ymhellach i weithgaredd gwrth-heneiddedd in vitro y bilen BNC gyda 2 ug cm-2 o HDE.
2. Defnyddiau a Dulliau
2.1. Cemegau a Deunyddiau
Citric acid (≥99.5%), dimethyl sulfoxide (DMSO) (≥99.0%), disodium hydrogen phosphate(≥99.0%), glucose(≥99.5%), glycerol(≥99.5%), magnesium nitrate hexahydrate (≥99.0%), potassium chloride(≥99.0%), potassium dihydrogen phosphate (≥99.0%), potassium sulphate (>99.0%), sodium bicarbonate (>99.5%), sodium chloride (>99.0 y cant ),a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT)(Fwyaf) na neu'n hafal i 97.5 y cant) eu prynu gan Sigma-Aldrich (Lisbon, Portiwgal). Roedd pob cemegyn arall o radd labordy.twf pidyn cistancheCalsiwm clorid, Canolig Eryr Addasedig Dulbecco (DMEM), etoposide, adweithydd ffenol Folin-Ciocalteu, magnesiwm clorid, sodiwm pyrwfad, hydoddiant trypsin-EDTA, N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-({{6}) }ethane asid sylffonig),4-(2-hydroxyethyl piperazine-1-ethane sulfonic acid (HEPES),) a 2,2-diffenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) yn a gyflenwir gan Sigma-Aldrich (Lisbon, Portiwgal).Cafwyd echdyniad peptone a burum o Himedia Laboratories GmbH (Einhausen, yr Almaen) Prynwyd serwm buchol ffetws (FBS), penisilin, a streptomycin gan Gibco (Carlsbad, CA, UDA).
Defnyddiwyd samplau o fasg wyneb dalen fasnachol BNC yn y profion mecanyddol a defnydd lleithder, at ddibenion cymharu. Disgrifir mwgwd wyneb dalen fasnachol BNC (Mwgwd Biocellulose Adnewyddu Croen Probiotic Superstart, Elizabeth Arden, Efrog Newydd, NY, UDA) fel un sy'n deillio o ddŵr cnau coco naturiol ac wedi'i ymgorffori mewn fformiwleiddiad cosmetig gyda phriodweddau adnewyddu croen sy'n cynnwys, ymhlith cynhwysion eraill, probiotegau (Lactococcus eplesu lysate, Lactobacillus), echdyniad planhigion (Althea rhosyn blodau dyfyniad, Polymnia sonchifolia sudd gwraidd, Crithmum maritimum dyfyniad), caffein, a humectants, megis glyserol, asid hyaluronig, neu polyethylen glycol (PEG)-450 . Cafodd samplau o ddalen fasnachol BNC eu sychu mewn popty wedi'i awyru ar 358C cyn ei ddefnyddio.manteision cistanche salsaLabill E.globulus ffres. casglwyd dail o goed llawndwf o blanhigfa ddiwydiannol The Navigator Company ger Aveiro yn Sever do Vouga (Bracal)(Aveiro, Portiwgal) a'u cyflwyno i broses hydro-ddistyllu nes bod y ffracsiwn olew hanfodol wedi'i echdynnu'n llwyr(2-3 h) defnyddio cyfarpar tebyg i Clevenger wedi'i addasu. Yn y diwedd, cafodd echdyniad dyfrllyd, yr HDE, ei adennill a'i lyoffileiddio, ei storio, a'i amddiffyn rhag golau mewn sychwr, ar dymheredd ystafell, nes ei ddefnyddio [40].
2.2. Cyfanswm Cynnwys Ffenolig HDE
Penderfynwyd ar gyfanswm cynnwys ffenolig (TPC) HDE gan ddefnyddio'r dull Folin-Ciocalteu, fel y disgrifir mewn man arall [41], gyda rhai addasiadau. Yn gryno, mewn 96-plât ffynnon, 150 μL o adweithydd Folin-Ciocalteu wedi'i wanhau o'r blaen (1∶10, o/ø）) â dŵr a 120 L o hydoddiant sodiwm carbonad dyfrllyd (75 g L-) ） eu hychwanegu at 30 μL o hydoddiant HDE dyfrllyd mewn crynodiadau yn amrywio o 1.95 ugs i 500 ug mL-1 o echdyniad. Deorwyd y cymysgeddau adwaith yn y tywyllwch ar dymheredd ystafell am 60 munud. Ar ôl y cyfnod deori, mesurwyd yr amsugnedd ar 760 nm yn erbyn gwag (dŵr yn lle echdyniad) mewn darllenydd microplate Thermo Scientific MultiskanTM FC (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, UDA). Cyfrifwyd TPC fel cyfwerth asid galig (GAE) o gromlin graddnodi hydoddiannau safonol asid galig (5.13-205.0 ug mL-1) a'i fynegi fel mg o GAE o echdyniad lyophilized. Perfformiwyd yr assay bum gwaith, a dadansoddwyd pob sampl yn driphlyg.
2.3. Cynhyrchu'r Bilenau BNC
Cynhyrchwyd pilenni BNC yn ein labordy gan ddefnyddio cyfrwng meithrin hylif Hestrin-Schramm (HS) (20g L-1glwcos, 5g L-1 peptone, 5g echdyniad Ll burum,2.7g L -1 hydrogen ffosffad disodium, 1.15 g asid L-Citric, pH5) brechu â'r bacteria asid asetig Gluconacetobacter sacchari o dan amodau diwylliant statig [42]. Ar ôl 4-6 diwrnod o ddiwylliant ar 30 gradd , cynaeafwyd y pilenni BNC a'u trin ddwywaith gyda 0.5 M NaOH ar 80 gradd am 30 munud. Wedi hynny, golchwyd pilenni sawl gwaith â dŵr distyll i ddileu'r cydrannau canolig a'r celloedd bacteriol sy'n weddill. Yn olaf, gwynnwyd pilenni BNC â hydoddiant dyfrllyd sodiwm hypoclorit 1 y cant ac yna golchwyd dro ar ôl tro â dŵr distyll nes cyrraedd pH niwtral. Roedd pilenni wedi'u puro'n cael eu storio mewn dŵr pur iawn ar 4 gradd yn ogystal nes eu bod yn cael eu defnyddio.
2.4. Paratoi Membranau BNC-G-HDE
Pelenni BNC gwlyb （diameter∶ ca.7.0±0.5 cm; trwch ∶ 7000 ± 1000 μm ） wedi'u llwytho â dosau gwahanol o HDE (a fynegir fel màs HDE fesul arwynebedd y bilen) a glyserol (7.5 mg cm-2) (Tabl 1), gan ddefnyddio'r dull impregnation. Yn gryno, cafodd pilenni gwlyb BNC eu pwysoli (tua 180 mg o BNC sych) a'u draenio trwy wasgu â llaw â phapur amsugnol gradd labordy nes bod y cynnwys dŵr wedi gostwng i bron i 40 y cant (a amcangyfrifir yn ôl colli pwysau). Yna, cafodd pilenni eu socian mewn 5 ml o hydoddiant dyfrllyd yn cynnwys y dosau priodol o HDE a glyserol a'u cynnal ar dymheredd yr ystafell nes bod yr hydoddiant HDE-G wedi'i amsugno'n llwyr. Yn olaf, sychwyd pilenni BNC (mewn prydau Petri) ar 35 gradd mewn popty wedi'i awyru (llinell Eco Venticell, grŵp MMM, Planegg, yr Almaen) am o leiaf 20 h. Roedd pilenni sych yn cael eu storio a'u hamddiffyn rhag y golau mewn sychwr ar dymheredd ystafell nes eu bod yn cael eu defnyddio. Er mwyn cymharu, cafodd pilenni BNC pur (heb y dyfyniad a glyserol) eu sychu fel y disgrifiwyd yn flaenorol, a pharatowyd pilenni wedi'u llwytho â glyserol (BNC-G) yn dilyn yr un weithdrefn.
2.5. Nodweddu Pilenni
2.5.1.Trwch
Mesurwyd trwch pilenni sych mewn pum safle ar hap gan ddefnyddio micromedr digidol llaw （Mitutoyo Corporation, Tokyo, Japan） gyda chywirdeb o 1 μm
2.5.2. Morffoleg
Dadansoddwyd morffolegau arwyneb a thrawstoriad (cryo-doriad) y pilenni trwy sganio microsgopeg electron (SEM). Cafwyd micrograffau gan ddefnyddio microsgop foltedd uchel (HR-FESEMSU 70 Hitachi, Tokyo, Japan) a weithredir ar 4.0 kV. Cyn caffael delwedd, gosodwyd samplau ar gynhaliaeth ddur a'u gorchuddio â charbon.
2.5.3. Perfformiad Mecanyddol
Gwerthuswyd perfformiad mecanyddol pilenni mewn cyflwr sych a gwlyb (lleithder 80 y cant) gan brofion tynnol. Diffiniwyd cynnwys lleithder pilenni gwlyb yn ôl y cynnwys lleithder a bennwyd yn y BNC masnachol. Perfformiwyd profion tynnol ar beiriant profi Instron 5564 uniaxial (Instron Corporation, Norwood, MA, UDA) yn y modd tyniant ar gyflymder croesben o 10 mm min-I gan ddefnyddio cell llwyth statig 500 N. Cynhaliwyd yr holl fesuriadau mewn o leiaf bum atgynhyrchiad gan ddefnyddio sbesimenau prawf hirsgwar （5 × 1 cm²） a hyd mesurydd o 30 mm. Cafodd cromliniau straen (MPa) a straen (y cant) eu plotio, a phenderfynwyd modwlws Young, cryfder tynnol, a'r elongation adeg egwyl gan ddefnyddio meddalwedd Instron BlueHill 3. Yn y profion hyn, profwyd sbesimenau o fasg wyneb BNC masnachol hefyd o dan yr un amodau, er mwyn cymharu.
2.5.4. Sefydlogrwydd Thermol
Cynhaliwyd dadansoddiad thermogravimetric (TGA) gyda dadansoddwr SETSYS Setaram TGA (SITARAM Instrumentation, Lyon, Ffrainc) gyda chell platinwm. Cynheswyd y samplau o dymheredd ystafell i 800C ar gyfradd gyson o 10 gradd munud-1 o dan atmosffer nitrogen.
2.5.5. Cynhwysedd Derbyn Lleithder
Gwerthuswyd cynhwysedd lleithder pob pilen trwy osod sbesimenau sych (2 × 2 cm-) o bob pilen mewn sychwr, ar dymheredd ystafell, gyda lleithder cymharol yn ca. 52 y cant yn defnyddio hydoddiant dyfrllyd magnesiwm nitrad dirlawn (52.89 ± 0.22 y cant ar 25 gradd)[43]. Cymerwyd y sbesimenau o'r sychwr a'u pwyso ar ôl 0.5 h, 1 h, 2.5 h, 24 h, a 48 h. Profwyd pob pilen yn driphlyg. Cyfrifwyd y defnydd o leithder fel a ganlyn:
lle Pwyis pwys dechreuol y rbeswm, a Wwis y pwys ar bob pwynt amser.
2.6. Mewn Gweithgaredd Gwrthocsidiol Chermico
Amcangyfrifwyd gweithgaredd gwrthocsidiol y pilenni llawn HDE gan ddefnyddio dull chwilota radical rhydd DPPH, yn dilyn y weithdrefn a adroddwyd yn flaenorol [44], gyda rhai addasiadau. Mae'r adwaith yn seiliedig ar y gostyngiad yn amsugnedd yr hydoddiant DPPH sy'n deillio o'r sborion radical gan y cyfansoddion gwrthocsidiol, gyda'r newid canlyniadol yn lliw'r hydoddiant DPPH o borffor i felyn golau [45]. Yn gryno, ychwanegwyd sbesimenau (2 × 5 cm²) o bob pilen at 3.75 ml o ethanol (EtOH) a halwynog wedi'i glustogi ffosffad (PBS) hydoddiant (60 ∶40); pH5.5）. Yna, ychwanegwyd 250 μL o hydoddiant DPPH （1 mM） mewn ethanol, a chafodd y cymysgeddau canlyniadol eu deor yn y tywyllwch gyda chymysgu ysgafn (100rpm) ar 22 gradd am 0.5 h, 1 h, a 2.5h, ac yna'r amsugnedd ar Darllenwyd 517nm yn erbyn y gwag (EtOH: PBS1 × pH5.5) gan ddefnyddio darllenydd microplat MultiskanTM FC (Thermo Scientific, Waltham, Massachusets, EUA). Er mwyn cymharu, cymysgeddau adwaith sy'n cynnwys yr HDE wedi'i wanhau yn EtOH: PBS1×pH5.5 ar grynodiad terfynol sy'n cyfateb i'r uchafswm o HDE y gellid ei ryddhau o bob pilen (HDE 1:2.5 ug mL-1; HDE1. 5∶3.75 ug mL-1; HDE 2∶5.0 ug mL-1; HDE 3∶7.5 ug mL-） hefyd wedi'u cynnwys yn yr assay. Rheolaeth yn cynnwys EtOH: PBS 1 × pH5.5 gyda DPPH a heb bilen yn cael ei ddefnyddio Cynhaliwyd tri asesiad annibynnol ar gyfer pob sampl Cyfrifwyd gweithgaredd sborion radical DPPH o amsugnedd pob sampl (sampl A) mewn perthynas â rheoli amsugnedd DPPH (ApppH) fel a ganlyn:
2.7. Gwerthusiad o Sefydlogrwydd y Bilen BNC-G-HDE2 o dan Storio
Yn seiliedig ar y "Canllawiau ar brofi sefydlogrwydd ar gyfer cynhyrchion cosmetig"[46], gwerthuswyd sefydlogrwydd storio BNC-G-HDE2. Ar gyfer hyn, gosodwyd samplau (14 cm²) o BNC-G (fel rheolydd) a philenni BNC-G-HDE2 mewn ffiolau gwydr a'u storio am 3 mis yn y tywyllwch yn y cyflwr storio arferol disgwyliedig, ar dymheredd ystafell ({{10) }} gradd ) a 52 y cant RH (amod I, gan ddefnyddio hydoddiant dirlawn magnesiwm nitrad [43]) ac ar gyflwr cyflym o 40 gradd C a 75 y cant RH (amod I, gan ddefnyddio hydoddiant dirlawn sodiwm clorid [43] ). Roedd y lleithder cymharol yn cael ei fonitro o bryd i'w gilydd gan ddefnyddio thermohydromedr i sicrhau lleithder cyson yn ystod y cyfnod storio cyfan. Dadansoddwyd pob sampl cyn ac ar ôl 1,2, a 3 mis o storio ynghylch eu gweithgaredd gwrthocsidiol (fel y disgrifir yn Adran 2.6). Cofnodwyd agwedd macrosgopig pilenni hefyd. Ar gyfer pob cyflwr, dadansoddwyd pob sampl yn driphlyg.
2.8. Asesiadau Biolegol In Vitro
2.8.1. Diwylliant Cell
Cafodd llinellau celloedd keratinocytes dynol (HaCaT, o CLS, Cell Lines Service, Eppelheim, yr Almaen) a ffibroblastau llygoden (NIH/3T3, ATCC CRL-1658, Manassas, VA, UDA) eu meithrin gan ddefnyddio Canolig Eryr Addasedig Dulbecco (DMEM) , ar 37 gradd , mewn awyrgylch aer wedi'i lleithio 5 y cant CO2-95 y cant. Ychwanegwyd at y cyfrwng â 10 y cant (o/v) serwm buchol ffetws anweithredol â gwres (FBS), 1 y cant (o/ø) pen/strep, 3.7 g L-Sodiwm bicarbonad, a 1 mM pyruvate sodiwm. Datgysylltwyd celloedd â datrysiad trypsin-EDTA 1 ×.
2.8.2. Assay Sytowenwyndra
Gwerthuswyd sytotocsigedd y pilenni gan ddefnyddio assay lleihau MTT. Cafodd samplau (2.5 cm²) o'r pilenni (BNC-G, BNC-G-HDE1, BNC-G-HDE1.5, BNC-G-HDE2, BNC-G-HDE3) eu sterileiddio ddwywaith gan ymbelydredd UV ar bob ochr yn ystod 20 min a deor ymhellach, am 24 h, mewn 2.5 mL o gyfrwng DMEM cyflawn ar 37 gradd mewn awyrgylch aer 5 y cant CO llaithedig,-95 y cant, i baratoi pob darn o bilen.
Yn y cyfamser, cafodd 2×10 ac 1×104 cell/ffynnon eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon ar gyfer celloedd HaCaT a NIH/3T3, yn y drefn honno. Ar ôl 24 h, defnyddiwyd yr un cyfaint o'r dyfyniad bilen i ddisodli'r cyfrwng diwylliant, a chafodd celloedd eu deori ymhellach am 24 h ar 37 gradd. Fel rheolydd, roedd celloedd yn cael eu trin yn yr un ffordd ag a ddisgrifiwyd ar gyfer samplau ond yn agored i gyfrwng DMEM yn unig. Ar ôl 24 h, tynnwyd y cyfrwng, a phenderfynwyd y cytotoxicity fel y disgrifiwyd yn flaenorol [47]. Yn fyr, ychwanegwyd datrysiad ffres o MTT (0.5 mg L-1) a baratowyd mewn cyfrwng Krebs (pH 7.4) a'i ddeor ar 37 gradd am 2h (celloedd HaCaT) neu 4h (celloedd NIH / 3T3). Ar ôl hynny, disodlwyd yr ateb MTT gan DMSO a'i ddeor am l0 munud, gydag ysgwyd, i ddiddymu'r crisialau formazan yn llwyr. Ar ôl deori, mesurwyd yr amsugnedd ar 570 nm mewn sbectroffotomedr (sbectra I SLT). Mynegwyd canlyniadau 3 arbrawf annibynnol, gyda 3 atgynhyrchiad yr un, fel canran ( y cant ) o'r gwerth amsugnedd a gafwyd wrth reoli a'u cyflwyno'n graffigol fel y cant o ostyngiad MTT.
2.8.3. Gweithgaredd Gwrth-Senescence
Gwerthuswyd gweithgaredd gwrth-senescence y bilen BNC-G-HDE2 gan ddefnyddio'r assay staenio -galactosidase ( -gal). Defnyddiwyd y bilen BNC-G fel rheolydd. Er mwyn paratoi'r darnau o bilen, cafodd samplau wedi'u sterileiddio (10 cm-) eu deor mewn 10 ml o gyfrwng DMEM cyflawn fel y disgrifiwyd yn flaenorol ar gyfer y assay sytowenwyndra.
Cafodd celloedd NIH/3T3 eu hadu mewn 12-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 2.5 × 104 o gelloedd/ffynnon a'u caniatáu i sefydlogi am 24 h. Yn dilyn hynny, defnyddiwyd 12.5 μM etoposide i gymell heneiddedd cellog yn NIH/3T3 am 24 h. Yna cafodd celloedd a ysgogwyd gan etoposide eu trin â dyfyniad bilen BNC-G-HDE2 am 24 awr arall.dos cistanche tubulosa redditFel rheolaeth, cafodd celloedd heb eu trin eu deor â chyfrwng DMEM neu gyda darnau o bilenni BNC-G a BNC-G-HDE. Ar ôl deori, tynnwyd y cyfrwng diwylliant, a golchwyd celloedd â PBS a'u marcio â hydoddiant -gal a baratowyd fel y disgrifiwyd gan y gwneuthurwr (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, UDA). Perfformiwyd y dadansoddiad o'r celloedd positif ar gyfer heneiddedd ar chwyddhad 20 × gan ddefnyddio microsgop maes llydan (Carl Zeiss, Oberkochen, yr Almaen). Perfformiwyd o leiaf 3 arbrawf annibynnol yn ddyblyg, a phenderfynwyd canran y celloedd -gal-positif gan ddefnyddio pedwar delwedd microsgopig.
2.9. Dadansoddiad Ystadegol
Wrth drin y canlyniadau o nodweddu, gweithgaredd gwrthocsidiol, a phrawf sefydlogrwydd storio'r pilenni, defnyddiwyd dadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA) ac yna prawf Tukey i asesu lefel yr arwyddocâd. Mynegir y canlyniadau fel cymedr ±gwyriad safonol y cymedr. O ran profion in vitro, aseswyd normalrwydd y dosbarthiad data gan brofion normalrwydd D'Agostino-Pearson a Shapiro-Wilk. Perfformiwyd cymariaethau ystadegol rhwng grwpiau gan ANOVA ac yna prawf post-hoc Dunnett neu brawf t Myfyrwyr heb eu paru. Cyflwynir y canlyniadau fel y cymedr ± gwall safonol cymedr y nifer o arbrofion a nodir.
Derbyniwyd pwysigrwydd ar werthoedd t<0.05. all="" statistical="" calculations="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" software(8.0.2,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">
Daw'r erthygl hon o Deunyddiau 2022, 15, 1982. https://doi.org/10.3390/ma15051982 https://www.mdpi.com/journal/materials
