Mae Cistanche Deserticola Polysacaridau yn Lliniaru Dirywiad Gwybyddol A Gwella Cof mewn Llygod Model sy'n Heneiddio

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSENOLDEB

Mae tystiolaeth ddiweddar yn awgrymu y gallai newidiadau yn echel microbiota-ymennydd y perfedd arwain at wywo nam gwybyddol. Yn yr astudiaeth bresennol, gwelsom fod gweinyddiaeth hir o D-galactos i lygod yn achosi dirywiad gwybyddol, dysbiosis microbaidd y perfedd, llid ymylol, a straen ocsideiddiol. Yn y model hwn o ddirywiad gwybyddol sy'n gysylltiedig ag oedran, fe wnaeth Cistanche deserticola polysacarides (CDPS) wella swyddogaeth wybyddol mewn llygod wedi'u trin â galactos D trwy adfer homeostasis microbaidd yn y perfedd, gan leihau straen ocsideiddiol a llid perifferalaidd. Diddymwyd effeithiau buddiol CDPS yn y llygod model heneiddio hyn trwy abladiad gutmicrobiota â gwrthfiotigau neu imiwnedd â cyclophosphamide. Dangosodd proffilio metabolomig serwm fod lefelau creatinin, valine, L-methionine, o-Toluidine, N-ethylaniline, asid wrig, a phroline wedi'u newid yn y llygod model sy'n heneiddio, ond fe'u hadferwyd gan CDPS. Dangosodd y canfyddiadau hyn fod CDPS yn gwella swyddogaeth wybyddol mewn model heneiddio a achosir gan D-galactose mewn llygod trwy adfer homeostasis echel ymennydd microbiota perfedd, a oedd yn lleddfu anghydbwysedd asid amino, llid ymylol, a straen ocsideiddiol. Mae CDPS felly yn dangos potensial therapiwtig i gleifion ag anhwylderau cof a dysgu, yn enwedig y rhai sy'n ymwneud â dysbiosis perfeddol.

Cistanchellysieuyn

RHAGARWEINIAD

Mae gweinyddu hirfaith o halwynau D-galactos (D-gal) a berylium yn achosi heneiddio mewn modelau anifeiliaid arbrofol a diwylliannau celloedd cynradd in vitro ac fe'i defnyddir i nodi mecanweithiau sy'n sail i'r broses heneiddio naturiol [1–4]. Mae astudiaethau blaenorol yn dangos bod dirywiad gwybyddol mewn llygod model heneiddio a achosir gan D-galactose yn gysylltiedig â lefelau protein llai o ffactor twf nerf (NGF) a mwy o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn yr ymennydd, sydd ill dau yn achosi dirywiad y niwronau hippocampal ac yn lleihau niwrogenesis [3, 4]. Mae astudiaethau diweddar hefyd wedi dangos bod cyfansoddiad a nifer microbiota perfedd dynol yn newid yn sylweddol yn ystod y broses heneiddio[5].

Mae Cistanche deserticola yn berlysiau sy'n tyfu'n bennaf yn rhanbarth anialwch Gogledd-Orllewinol Tsieina ac fe'i defnyddir mewn meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol. Fe'i gelwir yn gyffredin yn "ginseng yr anialwch." Mae detholiadau Cistanche deserticola yn cynnwys nifer o gyfansoddion sy'n weithredol yn ffarmacolegol, gan gynnwys glycosidau ffenylethanoid, iridoidau, lignose, oligosacaridau, polysacaridau, ac asidau amino; mae'r cyfansoddion hyn yn gysylltiedig ag eiddo gwrthlidiol, gwrth-ocsidiol, gwrth-senescent, neuroprotective, a immunomodulatory [6, 7]. Er enghraifft, mae polysacaridau a echdynnwyd o Cistanche deserticola wedi cael eu defnyddio mewn meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol i drin canser y colon a'r rhefr [8]. Mae ystod eang o polysacaridau gwan wenwynig gyda bioaccharidau defnyddiol wedi'u hynysu o sawl organebau, megis polysacarid Chuanqiong, polysacarid Ganoderma lucidum, a polysacarid Lycium barbarum [9-11]. Mae CDA 0.05 yn galactoglucan wedi'i ynysu o Cistanche deserticola sy'n hyrwyddo twf nifer o facteria coluddol buddiol, gan gynnwys sawl rhywogaeth o Bacteroides a Lactobacillus [12].

Mae mecanweithiau sylfaenol y broses heneiddio arferol hefyd yn gysylltiedig â nifer o afiechydon dynol megis anhwylderau niwro-ddirywiol, atherosglerosis coronaidd, diabetes math 2 (T2DM), a gorbwysedd [13, 14]. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod newidiadau yn y fflora berfeddol yn chwarae rhan arwyddocaol mewn heneiddio dynol [15]. Mae sawl astudiaeth wedi dangos bod gweinyddu D-galactos am gyfnod hir mewn llygod arbrofol a llygod mawr yn dynwared y broses heneiddio arferol ac mae'n fodel defnyddiol i astudio ffenoteipiau sy'n gysylltiedig â heneiddio megis dirywiad gwybyddiaeth [16]. Ar ben hynny, mae llygod model heneiddio a achosir gan D-galactose yn dangos newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota perfedd [17]. Felly, gwnaethom ragdybio y gallai newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd achosi dirywiad gwybyddol yn y model heneiddio a achosir gan galactos D, ac ymchwilio i weld a allai polysacaridau deserticola Cistanche (CDPS) liniaru dirywiad gwybyddol trwy adfer dysbiosis microbiota perfedd.

coesyn cistanche

CANLYNIADAU

Mae llygod model heneiddio a achosir gan D-galactos yn dangos dirywiad gwybyddol a dysbiosis microbaidd y perfedd

Gwnaethom ddadansoddi perfformiad ymddygiadol llygod math gwyllt (WT) a'r rhai a gafodd eu trin â 150 mg D-gal fesul Kg o bwysau'r corff am 2 fis (model neu Weinyddiaeth Amddiffyn) gan ddefnyddio profion adnabod gwrthrychau newydd a drysfa ddŵr Morris (MWM). Gostyngwyd y gwerthoedd mynegai ffafriol yn y prawf adnabod gwrthrychau newydd yn sylweddol yn llygod grŵp Mod o'u cymharu â llygod grŵp WT (Ffigur 1A, 1B). Dangosodd canlyniadau profion MWM fod yr amser hwyrni dianc ar ôl y chweched diwrnod wedi cynyddu'n sylweddol yn y grŵp Mod o'i gymharu â'r grŵp WT (Ffigur 1C, 1D). At hynny, gostyngwyd croesfannau platfform targed ac amseroedd nofio o fewn y cwadrant targed yn sylweddol yn y grŵp Mod o'i gymharu â'r grŵp WT (Ffigur 1E, 1F). Dangosodd y canlyniadau hyn ddirywiad sylweddol yng ngalluoedd dysgu a chof y llygod model heneiddio a achosir gan Gyfreithiol.

Yna fe wnaethom ddadansoddi'r gwahaniaethau yn helaethrwydd a chyfansoddiad ffyla microbaidd y perfedd, genera, a rhywogaethau yn samplau fecal y grwpiau Mod a WT o lygod gan ddefnyddio data dilyniannu RNA ribosomaidd 16S (rRNA) o samplau fecal. Y fflora coluddol pennaf yn llygod grŵp WT a Mod oedd Firmicutes a Bacteroides. Fodd bynnag, gostyngwyd helaethrwydd Bacteroides yn sylweddol a chynyddwyd helaethrwydd Firmicutes yn sylweddol yn y grŵp Mod o'i gymharu â'r grŵp WT (Ffigur 2A). Nesaf, gwnaethom gynnal dadansoddiad gwahaniaethol llinol (LDA) i bennu sgoriau maint effaith LDA (LEfSe) ac yna profion Kruskal-Wallis a Wilcoxon i werthuso digonedd cymharol gwahanol dacsa yn y llygod grŵp WT a Mod. Dangosir y canlyniadau LDA yn Ffigur 2B. Ar ben hynny, rydym yn adeiladu cladograms yn dangos gwahaniaethol cyfoethogi genera amrywiol a rhywogaethau sy'n perthyn i'r Bacteriodes a Firmicutes ffyla yn y WT a grwpiau model (Ffigur 2C). Yn gyffredinol, dangosodd ein canlyniadau nam ar allu gwybyddol a dysbiosis microbaidd y perfedd yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-galactose.

manteision iechyd cistanche: gwrth-ocsidiad

Mae triniaeth CDPS yn gwella gallu gwybyddol yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-gal

Fe wnaethom ddadansoddi a yw triniaeth CDPS yn lliniaru dirywiad gwybyddol mewn llygod model heneiddio a achosir gan D-gal. Yn ystod 2 fis y weinyddiaeth, mesurwyd pwysau'r corff bob yn ail ddiwrnod. Roedd pwysau corff y model a grwpiau CDPS o lygod yn debyg (Ffigur 3A). Cynnal arbrofion ymddygiadol ar ôl y dos olaf. Dangosodd canlyniadau adnabod gwrthrychau newydd a phrofion drysfa ddŵr Morris fod cof tymor byr yn sylweddol uwch yn y grwpiau CDPS o lygod o'i gymharu â'r grŵp model o lygod; roedd cof hirdymor yn y grŵp CDPS o lygod yn uwch ond yn ystadegol ddibwys o'i gymharu â'r grŵp model o lygod (Ffigur 3B, 3C). Roedd hyn yn awgrymu bod triniaeth CDPS yn atal colli cof adnabod gwrthrychau tymor byr mewn llygod a gafodd eu trin â D-gal.

Gwerthuswyd dysgu gofodol a chof y llygod hyn gan brawf drysfa ddŵr Morris, a dangosodd y canlyniadau fod amseroedd cêl dianc grŵp llygod CDPS yn debyg i grŵp llygod WT ac yn sylweddol fyrrach na llygod grŵp y Mod (Ffigur 3D) . At hynny, roedd amseroedd hwyrni dianc yn sylweddol is ar y chweched diwrnod ar ôl gweinyddu'r CDPS o gymharu â'r grŵp model (Ffigur 3E). Roedd yr amser nofio o fewn y cwadrant targed yn sylweddol uwch yn y grwpiau CH a CM o gymharu â'r grŵp model. Mae'r grŵp CL yn uwch na'r grŵp model ond nid oes iddo arwyddocâd ystadegol (Ffigur 3F). At hynny, roedd nifer y croesfannau platfform yn sylweddol uwch yn y grwpiau CM a CL o gymharu â'r grŵp model. Fodd bynnag, mae'r grŵp CH yn uwch na'r grŵp model ac nid oes iddo arwyddocâd ystadegol (Ffigur 3G). Dangosodd y canlyniadau hyn fod triniaeth CDPS wedi gwella dysgu gofodol a chof yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-gal.

Ffigur 1. Mae rhoi D-galactos am gyfnod hir yn arwain at nam dysgu a chof mewn llygod.

Ffigur 2. Mae rhoi D-galactos am gyfnod hir yn achosi dysbiosis microbaidd yn y perfedd mewn llygod.

Mae triniaeth CDPS yn adfer homeostasis o gyfansoddiad microbiota'r perfedd yn y llygod model D-galactos-heneiddio

Monosacaridau a polysacaridau yw'r maetholion hanfodol sydd eu hangen ar gyfer twf bacteria [18-21]. Adroddir hefyd bod CDPS yn rheoleiddio cyfansoddiad microbiota perfedd [22]. Felly, dadansoddwyd a oedd triniaethau CDPS yn lleddfu dysbiosis microbaidd y perfedd yn y grŵp model llygod trwy werthuso data dilyniant rRNA16S o samplau feces o'r grwpiau llygod WT, model, a CDPS.

Yn gyntaf, fe wnaethom gyfrifo mynegeion amrywiaeth alffa i werthuso cyfoeth microbiota fecal cyffredinol a gwahaniaeth strwythurol ymhlith y grwpiau hyn. Fe wnaethom ddadansoddi mynegeion amrywiaeth alffa (-amrywiaeth) fel gwerthoedd mynegai rhywogaethau a arsylwyd, Shannon, Chao 1, ACE, a Simpson i bennu newidiadau yng nghyfansoddiad rhywogaethau bacteriol amrywiol yn samplau feces o grwpiau gwahanolmurine. Roedd y mynegeion -amrywiaeth (rhywogaethau a arsylwyd, mynegeion Shannon, Chao 1, ACE, a Simpson) yn uwch yn y grwpiau llygod WT a CDPS o gymharu â'r grŵp model, ond dim ond ar gyfer gwerthoedd mynegai Chao 1 rhwng y CM y gwelwyd arwyddocâd ystadegol. grŵp a grŵp Mod. Nododd fod gweinyddu gyda CDPS yn cynyddu cyfoeth microbiome (Ffigur 4A-4E). Nesaf, fe wnaethom ddadansoddi - mynegeion amrywiaeth i nodi gwahaniaethau yn y rhywogaethau microbaidd perfedd rhwng y grwpiau llygod WT, model, a CDPS gan ddefnyddio Graddio Amlddimensiwn Anfetrig (NMDS), Dadansoddiad Prif Gyfesurynnau (PCoA), a Dadansoddi Prif Gydran (PCA) . Dangosodd PCA amrywiadau yng nghyfansoddiad microbaidd perfedd llygod y grŵp model yn ystod y broses heneiddio, gan gynnwys lleihau dimensiwn a chynnal patrymau a thueddiadau (Ffigur 4F). Nodwyd y gwahaniaethau yn y microbiota fecal rhwng y grwpiau WT, model, a CDPS yn seiliedig ar PCoA o'r pellteroedd UniFrac heb eu pwysoli ar gyfer y genynnau rRNA 16S (Ffigur 4G). Dangosodd dadansoddiad clystyru wahaniaethau sylweddol yn NMDS rhwng y grŵp model a'r grwpiau WT a CDPS (Ffigur 4H).

Gwerthuswyd ffyla 10 uchaf microbiota'r perfedd gennym a chanfod bod digonedd y ffyla Bacteroides yn sylweddol uwch yn y grwpiau CH, CM, a CL o gymharu â'r grŵp model (Ffigur 4I). Roedd hyn yn awgrymu bod CDPS yn adfer homeostasis microbiota'r perfedd mewn llygod wedi'u trin â D-gal. Roedd y cladograms yn dangos cyfoethogiad gwahaniaethol o wahanol fathau o genera a rhywogaethau sy'n perthyn i Bacteriodes a Firmicutes ffyla yn y WT, model, a'r grwpiau CDPS (Ffigur 4J). Fel y dangosir yn y mapiau gwres, gostyngodd triniaethau CDPS helaethrwydd cymharol Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria anhysbys, Fusobacteriia, ac Elusimicrobia anhysbys a chynyddodd niferoedd cymharol Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, heb eu nodi_Deferribacteres, Analytica, Analytica. ,Erysipelotrichia, a_Cyanobacteria anhysbys o gymharu â'r grŵp model (Ffigur 4K). Dangosodd y canlyniadau hyn fod triniaeth CDPS wedi adfer homeostasis microbiota'r perfedd yn sylweddol mewn llygod model heneiddio a achosir gan D-gal.

Ffigur 3. Mae triniaeth CDPS yn gwella dysgu a chof yn y llygod model heneiddio D-gal.

Mae triniaeth CDPS yn lleddfu niwroddirywiad yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-gal trwy leihau straen ocsideiddiol

Aethom ati nesaf i ddadansoddi effeithiau CDPS ar lid trwy ddadansoddi lefelau serwm cytocinau pro-lid (IL-2 a TNF- ), a chytocinau gwrthlidiol (IL-4 ac IL-10). ) mewn gwahanol grwpiau o lygod. Roedd lefelau serwm IL-2 a TNF- yn sylweddol is ac roedd lefelau serwm IL-4 ac IL-10 yn sylweddol uwch yn y grwpiau CH, CM, a CL o gymharu â'r model grwp. Dangosir bod gan CDPS effeithiau gwrthlidiol (Ffigur 5A-5D).

Mae straen ocsideiddiol yn cael ei achosi gan y cynhyrchiad cynyddol o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) ac mae'n un o'r prif ffactorau sy'n hyrwyddo heneiddio [23]. Felly, dadansoddwyd effeithiau CDPS ar straen ocsideiddiol yn y model llygoden heneiddio a achosir gan D-gal trwy werthuso lefelau serwm yr ensym gwrthocsidiol, SOD, a'r cynnyrch perocsidiad lipid, malondialdehyde (MDA). Roedd lefelau serwm MDA yn sylweddol uwch a gostyngwyd lefelau serwm SOD yn sylweddol yn y grŵp Mod o'i gymharu â'r grŵp WT, ond, roedd triniaeth CDPS yn gwrthdroi'r effeithiau hyn (Ffigur 5E, 5F). Dangosodd y canlyniadau hyn fod straen ocsideiddiol yn uwch yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-gal, ond cafodd ei leihau gan driniaeth CDPS.

At hynny, fe wnaethom asesu'r lefelau straen ocsideiddiol ym meinweoedd yr ymennydd trwy ddadansoddi lefelau'r cynnyrch protein ocsidiedig datblygedig (AOPP), perocsidiad lipid uniongyrchol (LPO), ac MDA yn ogystal â gweithgareddau ensymau gwrthocsidiol fel glutathione peroxidase (GSH-Px ) a superoxide dismutase (SOD) ym meinwe'r ymennydd homogenadau. Dangosodd ymennydd llygod grŵp Mod weithgareddau llai sylweddol o SOD a GSH-PX a lefelau uwch o AOPP, LPO ac MDA o'u cymharu â'r grŵp WT, ond cafodd yr effeithiau hyn eu gwrthdroi yn y grŵp CH, CM, a CL (Ffigur 6A - 6E).

At hynny, gwnaethom staenio rhannau o'r ymennydd yn histolegol gyda staeniau H&E a Nissl i asesu effeithiau amddiffynnol CDPS ar ymennydd llygod model heneiddio a achosir gan D-gal. Dangosodd llygod grŵp Mod ostyngiad sylweddol yn y niferoedd a chyfaint niwronau, mwy o fwlch rhwng niwronau, trefniant afreolaidd o niwronau, a pyknosis niwclear yn rhanbarth CA1 hippocampus o'i gymharu â'r grŵp WT, ond gostyngwyd y newidiadau patholegol hyn yn sylweddol gan driniaethau CDPS. Ffigur 6F). Dangosodd y canlyniadau hyn fod triniaethau CDPS wedi lleihau straen ocsideiddiol a phatholeg yr ymennydd yn sylweddol yn y llygod model heneiddio a achosir gan gal D.

Ffigur 4. Mae triniaeth CDPS yn adfer cyfansoddiad microbaidd perfedd yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-galactos.

Mae triniaeth CDPS yn lleihau llid ymylol a straen ocsideiddiol trwy gynnal homeostasis microbaidd yn y perfedd mewn llygod model a achosir gan D-gal

Nesaf, gwnaethom ddadansoddi a oedd y newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd yn gysylltiedig â llid ymylol cynyddol a straen ocsideiddiol yn ystod heneiddio. Tuag at hyn, fe wnaethom ddefnyddio coctel gwrthfiotig triphlyg (grŵp ABX) neu cyclophosphamide (grŵp Cy; gweler hefyd Deunyddiau a dulliau) i abladu microbiota'r perfedd neu ysgogi gwrthimiwnedd yn y llygod model heneiddio a driniwyd gan CDPS. Diddymodd y driniaeth wrthfiotig effeithiau buddiol triniaeth CDPS yn y llygod model sy'n heneiddio. Gwelsom nam ar ddysgu a chof (Ffigur 7A), a newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd (Ffigur 7B, 7C) yn y grŵp ABX llygod o'i gymharu â'r grŵp sy'n cael ei drin gan CDPS. Mae'r canlyniadau uchod yn dangos na all hyd yn oed gweinyddu CDPS gynyddu gallu dysgu a chof llygod ar ôl newid fflora'r coluddion. Ar ben hynny, gwelsom lefelau uwch o cytocinau pro-llidiol yn yr ymennydd a serwm llygod grŵp ABX o'i gymharu â'r grŵp CDPS (Ffigur 7D-7N). Dangosodd canlyniadau'r grŵp ABX a grŵp CY, ar ôl i'r fflora berfeddol a'r swyddogaeth imiwnedd gael eu dinistrio, na allai hyd yn oed gweinyddu CDPS wella gallu dysgu a chof llygod. Roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu bod triniaeth CDPS wedi lleihau llid ymylol, straen ocsideiddiol, a dirywiad gwybyddol yn y llygod model heneiddio a achosir gan Gyfreithiol trwy atal dysbiosis perfedd.

Yna defnyddiwyd y cyffur gwrthimiwnedd, cyclophosphamide [24] i bennu rôl llid yn effeithiau buddiol CDPS. Roedd llygod CDPS a driniwyd â cyclophosphamide (Cy group) yn dangos nam ar allu dysgu a chof, newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd, a lefelau afreolaidd o cytocinau pro-a gwrthlidiol yn yr ymennydd a serwm o'i gymharu â llygod math gwyllt a grŵp CDPS. Fodd bynnag, nid oes unrhyw arwyddocâd o'i gymharu â'r model a'r grŵp ABX. (Ffigur 7A–7N). Mae'r data hyn yn dangos bod newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd yn cynyddu llid ymylol yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-gal.

Ffigur 5. Mae triniaeth CDPS yn modiwleiddio lefelau cylchredeg cytocinau pro-a gwrthlidiol a ffactorau sy'n gysylltiedig â straen ocsideiddiol yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-galactos.

Mae CDPS yn atal heneiddio a achosir gan D-gal trwy reoleiddio metaboledd asid amino

Mae system imiwnedd y gwesteiwr yn cael ei ddylanwadu gan fetabolion a gynhyrchir gan ficrobiota'r perfedd [25]. Mae'r metabolion fecal yn cynrychioli darlleniad swyddogaethol o metaboledd microbaidd y perfedd a chyfansoddiad microbaidd y perfedd[26]. Ar ben hynny, mae metabolion microbiota'r perfedd yn mynd i mewn i gylchrediad y gwaed ac yn effeithio ar fetaboledd ac iechyd y gwesteiwr [26, 27]. Nodwyd cyfanswm o 1058 o fetabolion mewn samplau serwm o lygod FWT, Mod, a CDPS. Yna, gwnaethom ddadansoddi'r metabolion hyn gan ddefnyddioBioCyc, Gwyddoniadur Genynnau a Genomau Kyoto (KEGG), a Chronfa Ddata Metabolome Dynol (HMDB) a chanfod bod 65 o fetabolion wedi'u mynegi'n wahaniaethol yn y grŵp Mod o'i gymharu â'r grŵp WT. Ar ben hynny, canfuom fod lefelau 8 metabolyn (creatinin, valine, L-(-)-Methionine, o-Toluidine, N Ethylaniline, asid wrig, proline, a phenylalanine) yn sylweddol wahanol ymhlith y grwpiau WT, Mod, a CDPS. Dangosodd dadansoddiad cyfoethogi llwybr o'r 8 metabolion hyn gan ddefnyddio MetaboAnalyst [28, 29] fod y metabolion hyn yn gysylltiedig ag arginine, histidine, arginine, proline, a metaboledd purin (Ffigur 8A, 8B). 7 metabolyn gwahanol o grŵp MOD a grŵp CDPS yn y grŵp WT.

Yna fe wnaethom ddadansoddi a oedd newidiadau ym metabolaeth asid amino yn gysylltiedig â newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota'r perfedd. Gwelsom fod 7 metabolyn gwahanol o grwpiau WT, Mod, a CDPS (creatinin, valine, L-(-)-Methionine, o-Toluidine, N-Ethylaniline, asid wrig, a proline) wedi gostwng yn sylweddol yn yr ABX, Cy, a grwpiau Mod o'u cymharu â grwpiau WT a CDPS. At hynny, nid oes unrhyw arwyddocâd rhwng grwpiau ABX a Cy (Ffigur 8C). Yn olaf, er mwyn archwilio mae cydberthynas rhwng metaboledd gwahaniaethol a chlefydau eraill sy'n gysylltiedig â heneiddio. Fe wnaethom ddadansoddi'r gydberthynas rhwng y saith metabolit hyn a fynegwyd yn wahaniaethol a chlefydau dynol gan ddefnyddio cronfa ddata MetaboAnalyst a chanfod bod y metabolion hyn yn gysylltiedig â chlefyd Alzheimer (p=0.00173; Ffigur 8D, 8E). Yn gyffredinol, roedd y data hyn yn awgrymu bod CDPS yn amddiffyn rhag heneiddio a achosir gan D-gal trwy reoleiddio metaboledd asid amino.

Ffigur 6. Mae triniaeth CDPS yn lleihau straen ocsideiddiol yn ymennydd llygod model heneiddio a achosir gan D-galactose

TRAFODAETH

Mae dirywiad cynyddol mewn gweithrediad gwybyddol yn nodwedd nodweddiadol o heneiddio. Dangosodd astudiaethau blaenorol fod triniaeth CDPS wedi gwella dysgu a chof yn sylweddol yn y llygod model heneiddio [30-33]. Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom ddangos bod triniaeth CDPS wedi gwella swyddogaeth wybyddol trwy atal llid ymylol a straen ocsideiddiol trwy adfer homeostasis microbaidd y perfedd yn y llygod model heneiddio a achosir gan D-gal (Ffigur 9). Dangosodd llygod mawr Sprague-Dawley a gafodd eu bwydo â polysacaridau Cistanche fwy o dwf mewn bacteria perfedd buddiol a gwell amrywiaeth microbaidd yn y perfedd [34]. Gwellodd CDA-0.05, polysacarid niwtral Cistanche, dwf Lactobacilli probiotig [22]. Roedd y data hyn yn awgrymu bod polysacaridau Cistanche yn gwella homeostasis bacteria perfedd.

Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom ddangos bod gan CDPS effeithiau gwrthlidiol ac mae'n gwella gallu gwybyddol y llygod model sy'n heneiddio trwy fodiwleiddio digonedd o genynnau bacteriol perfedd fel Bacteroidetes, Firmicutes, a Proteobacteria. Felly, gall CDPs fod o fudd therapiwtig i glefydau sy'n gysylltiedig â heneiddio trwy ail-lunio cyfansoddiad microbiota'r perfedd [35,36]. Ar ben hynny, mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod lefelau cytocinau llidiol yn y serwm a'r colon yn gysylltiedig â digonedd cymharol genera bacteriol fel Bacteroidetes, Firmicutes, a Proteobacteria [37, 38]. Ar ben hynny, mae cyfansoddiad microbaidd perfedd yn rheoleiddio swyddogaeth yr ymennydd trwy fodiwleiddio lefelau cylchredeg sawl cytocin [39-43]. Dangosodd ein canlyniadau fod triniaeth CDPS wedi lleihau'r doreth gymharol o Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria anhysbys, Fusobacteriia, ac Elusimicrobia anhysbys, ac wedi cynyddu digonedd cymharol Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, Deferribacteres, Mollioscutes, Nia anhysbys. Erysipelotrichia, a_Cyanobacteria heb ei nodi.

Mae metabolion microbaidd perfedd yn cael eu rhyddhau i'r llif gwaed ac yn rheoleiddio iechyd a metaboledd y gwesteiwr [26, 27]. Gellir amcangyfrif metabolion microbaidd y perfedd trwy werthuso cyfansoddiad metabolion fecal, sy'n newid gyda newidiadau yng nghyfansoddiad microbau'r perfedd [44]. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod lefelau plasma o citrulline, proline, arginine, asparagine, phenylalanine, a threonine yn gysylltiedig ag anhwylderau niwroddirywiol gan gynnwys clefyd Alzheimer [45, 46]. Dangosodd ein hastudiaeth fod lefelau serwm creatinin, valine, L-methionine, o-Toluidine, N ethylaniline, asid wrig, a phroline yn gysylltiedig â heneiddio a achosir gan D-gal mewn llygod.

Dyfyniad Cistanche: clefyd gwrth-Alzheimer

Mae breichiau cynhenid ​​​​ac addasol y system imiwnedd yn chwarae rhan arwyddocaol wrth gynnal homeostasis lletyol-microbaidd yn yr arwyneb luminal berfeddol [47]. Mae microbiota berfeddol hefyd yn chwarae rhan arwyddocaol wrth reoleiddio'r system nerfol ganolog (CNS) ac imiwnedd trwy ryddhau cytocinau a metabolion i'r llif gwaed [48, 49]. Mae'r cytocinau pro-llidiol yn chwarae rhan allweddol mewn sawl clefyd niwroddirywiol [50-52]. Er enghraifft, mae dirywiad macwlaidd sy'n gysylltiedig ag oedran (AMD) a glawcoma yn gysylltiedig â chroniad allgellog o amyloid (A ) a dyddodiad mewngellol o tau hyper-ffosfforylaidd (p tau) a haearn yn y celloedd ganglion retinol (RGC) [44]. Ar ben hynny, mae llid yn chwarae rhan sylweddol mewn pathogenesis sy'n gysylltiedig â glawcoma [53]. Mae nam ar y golwg yn symptom cynnar o glefyd Alzheimer (AD) ac fe'i hamlygir cyn dechrau dirywiad gwybyddol [54]. Dangosodd ein hastudiaeth fod CDPS yn amddiffyn rhag dirywiad gwybyddol a llid ymylol trwy gynnal homeostasis microbiota'r perfedd.

Mae nifer o gyfyngiadau i'r astudiaeth hon. Yn gyntaf, nid yw'r berthynas rhwng metaboledd asid amino a chyfansoddiad microbiota'r perfedd yn hysbys iawn. Yn ail, nid yw cyfansoddiad a strwythur moleciwlaidd CDPS yn hysbys. Felly, mae angen astudiaethau yn y dyfodol i archwilio ymhellach rôl reoleiddiol CDPS wrth liniaru TA trwy echel signalau microbiota-ymennydd perfedd.

I gloi, dangosodd ein hastudiaeth fod CDPS wedi gwella gallu gwybyddol mewn llygod model heneiddio a achosir gan D-gal trwy adfer homeostasis microbiota perfedd, a thrwy hynny adfer anghydbwysedd asid amino, llid ymylol, a straen ocsideiddiol. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod CDPS yn therapiwtig posibl i gleifion ag anhwylderau dysgu a chof, yn enwedig y rhai sy'n gysylltiedig â dysbiosis y perfedd.

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Paratoi CDPS

Cafodd tua 1.0 kg o Cistanche deserticola wedi'i lanhau ei awyrsychu yn y ffwrn ar 40 gradd C a'i falurio'n bowdr crai. Echdynnwyd y powdr mewn ethanol poeth am 3 h. Hidlo'r gweddillion trwy rhwyllen i dynnu'r hidlif ac yna ei wanhau â dŵr (8X) a'i adlifo'n ddilyniannol am 2 h, 1.5 h, ac 1 h ar 90 gradd C. Ar bob pwynt amser, cafodd yr hydoddiant ei allgyrchu i wahanu'r uwchnatur a wedi'i gyfuno â'r hidlydd brown-goch. Yna, cafodd yr hidlydd ei grynhoi o dan bwysau llai, ei oeri i dymheredd yr ystafell, ei ychwanegu'n araf at 95 y cant ethanol (3X), a'i ganiatáu i sefyll ar 4 gradd C am 24 h. Yna, cafodd yr hydoddiant ei allgyrchu ar 6000 r / min am 20 munud ar 4 gradd C. Casglwyd y gwaddod ar ôl echdynnu dŵr dro ar ôl tro a dyddodiad alcohol deirgwaith. Cafodd y gwaddod ei ailgyfansoddi mewn dŵr, ei ddadbroteineiddio, ei ddialyzed, a'i rewi-sychu i gael polysacarid Cistanche deserticola crai (CDPs). Roedd y cynnwys polysacarid yn fwy na 90 y cant fel y'i gwerthuswyd gan sbectrophotometreg uwchfioled.

dyfyniad cistanche

Grwpio anifeiliaid a thriniaethau

Prynwyd llygod Kunming gwrywaidd wyth wythnos oed (Trwydded SCXK Rhif.2019-0010) oddi wrth SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, Tsieina), mewn ystafell a reolir gan olau a thymheredd, a'u bwydo â bwyd a dŵr. Cynhaliwyd yr holl arbrofion anifeiliaid yn unol â phrotocolau a gymeradwywyd gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol Feddygol Inner Mongolia. Cynhaliwyd yr arbrofion yn unol â Chanllaw'r Sefydliad Cenedlaethol dros Iechyd (NIH) ar gyfer Gofalu a Defnyddio Anifeiliaid Labordy.

Ar ôl addasu 1 wythnos i'r amgylchoedd newydd, rhannwyd 120 o lygod i'r 7 grŵp canlynol: (1) rheoli math gwyllt (WT); grŵp model (150 mg/Kg/dydd D-gal; Mod); (3) CH: D-gal ynghyd â 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal ynghyd â 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal ynghyd â 25 mg/kg CDPS; (6) Grŵp ABX: gwrthfiotigau ynghyd â D-gal ynghyd â CDPS 50 mg/Kg; (7) Cy grŵp: cyclophosphamide ynghyd â D-gal ynghyd â 50mg/kg CDPS.

Derbyniodd y llygod o'r grwpiau model, ABX, Cy, a CDPS bigiadau isgroenol o 150 mg/kg D-gal wedi'i doddi â halwyn bob dydd am 2 fis. Chwistrellwyd y grŵp WT yn isgroenol gyda chyfaint cyfartal o halwynog am 2 fis. Roedd llygod grŵp CDPS hefyd yn cael eu rhoi bob dydd gyda phigiadau intragastrig yn cynnwys 100 mg/kg, 50 mg/Kg neu 25 mg/Kg CDPS am 2 fis. Derbyniodd llygod y grŵp ABX ddŵr yfed gyda 0.1 mg/mL ampicillin a 0.5 mg/mL streptomycin am 2 fis yn ogystal â phigiadau D-gal a CDPS. Cyn rhoi D-gal, derbyniodd y llygod bigiadau yn cynnwys 0.1 mg / mL ampicillin, 0.5 mg / mL streptomycin, a 0.1 mg / mL colistin am 7 diwrnod yn y grŵp ABX. Derbyniodd llygod grŵp Cy bigiadau mewnperitoneol o 20 mg/Kg cyclophosphamide bob yn ail ddiwrnod (qod) am 2 fis yn ogystal â phigiadau dyddiol o D-gal a CDPS.

Prawf adnabod gwrthrych newydd

Cynnal arbrofion ymddygiadol ar ôl y dos olaf. Roedd y prawf adnabod gwrthrychau yn cynnwys camau ymgyfarwyddo, hyfforddi a phrofi. Yn ystod y cam ymgyfarwyddo, cafodd llygod eu cadw mewn siambr brofi wag am 10 munud am ddau ddiwrnod. Yna, ar y trydydd diwrnod (diwrnod hyfforddi), gosodwyd dau wrthrych o'r un maint, siâp a lliw (A1 ac A2) ar ddau ben y siambr. Yna rhoddwyd 10 munud i bob llygoden archwilio'r ddau wrthrych tebyg. Ar ôl 1-awr (ar y trydydd diwrnod) a 24-awr (ar y pedwerydd diwrnod) cyfnodau hyfforddi-i-brofi, disodlwyd un o'r gwrthrychau tebyg (A1 neu A2) â B neu C gwrthrych sy'n wahanol o ran maint, lliw a siâp ar ddiwrnod y prawf. Yn ystod y cam profi, profwyd pob llygoden am 5 munud a chyfrifwyd y mynegai ffafriol i bennu cof adnabod gwrthrych newydd (B neu C) gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol: Mynegai ffafriol=Amser ar wrthrych B neu C/ (Amser ar wrthrych B neu C ynghyd ag Amser ar wrthrych A) × 100 y cant .

Prawf dwr drysfa Morris

Cynhaliwyd prawf drysfa ddŵr Morris mewn pwll crwn a oedd yn 45 cm o ddyfnder a 90 cm mewn diamedr. Mae'r protocol a ddisgrifiwyd gan Ruediger S, et al. (2011) [55] a Wood RA, et al. (2018) [56] yn gyflogedig yma. Dyfnder y dŵr yn y pwll oedd 30 cm, a thymheredd y dŵr oedd 20 ± 1 gradd C. Roedd y platfform yn 6 cm mewn diamedr ac 1cm o dan y dŵr. Yr amser ar gyfer hyfforddi a phrofi oedd 60 s yr un. Ar gyfer hyfforddiant, fe wnaethom gynnal pedwar treial o 60 s yr un gyda llwyfan cudd bob dydd am bum diwrnod di-dor. Os na ddarganfuwyd y platfform gan y llygod mewn 60 s, cawsant eu harwain i'r platfform a'u gosod ar y platfform am 5 s. Yn ystod y cam profi, cofnodwyd a dadansoddwyd yr hwyrni i gyrraedd y llwyfan cudd mewn sesiynau prawf hyfforddi a phrofi, nifer y croesfannau dros leoliad y platfform a dynnwyd, a'r amser a dreuliwyd yn y cwadrant targed (llwyfan).

Profion ELISA

Dadansoddwyd lefelau serwm cytocinau pro-llidiol megisIL-2(), IL-4, IL-10, a TNF- ar gyfer pob grŵp o lygod gan ddefnyddio citiau ELISA a brynwyd o Shanghai Yi Li Technoleg Biolegol Co, Ltd (Shanghai, Tsieina) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Dadansoddwyd gweithgaredd yr ensym gwrthocsidiol, superoxide dismutase (SOD), a lefelau cynnyrch perocsidiad lipid, malondialdehyde (MDA), yn serwm pob grŵp o lygod gan gitiau assay a brynwyd gan Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng (Nanjing, Tsieina) . Amcangyfrifwyd lefelau cynhyrchion protein ocsideiddio uwch (AOPP) yn y samplau hippocampus murine gan ddefnyddio pecyn ELISA gan Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, Tsieina) yn ôl cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Amcangyfrif o straen ocsideiddiol mewn ymennydd murine

Fe wnaethom homogeneiddio meinwe hippocampus 10 0 mg gyda halwynog wedi'i oeri iâ 0.9 ml a chafodd y homogenad ei allgyrchu ar 12000 rpm am 30 munud ar 4 gradd C. Dadansoddwyd y cynnwys protein yn y supernatant gan ddefnyddio Pecyn Assay Protein BCA ( Beyotime Biotechnology, Shanghai, Tsieina). Dadansoddwyd lefelau perocsidiad lipid (LPO) a malondialdehyde (MDA), a gweithgareddau GSH-Px a SOD yn y samplau hippocampus yn ôl lliwimetreg gan ddefnyddio citiau o Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng (Nanjing, Tsieina) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Ychwanegiad cistanche: yn gwella cof

Cyfansoddiad microbiota perfedd

Casglwyd samplau fecal o'r holl lygod a'u storio ar unwaith ar -80 gradd C. Cafodd rhanbarth V3 plus V4 o'r genyn rRNA 16S ei ddilyniannu gan ddefnyddio Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, Tsieina) a'i ddadansoddi gan ddefnyddio'r QIIME llwyfan agored i bennu proffiliau microbiota'r perfedd.

Dadansoddiad LC/MS o fetabolion serwm

Deorwyd samplau serwm am 10 munud gyda methanol wedi'i oeri ymlaen llaw mewn cymhareb o 1:3 i waddodi'r proteinau. Cafodd y samplau eu centrifugio ar 12000r/munud am 15 munud ar 4 gradd C. Dadansoddwyd y supernatants gan Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Cromatograffaeth Hylif Cydraniad Cyflym a sbectrwm màs QExactive. Dangosir yr amodau cromatograffig yn Nhabl 1. Gwahanwyd y dadansoddiadau mewn colofn gromatograffig XBridge BEH Amide (2.1 × 100 mm; Waters Co., Aberdaugleddau, MA, UDA) gan ddefnyddio 0.1 y cant o asid fformig ac asetonitrile fel cyfnodau symudol A a B. , yn y drefn honno. Gosodwyd y gyfradd llif ar 0.4 ml/munud, cyfaint y pigiad oedd 5 µl, a gosodwyd tymheredd y golofn ar 25 gradd C (Tabl 1). Cafwyd y signalau sbectrwm màs gan ddefnyddio'r moddau sganio ïon positif a negyddol. Dangosir y foltedd chwistrellu ïon a pharamedrau MS penodol eraill yn Nhabl 2.

Dadansoddiad ystadegol

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 a t< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">