cyIaith
Cartref / Gwybodaeth / Cynnwys

Gwybodaeth

Pennod 1: Cyfansoddion sy'n Targedu OSBPL7 Cynyddu ABCA1- Dibynnol ar Cholesterol Efflux Yn Cadw Gweithrediad yr Arennau mewn Dau Fodel o Glefyd yr Arennau

May 13, 2022

Am fwy o wybodaeth:tina.xiang@wecistanche.com

Mae efflux colesterol cellog nam yn ffactor allweddol yn natblygiadarennol, cardiofasgwlaidd, aafiechydon hunanimiwn. Yma rydym yn disgrifio dosbarth o 5-gyfansoddion arylnicotinamide, a nodwyd trwy ddarganfod cyffuriau ffenotypig, sy'n dadreoleiddio efflux colesterol dibynnol ABCA trwy dargedu Protein Rhwymo Oxysterol Fel 7(OSBPL7). Nodwyd OSBPL7 fel targed moleciwlaidd y cyfansoddion hyn trwy ddull bioleg gemegol, gan ddefnyddio deilliadau arylnicotinamide 5- ffotoactifadwy mewn assay traws-gysylltu cellog/imiwneddodiad. Dangosodd gwerthusiad pellach o ddau gyfansoddyn (Cpd A a Cpd G) eu bod wedi achosi ABCA1 ac efflux colesterol o podocytes in vitro a phroteinwria normaleiddio ac atal dirywiad swyddogaeth arennol mewn modelau llygoden o glefyd yr arennau proteinwrig: neffropathi a achosir gan Adriamycin a Syndrom Alport. I gloi, rydym yn dangos bod cyffuriau moleciwl bach sy'n targedu OSBPL7 yn datgelu mecanwaith amgen i ddadreoleiddio ABCA1, a gallant gynrychioli strategaeth therapiwtig newydd addawol ar gyfer trin afiechydon arennol ac anhwylderau eraill homeostasis colesterol cellog.

cistanche benefits reddit：relieve adrenal fatigue

Cliciwch i ddysgu sut mae cistanche tubulosa o fudd a dywedwch wrthym beth yw eich profiad cistanche 

Clefyd cronig yn yr arennau (CKD) yn faich iechyd mawr yn yr Unol Daleithiau sy'n effeithio ar fwy na 30 miliwn o bobl. Gwnaed cynnydd sylweddol i arafu dilyniant CKD trwy gyflwyno atalyddion ensymau trosi angiotensin (ACEi) ac atalyddion derbynyddion angiotensin (ARBs) yn ogystal ag atalyddion math 2 cotransporter sodiwm-glwcos (SGLT2i). Fodd bynnag, mae llawer o gleifion â CKD yn dal i symud ymlaen i gam olaf clefyd arennol (ESRD)2-6. Mae ymdrechion ymchwil sylweddol yn mynd rhagddynt i wella'r driniaeth o CKD. Mae nodi targedau clefyd-benodol newydd, a chyffuriau newydd sy'n caniatáu ymyrraeth gynnar yn gyffredin (ee, clefyd diabetig yr arennau), yn ogystal â llai cyffredinafiechydon arennol(ee, glomerulosclerosis segmentol ffocal a syndrom Alport), yn ddymunol.

Rydym ni ac eraill wedi dangos bod lipidau yn cronni glomerwlaidd, e.e., colesterol, mewn clefyd diabetig yr arennau (DKD)7-1l, glomerwlosclerosis segmentol ffocal(FSGS)12-14, a syndrom Alport(AS)13 a yn gysylltiedig â is-reoleiddio cludwr casét rhwymo ATP (ABC Al)-efflux colesterol-cyfryngol. Rydym hefyd wedi dangos bod gorfynegiant genetig o ABCA1 yn achub llygod o glomerwlosclerosis tebyg i FSGS4, a bod diffyg ABCA1 sy'n benodol i podocyt yn gwaethygu DKD arbrofol. Fe wnaethom adrodd yn ddiweddar bod disbyddu glomeruli colesterol gyda cyclodextrin hefyd yn ad-amddiffynnol mewn modelau o DKD9, FSGSl3,14, ac AS13. Er ei fod yn amddiffynnol, mae cyclodextrin yn hyrwyddo tynnu colesterol mewn ffordd braidd yn annetholus, ac mae ei lwybr gweinyddu (hy, parenteral) yn anghyfleus. Gyda’i gilydd, mae’r data hyn yn awgrymu dulliau amgen o uwchreoleiddio efflux colesterol ABCA{1-cyfryngol a gallai gynnig triniaethau effeithiol ar gyfer FSGS a chlefydau arennol eraill.

Dangoswyd bod cyfansoddion blaenorol, megis T1317 a GW3965, gweithyddion yr afu-X-derbynyddion (LXR), yn ysgogi mynegiant mRNA ABCAl yn sylweddol ac yn hyrwyddo efflux colesterol cellog i lipoproteinau5-17. Mewn clefyd arennol, mae agonyddion LXR yn gwella cludiant colesterol cellog, ac ymatebion llidiol di-fin mewn macroffagau sy'n agored i lipoproteinau gan gleifion â CKD18 cymedrol i ddifrifol. Mewn llygod diabetig, mae agonyddion LXR yn lleihau proteinwria,llid arennol, a chynnwys colesterol glomerwlaidd arennol trwy gynyddu ABCA19-21. Yn anffodus, mae gan weithyddion LXR yr effaith annymunol i gynyddu plasma a thriglyseridau'r afu sydd wedi rhwystro datblygiad clinigol22.

Yn y gwaith hwn, rydym yn disgrifio canlyniadau menter darganfod cyffuriau ffenotypig (PDD) a arweiniodd at nodi dosbarth o anwythwyr moleciwlaidd bach o ABCA1 (5-arylnicotinamides). Arweiniodd datgyfnewidiad targed, gan ddefnyddio bioleg gemegol, at nodi protein rhwymo oxysterol tebyg i 7 (OSBPL7) fel y targed moleciwlaidd. Mae modelu homoleg a thocio ligand yn datgelu bod y cyfansoddion yn rhyngweithio'n uniongyrchol â'r boced rhwymo sterol a ragwelir. Arweiniodd optimeiddio pellach at nodi cyfansoddion A(Cpd A) a G(Cpd G) sy’n addas ar gyfer profion in vivo. Mae Cpd A a Cpd G yn cynyddu mem-brane plasma ABCAl mewn podocytau dynol diwylliedig ac yn cynyddu efflux colesterol dibynnol ABCA yn sylweddol. Datgelodd profion effeithiolrwydd mewn modelau llygoden o glefyd yr arennau proteinwrig (neffropathi a achosir gan adriamycin a syndrom Alport) fod Cpds A a G yn normaleiddio proteinwria, ac yn lleihau ffibrosis arennol a dirywiad swyddogaeth arennol yn sylweddol. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod cyffuriau moleciwl bach sy'n targedu OSBPL7 yn cynnig dull amgen o ddadreoleiddio gweithgaredd ABCAl, a gallant gynrychioli strategaeth therapiwtig newydd effeithiol a diogel ar gyfer trin clefydau arennol.

life extension standardized cistanche

Canlyniadau

Darganfod 5-arylnicotinamides fel anwythwyr ABCA1. Fe wnaethom berfformio sgrin ffenotypig gan ddefnyddio macroffagau dynol llawn colesterol (celloedd THP1) i nodi cyfansoddion sy'n gallu ysgogi elifiad colesterol i apoAI allgellog. Fe wnaethom nodi cyfres arweiniol newydd, a gynrychiolir gan y cyfansoddyn arylnicotinamide H(Cpd H) 5-. Cynyddodd Cpd H allrediad colesterol â label radio yn fwyaf effeithiol i HDL (HDL3) tlawd lipid neu i apoAI, gan awgrymu bod yr effaith yn cael ei chyfryngu gan ABCA1 (Ffig. la). Deilliodd Cpd H o raglen darganfod cyffuriau flaenorol ar gyfer antagonyddion derbynnydd cannabinoid math 1(CB1R) ar gyfer trin anhwylderau metabolaidd23. Dangosir ei strwythur a'i nerth ar gyfer rhwymo i CB1R yn Ffig. 1 Atodol a Thabl Atodol 1.

Perfformiwyd arbrofion efflux mewn ffibroblastau gan unigolyn â chlefyd Tangier24, syndrom a achosir gan golled genetig ABCA1. Roedd yr 5-arylnicotinamides, Cpd H a ​​Cpd J, a'r agonist LXR T1317, yn gallu cynyddu efflux colesterol i apoAI o ffibroblastau diffygiol normal, ond nid o ABCA, gan ddangos y gofyniad absoliwt ar gyfer ABCA1 (Ffig. 1b). Dangosodd blotiau gorllewinol o lysates o macroffagau THP1 dynol, wedi'u trin â'r 5-arynicotinamidau a T1317, fod pob asiant yn cynyddu protein cellog ABCAl (Ffig. lc). Datgelodd PCR meintiol amser real (RT-qPCR) fod T1317 wedi uwchreoleiddio mRNA ABCAl gan ~5-plyg (Ffig.1d) tra, mewn cyferbyniad, nid oedd Cpd H a ​​Cpd J hyd at 25 uM yn dangos unrhyw effaith. Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos bod 5-arylnicotinamidau yn dadreoleiddio protein ABCA1 ac elifiad colesterol trwy fecanwaith nad yw'n drawsgrifio.

Nodi OSBPL7 fel targed o'r 5-arylnicotinamidau. Fe wnaethom ddamcaniaethu y gallai gweithgaredd Cpd H i gymell ABCAl fod yn effaith oddi ar y targed oherwydd diffyg gweithgaredd ABCAl o ligandau CB1R nad ydynt yn gysylltiedig. Ar gyfer datgymalu targed, cafodd deilliad o Cpd H gyda swyddogaeth azide ffoto-ysgogadwy ei syntheseiddio a'i werthuso ar gyfer gweithgaredd efflux colesterol. Mae'r deilliad hwn, Cpd K (5-(4-azido-3-chlorophenyl)-6-(cyclopropylmethoxy)-N-[(1R,2R)-2-hydroxycyclohexyl]{ {11}}pyridine-carboxamide), yr un mor weithgar â Cpd H i ddadreoleiddio efflux ABCA1 in vitro (Ffig. 2a) ond roedd ganddo fwy na 200-plygiad llai o affinedd ar gyfer hCB1R. Mae'r grŵp azide o Cpd K yn caniatáu iddo groesgysylltu'n cofalent â gweddillion lysin pan fydd yn agored i olau UV. Defnyddiwyd Cpd K fel chwiliwr i nodi targed(au) protein.

Effects of 5-arylnicotinamides on ABCA1-mediated cholesterol efflux

Er mwyn nodi targedau ymgeiswyr, yn gyntaf fe wnaethom gynnal sgrin fyd-eang fesul sbectrometreg màs cipio (CC-MS). Ymhelaethwyd ar y proteinau a nodwyd gan CC-MS trwy ychwanegu ymgeiswyr eraill yn seiliedig ar hygrededd eu rhan yn y llwybr ABCA1, gan arwain at chwe deg naw o dargedau o ddiddordeb i ymgeiswyr. Cafwyd plasmidau yn mynegi pob un fel protein hyd llawn gyda thag FLAG terfynell-C. Trosglwyddwyd plasmidau yn unigol i gelloedd HEK293 ac yna'u deor ym mhresenoldeb 3H-Cpd K, ac yna croesgysylltu UV yn y fan a'r lle, paratoi lysates celloedd, imiwnodiad â gwrthgorff gwrth-FLAG, ac yna blotio gorllewinol cyfochrog i gadarnhau mynegiant protein, ac awtoradiograffeg i werthuso rhwymiad 3H-Cpd K (Ffig. 2b). Cafodd pedwar deg naw o ymgeiswyr, gan gynnwys ABCAl ei hun, eu dileu yn y sgrin gyntaf oherwydd dim croesgysylltu i 5H-Cpd K(Ffig.2c). Sgoriodd wyth ymgeisydd yn bositif am ryngweithio gyda Cpd K. Roedd y rhain yn cynnwys OSBPL7, CB1R, SCARB1, CAV1, ABCG4, ELOV1, TSPO, a STT3A (Ffig. 2c). ym mhresenoldeb 50-gormodedd plyg o Cpd K heb ei labelu. Bu Cpd K heb ei labelu i bob pwrpas yn cystadlu am rwymo 3H-Cpd K i OSBPL7 a CB1R, ond nid i'r chwe ymgeisydd arall, gan eu dileu fel rhwymwyr amhenodol. Fe wnaethom ailadrodd yr arbrawf i benderfynu a yw Cpd A a Cpd G, y ddau yn effeithiol i gymell efflux colesterol ABCAl-ddibynnol, yn cystadlu am rwymo 3H Cpd K i OSBPL7. Roedd Cpd A a Cpd G yn gystadleuwyr effeithiol, gan ddangos eu bod hefyd yn rhyngweithio ag OSBPL7 (Ffig. 2d, Ffig Atodol 2). Er mwyn magu hyder pellach yn OSBPL7, fe wnaethom ychwanegu trydedd ffilter trwy werthuso set o 12 moleciwlau strwythurol debyg ynghyd â rimonabant (Cpds A, G, H, J, K, L, M, N, P, Q, R, S ). Dangoswyd bod saith o'r cyfansoddion yn dadreoleiddio efflux colesterol ABCAl-gyfryngol, tra bod y pump arall a'r rimonabant yn anactif (Ffig. 3a). Canfuom fod cydberthynas rhwng gweithgarwch y moleciwlau hyn i ysgogi efflux ABCAl â'u gallu i gystadlu am rwymo 3H-Cpd K i OSBPL7. Mae'r berthynas "gweithgaredd-gweithgaredd" gadarnhaol hon rhwng rhwymo OBPL7 yn y assay cystadleuaeth gyda upregulation gweithgaredd ABC Al, yn awgrymu'n gryf mai OSBPL7 yw targed ffarmacolegol berthnasol y moleciwlau bach hyn sy'n achosi ABCAl.

A potential contribution of CBIR remained, however, rimonabant, a structurally unrelated CBIR antagonist, did not induce ABCAl cholesterol efflux (Fig. 3a; Fig. 4a). Several other CBIR agonists/antagonists including AM251, WIN55-212-2, and arachidonic choloroethylamine (ACEA), were also inactive (Fig. 4a). Cpd A and Cpd G carried forward into animal studies, were active to induce ABCAl and to compete for Cpd K binding to OSBPL7, but had either no(Cpd A; Ki hCBIR=>10,000 nM)neu isel (Cpd G; Ki hCBIR=13,20 nM) affinedd rhwymol i'r CB1R (Ffig. 2d a 3a).

Fig. 2 Chemical biology identifies OSBPL7 as the pharmacological target of the 5-arylnicotinamides. a Comparison of the potency of Cpd K (tritiated azide derivative) vs. Cpd H in apoAI-dependent cholesterol efflux from human THP1 cells. Cpd K retains similar potency as Cpd H validating Cpd K as an active chemical probe for target identification efforts. b Target identification screen flowchart: in step 1, a mammalian expression plasmid expressing a fulllength protein for the candidate of interest as a fusion protein with a C-terminal FLAG tag was transfected into HEK293 cells; in step 2 3H-Cpd K was added (1 µM), cells were incubated for 3 h, then exposed to UV light for 15 min; in step 3, cells were lysed, the expressed protein was purified by 1-step immunoaffinity using anti-FLAG antibody, proteins were separated on two identical SDS-PAGE gels, one was then subjected to WB to detect the expressed protein, and the second was dried and exposed to film (4 wks) to detect 3H-Cpd K binding to the expressed target. c Table showing the progression of the candidates screened according to the flowchart outlined in (b). Most candidate targets were properly expressed and demonstrated no binding of 3H-Cpd K. Several were not properly expressed (incorrect protein size, no protein detected) and were marked inconclusive. Seven targets showed binding of 3H-Cpd K but only OSBPL7 and CB1R emerged following competition binding experiments with unlabeled Cpd K. CB1R was excluded as a candidate since the high affinity ligand rimonabant (Cpd O) was inactive to induce cellular cholesterol efflux to apoAI (Fig. 3a). d Competition binding activities of Cpd G and Cpd A that were selected for studies in podocytes and kidney disease models. Data representative from three independent experiments. Both compounds bind to OSBPL7 as reflected by their ability to compete 3H-Cpd K interaction with OSBPL7 (full western blots shown in Supplementary Fig. 2).

Fig. 3 The 5-arylnicotinamides interact with the predicted OSBPL7 sterol binding domain. a Twelve 5-arylnicotinamides (7 active, 5 inactive) and rimonabant were used to explore the correlation between their ability to induce ABCA1-mediated cholesterol efflux in THP1 cells and their ability to compete with 3H Cpd K binding to OSBPL7. The table summarizes the ABCA1 efflux data for the selected set, the binding data results generated for OSBPL7, as well as the docking energies calculated from the homology model. This is the complete dataset including all Cpds evaluated for OSBLP7 binding. The graph depicts the relationship between ABCA1 efflux activity and ability to compete with 3H Cpd K binding to OSBPL7. Cpds A, G, H, J, K, L, M were scored as active (>Cynnydd o 50 y cant mewn efflux colesterol mewn celloedd THP1 yn erbyn effaith T1317) tra bod Cpds N, P, Q, R, S a rimonabant wedi'u sgorio'n anactif (<50% increase in cholesterol efflux). The efflux data strongly correlated with the ability of these Cpds to interact with OSBPL7. b Evaluation of 3H Cpd K binding to wildtype OSBPL7 (wt) and various single mutations introduced into the putative ORD. Mutation of K636A reduced 3H Cpd K binding by ~75% suggesting that Lys 636 is the site of covalent interaction via its reactive azide group. Representative data from three independent experiments, full western blot shown in Supplementary Fig. 3). c The predicted best poses and energies for binding of active Cpd M (left panel) to OSBPL7 in comparison to inactive Cpd R (right panel). Both compounds make a clear π-cation interaction with the catalytic Lys636. However, R, which has a higher GlideScore, fits the binding site less well due to the methyl group of the 4-pyridine ring which appears too close to the positively charged Arg550. d Left image: Focus on the binding site of the cholesterol/ORP1-ORD complex (pdb code 5zm5). Right image: Focus on the binding site of the Cpd M/OSBPL7 complex. The ligands are displayed as balland-stick models with the carbon atoms colored in magenta. The residues that occupy equivalent positions are indicated by the filled circles.

Fe wnaethon ni berfformio arbrofion dymchwel siRNA. Gostyngodd trawsnewid OSBPL7 siRNA mRNA tua ~ 60 y cant , gan ysgogi cynnydd sylweddol o 50 y cant mewn efflux colesterol ( Ffig. 4b , d ). Mewn cyferbyniad, gostyngodd tawelu CBIR mRNA gan ~ 80 y cant , ond nid oedd yn cael unrhyw effaith ar efflux colesterol, ac nid oedd yn dylanwadu ar y gweithgaredd o Cpd G ( Ffig. 4c-e ). Mae'r data hyn yn cadarnhau rôl OSBPL7 ac yn eithrio'r CBIR wrth gyfryngu gweithgaredd efflux colesterol yr 5-arylnicotinamides.

Fig. 4 Effects of OSBPL7 and CB1R siRNA and CB1R agonists on ABCA1-mediated cholesterol efflux.

Mae modelu homoleg yn dangos y cyfansoddion sy'n meddiannu poced rhwymo OSBPL7. Mae proteinau sy'n gysylltiedig â phroteinau rhwymo oxysterol, gan gynnwys OSBPL7, yn cynnwys parth rheoleiddio oxysterol sydd wedi'i gadw'n fawr (ORD) yn eu carboxy-terminus2526.Er mwyn rhagweld y boced rhwymo ligand, rydym wedi creu model homoleg o OSBPL7 (UNIPROT: Q9BZF2) gan ddefnyddio'r Gweinydd gwe SWISS-MODEL27(Ffig. 3c). Mae gan adeiledd grisial ORP dynol1-ORD, mewn cymhlethdod â cholesterol, homoleg o 42.5 y cant ac fe'i defnyddiwyd fel templed28. Lleihawyd y model rhagarweiniol yn gyntaf gan ddefnyddio'r pecyn modelu moleciwlaidd ALMOST i gael gwared ar wrthdaro atomau posibl ac yna ei optimeiddio i wneud cyfrifiadau tocio gan ddefnyddio'r cyfleustodau "dewin paratoi protein" o fewn cyfres Schrodinger ar gyfer modelu moleciwlaidd29.30. Sicrhaodd y dull hwn fod y nifer cywir o atomau hydrogen yn bresennol, bod pob atom yn cael ei nodi, bod rhannau coll o'r protein na ellid eu modelu yn gallu cael eu canfod, ac yn olaf, y gellid pennu cyflwr protoniad cywir yr holl asidau amino.

Yn seiliedig ar y model, fe wnaethom nodi gweddillion asid amino allweddol y rhagwelir y byddant yn leinio'r boced rhwymo ligand OSBPL7, a chyflwynwyd cyfres o fwtaniadau sengl. Trawsnewidiwyd pob mutant yn gelloedd a'i brofi am rwymo H-Cpd K. Lleihaodd treiglo lysin 636 i alanin allu Cpd K i gael ei groesgysylltu ag OSBPL7 o ~75 y cant (Ffig. 3b). Roedd hyn yn dangos bod Cpd K yn clymu o fewn y boced rhwymo sterol a ragfynegir, ac yn awgrymu bod Lys636 yn hanfodol ar gyfer ei ryngweithio cofalent ag OSBPL7. Mae'r model homoleg hefyd yn rhagweld bod taflen beta hydroffobig yn leinio'r boced, wedi'i diffinio gan asidau amino sy'n cael eu cadw yn ORDs OSBPs eraill (Ile641, Val616, Val618, a Lys636). Lleihaodd treiglad Ile641 i Ala rhwymiad Cpd K; gan awgrymu bod Cpd K yn llenwi'r boced gyfan (Ffig. 3b, Ffig. Atodol 3, a Ffig. 3c). Roedd amnewid Val616 neu Val618 gan Ala hefyd yn lleihau rhwymiad Cpd K, tra bod dirprwyon ceidwadol fel Val619lle ac Ile641Val yn cael eu goddef (Ffig. 3b, c). Mae'r data hyn yn datgelu bod cyfansawdd K yn clymu'n agos o fewn y boced rhwymo sterol a ragwelir o OSBPL7.

Yna fe wnaethom berfformio efelychiadau tocio deinamig o'r ligandau i'r model OSBPL7 gan ddefnyddio'r rhaglen Glide (Glide, Schrodinger, LLC, Efrog Newydd, NY, 2019)30. Diffiniwyd grid gyda blwch allanol o 30 A a blwch mewnol o 10 A, wedi'i ganoli o amgylch pob ligand, wedi'i gydgrisialu bron â'r templed. Gan fod Lys636 yn chwarae rhan allweddol wrth rwymo Cpd K i OSBPL7, dadansoddwyd cyfeiriadedd y gweddillion hwn yn ofalus gan ddefnyddio'r offeryn dewis rotamers yn Maestro. Canfuwyd dau rotamer fel y rhai mwyaf tebygol; un yn gogwyddo tuag at y safle rhwymo, ac un tuag at y tu mewn i'r protein. Gan nad oedd yr ail gyfeiriadedd yn caniatáu rhyngweithio â'r cyfansoddion, dewiswyd cyflwr rotamerig cyntaf Lys636 ar gyfer astudiaethau tocio.

consult us maca root ginseng cistanche sea horse

Cyflawnwyd tocio cyfansawdd gan y weithdrefn fanwl ychwanegol a swyddogaeth sgorio (GlideScoreXP). Ar gyfer pob moleciwl, nodwyd yr ateb tocio gorau gan ddefnyddio'r GlideScore. Dangosir yr egni rhwymo a gyfrifwyd ar gyfer y moleciwlau unigol yn Ffig. 3a. Sgôr cyfartalog y moleciwlau sy'n rhwymo OSBPL7 yw -8.2 kcal/mol, tra bod y cyfartaledd ar gyfer moleciwlau nad ydynt yn rhwymo'r protein neu nad ydynt yn rhwymo'r protein yn wael yn uwch;-6.8 kcal/mol. Mae hyn yn dangos bod egni'r gwahanol ystumiau yn ailadrodd yn ansoddol i ba raddau y mae'r gwahanol foleciwlau wedi'u rhwymo. Dangosir rhwymiad y Cpd M gweithredol yn Ffig. 3c (panel chwith), tra bod ystum gorau'r cyfansawdd R, nad oedd ganddo unrhyw weithgaredd, i'w weld yn Ffig. 3c (panel dde). Mae'r ddau gyfansoddyn yn gwneud rhyngweithiad T-catation clir â Lys636. Fodd bynnag, nid yw R, sydd â GlideScore uwch, yn cyd-fynd cystal oherwydd grŵp methyl y cylch pyridine 4- sy'n ymddangos yn rhy agos at yr Arg550 â gwefr bositif. Gwnaethom hefyd gymharu model OSBPL7 â strwythur yr ORP1-ORD (parth adnabod ocsisterol) mewn cyfadeilad â cholesterol (cod pdb 5zm5). Gwelsom fod I64 yn cyfateb i V712 a bod K636 yn cyfateb i N707 (Ffig. 3d). Mae archwiliad gweledol o'r cymhlyg ORP ORD/colesterol yn dangos bod y ddau weddillion hyn yn cysylltu â'r swbstrad ac, yn enwedig yn achos N707, yn ffurfio bond H â cholesterol, gan gyfrannu'n sylweddol at rwymo. O ystyried priodweddau ffisicocemegol tebyg valine ac isoleucine, a'r gallu gwarchodedig i ffurfio bondiau H o lysin mewn perthynas ag asparagine, mae'n rhesymol dod i'r casgliad bod I641 a K636 yn gwneud cyfraniad tebyg at rwymo colesterol i'r ORD OSBPL7.

Mae 5-arylnicotinamidau yn cynyddu ABCAl mewn podocytau dynol diwylliedig. O'r 5-gyfres arylnicotinamide, archwiliwyd Cpds A a G am effeithiau ar fynegiant ABCAl ac efflux colesterol mewn podocytes arennol, o'i gymharu â'r agonydd LXR Cpd C. Mae Cpd C yn weithydd LXR mwy grymus o'r un dosbarth hecsafluoroisopropanol o foleciwlau fel T131731. Dadansoddwyd mynegiant ABCA1 gan blot gorllewinol mewn lysates cell gyfan o bodosytau ar ôl triniaeth â chyffuriau. Cynyddodd y inducers ABC Al Cpd G (panel Ffig.5aleft, Ffig.4a Atodol, c) a Cpd A (Ffig. 5a panel dde, Ffig. Atodol 4b, d) yn sylweddol lefelau protein ABC Al ar grynodiadau 10 uM a 5uM, yn y drefn honno , ond i raddau llai na'r agonist LXR, Cpd C.

Yna fe fesuron ni efflux colesterol apo Al-mediated o bodosytau (Ffig. 5b). Cynyddodd Cpd G, Cpd A, a Cpd C yn sylweddol efflux colesterol apo Al-mediated ar 10 μM, 5 μM, ac 1 μM, yn y drefn honno, i tua'r un graddau; 2-plyg yn erbyn celloedd heb eu trin. Yn ddiddorol, roedd y cynnydd mewn efflux a achoswyd gan Cpd G a Cpd A yn debyg i'r cynnydd a achoswyd gan yr agonist LXR Cpd C, er gwaethaf y ffaith bod yr olaf wedi achosi lefelau uwch o brotein ABCAl cell gyfan yn yr arbrawf WB (Ffig. 5a). Rydym yn perfformio arbrofion ffracsiynu celloedd i asesu dosbarthiad isgellog o ABCAl ar ôl triniaeth cyffuriau (Ffig. 5c, d, Atodol Ffig. 5). Datgelodd yr arbrofion hyn fod yr 5-arylnicotinamides (Cpds G ac A) wedi cynyddu ABCAl yn y bilen plasma (Ffig. 5c), ond yn wahanol i'r agonist LXR, ni wnaethant gynyddu ABCAl mewn ffracsiynau microsomal (Ffig. 5d). Ni chanfuwyd unrhyw ABCAl yn y ffracsiwn sytosolig di-organelle (Ffig Atodol 5, panel dde). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai Cpd A a Cpd G sefydlogi ABCAl yn y bilen plasma.

Compound treatment increases ABCA1-mediated cholesterol efflux in human podocytes

Er mwyn mynd i'r afael â'r cwestiwn a yw ABC Al ac OSBPL7 yn rhyngweithio'n gorfforol, gwnaethom berfformio cyd-imiwnedd (cyd-IP) trwy drawsnewid celloedd HEK293 â phlasmidau sy'n gorfynegi OSBPL7-V5 ac ABCA1-proteinau wedi'u tagio gan FLAG . Fe ddefnyddion ni gleiniau gwrth-FLAG i imiwnoprecipitate ABCAl a phroteinau rhwymedig, wedi'u gwahanu gan SDS-PAGE a gorllewinol wedi'u blotio â gwrthgyrff i ganfod ABCAl ac OSBPL7-V5. Er bod y ddau brotein wedi'u gorfynegi, a'n bod yn gallu imiwnoprecipitate ABCAl-FLAG, ni wnaethom ganfod OSBPL7-V5 o dan yr amodau arbrofol hyn (Ffig Atodol 6).

Fig. 6 Cpd G protects from kidney injury in a mouse model of adriamycin-induced nephropathy. a–d Renal phenotype of mice that received vehicle (n = 8), Cpd A (30 mg/Kg, n = 11), Cpd G (100 mg/Kg, n = 10) or Cpd C (10 mg/Kg, n = 8) after adriamycin (ADR) injection. A group that did not receive ADR injection (C), is included to show the healthy phenotype. a Albumin to creatinine ratio in spot urines collected 4 weeks after treatment with vehicle (V) or with Cpd A (left), Cpd G (middle) or Cpd C (right). Data expressed as median and range. Treatments with vehicle or compound were compared using a two-tailed Mann–Whitney test: Cpd A (U = 9, P = 0.0025); Cpd G (U = 0, P < 0.0001); Cpd C (U = 24, P = 0.286). b Weight change, as % of weight at baseline, after 4 weeks of treatment with vehicle or with Cpd A (left), Cpd G (middle) or Cpd C (right). Data expressed as median and range. Groups treated with vehicle or compound were compared using a two-tailed Mann–Whitney test: Cpd A (U = 25, P = 0.107); Cpd G (U = 11, P = 0.006); Cpd C (U = 24, P = 0.274). c Representative images of PAS-stained kidney sections (magnification ×20) from mice injected with saline solution (no ADR) and mice injected with ADR that received vehicle (ADR + vehicle) or Cpd G (ADR + Cpd G). d Table summarizing the quantification of histological indicators of kidney damage obtained by a blinded pathology analysis of the PAS-stained kidney sections from mice that received vehicle or Cpd G after ADR injection. Glomerular damage was quantified and is expressed as the percentage of glomeruli with the indicated phenotype. The scale used to quantify tubular microcysts and interstitial inflammation represent the following extent of damage: 0: 0%; 0.5: 1–10%; 1: 11–25%; 2: 26–50%; 3: 51–75%; 4: >75%. Data expressed as the range and median (interquartile range). Both groups were compared using a double-tailed Mann–Whitney test (n = 5), *P < 0.05, **P < 0.01, the exact P values are indicated.

Mynegir OSBPL7 mewn podocytau arennol. Perfformiwyd dadansoddiad blot gorllewinol mewn lysates o bodosytau dynol a meinwe'r arennau. Canfuom fod OSBPL7 yn bresennol mewn arennau dynol a podocytau dynol, yn ogystal ag mewn llinellau celloedd dynol eraill (Caco2, HepG2, THP1, a HEK293)(Ffig. 5e, Ffig.7 Atodol). Datgelodd imiwneiddio trawstoriadau arennol fod OSBPL7 yn cael ei fynegi yn y cortecs arennol gan gynnwys mewn glomeruli, lle mae'n cydleoli â synaptopodin, marciwr podocyte-benodol (Ffig.5f).

Fig. 7 Cpd G protects from renal injury in the mouse model of Alport syndrome. a–f Treatment outcomes of 8-week-old 129-Col4a3 KO after receiving vehicle (V) or Cpd G (100 mg/Kg/day) for 28 days. A group of Col4a3+/+ littermates (C) is included to show the healthy phenotype. a Albumin to creatinine ratio in spot urine samples; b serum creatinine levels; c blood urea nitrogen (BUN) levels; d body weights; e mesangial expansion scores determined in a blinded manner by a pathologist in PAS-stained kidney sections; f representative pictures of PAS-stained kidney sections from each treatment group. a–e Data expressed as the median and range. Groups treated with vehicle or Cpd G were compared using a double-tailed Mann–Whitney test (n = 4, U = 0, P = 0.0286); g survival curve of Col4a3 KO mice that received vehicle or Cpd G (100 mg/Kg/day) for 4 weeks starting at the age of 6 weeks.

Mae Cpds G ac A yn lleihau anafiadau i'r arennau mewn neffropathi a achosir gan adriamycin. At ei gilydd, cafodd tua 180 5-arylnicotinamidau eu syntheseiddio a'u gwerthuso mewn profion efflux cellog THPI. O'r moleciwlau hyn, dewiswyd Cpds G ac A ar gyfer astudiaethau in vivo. Roedd hyn yn seiliedig ar weithgaredd efflux colesterol ABCAl, sefydlogrwydd metabolig mewn microsomau llygod mawr ac afu dynol, potensial rhyngweithio cytochrome P450 isel, a photensial isel ar gyfer rhwymo protein cofalent. Mae'r data hyn, a ffarmacocineteg dos sengl llygod mawr ar gyfer Cpd G, wedi'u crynhoi yn Nhabl Gwybodaeth Atodol S2. Profwyd Cpd G a Cpd A yn y model clefyd arennol a achosir gan Adriamycin (ADR). Mae neffropathi ADR yn adlewyrchu clefyd proteinwrig yr arennau a dyma'r model arbrofol mwyaf cyffredin o glomerwlosclerosis segmentaidd ffocal (FSGS). Mae nodweddion allweddol y model ADR yn cynnwys proteinwria dwys, colli pwysau, a newidiadau histolegol glomerwlaidd sy'n debyg i FSGS32,3.

Gwnaethom gynnal astudiaethau canfod dos ar gyfer asesiad rhagarweiniol o effeithiolrwydd a dewis dos ar gyfer astudiaethau dilynol. Cafodd llygod Balb/c a heriwyd gan ADR eu trin â chyfansawdd A neu G trwy gludydd llafar ar 30mg/kg neu 100mg/kg unwaith y dydd gan ddechrau postiad undydd -ADR pigiad. Defnyddiwyd y gweithydd LXR, Cpd C, ar ddogn o 10 mg/kg, fel cymharydd (Ffig Atodol 8). Er mwyn achosi anaf i'r arennau, rhoddwyd adriamycin ar ddogn o 12mg / kg o bwysau'r corff. Pennwyd cymarebau albwmin wrin i creatinin (ACR) a phwysau'r corff ar ddiwrnodau 7,14,21, a 28 ar ôl y pigiad. Roedd llygod a heriwyd gan ADR yn dangos proteinwria dros dro difrifol a cholli pwysau corff ar bob adeg. Gwellwyd gwerthoedd ACR yn sylweddol mewn anifeiliaid a gafodd eu trin â 30mg/kg/dydd neu 100mg/kg/dydd o Cpd A neu 100 mg/kg o Cpd G ac, i raddau llai, 30mg/kg o Cpd G. (Ffig Atodol. 8). Datgelodd microsgopeg imiwnofflworoleuedd o adrannau cortecs arennol ddirywiad glomerwlaidd a achosir gan ADR gyda cholled podocyt a cholli mynegiant ABC Al. Ataliwyd yr holl effeithiau hyn trwy driniaeth â Cpd G (Ffig Atodol 9). Yn seiliedig ar yr astudiaeth beilot, penderfynwyd mai'r dosau triniaeth optimaidd ar gyfer Cpd A a Cpd G oedd 30mg/kg/dydd a 100 mg/kg/dydd, yn y drefn honno. Defnyddiodd yr ail astudiaeth nifer fwy o anifeiliaid a phennwyd cymarebau albwmin i creatinin 28 diwrnod ar ôl y driniaeth (Ffig. 6a). Yn gyson â chanlyniadau rhagarweiniol, datblygodd llygod â her ADR (ADR plws V) broteinwria difrifol. Dangosodd triniaeth gyda Cpd A (ADR plws A)(Ffig. 6a, chwith) ac, yn fwy trawiadol, Cpd G (ADR plws G)(Ffig. 6a, canol), 8 a 30 gwaith yn is ACR, yn y drefn honno, gydag IQR canolrif. o 2.3 (0.3-12mg albwmin/mg creatinin) ar gyfer Cpd A a 0.6 (0.1-3.6mg albwmin/mg creatinin) ar gyfer Cpd G. Rheolaeth Roedd gan lygod â her ADR ganolrif IQR o 19 (10-72 mg albwmin/mg creatinin). Roedd llygod a gafodd eu trin â'r agonydd LXR Cpd C yn dangos gostyngiad mwy amrywiol mewn ACR (Ffig. 6a, ar y dde). Roedd Cpd A (Ffig. 6b, chwith) a Cpd G (Ffig. 6b, canol) hefyd yn lleihau colli pwysau yn sylweddol. Dros y 28-diwrnod ar ôl her ADR, collodd llygod yn y grŵp cerbydau hyd at 30 y cant o bwysau'r corff. Mewn cyferbyniad, ni ddangosodd 7 o bob 10 llygod a dderbyniodd Cpd G unrhyw golled pwysau, gyda dim ond mân golled o lai na 5 y cant ar gyfer y 3 llygod sy'n weddill (Ffig. 6b, chwith). Ni chafodd agonist LXR Cpd C unrhyw effaith sylweddol i atal colli pwysau (Ffig. 6b, ar y dde).

Fig. 8 Cpd G reduced accumulation of cholesterol esters in renal cortex in both disease models

Gan mai Cpd G oedd â'r effeithiolrwydd mwyaf i leihau proteinwria a cholli pwysau, gwnaethom ddadansoddiad histolegol ar adrannau'r arennau (Ffig. 6c). Achosodd her ADR newidiadau histolegol helaeth, gan gynnwys lefel uchel o glomerwlosclerosis ffocal a segmentol, ynghyd â microcystiau tiwbaidd, llid rhyng-ranol, ac ehangiad mesangial (Ffig. 6d). Gostyngodd Cpd G glomerwlosclerosis byd-eang a segmentol yn sylweddol, llai o hypertroffedd podocyte a hyperplasia, a llai o ficrocystiau tiwbaidd a llid interstitial (Ffig. 6d). Roedd Cpd G hefyd yn pylu llid a achoswyd gan ADR, a adlewyrchir gan lai o IL1 a MCP-1 yng nghortecs yr arennau (Ffig Atodol 10). Mae'r data hyn yn dangos bod Cpd G yn hynod effeithiol i leihau nodweddion FSGS, yn fwyaf nodedig, trwy wella ACR ac atal colli pwysau corff a achosir gan ADR (Ffig. 6).

Effects of Cpd G on plasma parameters and renal and liver lipids. Plasma lipids, hematological parameters, and liver trans-aminase levels were evaluated in all groups after 28 days of treatment. No significant differences in plasma total cholesterol or triglycerides were found. However, sporadically high cholesterol levels (>122mg/dL, 99.5th percentile of the healthy control group) were detected in 50% of ADR-challenged animals that received the vehicle,10% that received Cpd A,33% that received Cpd C, and none that received Cpd G (Supplementary Fig. lla, Supplementary Table 3). Hypercholesterolemia was observed only in mice with particularly severe proteinuria (ACR>15mg albwmin/mg creatinin). Ni welwyd unrhyw newidiadau mewn lefelau triglyserid (Ffig Atodol 11b). Dangosir hematocrit, haemoglobin, cyfrif celloedd gwaed gwyn, a gwerthoedd ALT ac AST yn Nhabl Data Estynedig 2. Ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau mewn cyfrif celloedd gwaed. Cynyddodd triniaeth Adriamycin ALT ac AST, a wanhawyd yn rhannol gan Cpd G (Tabl Atodol 4). Arhosodd cyfanswm y cynnwys colesterol a thriglyserid mewn cortecs arennau heb newid, er bod cynnwys triglyserid uwch wedi'i arsylwi mewn tua 30 y cant o anifeiliaid a dderbyniodd yr agonydd LXR Cpd C (Ffig Atodol 11c, d). Roedd cyfanswm yr afu a lefelau colesterol esteredig (CE) hefyd yn aros yr un fath mewn anifeiliaid â her ADR. (Ffig. Atodol lle,f). Gwrthwynebwyd y gostyngiad mewn cynnwys triglyserid hepatig oherwydd yr her ADR gan driniaeth â chyffuriau. Cpd A a Cpd C, ond nid Cpd G, cynyddodd cynnwys triglyserid hepatig yn erbyn rheolaethau a driniwyd gan gerbydau (Ffig Atodol 11g).

flavonoids supplements cardiovascular cerebrovasular

Mae Cpd G yn lleihau methiant arennol mewn model llygoden o syndrom Alport. Mae llawer o fathau o FSGS teuluol sy'n gwrthsefyll steroid a mathau eraill o CKD yn cael eu hachosi gan fwtaniadau mewn genynnau Col IV34-36. Fe wnaethom adrodd yn ddiweddar fod llai o fynegiant ABCAl mewn glomeruli o lygod taro Col4a3 (Col4a3 KO), model llygoden AS13. Nid yw llygod cnocio Col4a3 yn mynegi Colagen math IV. Mae'r llygod hyn yn datblygu albwminwria difrifol, nitrogen wrea gwaed uchel (BUN), a lefelau creatinin serwm uwch gan ddechrau yn 4 wythnos oed, gan symud ymlaen yn gyflym tuag at glefyd arennol diwedd cyfnod (ESRD). Mae anifeiliaid yn marw o fethiant yr arennau erbyn 8 wythnos oed37.

Roedd Cpd G(100mg/kg), neu gerbyd, yn cael ei roi i lygod Col4a3 KO bob dydd, trwy gavage llafar, gan ddechrau yn 4 wythnos oed pan fydd llygod yn ymddangos gyntaf gydag arwyddion o annigonolrwydd arennol. Parhaodd y driniaeth am 4 wythnos, ac aberthwyd llygod a oedd wedi goroesi yn 8 wythnos oed. Lleihawyd yn sylweddol Albuminuria (Ffig. 7a), creatinin serwm (Ffig. 7b), nitrogen wrea gwaed (Ffig. 7c), a graddau colli pwysau (Ffig. 7d) yn llygod Col4a3 KO a gafodd eu trin â Cpd G. O gymharu â anifeiliaid a gafodd ramipril o astudiaeth flaenorol gyda chynllun cyfartal38, lleihawyd albwminwria yn sylweddol mewn anifeiliaid a gafodd Cpd G ac nid oedd effaith Cpd G ar BUN a creatinin serwm yn israddol i ramipril (Ffig.12 Atodol). Datgelodd dadansoddiad histolegol o adrannau arennau lawer llai o ehangiad mesangial mewn llygod wedi'u trin â Cpd â G (Ffig. 7e, f). Ni chafodd Cpd G unrhyw effaith ar golesterol serwm (Ffig Atodol 13a) ond roedd yn tueddu i leihau triglyseridau serwm (Ffig Atodol 13b). Ni effeithiodd Cpd G ar gyfanswm cynnwys colesterol neu driglyserid mewn cortecsau arennau (Ffig.13c Atodol, d).

Er mwyn archwilio a allai Cpd G fod o fudd mewn methiant arennol datblygedig, fe wnaethom gynnal astudiaeth marwolaethau lle dechreuwyd triniaeth â Cpd G neu blasebo yn 6 wythnos oed, adeg pan fo methiant arennol sylweddol wedi digwydd. Canfuom fod Cpd G wedi lleihau marwolaethau mewn llygod Col4a3 KO, gan arwain at gyfnod bywyd cynyddol o tua 15 y cant o'i gymharu â rheolaethau (Ffig.7g).

Roedd Cpd G yn lleihau cynnwys ester colesterol arennol yn y ddau fodel clefyd. Mae'n hysbys bod colesterol glomerwlaidd a chroniad lipid yn gysylltiedig â dilyniant clefyd yr arennau7-10,12-14 cortecsau arennau o lygod a gafodd gerbyd ar ôl her ADR, ond nid y rhai a gafodd Cpd G, dangosodd dyddodiad o defnynnau lipid yn enwedig mewn glomeruli, a chynnydd sylweddol mewn cynnwys ester colesterol (Ffig. 8a, b). Roedd cysylltiad cryf rhwng y cynnydd yn y cynnwys ester colesterol ac albwminwria (Ffig. 8c). Roedd Cpd G hefyd yn lleihau cynnwys ester colesterol yn arennau llygod KO Col4a3 yn sylweddol (Ffig. 8d). Er gwaethaf y gostyngiad mewn ester colesterol yn yr aren, nid oedd unrhyw newid mewn colesterol plasma mewn llygod Col4a3 a dim ond mewn tua 50 y cant o'r llygod ADR (Ffig Atodol. lla a Ffig Atodol 13a). Mae'r data hyn yn awgrymu y gall Cpd G fod yn amddiffynnol trwy leihau cynnwys colesterol a lipid yn yr arennau.

Fe allech Chi Hoffi Hefyd