CAR-neutrophil Cyfryngol Cyflenwi Nanodrugs Ymatebol Micro-amgylchedd Tiwmor Ar gyfer Glioblastoma Cemo-imiwnotherapi

Glioblastoma (GBM) yw un o'r tiwmorau solet mwyaf ymosodol a marwol mewn pobl. Er bod therapiwteg effeithiol, fel celloedd derbynyddion antigen chimerig (CAR)-T sy'n dod i'r amlwg a chemotherapiwteg, wedi'u datblygu i drin canserau amrywiol, mae eu heffeithiolrwydd mewn triniaeth GBM wedi'i rwystro'n bennaf gan y rhwystr gwaed-ymennydd a rhwystrau tiwmor gwaed-ymennydd. Mae niwtroffiliau dynol yn croesi rhwystrau ffisiolegol yn effeithiol ac yn arddangos imiwnedd effeithydd yn erbyn pathogenau ond mae'r oes fer a'r ymwrthedd i olygu genomau niwtroffiliau cynradd wedi cyfyngu ar eu cymhwysiad eang mewn imiwnotherapi. Yma rydyn ni'n peiriannu bôn-gelloedd lluosog dynol yn enetig gyda genyn cyfryngol CRISPR/Cas{9-gnawd i mewn i fynegi amrywiol luniadau CAR gwrth-GBM gyda CD3ζ T-benodol neu barthau signalau neutroffil-benodol. Mae neutrophils CAR gyda'r gweithgaredd gwrth-tiwmor gorau yn cael eu cynhyrchu i gyflenwi a rhyddhau cyffuriau nano micro-amgylchedd-ymatebol i ficro-amgylchedd tiwmor yn benodol ac yn anfewnwthiol i dargedu GBM heb fod angen achosi llid ychwanegol yn y safleoedd tiwmor. Mae'r cemo-imiwnotherapi cyfun hwn yn arddangos gweithgareddau gwrth-GBM uwchraddol a phenodol, yn lleihau cyflenwi cyffuriau oddi ar y targed, ac yn ymestyn oes llygod sy'n cario tiwmor benywaidd. Gyda'i gilydd, mae'r system dosbarthu cyffuriau CAR-neutrophil biomimetig hon yn llwyfan diogel, grymus ac amlbwrpas ar gyfer trin GBM ac o bosibl afiechydon dinistriol eraill.

Manteision cistanche tubulosa-Antitumor

Nodweddir Glioblastoma (GBM) gan gyfradd marwolaethau uchel, oes fer, a phrognosis gwael gyda thueddiad uchel o ailddigwydd1,2. Mae effeithiolrwydd therapiwtig llawdriniaethau a chemo-gyffuriau yn cael eu rhwystro'n bennaf gan strwythur yr ymennydd mân a rhwystr ffisiolegol gwaed-ymennydd (BBB) ​​neu rwystr gwaed-ymennydd-tiwmor (BBTB)3-5. Yn arbennig, mae cyflwyno cyffuriau i'r system nerfol ganolog (CNS) ar gyfer trin tiwmorau ar yr ymennydd yn heriol iawn:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Cafodd imiwnedd cynhenid ​​​​neutrophils a phlastigrwydd yn erbyn canserau amrywiol12-16, gan gynnwys GBM, eu harchwilio'n llai na'u cymhwysiad fel cludwyr celloedd wrth ddosbarthu cyffuriau8-10. Mae neutrophils sy'n cylchredeg yn y gwaed yn gartref i'r micro-amgylchedd tiwmor hypocsig (TME), lle maent yn dod yn niwtroffiliau heterogenaidd sy'n gysylltiedig â thiwmor (TANs), elfen hanfodol o TME gwrthimiwnedd sy'n cyfrannu at ddilyniant canser ac ymwrthedd therapiwtig12,17. Yn debyg i macroffagau, canfuwyd ffenoteipiau gwrth-tiwmor N1 a rhag-tiwmor N2 o TANs o fewn TME18-21 hypocsig. Mae strategaethau therapiwtig amrywiol wedi'u datblygu i dargedu neutrophils yn uniongyrchol gyda ffocws ar ddisbyddu neu ataliad neutrophil12,22, gan arwain at sawl treial clinigol (ee, atalydd CCR5 Maraviroc yn NCT03274804). Felly, gall cymhwyso niwtroffiliau heb eu trin yn uniongyrchol fel nanocarrier achosi risg ychwanegol i gleifion canser lle gellir ailraglennu neutrophils masnachu cyffuriau i'r ffenoteip gwrth-tiwmor gwrthimiwnedd N2 o fewn TME ar ôl cartrefu i safleoedd tiwmor13,23. Yn ogystal, dylid archwilio a hybu gweithgareddau gwrth-tiwmor cynhenid ​​niwtroffiliau naïf er mwyn sicrhau'r effeithiolrwydd therapiwtig gorau posibl pan gaiff ei ddefnyddio fel cludwr cyffuriau ar y cyd â chemotherapiwteg.

Manteision cistanche tubulosa- cryfhau'r system imiwnedd

Mae addasu derbynyddion antigen cemerig (CAR) wedi gwella'n sylweddol weithgareddau gwrth-diwmor celloedd T imiwn neu gelloedd lladd naturiol (NK)24-27. Fodd bynnag, mae eu heffeithiolrwydd mewn tiwmorau solet yn gyfyngedig o hyd yn rhannol oherwydd eu gallu cymharol isel i fasnachu mewn pobl a threiddiad tiwmor. Mae presenoldeb BBB ffisiolegol a BBTB yn amharu ymhellach ar effeithiolrwydd y therapiwteg datblygol hyn yn erbyn GBM yn yr ymennydd. Fe wnaethom ddyfalu y gallai'r cyfuniad o beirianneg CAR a niwtroffiliau symudol iawn gynnal eu ffenoteip N1 gwrth-diwmor a chynhyrchu effeithiolrwydd therapiwtig rhagorol wrth drin GBM. Mae neutrophils cynradd yn fyrhoedlog ac yn gallu gwrthsefyll golygu genom28, gan gyfyngu ar eu defnydd mewn imiwnotherapi a gyfeirir gan CAR. Gallai bôn-gelloedd lluosog dynol (hPSCs), sy’n fwy hygyrch i olygu genynnau ac sy’n gallu gwahaniaethu’n niwtroffiliau’n aruthrol, ddarparu ffynhonnell ddiderfyn o niwtroffiliau CAR o ansawdd uchel ar gyfer imiwnotherapi wedi’i dargedu o dan amodau di-xeno wedi’u diffinio’n gemegol29. Mae neutrophils hefyd yn ffafrio pathogenau microbaidd phagocytose gydag arwynebau garw neu hir, megis S. awrëws ac E. coli30, y dylid eu hystyried wrth ddylunio nanoronynnau wrth gyflenwi cyffuriau trwy gyfrwng neutrophil. Yn wir, mae Safari et al. adroddwyd yn ddiweddar y ffagocytosis a ffefrir o ronynnau hirfaith a weinyddir yn fewnwythiennol, heb addasiadau cymhleth i'r wyneb, trwy neutrophils cylchredol30. Gall dyluniad mor hawdd a bio-ysbrydoledig mewn nanoronynnau wedi'u llwytho â chyffuriau wneud y mwyaf o lwyth cyffuriau mewn niwtroffiliau a chaniatáu lefelau therapiwtig o gyflenwi cyffuriau mewn safleoedd targedig.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>Mae 20% o nanodrugs a weinyddir yn cael eu danfon i diwmorau ar yr ymennydd gan neutrophils CAR o gymharu ag 1% gan nanodrugs rhad ac am ddim. I grynhoi, mae ein system dosbarthu cyffuriau CAR-neutrophil biomimetig yn llwyfan diogel, cryf ac amlbwrpas ar gyfer trin GBM a chlefydau dinistriol eraill.

Manteision cistanche tubulosa-Antitumor

Canlyniadau

Sgrinio strwythurau CAR sy'n benodol i niwtroffil ar gyfer gwell gweithgareddau gwrth-diwmor

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, ac mae mwyafrif y clonau a dargedir yn heterosygaidd (Ffig Atodol 1a–d). Cadarnhawyd mynegiant CAR ar hPSCs peirianyddol ymhellach gan RT-PCR a dadansoddiad cytometreg llif o CLTX-IgG4 (Ffig Atodol 1e-g). Yn ôl y disgwyl, cadwodd HPSCs sy'n mynegi CAR lefelau mynegiant uchel o farcwyr lluosog, gan gynnwys OCT4, SSEA4, a SOX2 (Ffig Atodol 1f).

Er mwyn cynhyrchu niwtroffiliau CAR de novo, cafodd HPSCs sy'n mynegi CAR eu gwahaniaethu'n gyntaf yn epilyddion hematopoietig lluosog ac yna myeloid gyda thriniaeth cytocinau cam-benodol35 (Ffig. 2c). Roedd cyflogaeth ddilynol G-CSF ac agonist asid retinoig AM580 yn hyrwyddo cynhyrchu niwtroffiliaid cadarn36. Yn debyg i'w cymheiriaid mewn gwaed ymylol (PB), cyflwynodd niwtroffiliau CLTX-CAR sy'n deillio o hPSC morffoleg neutrophil nodweddiadol a marcwyr wyneb CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b, a CD18 (Ffig Atodol. 2). Nesaf, gwnaethom bennu effeithiau mynegiant CAR ar sytowenwyndra gwrth-diwmor niwtroffiliau sy'n deillio o hPSC trwy eu cyd-ddiwyllio â chelloedd glioblastoma (GBM) U87MG in vitro. Yn ôl y disgwyl, cyflwynodd niwtroffiliau CLTX-CAR sy'n deillio o hPSC well gallu i ladd tiwmor o'i gymharu â neutrophils PB (Ffig. 2d), yn gyson ag arsylwadau blaenorol mewn celloedd CAR-T CLTX27. Ymhlith y gwahanol CARs hyn, roedd CAR #1 yn cyfryngu gweithgareddau lladd tiwmor uwchraddol mewn niwtroffiliau hPSC. Yn nodedig, mae CAR #4 sy'n seiliedig ar gadwyn yn lleiaf effeithiol o ran sbarduno lladd tiwmor wedi'i gyfryngu gan neutrophil, a allai fod oherwydd y copi is o ITAM mewn nag ζ-is-uned a mynegiant is o CARs sy'n dwyn ar wyneb y gell28. Mae niwtrophils yn rhyddhau rhywogaethau ocsigen adweithiol sytotocsig (ROS) a ffactor necrosis tiwmor- (TNF- ) i ladd celloedd targed. Roedd cynhyrchu ROS a TNF- (Ffig. 2e, f) o wahanol niwtroffiliau yn cyd-daro'n dda â'u cytolysis cynyddol. Yn ôl y disgwyl, roedd cynhyrchu ROS a TNF- o wahanol neutrophils ar ôl coculturing â chelloedd glial p12 SVG arferol yn parhau mor isel â'r grŵp rheoli negyddol (Ffig Atodol 3a, b). Yn ogystal, dim ond mewn cyd-deoriad â chelloedd GBM y gwelwyd sytowenwyndra gwrth-tiwmor gwell, gan gynnwys U87MG, oedolion cynradd GBM43, a chelloedd SJ-GBM2 pediatrig (Ffig Atodol 3c), gan ddangos penodoldeb uchel ein CLTX -CAR. Yn nodedig, dangosodd neutrophils CAR fiogydnawsedd uchel â chelloedd glial p12 SVG arferol, hPSCs, a chelloedd sy'n deillio o hPSC (Ffig Atodol 3d), yn gyson ag arsylwad blaenorol nad yw neutrophils cynradd anweithredol yn lladd celloedd iach16. Gyda'i gilydd, cyflwynodd niwtroffiliau CAR o ganlyniad i hPSC, yn enwedig niwtroffiliau CAR sy'n dwyn CD3ζ, sytowenwyndra gwrth-tiwmor gwell a chynhyrchwyd mwy o ROS a TNF- in vitro, gan amlygu eu potensial mewn imiwnotherapi wedi'i dargedu.

Ffig. 1|Sgematig o effeithlonrwydd gwrth-glioblastoma gwell gan ddefnyddio imiwnotherapi cyfun o niwtroffiliau CAR a nano-gyffuriau ymatebol i ficro-amgylchedd tiwmor. Peiriannwyd bôn-gelloedd lluosog dynol â CARs a'u gwahaniaethu i CAR-neutrophils sy'n cael eu llwytho â nanoronynnau silica garw (SiO2 NPs) sy'n cynnwys tirapazamine sy'n targedu hypocsia (TPZ) neu gyffuriau eraill, fel imiwnochemotherapi deuol. b CAR-neutrophil@R-SiO a weinyddir yn systemig2- Mae NPs TPZ yn ymosod yn gyntaf ar gelloedd tiwmor normocsig allanol trwy ffurfio synapsau imiwnolegol a lladd celloedd tiwmor trwy ffagocytosis. Ar ôl apoptosis, gallai CAR-neutrophils wedyn ryddhau R-SiO2-TPZ NPs, sy'n cael eu goddiweddyd gan gelloedd tiwmor. Wedi hynny, mae nano-gynhyrchion yn ymateb i'r micro-amgylchedd tiwmor hypocsig ac yn lladd celloedd tiwmor yn effeithiol. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.

Cynhaliodd niwtroffiliau CAR weithgareddau gwrth-tiwmor gwell o dan ficro-amgylcheddau tiwmor gwrthimiwnedd

Yn debyg i macroffagau, canfuwyd ffenoteipiau gwrth-tiwmor N1 a pro-tiwmor N2 o niwtroffiliau sy'n gysylltiedig â thiwmor o fewn y micro-amgylchedd tiwmor gwrthimiwnedd17. Mae neutrophils N2 pro-tiwmor yn chwarae rhan hanfodol mewn angiogenesis tiwmor, metastasis, a gwrthimiwnedd, ond mae targedu therapiwtig o'r math hwn o gelloedd wedi bod yn heriol.

Yn hytrach na strategaeth disbyddu systemig22, yma fe wnaethom werthuso potensial peirianneg CAR o ran cynnal y ffenoteip gwrth-diwmor o niwtroffiliau. Cafodd niwtroffiliau sy'n deillio o CAR hPSC a PB eu trin â hypocsia (3% O2) a TGF, sy'n cyfrannu at imiwneiddiad micro-amgylchedd tiwmor37,38, i asesu eu gweithgaredd lladd tiwmor parhaus. Er bod niwtroffiliau PB a gyflwynwyd wedi gostwng cytolysis yn sylweddol yn erbyn celloedd GBM o dan amodau gwrthimiwnedd, cynhaliodd niwtroffiliau CAR weithgareddau lladd tiwmor uchel (Ffig Atodol 4a). Gwnaed arsylwadau tebyg hefyd yn y datganiad TNF a'r genhedlaeth ROS (Ffig Atodol 4b, c) o PB neu CAR-neutrophils o dan amodau gwrthimiwnedd a normal. Er mwyn cadarnhau ffenoteip neutrophil ymhellach o dan amodau hypocsig a TGF, fe wnaethom fesur mynegiant iNOS penodol ac N2- N2-arginas penodol ar y neutrophils ynysig gan cytometreg llif (Ffig Atodol. 4d–f). O'i gymharu â normocsia, gostyngodd hypocsia gwrthimiwnedd, a TGF yn sylweddol lefelau mynegiant iNOS a lefelau uwch o arginase mewn neutrophils PB, tra bod niwtroffiliau CAR yn cadw lefelau mynegiant uchel o iNOS. Mae astudiaethau blaenorol yn dangos bod gweithrediad llwybr signalau Syk-Erk yn arwain at gynhyrchu ROS39-42. Felly, gwnaethom ganfod a chymharu actifadu Syk-Erk mewn neutrophils heb eu haddasu a niwtroffiliau CAR, ac roedd ein canlyniadau'n awgrymu gweithrediad sylweddol uwch o'r llwybr Syk-Erk mewn niwtroffiliau CAR o dan hypocsia (Ffig Atodol 5a-d), a allai gynnal cynhyrchiad ROS digyfnewid o CAR-neutrophils o dan hypocsia. Gyda'i gilydd, cynhaliodd niwtroffiliau CAR ffenoteip gwrth-tiwmor a chynnal gweithgareddau gwrth-tiwmor uchel o dan amodau micro-amgylchedd tiwmor yn dynwared in vitro, gan amlygu eu potensial mewn imiwnotherapi wedi'i dargedu.

Ffig. 2|Sgrinio strwythurau derbynnydd antigen chimerig (CAR) sy'n benodol i niwtroffil gyda gweithgareddau gwrth-tiwmor gwell wedi'u cyfryngu gan neutrophil. Sgematig o strwythurau CAR amrywiol. b Sgematig CAR #1 adeiladu a thargedu strategaeth taro i mewn at locws harbwr diogel AAVS1 o fôn-gelloedd lluosog dynol (hPSCs). Mae'r saeth fertigol yn dynodi'r AAVS1 yn targedu sgRNA. Mae saethau llorweddol coch a glas yn dynodi paent preimio ar gyfer asesu targedu effeithlonrwydd a homosygosity, yn y drefn honno. HDR: atgyweirio ailgyfuniad homologaidd. c Sgematig o wahaniaethiad niwtroffil wedi'i optimeiddio oddi wrth HPSCs o dan amodau a ddiffinnir yn gemegol. ch Perfformiwyd profion sytowenwyndra yn erbyn celloedd glioblastoma U87MG ar gymarebau gwahanol o darged niwtroffil-i-tiwmor gan ddefnyddio niwtroffiliau a nodwyd. Cynrychiolir data fel ± DC cymedrig o bum atgynhyrchiad biolegol annibynnol, prawf-t Myfyriwr dwy gynffon. Penderfynwyd ar rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) cenhedlaeth (e) a dadansoddiad ELISA o ryddhau TNF (f) o wahanol neutrophils ar ôl coculturing â chelloedd U87MG. n=5 samplau biolegol annibynnol. Cynrychiolir y data fel cymedrig ± SD, prawf-t Myfyriwr dwy gynffon. Darperir data ffynhonnell fel ffeil Data Ffynhonnell.

Paratoi a nodweddu niwtroffiliau CAR hPSC wedi'u llwytho â tirapazamine (TPZ) - sy'n cynnwys nanoronynnau SiO2

Mae niwtroffiliau PB wedi'u defnyddio fel cludwyr cellog i ddosbarthu cyffuriau delweddu a therapiwtig i diwmorau'r ymennydd8-10, er bod ymdreiddiad niwtrophil wedi'i dargedu yn gofyn am lawdriniaeth neu lid a achosir gan ysgafn a gall cyflenwi cyffuriau oddi ar y targed fod yn bryder11. Er mwyn gwella ymhellach weithgareddau gwrth-diwmor CAR-niwtroffiliau, gwnaethom baratoi nanoronynnau silica (SiO2-NP) gydag arwyneb garw neu esmwyth i lwytho cyffuriau cemotherapiwtig neu ymbelydredd yn neutrophils. Roedd delweddau microsgop electron trawsyrru (TEM) yn dangos bod y ddau nanoronynnau SiO2 wedi'u gwasgaru'n dda ac yn arddangos morffoleg sfferig gyda maint unffurf (Ffig. 3a, Ffig Atodol 6a). Dangosodd dadansoddiad dosbarthiad cyfansoddiad trwy sganio TEM (STEM) gyda sbectrosgopeg pelydr-X gwasgaredig ynni (EDS) fod yr elfen sylffwr (S) wedi'i ddosbarthu'n gyfartal o fewn y nanoronynnau SiO2 garw cyfan (R-SiO2) (Ffig. 3b). Gan ddefnyddio nitrogen (N2) isothermau arsugniad-amsugno a dadansoddiad dosbarthiad maint mandwll cyfatebol, meintiau mandwll o R- a SSiO2 NPs eu mesur fel 25 nm a 35 nm (Ffig. 3c, Atodol Ffig. 6b), yn y drefn honno. O ystyried yr arwynebedd arwyneb uchel a maint mandwll mawr, gallai cyffuriau therapiwtig gael eu llwytho'n effeithiol i NPs R- a S-SiO2, fel y dangosir gan y tirapazamine pro-gyffur sy'n ymateb i hypocsia (TPZ) (Ffig. 3d, Ffig Atodol 6c) . Ar ôl llwytho TPZ, ni welwyd newidiadau sylweddol yn y gwasgariad, morffoleg, a maint R-SiO2-TPZ gan ddefnyddio TEM a dadansoddiad gwasgariad golau deinamig (Ffig Atodol 6d, e). Mae'r bondiau tetra-sylfid sydd wedi'u hymgorffori yn y NPs R-SiO2 yn sensitif i amgylcheddau gostyngol a gallant gael eu diraddio'n gyflym gan y swm mawr o glutathione (GSH) sy'n bresennol yn y celloedd tiwmor43. Fe wnaethom benderfynu nesaf ar ddiraddadwyedd ymatebol GSH NPs R-SiO2-TPZ ym mhresenoldeb 10 mM, 1 mM, a 10 μM GSH, a oedd yr un fath â chyflyrau mewngellol celloedd canser, celloedd normal, ac amgylcheddau allgellog43, yn y drefn honno. Ar ôl triniaeth GSH 10 mM, cafodd strwythur sfferig cychwynnol R-SiO2-TPZ NPs ei ddinistrio'n ddifrifol ar ôl 24 awr (Ffig Atodol 6f, g). Cafodd y nanoronynnau eu dadelfennu'n gyfan gwbl i falurion bach ar ôl 48 h, gan arwain at ryddhau TPZ mewn modd GSH-ymatebol (Ffig. 3e). Nid oedd malurion NPs R-SiO2 yn achosi unrhyw sytowenwyndra sylweddol i'r celloedd a brofwyd yn vitro (Ffig Atodol 6h), gan nodi diogelwch cymharol NPs R-SiO2.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche

【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Y tro nesaf fe wnaethom werthuso ymarferoldeb defnyddio NPs SiO2-TPZ i lwytho cyffuriau therapiwtig i mewn i niwtroffiliau CAR fel cemoimmunotherapi cyfun i gyflawni effeithiolrwydd therapiwtig gwell. Ar ôl centrifugio, fe wnaethom fesur y nifer sy'n cymryd cellog o NPs SiO2-TPZ gan niwtroffiliau gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd a dadansoddiad cytometreg llif (Ffig. 3f, g), a chanfod bod cellog yn fwy sylweddol o R-SiO2-TPZ NPs na S-SiO2 - NPs TPZ gan neutrophils. Cynnwys Si Cellog mewn neutrophils ei fesur fel 11.3 a 19.1 ng Si / ug protein ar gyfer llyfn a garw SiO2 NPs@TPZ (Ffig. 3h), yn y drefn honno, gan anwythol cyplysu plasma sbectrometreg màs (ICP-MS). O ystyried eu gallu llwytho uchel mewn neutrophils, R-SiO2-TPZ NPs eu cyflogi ar gyfer arbrofion dilynol. Yna ceisiasom brofi swyddogaethau ffisiolegol neutrophils CAR ar ôl llwytho NPs R-SiO2-TPZ. Ni welwyd unrhyw newidiadau yn hyfywedd celloedd (Ffig. 3i, Atodol Ffig. 6i), gallu mudo trawswell (Ffig. 3j), chemotaxis, a chyflymder cyfatebol (Ffig. 3k, l) CAR-neutrophils cyn neu ar ôl llwytho R-SiO2 – TPZ NPs, gan ddangos eu biocompatibility uchel. Perfformiwyd dadansoddiad llwytho nano-gyffuriau sy'n dibynnu ar amser hefyd a chyrhaeddwyd y cynnwys llwytho uchaf ar 1 h ar ôl deori cell-NP (Ffig Atodol 7a). Mae mwy na 95% CAR-neutrophils eu llwytho yn llwyddiannus gyda R-SiO2-TPZ NPs (Atodol Ffig. 7b). Ni newidiwyd lefel mynegiant CD11b, protein arwyneb niwtrophil sy'n cyfryngu swyddogaeth adlyniad a mudo ar symbyliad moleciwlau llidiol, ar CAR-neutrophils gyda neu heb lwytho R-SiO TPZ (Ffig Atodol 7c, d). Mae superoxide neu rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn cael eu rhyddhau o niwtroffiliau gweithredol i ladd microbau a chelloedd tiwmor44. Yn ôl y disgwyl, cynyddwyd cynhyrchu ROS gan CAR-neutrophils yn sylweddol ar ôl triniaeth N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP), ac ni welwyd gwahaniaethau sylweddol mewn cynhyrchu ROS gan CAR-neutrophils cyn ac ar ôl llwytho R-SiO2- TPZ (Ffig. 3m). Gyda'i gilydd, dangosodd ein data fod niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO2-TPZ wedi cynnal gweithgareddau ffisiolegol neutrophils math gwyllt ac y gallent symud yn weithredol tuag at ysgogiadau llidiol, gan amlygu eu potensial mewn cemoimmunotherapi canser wedi'i dargedu.

Niwtrophils CAR sy'n cael eu llwytho â nanoronynnau R-SiO2-TPZ nanoronynnau yn lladd celloedd glioblastoma i bob pwrpas

Y tro nesaf fe wnaethom werthuso effaith R-SiO2-TPZ ar allu niwtroffiliau CAR i ladd tiwmor. Roedd rhyngweithio agos rhwng effaithydd-targed yn rhagofyniad ar gyfer cytolysis wedi'i gyfryngu gan neutrophil. Yn ôl y disgwyl, ffurfiodd CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ synapsau imiwn gyda chelloedd tiwmor o fewn 2 f ac arddangosodd niferoedd rhyngweithio targed effaithydd tebyg i CAR-neutrophils di-gyffuriau (Ffig. 4a, Ffig. Atodol 8) . Yn nodedig, ni chanfuwyd unrhyw ryngweithiadau gweladwy rhwng CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ a chelloedd somatig nad ydynt yn ganseraidd (Ffig. Atodol 8), gan amlygu penodoldeb CLTX-CAR yn erbyn tiwmorau ar yr ymennydd. Ar ben hynny, R-SiO2-TPZ NPs eu rhyddhau o neutrophils i mewn i'r cyfrwng diwylliant (Atodol Ffig. 9a, b) 12 h ar ôl cyd-ddiwylliant a mynd i mewn i'r celloedd tiwmor sy'n weddill (Ffig. 4a). Pedair awr ar hugain ar ôl cyd-deoriad o SiO2-TPZ NP-llwytho CAR-neutrophils gyda chelloedd tiwmor, hyd at 95% o gelloedd tiwmor yn cynnwys R-SiO2-TPZ NPs (Ffig. 4a, Atodol Ffig. 9c), sy'n dynodi llwyddiannus rhaeadru trafnidiaeth sy'n cynnwys neutrophils cludo sy'n cyflawni eu swyddogaeth celloedd effaith ac sy'n cael apoptosis, gan ryddhau NPs R-SiO2-TPZ yn oddefol i'r celloedd tiwmor targed45. Fe wnaethom hefyd ddilysu swyddogaeth ymatebol hypocsig a sytowenwyndra TPZ pro-gyffuriau o fewn celloedd tiwmor trwy ddadansoddiad sbectrosgopeg cyseiniant paramagnetig electron (EPR) o gynhyrchu radicalau o TPZ (Ffig Atodol 9d) a dadansoddiad cytometreg llif o TOPRO-3 ar diwmor. celloedd (Ffig Atodol 9e) o dan hypocsia a normocsia. Er mwyn pennu cytolysis R-SiO2-TPZ NP-lwytho niwtroffiliau CAR, rydym yn gweithredu in vitro normocsia-hypocsia ail-ail-alwino model tiwmor (Ffig. 4b). Pedair awr ar hugain ar ôl cyd-ddiwylliant normocsig, roedd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho â R-SiO2-TPZ NPs neu ddim yn arddangos sytowenwyndra gwrth-tiwmor tebyg (Ffig. 4c), ac roedd y ddau yn uwch na PB-niwtroffil wedi'i lwytho ag R. -SiO2-TPZ NPs neu beidio ac R-SiO2- TPZ NPs yn unig. Mae'r sytotocsigedd gwell yn bennaf oherwydd y gallu cynyddol i dargedu tiwmor gan neutrophils ar ôl peirianneg CAR. Ar ôl cyd-ddiwylliant hypocsig 12 a 24-h ychwanegol gyda chelloedd tiwmor, dangosodd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO TPZ NP allu gwrth-tiwmor uwch o gymharu â grwpiau eraill (Ffig. 4d, e). Yn ogystal, dangosodd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho ag R-SiO2-TPZ NPs sytolysis ardderchog yn erbyn celloedd tiwmor ffres wedi'u hailhadu (Ffig. 4f), sy'n dangos gallu gwrth-diwmor R-SiO a ryddhawyd2-TPZ nanoronynnau ar ôl apoptosis neutrophil.

Yna fe wnaethom gynnal dadansoddiad dilyniannu RNA (RNA-seq) ar gelloedd tiwmor i egluro'r mecanwaith moleciwlaidd posibl sy'n sail i cytolysis gwrth-diwmor gwell o niwtroffiliau gan fynegiant CAR ac R-SiO2- TPZ NPs. Dangosodd dadansoddiad mynegiant genynnau, o gymharu â rheolaeth ac R-SiO2-TPZ NPs, fod niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gyda neu heb R-SiO2-TPZ NPs wedi lleihau mynegiant genynnau cytoplasm a philen mewn celloedd tiwmor yn sylweddol. Atodol Ffig. 10a, Ffig. 4g), cefnogi ymhellach eu ffagocytosis o gelloedd tiwmor adeg cyd-ddiwylliant. Er bod pob grŵp arbrofol wedi cynyddu straen ocsideiddiol cellog mewn celloedd tiwmor, perfformiodd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO TPZ yn well na grwpiau eraill o ran sbarduno signalau straen ocsideiddiol. Yn ogystal, roedd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO{2-TPZ) wedi hyrwyddo apoptosis yn sylweddol ac wedi lleihau ymlediad mewn celloedd tiwmor. Er mwyn deall ymhellach weithgareddau gwrth-tiwmor gwell niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO{{2-TPZ), gwnaethom gymhwyso atalydd ffagosytosis cytochalasin D a sborionwr rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) N-acetyl-cysteine ​​(NAC) a atalydd ROS GSK2795039 i'r cyd-ddiwylliant tiwmor-niwtroffil. Gostyngwyd cytolysis celloedd tiwmor gan CAR-neutrophils yn sylweddol gan 5 μM cytochalasin D, 5 mM NAC, a 100 nM GSK2795039 (Ffig Atodol 10b, c), sy'n nodi rôl amlwg ffagocytosis a ROS mewn CAR neutrophil-gyfryngol tiwmor-gell lladd. Mae'r 40%{37}}% sy'n weddill o lysis celloedd tiwmor ym mhresenoldeb neutrophils a NAC neu GSK2795039 yn dangos bod mecanwaith ROS-annibynnol yn cymryd rhan mewn lladd tiwmor trwy gyfrwng neutrophil sy'n werth ymchwilio ymhellach.

Ffig. 3|Paratoi a nodweddu niwtroffiliau CAR hPSC wedi'u llwytho â tirapazamine (TPZ) sy'n cynnwys nanoronynnau SiO2. a–e Microsgop electron trawsyrru (TEM) (a) a sbectrosgopeg gwasgaredig egni (EDS) delweddau mapio elfennol (b) o nanoronynnau SiO2 garw yn cael eu dangos. c Nitrogen arsugniad-disorption isotherm o nanoronynnau SiO2 garw ynghyd â Barrett-JoynerHalenda (BJH) plot dosbarthiad maint mandwll yn cael ei ddangos. Perfformiwyd triphlygiadau biolegol yn annibynnol. Mesurwyd cynnwys llwytho TPZ mewn nanoronynnau SiO2 (d) a glutathione (GSH) --rhyddhau TPZ ymatebol (e) ar yr amser a nodwyd. n=3 samplau biolegol annibynnol. Dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ar gyfer (e). Delweddau fflworoleuedd (f) a dadansoddiad cytometreg llif (g) o niwtroffiliau wedi'u llwytho â SiO llyfn a garw2-TPZ. Perfformiwyd triphlygiadau biolegol yn annibynnol. h Mesurwyd cynnwys Cellog SiO2 mewn niwtroffiliau CAR sy'n deillio o hPSC. n=5 samplau biolegol annibynnol, prawf-t Myfyriwr dwy gynffon. Hyfywedd cellog (i), n=3 samplau sy'n annibynnol yn fiolegol, trawsfudo (j), n=5 samplau sy'n annibynnol yn fiolegol, galluoedd cemoatyniad (k, l), n=20 samplau sy'n annibynnol yn fiolegol, a Dangoswyd gallu cynhyrchu ROS (m) o niwtroffiliau CAR sy'n deillio o hPSC wedi'u llwytho gyda neu heb SiO garw2-TPZ, n=5 samplau biolegol annibynnol, prawf-t Myfyriwr dwy gynffon. PMA: phorbol myristate asetad. Cynrychiolir yr holl ddata yn y ffigur hwn fel cymedr ± DC. Darperir data ffynhonnell fel ffeil Data Ffynhonnell.

Gwerthusiad swyddogaethol o niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho â nano-gyffuriau gan ddefnyddio modelau glioblastoma biomimetig in vitro

Er mwyn asesu ymhellach weithgareddau R-SiO2-TPZ NP-neutrophils CAR-neutrophils, fe wnaethom weithredu model tiwmor rhwystr gwaed-ymennydd seiliedig ar drawswellt (BBB) ​​gan ddefnyddio celloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd dynol (Ffig. 5a, Ffig. .11a). Yn ôl y disgwyl, dangosodd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO2-TPZ NP-Llwythiad CAR allu trawsfudo rhagorol ar draws model BBB in vitro (Ffig. 5b), gan ladd celloedd tiwmor wedi'u targedu i bob pwrpas ar ôl trawsfudo o dan amodau normocsig a hypocsig (Ffig. 5c). , ch), a rhyddhau mwy o cytocinau llidiol (Ffig. 5e) a allai ddenu celloedd effeithydd eraill i ladd y celloedd tiwmor. Yn ogystal, ni wnaeth neutrophils CAR effeithio'n sylweddol ar hyfywedd celloedd endothelaidd ar ôl trawsfudo (Ffig Atodol 11b). Cadwodd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO TPZ NP allu trawsfudo rhagorol yn ystod yr ail arbrawf trawsfudo (Ffig. 5f) a gallu gwrth-diwmor uwch o gymharu â grwpiau eraill (Ffig. 5g). Yna defnyddiwyd model sfferoid tiwmor tri dimensiwn (3D) i werthuso cynhwysedd treiddiad tiwmor R-SiO2-TPZ NP-nwtroffiliau CAR-lwythog (Ffig. 5h). Ymfudodd CAR-neutrophils yn raddol tuag at ganol y sfferoid tiwmor a'i ddosbarthu'n unffurf yn y sfferoid ar ôl 8 h o ddeor (Ffig. 5i). Gwelwyd lefel uchel o gyd-leoli rhwng niwtroffiliau CAR ac R-SiO2-TPZ NPs (Ffig. Atodol 12a–c), sy'n dangos bod R-SiO2-TPZ NPs wedi'u crynhoi'n sefydlog yn y CAR. -neutrophils yn ystod ymdreiddiad tiwmor cyn eu cytolysis. Heb esgoriad trwy gyfrwng neutrophil, dim ond ar haen allanol sfferoidau tiwmor y canfuwyd R-SiO2-TPZ NPs. O'i gymharu ag R-SiO TPZ NPs a CAR-neutrophils, arddangosodd niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho gan R-SiO TPZ NP sytolysis gwrth-tiwmor uwchraddol yn y model tiwmor 3D (Ffig. 5j). Gellir cyflogi NPs CAR-neutrophils@R-SiO2 hefyd i ddosbarthu cyffuriau eraill, gan gynnwys temozolomide clinigol (TMZ) a JNJ- 64619187, i fodelau tiwmor 3D a lladd celloedd GBM yn effeithlon (Ffig Atodol 12d–f). Gyda'i gilydd, roedd y niwtroffiliau CAR cyfunol a'r cyffuriau nano yn dangos gweithgareddau gwrth-tiwmor rhagorol mewn micro-amgylchedd tiwmor biomimetig yn dynwared amodau in vitro, gan amlygu potensial therapiwtig cemoimmunotherapi cyfun seiliedig ar niwtroffil.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Dosbarthiad in vivo R-SiO CAR a gyflenwir gan niwtroffil2-TPZ nanoronynnau

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >Dosbarthwyd 20% o nanodrugs a weinyddwyd i diwmorau ar yr ymennydd gan CAR-neutrophils o gymharu ag 1% gan nanodrugs rhad ac am ddim sy'n gyson ag adroddiadau blaenorol6. Cadarnhaodd dadansoddiad histoleg hefyd fod y dadansoddiad histoleg (Ffig. 6d) yn cyflwyno targedig o R-SiO NPs TPZ i'r ymennydd gwesteiwr ar draws BBB gan CAR-neutrophils. I'r gwrthwyneb, roedd R-SiO2-TPZ NPs yn unig yn cronni'n bennaf yn yr afu a'r ddueg. Gyda'i gilydd, roedd ein data'n dangos darpariaeth well wedi'i thargedu o R-SiO TPZ NPs gan niwtroffiliau CAR heb fod angen achosi llid ychwanegol ar safle'r tiwmor, gan amlygu dichonoldeb a diogelwch cemoimmunotherapi seiliedig ar neutrophil mewn triniaeth canser.

Roedd y cemoimiwnotherapi cyfun o CAR-neutrophils ac R-SiO2-TPZ nanoronynnau yn arddangos gweithgareddau gwrth glioblastoma rhagorol in vivo

Er mwyn pennu effeithiolrwydd therapiwtig niwtroffiliau CAR wedi'i lwytho gan R-SiO2-TPZ NP, sefydlwyd model xenograft in situ o glioblastoma yn y llygod NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) gan ddefnyddio celloedd luciferase sy'n mynegi U87MG. Roedd llygod sy'n dwyn tiwmor yn cael eu gweinyddu'n fewnwythiennol 5 × 106 neutrophils yn wythnosol (Ffig. 7a), a chafodd baich tiwmor yn y gwesteiwyr ei fesur a'i feintioli (Ffig. 7b, c). O'i gymharu â llygod wedi'u trin â PBS neu PB-neutrophil, roedd triniaeth â niwtroffiliau CAR a CAR neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs wedi arafu twf tiwmor yn effeithiol. Neutrophils CAR@R-SiO2-TPZ Dangosodd NPs sytowenwyndra gwrth-tiwmor lawer uwch nag unrhyw grwpiau arbrofol eraill. I'r gwrthwyneb, roedd PB-neutrophils yn hyrwyddo twf tiwmor yn sylweddol yn yr ymennydd, gan arwain at farwolaeth llygod sy'n dwyn tiwmor mor gynnar â diwrnod 23 (Ffig. 7d), gan awgrymu y gallai neutrophils heb eu peiriannu achosi risgiau ychwanegol. Rydym yn mesur rhyddhau cytocine dynol nesaf yn y plasma o grwpiau llygoden arbrofol gwahanol (Ffig. 7e). Cynhyrchodd pob grŵp arbrofol nad yw'n PBS TNF ac IL-6 canfyddadwy yn y plasma o ddiwrnod 5 i ddiwrnod 26, gan awgrymu actifadu neutrophils dynol ar ysgogiad tiwmor. Yn gyson â'r gyfradd twf tiwmor uwch a arsylwyd, rhyddhaodd niwtroffiliau heb eu haddasu yn raddol fwy o IL-6 a TNF , a allai arwain at syndrom rhyddhau cytocin mewn cleifion a bod angen astudiaethau diogelwch manylach gydag atalwyr IL46,47 . Yn nodedig, dangosodd NPau CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ lai o allu i gynhyrchu cytocinau yn ddiweddarach (diwrnod 19 a diwrnod 26), gan awgrymu risg isel posibl o syndrom rhyddhau cytocin mewn cleifion sy'n cael eu trin â chemoimmunotherapi seiliedig ar CAR-neutrophil. Gwerthuswyd biocompatibility CAR-neutrophils cyfunol ac R-SiO2-TPZ NPs trwy fesur pwysau'r corff yn wythnosol a monitro newidiadau patholegol mewn organau mawr o lygod. Ni welwyd unrhyw wahaniaeth ym mhwysau'r corff rhwng CAR neutrophils@R-SiO2-TPZ llygod wedi'u trin â NP ac unrhyw grwpiau arbrofol eraill (Ffig. 7f), sy'n nodi gwenwyndra systemig lleiaf posibl a biogydnawsedd rhagorol CAR-neutrophils@ R-SiO2-TPZ NPs o fewn 28 diwrnod o driniaeth. Dangosodd dadansoddiad histolegol ar organau mawr wedi’u sleisio o lygod ar ddiwrnod 30 nad oedd llygod a gafodd eu trin gan CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ a gafodd eu trin â NP yn achosi annormaledd amlwg na niwed i organau yn y galon, yr afu, y ddueg, yr ysgyfaint a’r aren (Ffig Atodol. 13), gan gadarnhau ymhellach ddiogelwch CAR-neutrophils cyfun ac R-SiO2-TPZ NPs.

Ffig. 4|Mae niwtroffiliau CAR sy'n cael eu llwytho â nanoronynnau R-SiO2-TPZ yn lladd celloedd glioblastoma i bob pwrpas. Dangoswyd delweddau cynrychioliadol o synapsau imiwnolegol a nodwyd gan groniad F-actin wedi'i begynnu ar y rhyngwyneb rhwng CAR-neutrophils a chelloedd tiwmor yn 6, 12, a 24 h. R-SiO2-TPZ nanoronynnau a ryddhawyd o CAR-neutrophils ar ffagocytosis cell tiwmor yn cael eu cymryd gan gelloedd tiwmor. Perfformiwyd triphlyg yn annibynnol. b Sgematig o asesiad sytowenwyndra gwrth-tiwmor wedi'i gyfryngu gan neutrophil. Perfformiwyd cytotocsigedd yn erbyn celloedd glioblastoma U87MG ar wahanol gymarebau o darged neutrophil-i-tiwmor gan ddefnyddio neutrophils a nodir yn 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e), a 72 h (f). n=3 samplau biolegol annibynnol. Cynrychiolir data fel cymedr ± DC, dadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA). g Perfformiwyd dadansoddiad dilyniant RNA swmp ar gelloedd U87MG o dan amodau amrywiol. Mae map gwres yn dangos lefelau mynegiant cytoplasm dethol, pilen, straen ocsideiddiol, apoptosis, a genynnau sy'n gysylltiedig ag amlhau yn y celloedd glioblastoma a nodir. n=2 samplau biolegol annibynnol. Darperir data ffynhonnell fel ffeil Data Ffynhonnell.

Ffig. 5|Gwerthusiad swyddogaethol o niwtroffiliau CAR wedi'u llwytho â nanoronynnau R-SiO2-TPZ gan ddefnyddio modelau glioblastoma biomimetig (GBM) in vitro. Sgematig o'n model tiwmor in vitro o GBM gyda rhwystr gwaed-ymennydd (BBB), sy'n cynnwys celloedd endothelaidd ar y gellbilen fewnosod a chelloedd tiwmor ar waelod yr un trawswell. b Dangosir dadansoddiad mudo Transwell o niwtroffiliau ar 12 h. Mesurwyd a mesurwyd sytowenwyndra gwrth-GBM o niwtroffiliau a nodwyd ar 24 h (c) a 36 h (d). e Perfformiwyd dadansoddiad ELISA o IL-6 a TNF a ryddhawyd o niwtroffiliau a nodwyd ar 36 h. f Dangosir ail ymfudiad o wahanol niwtroffiliau ar 48 h. g Cafodd sytowenwyndra gwrth-GBM y neutrophils a nodwyd ar 60 h ei fesur a'i feintioli. h–j Dangoswyd sgematig o fodel tiwmor tri dimensiwn (3D) wedi'i ymdreiddio gan niwtroffil yn vitro yn (h). Dangoswyd delweddau fflwroleuol cynrychioliadol o neutrophils ymdreiddiedig yn y modelau tiwmor 3D. Defnyddiwyd DAPI i staenio'r celloedd niwclear a defnyddiwyd CD45 i staenio neutrophils. Bariau graddfa, 200 μm. Perfformiwyd triphlygiadau biolegol yn annibynnol. j Mesurwyd a meintiolwyd gallu lladd tiwmor cyfatebol niwtroffiliau a nodwyd gan ddefnyddio pecyn sytowenwyndra. Cynrychiolir data fel cymedrig ± DC o bum atgynhyrchiad biolegol annibynnol, dadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA). Darperir data ffynhonnell fel ffeil Data Ffynhonnell.

Er bod CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs wedi arafu twf tiwmor yn sylweddol mewn llygod xenograft, mae'r gwahaniaeth mewn goroesiad anifeiliaid mewn grwpiau arbrofol o CAR-neutrophils, SiO2-TPZ NPs a CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs yn ddibwys. (p> 0.05), sydd o bosibl oherwydd marwolaeth neutrophils byrhoedlog yn ystod paratoi celloedd a chwistrellu. Fe wnaethom ganolbwyntio nesaf ar y tri grŵp hyn a phenderfynu a fyddai llai o amser paratoi celloedd a mwy o ddosau o CAR-neutrophils a nano-gyffuriau yn gwneud unrhyw wahaniaeth o ran goroesiad anifeiliaid (Ffig. 7g). Pan gafodd ei weinyddu'n systematig 6 gwaith, perfformiodd NPs CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ yn well na'r ddau grŵp arall o ran ymestyn oes llygod â thiwmor (Ffig. 7h), tra bod gwahaniaeth goroesiad anifeiliaid mewn grwpiau o CAR-neutrophils a SiO2- Roedd NPs TPZ yn parhau'n ddibwys. Er y gwelwyd cromlin goroesi debyg o'r grŵp R-SiO TPZ2- TPZ rhwng y ddwy astudiaeth anifeiliaid annibynnol hyn, gostyngodd yr amser ynysu celloedd a pharatoi ar gyfer pigiad o gyfanswm o ~4 awr i 1 awr yn ystod y 4 niwtroffil cyntaf. arweiniodd dosau at well goroesiad anifeiliaid mewn grwpiau CAR-niwtroffil cyn diwrnod 32. Gyda'i gilydd, dangosodd ein data bwysigrwydd paratoi niwtroffil ac optimeiddio dosau mewn cymwysiadau clinigol therapiwteg niwtroffil yn y dyfodol.

Trafodaeth

Mae neutrophils llygod wedi'u dangos fel cludwr pwerus i ddosbarthu nanodrugs yn effeithlon i diwmorau ymennydd llidus ar ôl llawdriniaeth8,9. Er hynny, mae dichonoldeb a diogelwch defnyddio neutrophils dynol wrth gyflenwi cyffuriau yn parhau i fod yn anodd dod i'r amlwg. Efallai y bydd y nifer fawr o niwtroffiliau llygoden (10 gwaith yn uwch na chyfanswm nifer y niwtroffiliau sy'n cylchredeg mewn llygod11) a ddefnyddiwyd yn yr astudiaethau hyn i sicrhau budd therapiwtig yn rhwystro eu cyfieithiad clinigol ymhellach oherwydd gall echdynnu nifer fawr o niwtroffiliau o gleifion canser arwain at niwtropenia a phys. risgiau eraill. Er mwyn mynd i’r afael â’r heriau hyn, gwnaethom harneisio pŵer HPSCs hunan-adnewyddu i gael niwtroffiliau dynol de novo diderfyn29. Fe wnaethom ddatblygu system bwerus ar gyfer dosbarthu cyffuriau wedi'i chyfryngu gan fio-ysbrydoledig gyda pheirianneg CAR29 a defnyddio niwtroffiliau CAR dynol wedi'u peiriannu fel nanocarrier gyda gweithgareddau gwrth-diwmor trawiadol. Mae NPs SiO2 garw yn gweithio'n well na NPs SiO2 llyfn mewn cludwyr CAR-niwtroffil, yn gyson ag arsylwadau blaenorol bod neutrophils yn ffafrio pathogenau microbaidd garw ffagocytos30. Nodwyd bod niwtroffiliau yn hybu amlhau a dilyniant celloedd glioma48. Gwelsom effaith pro-tiwmor tebyg o niwtroffiliau heb eu haddasu yn ein hastudiaeth anifeiliaid, gan amlygu'r angen am beirianneg CCAR neu addasiadau eraill mewn niwtroffiliau i sicrhau eu diogelwch wrth gyflenwi cyffuriau a chymwysiadau therapiwtig eraill. Yn nodedig, mae ein cyflenwad cyffuriau CAR-niwtroffil-gyfryngol yn dibynnu ar allu GBM i ddenu cemo-denydd brodorol yn unig, ond nid ar y signalau llidiol ôl-lawfeddygol chwyddedig, sy'n awgrymu penodoldeb uchel a photensial therapiwtig ein system cyflenwi cyffuriau wrth ddileu gliomas sydd wedi ymdreiddio'n ddwfn. na ellir ei dynnu trwy lawdriniaeth. Gan mai echdoriad llawfeddygol a chemotherapi/radiotherapi cynorthwyol yw'r ymyriadau clinigol sylfaenol ar gyfer GBM12, gall triniaeth gyfunol â nano-gludwyr niwtroffil CAR a llawdriniaeth/radiotherapi gyflawni'r effeithiolrwydd therapiwtig gorau posibl ac mae'n werth ymchwilio ymhellach. Mae lluniadau CAR sy'n benodol i gelloedd T a NK wedi'u defnyddio'n helaeth i wella gweithgareddau gwrth-diwmor celloedd T a NK, ond ni ddisgrifiwyd CARs neutrophil-benodol sy'n gwella swyddogaethau gwrth-diwmor neutrophils. Adroddwyd yn flaenorol bod derbynyddion imiwnedd chimerig CD4ζ a CD4 yn gwella cytolysis neutrophils yn erbyn celloedd in vitro a drosglwyddir gan HIV. Eto i gyd, dim ond ~10% oedd yr effeithlonrwydd lysis ar gymhareb effeithydd-i-darged (E:T) o 10:128. Mae Fc RIIA (CD32a) yn dderbynnydd trawsbilen un gadwyn affinedd isel ar gyfer IgG monomerig sy'n cael ei fynegi'n fawr mewn niwtroffiliau (30,000 i 60,000 moleciwlau/cell31), ac mae ei glymu yn achosi Fc - swyddogaethau dibynnol mewn niwtroffiliau, megis rhyddhau cynnwys gronynnau, mobileiddio Ca{2+, sytowenwyndra gwrth-tiwmor, a ffagocytosis49. O ystyried rôl amlwg CD32a wrth actifadu a swyddogaeth neutrophils, fe wnaethom ddylunio a phrofi lluniadau CAR seiliedig ar CD32a. Fodd bynnag, dangosodd ein canlyniadau fod CD3ζ yn cyfryngu cytolysis llawer gwell na CD32a o'i fynegi mewn niwtroffiliau sy'n deillio o hPSC, a all fod yn rhannol oherwydd y copïau uwch o ITAMs yn CD3ζ na CD32a: tri chopi ac un, yn y drefn honno, a lefelau mynegiant uwch o ζ nag ar arwyneb celloedd neutrophils28. Fel CD32a, mae Fc RIII (CD16b) yn dderbynnydd affinedd isel arall ar gyfer IgG monomerig ac fe'i mynegir ar lefel lawer uwch na CD32a ar neutrophils31. Er mai dim ond ysgogi Ca2+ y mae trawsgysylltu CD16b yn ei achosi, ond nid ffagocytosis a sytolysis mewn neutrophils28,50, bydd yn dal i fod o ddiddordeb mewn astudiaethau yn y dyfodol i berfformio cymhariaeth systematig ar alluoedd CD3ζ- a CD16b -CARs i sbarduno a gwella swyddogaethau gwrth-diwmor neutrophils.

Ffig. 6|Dosbarthiad in vivo o R-SiO CAR a ddarperir gan niwtroffil2-TPZ nanoronynnau (NPs). Sgematig o Cy5-labelu CAR neutrophil@R-SiO2 NPs a R-SiO2 NPs ar gyfer astudiaeth olrhain celloedd in vivo. Cafodd celloedd 5 × 105 luciferase (Luci)-yn mynegi celloedd U87MG eu mewnblannu'n stereotactig i flaen ymennydd cywir llygod NRG. Ar ôl 4 diwrnod, cafodd llygod eu trin yn fewnwythiennol â PBS, 5 × 106 Cy5-labelu CAR neutrophil@R-SiO2 NPs a R-SiO2 NPs. b Cafodd bioddosbarthiad amser-ddibynnol o niwtroffiliau Cy5+ yn y corff cyfan, yr ymennydd, ac organau eraill ei bennu a'i feintioli gan ddelweddu fflworoleuedd ar yr oriau a nodir. c Dadansoddwyd bio-ddosbarthiad CAR neutrophil@R-SiO2 NPs a NPs R-SiO2 mewn llygod ar ôl pigiad 24 h gan sbectrometreg allyriadau plasma-optegol cypledig anwythol (ICP-OES) yn seiliedig ar elfen Si, a mynegwyd data fel y ganran o ddos ​​wedi'i chwistrellu fesul gram o feinwe (% ID/g). n=5 samplau biolegol annibynnol. Cynrychiolir data fel cymedr ± DC. Darperir data ffynhonnell fel ffeil Data Ffynhonnell. d Dangoswyd delweddau fflworoleuedd cynrychioliadol o CD45 a SiO2 yn y xenografftiau glioblastoma a nodwyd wedi'u hynysu o lygod sy'n cario tiwmor. Bariau graddfa, 100 μm. Perfformiwyd triphlygiadau biolegol yn annibynnol.

Ffig. 7|Aseswyd gweithgareddau gwrth-tiwmor in vivo o CAR-niwtroffilau cyfun ac R-SiO2-TPZ nanoronynnau (NPs) drwy chwistrelliad mewnwythiennol. Sgematig o PBS a weinyddir yn fewnwythiennol, PB-neutrophils, CAR-neutrophils, a CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs ar gyfer astudiaeth lladd tiwmor in vivo. Cafodd celloedd 5 × 105 luciferase (Luci)-yn mynegi celloedd U87MG eu mewnblannu'n stereotactig i flaen ymennydd cywir llygod NRG. Ar ôl 4 diwrnod, roedd llygod yn cael eu trin yn fewnwythiennol â neutrophils a nodwyd yn wythnosol am fis. Pennwyd baich tiwmor sy'n dibynnu ar amser (b) a'i feintioli (c) gan ddelweddu bioluminescent (BLI) ar y dyddiau a nodwyd. Mae data yn gymedrig ± SD ar gyfer llygod yn (b) (n=5), dadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA). d Dangoswyd cromlin Kaplan-Meier yn dangos goroesiad grwpiau arbrofol a nodwyd (n=5). Mesurwyd ffactor necrosis tiwmor dynol a ryddhawyd- (TNF ) ac IL-6 yng ngwaed ymylol (e) a phwysau corff (f) gwahanol grwpiau llygoden ar y dyddiau a nodwyd. Mae data yn samplau cymedrig ± SD, n=5 sy'n annibynnol yn fiolegol. g, h Aseswyd gweithgarwch gwrth-diwmor o amlder dognau cynyddol o CAR-neutrophils ac RSiO2-TPZ NPs. g Sgematig o CAR-neutrophils a weinyddir yn fewnwythiennol, R-SiO2-TPZ NPs, a CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs ar gyfer astudiaeth lladd tiwmor in vivo. h Dangoswyd cromlin Kaplan-Meier yn dangos goroesiad grwpiau arbrofol a nodwyd (n=5). Dadansoddwyd cromliniau Kaplan-Meier gan y prawf rheng log. Darperir data ffynhonnell fel ffeil Data Ffynhonnell.

Fe wnaethom hefyd gyflwyno yma hefyd blatfform darparu cyffuriau neutrophil HPSC modiwlaidd ac amlbwrpas y gellir ei ail-lunio a'i diwnio yn y dyfodol i gefnogi ymdrechion eraill sy'n seiliedig ar niwtroffiliau i drin clefydau dynol eraill. Yn gyntaf, mae peirianneg CAR yn fwy hygyrch mewn hPSCs nag mewn celloedd T imiwnedd sylfaenol a neutrophils. Dim ond golygu genom un-amser sydd ei angen i gyflawni mynegiant sefydlog a homogenaidd o wahanol CARs29. Yn ogystal â'r CARs CLTX, fe wnaethom hefyd adeiladu llinellau hPSC sefydlog sy'n mynegi gwrth-fflworoleuedd (FITC)51 cyffredinol neu gwrth-PD-L1 CAR52, y gellid harneisio'r ddau ohonynt i gael niwtroffiliau CAR nanocarrier solet cyffredinol sy'n targedu tiwmor. Gellir cyflawni addasiadau genetig eraill, megis ffibrosis sy'n targedu CARs gwrth-FAP53, hefyd i gyfeirio nano-gludwyr niwtroffilig i drin clefydau dirywiol angheuol, gan gynnwys trawma ymennydd a ffibrosis cardiaidd. Ar ben hynny, gallai HPSC sy'n mynegi CAR gael ei addasu'n hawdd hefyd i gynhyrchu celloedd CAR-T neu CAR-NK29, a gallai cyfuniadau o'r imiwnotherapïau hyn â nano-gludwyr CAR-neutrophil gyflawni'r buddion gwrth-tiwmor therapiwtig gorau posibl. Yn olaf, mae ein system nanodrug ymatebol tiwmor bioinspired glutathione (GSH) yn llwyfan modiwlaidd ac amlbwrpas i lwytho cyffuriau cemotherapiwtig neu ymbelydrol addawol i mewn i niwtroffiliau CAR ar gyfer danfon cyffuriau wedi'u targedu, fel y dangosir gan TMZ clinigol, JNJ64619187, a TPZ pro-gyffuriau. Gall astudiaethau yn y dyfodol ar brofi nanoronynnau eraill arwain at lwythiad cyffuriau optimaidd mewn neutrophils a chyflawni'r effeithiolrwydd therapiwtig mwyaf posibl mewn vivo.

Er ein bod wedi dangos y cysyniad therapiwtig o ddefnyddio CAR-neutrophils i gyflenwi chemo-gyffuriau yn benodol ac yn effeithlon i diwmorau ymennydd ar draws BBB, mae rhai cyfyngiadau yn yr astudiaeth hon. Yn gyntaf, 4-efallai na fydd brechiad celloedd tiwmor dydd yn ddigon i sefydlu tiwmorau sy'n dynwared y senario clinigol ar gyfer ymchwiliad therapiwtig, ac mae angen gwaith yn y dyfodol gyda chyfnodau brechu tiwmor gwahanol i ailadrodd y gwahanol gamau o ddatblygiad glioblastoma ac ymateb therapiwtig mewn gwahanol gyfnodau. cleifion54,55. Yn ail, nid oes gan y llygod imiwnoddiffygiol a ddefnyddiwyd gennym yma imiwnedd addasol, ac mae angen modelau rhag-glinigol eraill â system imiwnedd gyfan, megis cŵn anwes â glioma digymell56, i asesu diogelwch ac effeithiolrwydd niwtroffiliau CAR a gynhyrchir in vitro yn well. Yn benodol, mae angen proffilio gwenwyndra oddi ar y targed o niwtroffiliau CAR gyda neu heb lwytho cyffuriau nano mewn anifeiliaid trwythedig, gan gynnwys syndrom rhyddhau cytocinau, niwrowenwyndra, a gwenwyndra tiwmor oddi ar y targed a welwyd mewn celloedd CAR-T57, er gwaethaf yr oes fer. o neutrophils. Er bod dulliau gweithredu dichonadwy, megis peirianneg rhoddwr cyffredinol hypoimiwnogen hPSCs58-61 a bancio llyfrgelloedd antigen leukocyte dynol (HLA)-homosygaidd HPC62, ar gael yn rhwydd i osgoi'r risg bosibl o glefyd impiad-yn erbyn gwesteiwr (GvHD), modelau anifeiliaid preclinical gydag un mae angen system imiwnedd gyfan o hyd i asesu potensial trosiadol ein therapiwteg niwtroffil. Yn olaf, gwelwyd sytowenwyndra gwrth-tiwmor cyfyngedig ac ymestyn oes anifeiliaid therapiwteg CAR-neutrophil nanodrug. Felly, mae archwilio cyffuriau cemotherapi mwy effeithiol neu radiosensitizers yn y dyfodol, a therapïau cyfun â CAR-T clasurol ac echdoriad llawfeddygol yn hanfodol er mwyn sicrhau effeithiolrwydd gwrth-tiwmor mwyaf therapiwteg CAR-niwtroffil. Er enghraifft, mae astudiaeth ddiweddar ar ddyluniad yn seiliedig ar fecanwaith wedi arwain at KL-50 cyffur mwy effeithiol sy'n goresgyn ymwrthedd a gaffaelwyd fel y gwelwyd yn y cyffur TMZ clinigol63 ac y gellir felly ei ymgorffori yn ein platfform CAR-neutrophil nanodrug modiwlaidd ar gyfer un o'r problemau posibl. gwell effeithiolrwydd therapiwtig. Gall ymestyn oes silff niwtroffiliau i 5 diwrnod trwy driniaeth CLON-G (triniaeth permeabilization bilen caspases-lysosomaidd-ocsidydd-necroptosis ynghyd â ffactor sy'n ysgogi cytref granulocyte64) a/neu ddefnyddio system rhyddhau cyffuriau rheoledig tymor hwy mewn CAR-neutrophils hefyd cyflawni effeithiolrwydd gwrth-tiwmor parhaus in vivo ar ôl apoptosis neutrophil. Gyda’i gilydd, dangosodd ein canfyddiadau’n glir y gallai neutrophils CAR wedi’u llwytho gan R-SiO2-TPZ gynnal y ffenoteip gwrth-diwmor N1 a lladd celloedd tiwmor yn effeithlon o dan amrywiol amodau tebyg i niche tiwmor in vitro. Gallai niwtroffiliau CAR swyddogaethol hefyd gael eu cynhyrchu mewn symiau mawr o HPSCs peirianyddol i ddarparu cyffuriau nano sy'n ymateb i ficro-amgylchedd tiwmor yn union i dargedu GBM in vivo, gan arwain at gemo-imiwnotherapi cyfun gyda gweithgareddau gwrth-GBM cadarn a phenodol ac ychydig iawn o gyflenwi cyffuriau oddi ar y targed. oes hir mewn llygod â thiwmor.

Cyfeiriadau

1. Yang F. et al. Imiwnotherapi synergaidd o glioblastoma trwy dargedu IL-6 a CD40 yn ddeuol. Nat. Cymmun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Cyflwr presennol imiwnotherapi ar gyfer glioblastoma. Nat. Parch Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Mae cyflwyno IL-12 intratumoral yn grymuso imiwnotherapi celloedd CAR-T mewn model cyn-glinigol o glioblastoma. Nat. Cymmun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils fel targedau therapiwtig sy'n dod i'r amlwg. Nat. Parch. Drug Disov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA a Torchilin, VP Neutrophils fel targed therapiwtig sy'n dod i'r amlwg ac offeryn ar gyfer therapi canser. Gwyddor Bywyd. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-ddadansoddiad o gyflenwi nanoronynnau i diwmorau gan ddefnyddio dull modelu ac efelychu ffarmacocinetig sy'n seiliedig ar ffisiolegol. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Dadansoddiad o ddanfoniad nanoronynnau i diwmorau. Nat. Parch Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Cyflenwi cyffuriau gwrthganser cyfryngol neutrophil ar gyfer atal glioma malaen rhag digwydd eto ar ôl llawdriniaeth. Nat. Nanodechnoleg. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. Olrhain delweddu MR o niwtroffiliau peirianyddol y gellir eu hysgogi gan lid ar gyfer therapi wedi'i dargedu o glioma wedi'i drin â llawfeddygaeth. Nat. Cymmun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Photosensitization preimio micro-amgylcheddau tiwmor yn gwella cyflwyno nanotherapeutics drwy ymdreiddiad neutrophil. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Therapi canser: Neutrophils traffig mewn nanodrugs canser. Nat. Nanodechnoleg. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. a Hwang, TL Rolau neutrophils mewn glioma a metastasis yr ymennydd. Blaen. Imiwnol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Polareiddio ffenoteip neutrophil sy'n gysylltiedig â thiwmor gan TGF-beta: "N1" yn erbyn "N2" TAN. Cell Cancr (2009).

14. Blaisdell, A. et al. Mae neutrophils yn gwrthwynebu carcinogenesis epithelial groth trwy ddadbridio celloedd tiwmor hypocsig. Cell Cancr 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. Mae rhyddhad hypocsia tiwmor yn rhyddhau potensial tiwmorladdol neutrophils. J. Clin. Buddsoddi 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. Mae neutrophils polymorphoniwclear dynol yn adnabod ac yn lladd celloedd canseraidd yn benodol. Oncoimiwnoleg 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Amrywiaeth a phlastigrwydd niwtroffil mewn dilyniant a therapi tiwmor. Nat. Canser y Parch 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Cynnydd ymchwil am fôn-gelloedd glioma ym micro-amgylchedd imiwnedd glioma. Blaen. Ffarmacol. https://doi.org/10. 3389/ffar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Microamgylchedd imiwnedd gliomas. Lab. Ymchwilio. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Plastigrwydd celloedd tiwmor, heterogenedd, a gwrthiant mewn cilfachau micro-amgylcheddol hanfodol mewn glioma. Nat. Cymmun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Imiwnotherapïau sy'n dod i'r amlwg ar gyfer glioma malaen: O imiwnogenomeg i therapi celloedd. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Mae ferroptosis a achosir gan neutrophil yn hyrwyddo necrosis tiwmor mewn dilyniant glioblastoma. Nat. Cymmun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Amrywiaeth ffenotypig a phlastigrwydd mewn isboblogaethau niwtroffil sy'n cylchredeg mewn canser. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS a Kaufman, DS Mae celloedd lladd naturiol dynol sy'n deillio o iPSC wedi'u peiriannu â derbynyddion antigen chimerig yn gwella gweithgaredd gwrth-tiwmor. Cell Bôn-gell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Mae celloedd CAR T wedi'u targedu gan Mutant affinedd uchel, Interleukin-13, yn gwella'r broses o gyflenwi nanoronynnau fflworoleuol bioddiraddadwy clicadwy i glioblastoma. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. System gyflenwi ligand newydd i ddelweddu'n anfewnwthiol a manteisio'n therapiwtig ar y biomarcwr IL13R 2 cyfyngedig â thiwmor. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Celloedd CAR T a gyfeirir at glorotocsin ar gyfer targedu glioblastoma yn benodol ac yn effeithiol. Sci. Cyfieithiad. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Sytolysis antigen-benodol gan neutrophils a chelloedd NK mynegi derbynyddion imiwnedd chimeric dwyn zeta neu parth signalau gama. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Peirianneg niwtroffiliau derbynnydd antigen chimerig o fôn-gelloedd lluosog dynol ar gyfer imiwnotherapi canser wedi'i dargedu. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Neutrophils yn ffafrio gronynnau hirfain ffagocytose cyfle ar gyfer targedu dethol mewn clefydau llidiol acíwt. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Mynegiant, rôl, a rheoliad derbynyddion neutrophil Fc. Blaen. Imiwnol. https://doi.org/10.3389/fimmu . 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Pwysigrwydd ITAM Tyrosines cadwyn derbynnydd fc mewn gweithrediad niwtroffiliaid ac arthritis awtoimiwn in vivo. Blaen. Imiwnol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Rōl ffurfiau polymorphic neutrophil Fc RIIa (CD32) a Fc RIIIb (CD16) mewn ffagocytosis o facteria ac erythrocytes dynol IgG ac IgG. Trallwys. Med. Parch. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Mae derbynyddion Fc neutrophil dynol yn cychwyn ac yn chwarae rolau di-angen arbenigol mewn clefydau llidiol sy'n cael eu cyfryngu gan wrthgyrff. Imiwnedd. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Cenhedlaeth a ddiffinnir yn gemegol o endotheliwm hemogenig dynol a chelloedd hematopoietig diffiniol. Bioddeunyddiau 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Cynhyrchu niwtroffiliau swyddogaethol yn effeithiol ac yn gyflym o fôn-gelloedd lluosog ysgogedig gan ddefnyddio mRNA wedi'i addasu gan ETV. Bôn-gell Cynrychiolydd 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. Rôl hypocsia yn y micro-amgylchedd tiwmor a datblygiad bôn-gell canser: dull newydd o ddatblygu triniaeth. Cell Canser Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Effaith micro-amgylchedd tiwmor hypocsig a phlastigrwydd celloedd tiwmor ar fynegiant pwyntiau gwirio imiwnedd. Cancr Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Rôl protein-tyrosine kinase Syk mewn signalau straen ocsideiddiol mewn celloedd B. Arwydd rhydocs gwrthocsidyddion. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. ROS a signalau cellog cyfryngol ROS. Ocsidat. Med. Cell. Hirhoedledd. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Mae llwybr actifadu Ras yn dibynnu ar ffosfforyleiddiad Syk o brotein kinase C. Proc. Natl. Acad. Sci. UDA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ Y tyrosine kinase SYK: Chwaraewr hanfodol mewn swyddogaethau biolegol amrywiol. Nat. Parch Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Nanogyfansawdd sy'n ymateb i diwmor-micro-amgylchedd ar gyfer nwy hydrogen sylffid a therapi deinamig ensym gwell trimodal. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma . 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Gwyrdd, ER a Mecsas, J. Neutrophils i'r ROScue: Mecanweithiau actifadu ocsidas NADPH ac ymwrthedd bacteriol. Blaen. Cell. Heintio. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017 . 00373 (2017).

45. Che J. et al. Mae niwtroffiliau yn galluogi danfon liposomau lleol ac anfewnwthiol i gyhyr ysgerbydol llidus a chalon isgemig. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. Crynodeb o gymeradwyaeth yr FDA: tocilizumab ar gyfer trin syndrom rhyddhau cytocinau derbynnydd antigen T chimerig a achosir gan gell difrifol neu sy'n bygwth bywyd. Oncolegydd 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, syndrom rhyddhau M. Cytokine a niwrowenwyndra cysylltiedig mewn imiwnotherapi canser. Nat. Parch Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. Mae neutrophils yn hyrwyddo'r ffenoteip glioma malaen trwy S100A4. Clin. Canser Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Rheoleiddio cell-benodol, dibynnol ar actifadu swyddogaeth ligand-rwymo neutrophil CD32A. Gwaed https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Cytotoxicity wedi'i gyfryngu gan dderbynyddion Fc dynol ar gyfer IgG. Imiwnol. Heddiw. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Rheoleiddio gwenwyndra sy'n debyg i syndrom rhyddhau cytocinau cell-gyfryngol CAR T gan ddefnyddio addaswyr pwysau moleciwlaidd isel. Nat. Cymmun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Mae derbynnydd antigen chimerig newydd sy'n cynnwys parth signalau JAK-STAT yn cyfryngu effeithiau gwrth-tiwmor uwchraddol. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Targedu ffibrosis cardiaidd gyda chelloedd T wedi'u peiriannu. Natur. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-celloedd NK penodol ar gyfer therapi glioblastoma wedi'i dargedu. J. Natl. Sefydliad Canser. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. Celloedd CAR T ar gyfer tiwmorau ar yr ymennydd: Gwersi a ddysgwyd a'r ffordd ymlaen. Imiwnol. Parch https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Data diogelwch a goroesiad interim ar ôl rhoi M032 mewngreuanol, HSV oncolytig wedi'i beiriannu'n enetig-1 yn mynegi IL-12, mewn cŵn anwes â gliomas achlysurol. Neurosurg. Ffocws 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC a Maus, MV Datblygiadau a darganfyddiadau diweddar ym mecanweithiau a swyddogaethau celloedd CAR T. Nat. Canser y Parch 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Cynhyrchu celloedd T hypoimmunogenig o fôn-gelloedd plwripotent a achosir gan bobl allogeneig wedi'u peiriannu'n enetig. Nat. Biomed. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Mae deilliadau hypoimmunogenig o fôn-gelloedd plwripotent anwythol yn osgoi gwrthodiad imiwn mewn derbynwyr allogeneig imiwnocompetent llawn. Nat. Biotechnol. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Cynhyrchu bôn-gelloedd plwripotent dynol hypoimmunogenig. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. Cynhyrchodd golygu genom HLA DR gyda TALENs mewn iPSCs dynol gelloedd dendritig sy'n oddef imiwn. Bôn-gelloedd Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. Mae paru MHC yn gwella amgodiad niwronau sy'n deillio o iPSC mewn primatiaid nad ydynt yn ddynol. Nat. Cymmun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. Mae targedu llwybrau marwolaeth celloedd lluosog yn ymestyn yr oes silff ac yn cadw swyddogaeth niwtroffiliau dynol a llygoden ar gyfer trallwysiad. Sci. Cyfieithiad. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Dangosyddion fflwroleuol ar gyfer adrodd parhaus a phenodol i linach ar gamau cylchred celloedd mewn bôn-gelloedd lluosog dynol. Biotechnol. Bioeng. did.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Cenhedlaeth wedi'i ddiffinio'n gemegol o fôn-gelloedd hematopoietig diffiniol dynol a epilgelloedd. STAR Protoc. 4, 101953 (2023).