Mae Cistanche Deserticola Polysacarid yn Gwanhau Osteoclastogenesis Ac Atsugniad Esgyrn Trwy Atal Arwyddion RANKL A Chynhyrchu Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

Mae osteoporosis yn glefyd metabolig a nodweddir gan osteopenia a dirywiad microstrwythurol esgyrn. Osteoclastau yw'r prif gelloedd effeithydd sy'n diraddio matrics esgyrn ac mae eu swyddogaeth annormal yn arwain at ddatblygiad osteoporosis. Mae cronni rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn ystod metaboledd cellog yn hyrwyddo amlhau osteoclast a gwahaniaethu, felly, yn chwarae rhan bwysig mewn osteoporosis.Cistancheanialwchpolysacarid(CDP) yn meddu ar weithgaredd antitumor, gwrthlidiol a gwrthocsidiol. Fodd bynnag, nid yw effaith CDP ar osteoclastau yn glir. Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd staenio ffosffatas asid sy'n gwrthsefyll tartrad, imiwnfflworoleuedd, adwaith cadwynol trawsgrifio gwrthdro-polymerase, a dadansoddiad blotiau gorllewinol i ddangos bod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)osteoclastogenesis atal ac atsugniad hydroxyapatite. Yn ogystal, CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)hefyd yn atal mynegiant genynnau marciwr osteoclast gan gynnwys Ctsk, Mmp9, ac Acp5, ac ni chafodd unrhyw effaith ar ysgogydd derbynnydd mynegiant ffactor niwclear κB (RANK). Datgelodd dadansoddiadau mecanyddol bod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn cynyddu mynegiant ensymau gwrthocsidiol i wanhau cynhyrchiad ROS wedi'i gyfryngu gan RANKL mewn osteoclastau ac yn atal ffactor niwclear celloedd T wedi'i actifadu ac actifadu kinase protein a weithredir gan mitogen. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai CDP gynrychioli cyffur ymgeisiol ar gyfer trin osteoporosis a achosir gan weithgaredd osteoclast gormodol.

GEIRIAU ALLWEDDOLatsugniad esgyrn,Cistancheanialwchpolysacarid, MAPK, osteoclast, rhywogaethau ocsigen adweithiol

bodybuilding cistanche

1|RHAGARWEINIAD

Mae'r cydbwysedd rhwng ffurfio esgyrn, wedi'i gyfryngu gan osteoblastau, ac atsugniad esgyrn, wedi'i gyfryngu gan osteoclastau, yn chwarae rhan hanfodol wrth gynnal homeostasis metabolig esgyrn (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Pan fydd atsugniad esgyrn yn fwy na ffurfiant esgyrn, mae osteoporosis yn digwydd, a nodweddir gan lai o fàs esgyrn a difrod microstrwythurol esgyrn (Ikeda, 2008). Mae osteoporosis yn glefyd cyffredin mewn unigolion oedrannus a menywod ar ôl diwedd y mislif ac nid yw ei bathogenesis wedi'i egluro'n llawn (Cooper a Melton, 1992). Diffyg estrogen yw un o brif achosion osteoporosis (Manolagas, O'Brien, ac Almeida, 2013). Yn ogystal, gall rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) gael eu hysgogi gan ysgogydd derbynnydd ffactor niwclear κB ligand (RANKL) ac maent yn gysylltiedig â ffurfio osteoclast (Yip et al., 2005), ac felly gallant gyfrannu at ddatblygiad osteoporosis (Manolagas, 2010). Mae rhai astudiaethau wedi canfod bod diffyg Nrf2-antioxidant yn cynyddu lefelau ROS ac yn hyrwyddo gwahaniaethu osteoclast a achosir gan RANKL (Hyeon, Lee, Yang, a Jeong, 2013). Felly, dylid gwerthuso lleihau cynhyrchiad ROS yn ystod gwahaniaethu osteoclast fel strategaeth therapiwtig ar gyfer trin osteoporosis.

Mae osteoclastau yn deillio o'r llinach hematopoietig monocyte neu facroffage a dyma'r unig gelloedd amlnewyllol sy'n cyflawni atsugniad esgyrn (Teitelbaum, 2000). Felly, mae ymchwil sy'n cynnwys ffurfio osteoclast yn arwyddocaol iawn wrth ddatblygu triniaethau effeithiol ar gyfer clefydau metaboledd esgyrn (Lorenzo, 2017). Mae ffactor ysgogi cytrefi Macrophage (M-CSF) a RANKL, a gynhyrchir gan osteoblastau a chelloedd T actifedig, yn sytocinau pwysig sy'n rheoleiddio osteoclastogenesis (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). Mae RANKL yn ysgogi mynegiant ffactor niwclear celloedd T actifedig (NFATc1), sy'n ffactor trawsgrifio hanfodol sy'n weithredol yn ystod ffurfio osteoclast (Ishida et al., 2002). Mae NFATc1 wedi'i actifadu yn hyrwyddo mynegiant genynnau marcio osteoclast fel ffosffatase asid sy'n gwrthsefyll tartrate (TRAcP) a cathepsin K (CTSK) sy'n rheoleiddio osteoclastogenesis a swyddogaeth osteoclast (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistancheanialwchpolysacarid(CDP) wedi'i ynysu oddi wrth goesynnau cigogCistancheac yn meddu ar reoliad imiwnedd, gwrth-tiwmor, gwrth-heneiddio, ac effeithiau ffarmacolegol eraill (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)wedi cael effaith ataliol ar gynhyrchu ocsid nitrig (NO) a achosir gan lipopolysaccharid mewn celloedd microglial llygoden (celloedd BV-2; Nan et al., 2013). Yn ogystal, mae dyfyniad llawn ffenylethanoid (ECD) oCistanchegwella gallu nofio llygod trwy leihau niwed i gyhyrau, gohirio cronni asid lactig, a gwella storio ynni (Cai et al., 2010). Fodd bynnag, mae effeithiau CDP ar swyddogaeth a gweithgaredd osteoclast yn anhysbys o hyd.

Yn yr astudiaeth hon, rydym yn dangos bod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn atal gwahaniaethu osteoclast a achosir gan RANKL ac atsugniad esgyrn. Y mecanwaith sylfaenol oedd y CDP hwnnw(Cistancheanialwchpolysacarid)yn gwella mynegiant ensymau gwrthocsidiol i wanhau cynhyrchiad ROS, ac yna'n atal rhaeadrau signalau NFAT a ysgogwyd gan RANKL a protein kinase mitogen-activated (MAPK). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)Gellir ei ddefnyddio i drin osteoporosis a achosir gan atsugniad esgyrn osteoclastig gormodol.

maca ginseng cistanche

2|DEUNYDDIAU A DULLIAU

2.1|Defnyddiau

CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)(purdeb > 98 y cant ) ei brynu gan Solarbio (Beijing, Tsieina) a'i baratoi ar grynodiad stoc o 1 mM mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS). Mae gwrthgyrff yn benodol ar gyfer c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, ffosfforyleiddiad (p)-ERK, p-p38, p-JNK, ac ‐actin gan Siôn Corn Biotechnoleg Cruz (San Jose, CA). Cynhyrchwyd gwrthgyrff i V‐ATPase d2 fel y disgrifiwyd yn flaenorol (H. Feng et al., 2009). Cafwyd y system assay 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2 (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) a luciferase gan Promega (Sydney, Awstralia) . Prynwyd M‐CSF ailgyfunol gan R&D Systems (Minneapolis, MN). Mynegwyd a phuro protein GST-rRANKL ailgyfunol fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Xu et al., 2000).

2.2|Diwylliant celloedd

Cafwyd celloedd RAW264.7 (celloedd macrophage llygoden) o American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) a'u meithrin mewn cyfrwng hanfodol lleiaf wedi'i addasu (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Awstralia) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant, 2 mM o L-glutamin, 100 U/ml o benisilin, a 100 ug/ml o streptomycin (cyfrwng cyflawn). Cafodd monocytau sy'n deillio o fêr esgyrn (BMMs) eu hynysu oddi wrth lygod C57BL/6J 6 wythnos oed, a gafodd eu ewthaneiddio yn unol â gweithdrefnau a gymeradwywyd gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Prifysgol Gorllewin Awstralia (RA/3/100/1244). Rhannwyd esgyrn hir yn rhydd o feinweoedd meddal a chafodd y mêr esgyrn ei fflysio o'r ffemwr a'r tibia, a gafodd ei feithrin wedyn mewn cyfrwng cyflawn ym mhresenoldeb M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Assay osteoclastogenesis

Cafodd BMMs eu platio i blatiau meithrin 96-ffynnon ar ddwysedd o 6 × 103 o gelloedd fesul ffynnon a'u trin â chyfrwng cyflawn sy'n cynnwys M-CSF (50 ng / ml) a GST-rRANKL (100 ng / ml), ym mhresenoldeb neu absenoldeb crynodiadau amrywiol o CDP(Cistancheanialwchpolysacarid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tri chnewyllyn) fel osteoclastau.

2.4|Profion sytowenwyndra

Cafodd BMMs eu hadu i blatiau 96 ffynnon ar 6 × 103 o gelloedd y ffynnon a'u gadael dros nos i gadw. Y diwrnod canlynol, deorwyd y celloedd gyda chrynodiadau amrywiol o CDP(Cistancheanialwchpolysacarid). Ar ôl 48 awr arall, ychwanegwyd yr hydoddiant MTS (20 µl/wel) a'i ddeor â chelloedd am 2 awr. Penderfynwyd ar yr amsugnedd ar 490 nm gyda darllenydd microplate (Sbectrwm Amliscan; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Staenio imiwnofflworoleuol

Cafodd BMMs eu hadu ar ddwysedd o 6 × 103 o gelloedd fesul ffynnon ym mhresenoldeb M-CSF (50 ng/ml) dros nos. Yna ysgogwyd celloedd gyda M-CSF a GST-rRANKL (100 ng/ml) nes i osteoclastau aeddfed ffurfio. Yna cafodd yr osteoclastau eu trin â chrynodiadau amrywiol o CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)am 48 awr cyn ei osod gyda 4 y cant o baraformaldehyd, gan athreiddio gyda 0.1 y cant Triton X-100-PBS, a blocio gydag albwmin serwm buchol 3 y cant yn PBS. Deorwyd celloedd parod â phalloidin wedi'i gyfuno â rhodamine am 45 munud yn y tywyllwch i'w staenio ar gyfer F-actin. Yna cafodd celloedd eu golchi â PBS, niwclysau eu gwrth-staenio â 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), a'u gosod â gorchuddion ar gyfer microsgopeg confocal.

profiad cistanche

2.6|Assay resorption hydroxyapatite

I fesur gweithgaredd osteoclast ysgogwyd BMMs (1 × 105 o gelloedd y ffynnon) wedi'u meithrin ar blatiau wedi'u gorchuddio â cholagen chwe ffynnon (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) â GST-rRANKL (100 ng / ml) a M-CSF (50 ng / ml) nes bod osteoclastau aeddfed yn cael eu cynhyrchu (Zhou et al., 2016). Yna cafodd celloedd eu gwahanu'n ysgafn o'r plât gan ddefnyddio hydoddiant daduniad celloedd (Sigma-Aldrich) a chafodd niferoedd cyfartal o osteoclastau aeddfed eu hadu ar ffynhonnau unigol mewn platiau 96-ffynnon wedi'u gorchuddio â hydroxyapatite (Corning Osteoassay, Corning, NY). Deorwyd osteoclastau aeddfed mewn cyfrwng sy'n cynnwys GST-rRANKL ac M-CSF gyda neu heb CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn y crynodiadau a nodir. Ar ôl 48 awr, cafodd hanner y ffynhonnau eu staenio'n imiwn-histocemegol ar gyfer gweithgaredd TRAcP, fel y disgrifir uchod, i asesu nifer y celloedd aml-niwclear fesul ffynnon. Cafodd gweddill y ffynhonnau eu cannu am 10 munud i gael gwared â chelloedd a chaniatáu mesur yr ardaloedd sydd wedi'u hadsugno. Tynnwyd lluniau o ardaloedd wedi'u hadsugno o dan ficrosgopeg golau safonol a defnyddiwyd meddalwedd Image J (Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol, Bethesda, MD) i feintioli arwynebedd canrannol yr arwyneb hydroxyapatite a atsugnwyd gan yr osteoclastau.

2.7|Profion gohebydd Luciferase

Er mwyn ymchwilio i actifadu trawsgrifiadol NFATc1, cafodd celloedd RAW264.7 eu trawsnewid yn sefydlog â lluniad gohebydd luciferase ymatebol NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Cafodd celloedd wedi'u trawsyrru eu meithrin mewn platiau 48 ffynnon ar ddwysedd o 1.5 × 105 o gelloedd fesul ffynnon a'u rhag-drin gyda chrynodiadau amrywiol o CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)am 1 awr. Yn dilyn rhag-driniaeth, ysgogwyd celloedd â GST-rRANKL (100 ng / ml) am 24 awr, a mesurwyd gweithgaredd luciferase gan ddefnyddio system assay gohebydd luciferase yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (Promega).

2.8|Dadansoddiad meintiol trawsgrifio gwrthdro-adwaith cadwyn polymeras (RT-PCR).

Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu o gelloedd gan ddefnyddio adweithydd Trizol yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (Thermo Fisher Scientific). Cafodd DNA cyflenwol ei syntheseiddio gan ddefnyddio trawsgrifiad gwrthdroi firws lewcemia Moloney murine gydag 1 ug o dempled RNA a phaent preimio oligo-dT. Perfformiwyd ymhelaethiad adwaith cadwynol polymeras ar ddilyniannau penodol gan ddefnyddio'r rhaglen ganlynol: 94 gradd am 5 munud, ac yna 30 cylch o 94 gradd am 40 s, 60 gradd am 40 s, a 72 gradd am 40 s, a cham ymestyn olaf o 5 munud ar 72 gradd. Dangosir gwybodaeth fanwl preimwyr penodol yn Nhabl 1. Cyfrifwyd lefelau RNA negeseuol cymharol trwy normaleiddio i fynegiant y genyn cadw tŷ Hmbs.

2.9|Dadansoddiad o blotiau gorllewinol

Cafodd BMMs eu meithrin mewn cyfrwng cyflawn gyda M-CSF mewn platiau chwe ffynnon a'u hysgogi gyda GST-rRANKL (100 ng / ml) am yr amseroedd a nodwyd. Cafodd celloedd eu lysed mewn byffer lysis radioimmunoprecipitation a phroteinau eu datrys gan sodiwm dodecyl sylffad-polyacrylamide gel electrofforesis a'u trosglwyddo i poly (fflworid finylidene) pilenni (GE Healthcare, Silverwater, Awstralia). Cafodd y pilenni eu blocio mewn llaeth sgim 5 y cant am 1 awr ac yna eu harchwilio â gwahanol wrthgyrff cynradd penodol gan ysgwyd yn ysgafn dros nos ar 4 gradd. Roedd pilenni'n cael eu golchi a'u deor wedyn â gwrthgyrff eilaidd wedi'u cyfuno â rhuddygl poeth perocsidas. Yna canfuwyd adweithedd gwrthgyrff gydag adweithydd cemiluminescence gwell (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a'i ddelweddu gyda Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Canfod ROS mewngellol

Canfuwyd lefelau ROS mewngellol gan ddefnyddio pecyn canfod ROS cellog 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate cellog canfod ROS (Abcam, Melbourne, Awstralia). Cafodd BMMs (5 × 103 o gelloedd y ffynnon) eu meithrin mewn platiau 96-ffynnon a'u trin â RANKL (100 ng / ml), M-CSF (50 ng / ml), a CDP am 72 awr. Mesurwyd lefelau ROS mewngellol gan ddefnyddio 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate, sy'n ocsideiddio i DCF fflwroleuol ym mhresenoldeb ROS. Golchwyd celloedd yng nghlustog Hank a'u deor yn y tywyllwch am 30 munud gyda 10 µM o DCFH‐DA. Cafwyd delweddau gan ddefnyddio microsgopeg confocal.

2.11|Dadansoddiadau ystadegol

Mae'r holl ddata yn gynrychioliadol o o leiaf dri arbrawf a gyflawnir yn driphlyg oni nodir yn wahanol. Mynegir data fel cymedr ± DC. Defnyddiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant a ddilynwyd gan brofion post hoc Student–Newman–Keuls i bennu arwyddocâd gwahaniaethau rhwng canlyniadau, gyda p < 0.05="" yn="" cael="" ei="" ystyried="" yn="">

3|CANLYNIADAU

3.1|Mae CDP yn atal osteoclastogenesis a achosir gan RANKL ac ymasiad osteoclast

Penderfynu a yw CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn gallu atal ffurfiad osteoclast a achosir gan RANKL, fe wnaethom berfformio assay osteoclastogenesis gyntaf gan ddefnyddio BMMs llygoden (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). Cafodd BMMs eu trin â RANKL ac M-CSF am 5 diwrnod gyda chrynodiadau cynyddol o CDP. Gostyngodd CDP nifer y celloedd aml-niweidiol TRAcP‐ positif pan oedd crynodiad CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)cyrraedd 5 µM neu uwch (Ffigur 1a,b). Gwerthuso CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)gwenwyndra a chadarnhau nad oedd y canlyniadau hyn yn adlewyrchiad o farwolaeth celloedd neu nifer, fe wnaethom berfformio assay MTS. Cafodd BMMs eu trin â RANKL a M-CSF am 48 awr gyda dosau amrywiol o CDP(Cistancheanialwchpolysacarid). Ni chafodd CDP unrhyw effaith ar amlhau BMM ar y crynodiad o 15 µM neu lai (Ffigur 1c).

I brofi effeithiau CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)ar ymasiad osteoclast, cafodd osteoclastau eu hysgogi â thriniaeth RANKL a M-CSF, gyda dosau amrywiol o CDP neu hebddynt.(Cistancheanialwchpolysacarid). Cafodd osteoclastau eu staenio â rhodamine-phalloidin a DAPI i asesu nifer y niwclysau fesul osteoclast (Ffigur 2a). Gostyngodd nifer yr osteoclast a nifer cyfartalog y niwclysau fesul osteoclast yn dilyn CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)triniaeth (5–10 µM; Ffigur 2b,c). Felly, CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)wedi cael effeithiau ataliol ar osteoclastogenesis a achosir gan RANKL ac ymasiad osteoclast mewn modd sy'n dibynnu ar ddos.

3.2|CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn gwanhau gweithgaredd atsugniad osteoclastig hydroxyapatite a achosir gan RANKL

Perfformiwyd assay resorption hydroxyapatite i ganfod effaith CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)ar swyddogaeth osteoclast (Ffigur 3a). Ar ôl deoriad 24 awr, ni newidiodd nifer yr osteoclastau fesul ffynnon tra bod yr ardal atsugniad hydroxyapatite wedi'i ostwng yn sylweddol trwy driniaeth gyda CDP 5 a 10 µM o'i gymharu â grwpiau rheoli (Ffigur 3b,c). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y CDP hwnnw(Cistancheanialwchpolysacarid)yn cael effeithiau ataliol cryf ar ffurfiant osteoclast a gweithgaredd atsugniad osteoclast heb unrhyw effeithiau sytotocsig.

3.3|CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn atal mynegiant genynnau marciwr osteoclast

Ymchwilio ymhellach i effeithiau ataliol CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)ar osteoclastogenesis ac atsugniad esgyrn osteoclastig, cafodd BMMs eu trin â RANKL ac M-CSF am 5 diwrnod gyda chrynodiadau amrywiol o CDP(Cistancheanialwchpolysacarid). Yna perfformiwyd RT-PCR i ganfod mynegiant genynnau marciwr osteoclast. Cafodd mynegiant Nfatc1, ffactor trawsgrifio hanfodol yn ystod osteoclastogenesis, ei atal gan CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​(Ffigur 4a). Yn ogystal, CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)(5 a 10 µM) is-reoleiddio mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig ag atsugniad esgyrn, gan gynnwys Mmp9, Ctsk, ac Acp5 (Ffigur 4b–d).

3.4|Mae CDP yn atal gweithgaredd NFATc1 a mynegiant protein i lawr yr afon

Archwilio effaith CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)ar weithgaredd NFATc1 a achosir gan RANKL, cynhaliwyd assay gohebydd luciferase. Triniaeth gyda CDP(Cistancheanialwchpolysacarid), mewn crynodiadau o 5 µM ac uwch, gweithgaredd NFATc1 a achosir gan RANKL yn sylweddol (Ffigur 5a). Yn ogystal, mae dadansoddiad blotiau gorllewinol yn dangos bod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)atal mynegiant protein o NFATc1 a c-Fos yn sylweddol mewn BMMs a gafodd eu trin â RANKL ac M-CSF am 3 a 5 diwrnod (Ffigur 5b). Ar ben hynny, roedd mynegiant proteinau sy'n gysylltiedig â swyddogaeth osteoclast, fel V-ATPase-d2 a CTSK, wedi'i isreoleiddio ym mhresenoldeb CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)o'i gymharu â grwpiau rheoli. Fodd bynnag, ni chafodd CDP unrhyw effaith ar fynegiant RANK (Ffigur 5b).

3.5|Mae CDP yn hyrwyddo mynegiant ensymau gwrthocsidiol i ysbeilio cynhyrchiad ROS yn ystod osteoclastogenesis a achosir gan RANKL

Er mwyn archwilio mecanwaith sylfaenol ataliad osteoclastogenesis sy'n ddibynnol ar CDP, cafodd BMMs eu trin â RANKL (100 ng / ml) a M-CSF (50 ng / ml) ynghyd â PBS neu CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)am 72 awr. Fe wnaethom archwilio effaith CDP ar gynhyrchu ROS mewngellol wedi'i ysgogi gan RANKL. Cynyddwyd lefelau ROS mewngellol gan driniaeth RANKL, a wanhawyd gan CDP (5 a 10 µM; Ffigur 6a). Gostyngwyd nifer y celloedd ROS-positif a dwyster staenio ROS gan driniaeth CDP mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​(Ffigur 6b, c). Dangosodd dadansoddiad blotiau gorllewinol fod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)hyrwyddo mynegiant thioredoxin (TRX1) a glutathione reductase (GSR) tra'n atal mynegiant synthase ocsid nitrig anwythadwy (NOS2) mewn BMMs a gafodd eu trin â RANKL a M-CSF am 3 diwrnod (Ffigur 6d).

I archwilio ymhellach os CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)atal gwahaniaethu osteoclast trwy leihau cynhyrchiad ROS, yna fe wnaethom drin BMMs gyda perocsid (10 µM) i ddynwared y statws ROS uchel mewn celloedd. Cafodd BMMs eu hysgogi gan RANKL a M-CSF am 3 diwrnod a dangosodd canlyniadau dadansoddiad blotiau gorllewinol a RT-PCR fod perocsid yn hyrwyddo mynegiant NFATc1 a c-Fos o'i gymharu â'r grwpiau rheoli. Yn gyson â'r canlyniadau yn Ffigur 5, cafodd mynegiant NFATc1 a c-Fos ei atal gan CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)tra bod perocsid yn achub effaith ataliol CDP (Ffigur 6e,f). Roedd y data hyn yn dangos bod CDP wedi atal mynegiant NFATc1 a c-Fos trwy ysbeilio cynhyrchiad ROS.

3.6|CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn atal llwybrau MAPK yn ystod osteoclastogenesis a achosir gan RANKL

Nesaf, fe wnaethom ymchwilio i effaith CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)triniaeth ar fynegiant TRAF6 wedi'i gyfryngu gan RANKL ac actifadu llwybr MAPK. Yn dilyn deori mewn cyfrwng di-serwm am 2 awr, ysgogwyd BMMs gyda RANKL, gyda neu heb CDP, am 60 munud. Ni chafodd ysgogiad gyda CDP (10 µM) unrhyw effaith ar fynegiant TRAF6 a ffosfforyleiddiad gwanedig o JNK2 ac ERK1/2 am 10 ac 20 munud (Ffigur 7). Yn ogystal, roedd ffosfforyleiddiad p38 yn cael ei atal yn sylweddol gan CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)triniaeth o 60 munud o'i gymharu â grwpiau rheoli (Ffigur 7). Mae'r data hyn yn datgelu'r CDP hwnnw(Cistancheanialwchpolysacarid)yn atal llwybrau signalau MAPK a achosir gan RANKL, yn gyson â'i effaith ataliol ar ffurfiant osteoclast a gweithgaredd.

4|TRAFODAETH

Mae Cistanche, a elwir yn "ginseng anialwch," wedi denu llawer o sylw yn ddiweddar am ei allu i fodiwleiddio imiwnedd a gweithredu'n amddiffynnol yn ystod heneiddio a straen ocsideiddiol (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Dangoswyd bod glycosidau a amnewidiwyd gan ffenylpropanoid, prif gydrannau gweithredol Cistanche, yn atal DIM gweithgaredd mewn macroffagau (Ahn, Chae, Chin, a Kim, 2017). Yn ogystal, aCistanchellai o straen ocsideiddiol mewn myocardiwm atgyfnerthol yn dilyn isgemia a chwaraeodd ran sylweddol yn atal llwybrau apoptotig sy'n arwain at cardioprotection (Yu, Li, & Cao, 2016). Fel elfen bwysig o Cistanche, CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)mae ganddo amrywiaeth o swyddogaethau ffarmacolegol. Canfu ein hastudiaeth gyfredol fod CDP yn atal gwahaniaethu osteoclast wedi'i actifadu gan RANKL ac yn ysgogi trwy wanhau cynhyrchiad ROS yn ogystal ag actifadu NFAT a MAPK.

Fel ffosffatas asid, mae TRAcP yn bodoli mewn amrywiaeth o gelloedd ac mae'n doreithiog mewn osteoclastau a macroffagau alfeolaidd (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). Mae TRAcP yn ensym nodweddiadol o osteoclastau ac mae ei fynegiant yn perthyn yn agos i swyddogaeth osteoclast, a ystyrir yn ddangosydd o weithgarwch osteoclast ac atsugniad esgyrn (Minkin, 1982). Yn ein hastudiaeth, CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)atal nifer y celloedd TRAcP-positif, gan nodi bod osteoclastogenesis a achosir gan RANKL wedi'i rwystro gan CDP(Cistancheanialwchpolysacarid). Mae diraddio matrics esgyrn gan osteoclastau yn dibynnu ar cathepsin K (CTSK) a MMPs (Gruber, 2015). Yma, roedd CDP yn is-reoleiddio mynegiant genynnau swyddogaethol osteoclast fel Mmp9, Ctsk, ac Acp5 yn sylweddol.

Mae gwahaniaethu a swyddogaeth osteoclast yn cael eu rheoleiddio gan lwybrau signalau lluosog (Boyle, Simonet, a Lacey, 2003). Ar ôl rhwymo i RANK, mae RANKL yn recriwtio protein addasydd TRAF6 i actifadu mynegiant NFATc1, sy'n ffactor trawsgrifio pwysig ar gyfer ffurfio osteoclast, sy'n effeithio ar fynegiant genynnau osteoclast-benodol, gan gynnwys TRAcP a CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Yn yr astudiaeth hon, canfuom fod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)ni chafodd unrhyw effaith ar fynegiant RANK a TRAF6 mewn osteoclastau. Fodd bynnag, CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)atal gweithrediad NFATc1 a achosir gan RANKL yn ystod osteoclastogenesis BMMs. Ar ben hynny, dangoswyd bod ROS, a gynhyrchwyd gan mitocondria yn y broses o ddosbarthu electronau, yn hyrwyddo amlhau a gwahaniaethu osteoclastau a diraddio matrics esgyrn rheoledig (Ha et al., 2004). Canfu astudiaeth ddiweddar fod RANKL wedi ysgogi mewnforio niwclear Bach1 ac wedi gwanhau cynhyrchiad ensymau gwrthocsidiol Nrf2-mediated, a thrwy hynny ychwanegu at fynegiant ROS mewngellol ac osteoclastogenesis mewn llygod (Kanzaki et al., 2017). Yn ogystal, mae mwy o gynhyrchu ROS mewngellol gan homocysteine ​​wedi gwella ffurfiant osteoclast a gweithgaredd (Koh et al., 2006). Canfu ein hastudiaeth fod CDP wedi lleihau cronni ROS mewn osteoclastau trwy atal mynegiant NOS2 a hyrwyddo mynegiant ensymau gwrthocsidiol, megis TRX1 a glutathione reductase. Pan wnaethom drin BMMs â pherocsid i wella croniad ROS mewngellol, datgelodd y canlyniadau y gallai cynnydd mewn ROS wella mynegiant NFATc1 fod ROS i fyny'r afon o NFATc1. Gwelsom hefyd fod perocsid yn achub effaith ataliol CDP ar fynegiant NFATc1. Felly, mae ein data yn awgrymu bod CDP yn atal cronni ROS i atal mynegiant NFATc1, yna i atal ffurfio a swyddogaeth osteoclast.

Mae ERK, JNK, a t38 yn perthyn i'r teulu MAPK, sydd hefyd yn ymwneud â rheoleiddio gwahaniaethu osteoclast (Seger & Krebs, 1995). Mae RANKL yn actifadu llwybr MAPK trwy gynyddu ffosfforyleiddiad ERK, JNK, a p38 (Mizukami et al., 2002). Fe wnaethom ddangos y CDP hwnnw(Cistancheanialwchpolysacarid)atal ffosfforyleiddiad RANKL-gyfryngol o broteinau allweddol yn y llwybr MAPK, a thrwy hynny gyfrannu at effaith ataliol CDP ar fynegiant genynnau marcio osteoclast. Hyd y gwyddom, dyma'r astudiaeth gyntaf sy'n dangos effeithiau ataliol CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)ar gynhyrchu ROS, NFAT, ac actifadu MAPK, sy'n cynrychioli mecanweithiau gweithredu newydd CDP in vitro.

I grynhoi, gwnaethom ddangos y CDP hwnnw(Cistancheanialwchpolysacarid)yn gwanhau osteoclastogenesis ac atsugniad hydroxyapatite, a mynegiant genynnau marcio osteoclast gan gynnwys Ctsk, Mmp9, ac Acp5. CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn gallu atal cynhyrchu ROS wedi'i gyfryngu gan RANKL, yn ogystal ag actifadu NFAT a MAPK (Ffigur 8). Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n awgrymu bod CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)gall gynrychioli cyffur ymgeisiol ar gyfer trin cyflyrau sy'n gysylltiedig ag osteoclast ynghyd â gorgynhyrchu ROS.

FFIGUR 8 Diagram sgematig o CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)swyddogaeth mewn gwahaniaethu osteoclast. CDP(Cistancheanialwchpolysacarid)yn atal cynhyrchu ROS a achosir gan RANKL, yn ogystal ag actifadu NFATc1 a MAPK, gan atal osteoclastogenesis. CDP,Cistancheanialwchpolysacarid; MAPK, kinase protein wedi'i actifadu â mitogen; NFATc1, ffactor niwclear cell T wedi'i actifadu; RANKL, ysgogydd derbynnydd ffactor niwclear κB ligand; ROS, rhywogaethau ocsigen adweithiol [Gellir gweld y ffigur lliw yn wileyonlinelibrary.com]

DIOLCHIADAU

Cefnogwyd yr astudiaeth hon gan Sefydliad Gwyddoniaeth Natur Tsieina (81572164), Rhaglen Ymchwil a Datblygu Technoleg Allweddol Genedlaethol Tsieina (2017YFC1103300), Sefydliad Gwyddoniaeth Naturiol Talaith Guangxi (2016GXNSFAA380295), a Phrosiect Ymchwil Gwyddoniaeth a Thechnoleg Prifysgol Guangxi Talaith (KY2015YB054). Fe'i cefnogir yn rhannol hefyd gan Brosiect Cynllun Datblygu Ymchwil a Thechnoleg Gwyddonol Guangxi (GKG13349003, 1598013-15), Cronfa Seilwaith Ymchwil Feddygol ac Iechyd Gorllewin Awstralia, Sefydliad Arthritis Awstralia, Gwobrau Cydweithrediad Ymchwil Prifysgol Gorllewin Awstralia (UWA), a'r Cyngor Ymchwil Iechyd a Meddygol Awstralia (NHMRC, Rhifau 1107828 a 1027932).

GWRTHDARO BUDDIANNAU

Mae'r awduron yn datgan nad oes unrhyw wrthdaro buddiannau

Oddi wrth:'Cistancheanialwchpolysacaridyn gwanhau osteoclastogenesis ac atsugniad esgyrn trwy atal signalau RANKL a chynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol gan Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018; 233: 9674-9684