Mae Clec12a yn Tymheru Llid Tra'n Cyfyngu ar Ehangu Cymesuredd Colitogenig
Dec 29, 2023
CRYNODEB
Mae rheoleiddio'r microbiota yn hanfodol i iechyd berfeddol ond mae'r mecanweithiau a ddefnyddir gan imiwnedd cynhenid yn parhau i fod yn aneglur. Yma rydym yn dangos bod llygod sy'n ddiffygiol yn y derbynnydd C-Type-lectin, Clec12a wedi datblygu colitis difrifol, a oedd yn dibynnu ar y microbiota. Datgelodd astudiaethau trawsblannu fecal-microbiota (FMT) i lygod di-germ microbiota colitogenig a ffurfiwyd o fewn llygod Clec12a-/- a gafodd eu nodi gan ehangiad yr organeb gram-bositif, cnofilod Faecalibaculum. Roedd triniaeth gyda F. rodentium yn ddigon i waethygu colitis mewn llygod math gwyllt. Mae macroffagau yn y coludd yn mynegi'r lefelau uchaf o Clec12a. Datgelodd dadansoddiad cytocin a dilyniannu mewn macroffagau Clec12a-/- llid uwch ond gostyngiad amlwg mewn genynnau sy'n gysylltiedig â ffagocytosis. Yn wir, mae nam ar allu Clec12a-/- macroffagau i gymryd F. rodentium. Roedd gan Clec12a wedi'i buro rwymo uwch i organebau Gram-bositif fel F. rodentium. Felly, mae ein data yn nodi Clec12a fel mecanwaith gwyliadwriaeth imiwnedd gynhenid i reoli ehangu commensalau a allai fod yn niweidiol heb lid amlwg.
manteision cistanche ar gyfer dynion-cryfhau system imiwnedd
RHAGARWEINIAD
Gall cyfansoddiad a swyddogaeth y microbiota gael effaith ddofn ar iechyd a chlefydau mamaliaid (Fassarella et al., 2021). Mae hyn wedi'i ddogfennu'n dda ar gyfer clefyd llidiol y coluddyn (IBD), lle mae'r rhan fwyaf o fodelau llygoden o IBD yn sensitif i newidiadau yng nghyfansoddiad microbiota (Gkouskou et al., 2014). Bydd deall y ffactorau sy'n dylanwadu ac yn cyfarwyddo sefydlogrwydd microbiota yn bwysig wrth i therapïau sy'n seiliedig ar ficrobiota gael eu datblygu (Sharma et al., 2020; Sorbara a Pamer, 2022). Mae paramedrau lluosog yn dylanwadu ar y microbiota gan gynnwys diet, meddyginiaethau, a'r system imiwnedd. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, dangoswyd bod cydrannau imiwn addasol, yn enwedig IgA, yn dylanwadu ar gyfansoddiad microbiota (Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang a Palm, 2020). Fodd bynnag, mae llai yn hysbys am sut mae derbynyddion imiwnedd cynhenid penodol yn dylanwadu ar gyfansoddiad microbiota homeostatig.
Mae polymorphisms genetig mewn genynnau sy'n rheoleiddio adnabyddiaeth microbaidd ac imiwnedd mwcosaidd yn alelau risg sylweddol ar gyfer IBD, gan gynnwys y protein awtoffagy ATG16L1 (Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007; ). Mewn astudiaeth ddiweddar sy'n archwilio newidiadau mynegiant genynnau myeloid mewn unigolion â'r polymorphism ATG16L1T300A, nodwyd bod y derbynnydd lectin ataliol math C (CLR), Clec12a, wedi'i atal yn sylweddol yn y celloedd hyn (Begun et al., 2015). Dangosodd yr un astudiaeth hon fod Clec12a yn gweithredu i amddiffyn haint pathogenig trwy gysylltiad â'r llwybr awtophagi. Mae'r data hyn yn awgrymu y gallai is-reoleiddio Clec12a mewn unigolion ag IBD ddylanwadu ar ddifrifoldeb a/neu ddatblygiad y clefyd. Er gwaethaf y dystiolaeth hon, ychydig a wyddys am y mecanweithiau rheoleiddio imiwnedd a ddefnyddir gan Clec12a yn ystod colitis.
Mae lectinau math-C yn grŵp amrywiol o foleciwlau hydawdd neu bilen sy'n gallu rhwymo lipidau, proteinau a charbohydradau sy'n deillio o letyol neu ficrobaidd (Brown et al., 2018). Mae Mincle (Clec4e) a Dectin-1 (Clec7a) yn ddau CLR sy'n dylanwadu ar aelodau penodol o'r microbiota i gynnal homeostasis berfeddol (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Fodd bynnag, gyda dros 1,000 lectinau math C gwahanol, mae llawer i'w ddarganfod o hyd yn y teulu protein hwn. Mae Clec12a yn perthyn i'r teulu derbynnydd lladdwr naturiol ac mae'n un o ddim ond dau lectin math C sy'n cynnwys motiff ataliol imiwn-tyrosin (ITIM) sy'n gallu cyfyngu ar lwybrau signalau llidiol (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Mae Clec12a yn adnabod asid wrig sy'n arwydd o niwed cellog (Neumann et al., 2014). Mae Clec12a wedi'i fynegi fwyaf mewn celloedd imiwnedd cynhenid, ac mewn neutrophils mae'n gweithredu i leihau actifadu a lleihau cynhyrchiant cytocinau llidiol ar adnabyddiaeth asid wrig (Neumann et al., 2014). I'r gwrthwyneb, mae Clec12a yn hyrwyddo llid trwy ganiatáu trawsfudo ffagosytau mono-niwclear (MNPs) ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd yn ystod model hunanimiwn o sglerosis ymledol a signalau interfferon math I potentiating mewn ymateb i haint firaol (Li et al., 2019; Sagar et al ., 2017). Mae Clec12a hefyd yn gallu adnabod y cynnyrch plasmodial, hemozoin, y dangoswyd ei fod yn cynyddu celloedd CD8+ T yn yr ymennydd yn dilyn haint Plasmodium (Raulf et al., 2019). Felly, mae Clec12a yn cynrychioli CLR anwastad gydag amrywiaeth o rolau mewn imiwnedd a galluoedd signalau unigryw, ond nid yw ei rôl yn y coluddyn yn hysbys o hyd.
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
Rydym wedi dangos yn flaenorol bod ffyngau perfedd penodol yn gwaethygu colitis trwy gymell y metabolit purin, asid wrig (Chiaro et al., 2017). Ar ben hynny, roedd metaboledd purin yn gysylltiedig yn ddiweddar â chlefyd berfeddol dynol (Zhu et al., 2019). Mae'r data hyn gyda'i gilydd yn awgrymu y gallai canfod asid wrig fod yn berthnasol i IBD. Yn seiliedig ar hyn, aethom ati i archwilio swyddogaeth Clec12a yn y coluddyn. Gwelsom fod anifeiliaid â diffyg Clec12a yn agored iawn i golitis sy'n dibynnu ar y cyfansoddiad microbiota a ffurfiwyd yn absenoldeb Clec12a. Roedd FMT o Clec12a-/- microbiota i mewn i anifeiliaid di-germ WT yn ddigon i waethygu colitis ac mae ffurfio'r microbiota colitogenig mewn anifeiliaid Clec12a-/- yn annibynnol ar imiwnedd addasol. Er mwyn nodi microbau perthnasol a allai waethygu colitis, cafodd anifeiliaid Clec12a-/- eu trin ag amrywiol wrthfiotigau, a'r rhai a dargedodd glefydau lleddfu bacteria gram-bositif. 16S canfu dilyniannu rDNA fod Faecalibaculum rodentium yn llawer mwy niferus mewn anifeiliaid Clec12a-/- ac roedd gavage F. rodentium yn y geg yn ddigon i waethygu patholeg clefyd mewn anifeiliaid WT. Datgelodd proffilio imiwnedd anifeiliaid Clec12a-/- ostyngiad amlwg mewn celloedd myeloid homeostatig yn y colon. Datgelodd dilyniant RNA o F. macroffagau wedi'u trin â rodentium fod Clec12a yn hyrwyddo ffagocytosis. Gan y dangoswyd bod Clec12a yn rhwymo ligandau lluosog, gofynnwyd a fyddai Clec12a yn rhwymo aelodau amrywiol o'r microbiota. Gan ddefnyddio protein ymasiad Clec12a-Fc rydym yn nodi bod Clec12a yn rhwymo aelodau gram-bositif y microbiota fwyaf. Gyda'i gilydd mae'r data hyn yn awgrymu model lle mae Clec12a yn rheoli aelodau colitogenig o'r microbiota trwy rwymo uniongyrchol a ffagocytosis tra'n atal ymatebion llidiol. Mewn senarios lle mae mynegiant Clec12a yn cael ei leihau, gall pathobiontau gram-bositif ehangu a hyrwyddo llid. Felly, mae ein hastudiaethau'n nodi Clec12a fel atalydd llidiol pwysig i sicrhau homeostasis a chynnal microbiota iach.
CANLYNIADAU
Clec12a-/- mae anifeiliaid yn agored iawn i golitis yn annibynnol ar y system imiwnedd ymaddasol
Mae mynegiant llai o Clec12a wedi'i adrodd mewn unigolion ag IBD ac rydym wedi dangos y gall rhwystro cynhyrchu un o'r ligandau ar gyfer Clec12a, asid wrig, leddfu colitis (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). Fodd bynnag, nid yw Clec12a wedi'i astudio eto mewn modelau colitis anifeiliaid. I'r perwyl hwn, heriwyd llygod WT a Clec12a-/- C57BL/6 gyda cholitis DSS acíwt. Collodd anifeiliaid Clec12a-/- lawer mwy o bwysau, arddangos colonau byrrach, a chafwyd cynnydd sylweddol yn y marciwr llidiol LCN2 mewn feces o'i gymharu ag anifeiliaid WT, gan nodi llid a chlefyd wedi gwaethygu (Ffigur 1A-C). I gefnogi hyn, datgelodd dadansoddiad histolegol fwy o ddifrod epithelial, colli crypt, a mewnlifiad o gelloedd imiwnedd mewn anifeiliaid Clec12a-/- o'i gymharu â WT (Ffigur 1D, E). Yn gyson â'r canlyniadau yn y model colitis DSS, trosglwyddo celloedd CD4+ CD45RBhi i TCRb-/-; Arweiniodd Clec12a-/- llygod dwbl at ennill llai o bwysau dros amser a cholonau byrrach o'u cymharu â chelloedd T a drosglwyddwyd i lygod TCRb-/- (Ffigur 1F, G). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod colli Clec12a yn arwain at waethygu clefyd y coluddion.
Dywedir bod Clec12a wedi'i fynegi'n bennaf o fewn celloedd imiwnedd cynhenid gyda mynegiant isel iawn wedi'i adrodd mewn celloedd CD8+ T. Felly, i benderfynu a yw imiwnedd addasol yn gysylltiedig â'r afiechyd gwaeth a welwyd mewn anifeiliaid Clec12a-/-, croeswyd anifeiliaid Clec12a-/- i anifeiliaid Rag-/- i dynnu celloedd T a B. Unwaith eto, gwaethygodd anifeiliaid Clec12a-/- afiechyd o'u cymharu ag anifeiliaid WT wrth iddynt golli mwy o bwysau a chael colonau byrrach na rheolaethau WT (Ffigur 1H, I). Yn yr un modd, Clec12a-/-; Datblygodd Rag-/- afiechyd berfeddol gwaethygu o'i gymharu â rheolyddion Rag-/- a chollodd cymaint o bwysau ac roedd ganddo colonau byrrach na WT a Rag-/- â Clec12a-/- (Ffigur 1H, I). Rydym wedi adrodd yn flaenorol bod triniaeth lafar gyda S. cerevisiae yn cynyddu lefelau asid wrig i waethygu colitis. Fodd bynnag, ni welwyd unrhyw wahaniaethau yn lefelau asid wrig y serwm neu feces mewn anifeiliaid WT yn erbyn Clec12a-/-, sy'n awgrymu nad yw'r clefyd gwell a welwyd yn y Clec12A-/- yn ganlyniad i fwy o asid wrig (Ffig. S1). Felly, mae datblygiad colitis gwaeth a welwyd mewn anifeiliaid Clec12a-/- yn annibynnol ar y system imiwnedd addasol.
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche
【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Mae colitis gwaeth mewn anifeiliaid Clec12a-/- yn dibynnu ar y microbiota
Mae'n hysbys bod colitis yn cael ei yrru, yn rhannol, gan newidiadau i gyfansoddiad y microbiota (Kubinak et al., 2015; Ray a Dittel, 2015). Er mwyn penderfynu a yw anifeiliaid Clec12a-/- yn cynnal microbiota sy'n hybu colitis gwaethygol, perfformiwyd FMTs o WT neu Clec12a-/- llygod i anifeiliaid WT di-germ. Pedair wythnos ar ôl trawsblannu, roedd hanner yr anifeiliaid yn cael eu cyd-gartrefu gyda'i gilydd, tra bod yr hanner arall yn parhau i gael ei roi dan do ar wahân. Yna cafodd colitis DSS acíwt ei achosi ym mhob grŵp (Ffigur 2A). Collodd anifeiliaid a gafodd Clec12a-/- FMT ac anifeiliaid a oedd yn cael eu cyd-gartrefu lawer mwy o bwysau (Ffigur 2B) ac roedd ganddynt colonau sylweddol fyrrach (Ffigur 2C) nag anifeiliaid a gafodd FMT gan lygod WT. Ar ben hynny, datgelodd dadansoddiad histolegol fwy o ddifrod epithelial a mewnlifiad llidiol ar ôl trawsblannu â microbiota Clec12a-/- (Ffigur 2D, E). Roedd y cymunedau microbaidd sefydledig yn wahanol ymhlith y grwpiau fel y'u pennwyd gan ddilyniant genynnau rRNA 16S gan ddefnyddio Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), heb ei bwysoli (PERMANOVA, p=0.0062), ac wedi'i bwysoli- Pellteroedd Unifrac (PERMANOVA, p= 0.0001). Roedd yr annhebygrwydd microbiota o fewn y grŵp ar ei fwyaf mewn anifeiliaid cyd-gartrefu yn ôl yr un metrigau sy'n nodi caffaeliad microbau o bob genoteip FMT (Ffigur 2 FH). Mae'r data hyn yn dangos bod colitis gwaeth o fewn anifeiliaid Clec12a-/- yn cael ei yrru gan ficrobau penodol wedi'u cyfoethogi yn absenoldeb Clec12a; a daeth y microbau hyn yn brif yrwyr ffenoteip colitogenig, hyd yn oed ym mhresenoldeb microbiota WT sefydledig.
Mae cyfansoddiad microbiota a ffurfiwyd mewn anifeiliaid Clec12a-/- yn annibynnol ar imiwnedd addasol
Mae'r system imiwnedd yn bwysig ar gyfer pennu cyfansoddiad y microbiota. Nododd yr arbrawf FMT fod Clec12a-/- yn arwain at newid yng nghyfansoddiad y microbiota sy'n hyrwyddo datblygiad colitis gwaeth. Yn gyntaf, roeddem am benderfynu a oedd diffyg Clec12a-/- yn yr adran imiwnedd yn gallu ail-lunio microbiota'r perfedd. I'r perwyl hwn, trosglwyddwyd mêr esgyrn o WT neu Clec12a-/- llygod i lygod derbynnydd SPF WT a arbelydrwyd yn farwol er mwyn safoni'r microbiota ac yna 8-wythnos o gyfnod ailgyfansoddi imiwnedd (Ffigur 3A). Yn ystod yr amser hwn, mae gan y systemau imiwnedd trawsblanedig amser i ddatblygu o fewn y derbynnydd, gan siapio cyfansoddiad y microbiota yn wahanol. Er mwyn penderfynu a oedd newidiadau procolitogenig i'r microbiota yn deillio o'r cerflun imiwn hwn, fe wnaethom berfformio FMTs gan ddefnyddio'r feces o naill ai WT neu Clec12a-/- llygod chimerig a cholitis DSS ysgogedig (Ffigur 3A). Er na fu unrhyw newidiadau sylweddol o ran colli pwysau (Ffigur 3B), roedd y colonau o anifeiliaid a gafodd FMT gan Clec12a-/- llygod chimerig yn sylweddol fyrrach o gymharu ag anifeiliaid a gafodd y FMT gan lygod WT (Ffigur 3C), gan nodi bod y clefyd wedi gwaethygu. Ar ben hynny, pan oedd derbynwyr WT a Clec12a-/- FMT yn cael eu cyd-gartrefu, roedd y colonau yn sylweddol fyrrach o'u cymharu ag anifeiliaid a gafodd FMT WT (Ffigur 3C). Felly, mae diffyg Clec12a-/- yn yr adran hematopoietig yn arwain at ffurfio microbiota colitogenig dominyddol.
Er mwyn cefnogi ymhellach bod y system imiwnedd addasol yn anhepgor ar gyfer ffurfio'r microbiota colitogenig mewn anifeiliaid Clec12a-/-, gwnaethom berfformio FMT gan ddefnyddio feces o Rag-/- neu Rag- /-; Clec12a-/- - fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Anifeiliaid a gafodd Rag-/-; Collodd Clec12a-/- FMT fwy o bwysau ac roedd ganddo colonau sylweddol fyrrach nag anifeiliaid a oedd wedi cael FMT gan anifeiliaid Rag-/-, ar ben hynny, datblygodd anifeiliaid cyd-gartrefu hefyd afiechyd a oedd yn gwaethygu (Ffigur 3D, E). Mae'r data hyn yn dangos bod diffyg Clec12a yn y system imiwnedd gynhenid yn ddigon i arwain at ffurfio microbiota sy'n gallu gwaethygu colitis.
Mae Clec12a yn atal ehangu Faecalibaculum rodentium
Defnyddiasom gyfres o wrthfiotigau gwahanol i adnabod yr organebau perthnasol sy'n gyrru afiechyd o fewn yr anifeiliaid Clec12a-/-. Yn gyntaf, roedd triniaeth gyda choctel cryf o wrthfiotigau sbectrwm eang sy'n cynnwys erythromycin, ampicillin, neomycin, a gentamycin, wedi lleihau difrifoldeb y clefyd yn sylweddol mewn anifeiliaid Clec12a-/- ac WT, gan awgrymu bod poblogaeth bacteriol y microbiota yn berthnasol ar gyfer afiechyd ( Ffigur 4A; Ffigur S2). Nesaf, fe wnaethom leihau ymhellach pa boblogaethau bacteriol oedd fwyaf perthnasol ar gyfer afiechyd trwy ddefnyddio gwahanol wrthfiotigau i dargedu tacsa bacteria unigryw. Yn benodol, fe ddewison ni gentamycin, aminoglycoside sy'n targedu bacteria gram-negyddol, a cephalothin, sef cephalosporin sy'n targedu bacteria gram-bositif yn bennaf. Rhoddwyd y cyffuriau hyn i anifeiliaid Clec12a-/- yn ystod colitis DSS. Er nad oedd triniaeth â gentamycin yn gwneud unrhyw wahaniaeth o ran difrifoldeb y clefyd, roedd anifeiliaid a gafodd cephalothin yn cynnal eu pwysau ac roedd ganddynt colonau llawer hirach nag anifeiliaid ffug (Ffigur 4B, C), gan nodi bod organebau gram-bositif sy'n byw yn y ddrama microbiota Clec12a-/- rôl bwysig wrth waethygu patholeg clefyd.
Y tro nesaf fe wnaethom berfformio dilyniannu genynnau rRNA 16S o SPF WT a Clec12a-/- feces i broffilio newidiadau cyfansoddiadol yn y microbiota. Roedd anifeiliaid WT a Clec12a-/- wedi'u clystyru'n sylweddol wahanol yn ôl metrigau pwysoliad digonedd nad ydynt yn ffylogenetig a ffylogenetig, Bray-Curtis ac UniFrac pwysol, yn y drefn honno (Ffigur S3A-C). Ni ddatgelodd metrigau amrywiaeth Alpha unrhyw wahaniaethau arwyddocaol mewn cyfoeth (nodweddion a arsylwyd), sy'n nodi nad oedd Clec12a-/- yn cynnwys mwy o rywogaethau (Ffigur 4D). Fodd bynnag, cynyddwyd cyfartaleddau a mynegeion amrywiaeth Shannon yn absenoldeb Clec12a sy’n dangos bod dosbarthiad cyfrannol bacteria mewn llygod Clec12a-/- wedi’i newid (Ffigur 4E, F) ac yn cefnogi ymhellach fod Clec12a yn bwysig ar gyfer rheoleiddio strwythur microbiota yn y perfedd.
Datgelodd dadansoddiad o gyfansoddiad microbiomau (ANCOM), ymhlith yr ASVs (amrywiadau dilyniant amplicon) sy'n doreithiog yn wahanol, fod ASV a ddosbarthwyd yn y genws Faecalibaculum (teulu Erysipelotrichaceae), wedi'i ehangu'n sylweddol o fewn y Clec12a-/- feces o'i gymharu â WT (Ffigur 4G, H). Dangosodd BLAST gan ddefnyddio'r dilyniant cynrychioliadol ASV o'n dadansoddiad hunaniaeth 100% i ddilyniannau o'r bacteria Faecalibaculum rodentium. Mae'r data hyn yn darparu tystiolaeth bod bacteria gram-bositif yn yr anifail Clec12a-/- yn gyfrifol am y ffenoteip colitogenig, ac yn benodol yn ymhlygu'r organeb gram-bositif, F. rodentium, mewn afiechyd sydd wedi gwaethygu.
Yn seiliedig ar hyn, gwnaethom brofi'r ddamcaniaeth y gallai F. rodentium waethygu colitis. Cyn-driniwyd anifeiliaid WT SPF gyda 1 x 108 CFU o naill ai F. rodentium byw neu sefydlog trwy gavage llafar a thriniaeth barhaus bob dydd yn ystod y model acíwt o DSS i sicrhau lefelau uchel o cytrefu F. cnofilod. Collodd anifeiliaid a gafodd F. rodentium byw a sefydlog fwy o bwysau ac roedd ganddynt colonau sylweddol fyrrach nag anifeiliaid wedi'u trin â cherbyd (Ffigur 4I, J), sy'n dangos y gall lefelau uwch o F. rodentium waethygu afiechyd.
Mae Clec12a yn cyfyngu ar ymateb llidiol macrophage wrth wella ffagocytosis
Er mwyn diffinio mynegiant cellog Clec12a yn absenoldeb afiechyd, gwnaethom broffilio celloedd imiwnedd cynhenid ac addasol yn y lamina propria (LP) gan ddefnyddio cytometreg llif aml-liw. Yn gyson ag adroddiadau blaenorol, mae Clec12a wedi'i gyfyngu'n bennaf i'r llinach myeloid heb fawr ddim mynegiant ar lymffocytau (Ffigur 5A) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). Niwtroffiliau berfeddol, macroffagau, a chelloedd dendritic arddangos lefelau tebyg o Clec12a mynegiant (Ffig. S4A), tra bod macroffagau oedd y ganran fwyaf o gelloedd o fewn y meinwe perfedd mynegi Clec12a (Ffigur 5A). O ystyried rôl ddeuol macroffagau i hyrwyddo llid trwy actifadu clasurol ond hefyd i gychwyn mecanweithiau gwneud iawn mewn ymateb i niwed i feinwe, gofynnwyd sut y gallai Clec12a ddylanwadu ar y ddeuoliaeth hon yn ystod colitis. Er bod macroffagau yn eithaf amrywiol, gellir eu rhannu'n fras yn macroffagau llidiol M1 a M2 trwy fynegiant CD38 ac EGR2 yn y drefn honno. Rydym yn dangos Clec12a -/- anifeiliaid wedi cynyddu macroffagau M1 a gostwng M2 macroffagau yn y LP colonig yn ystod colitis (Ffigur 5 B, C, Ffig. S4 B). Mae'r data hyn yn dangos bod Clec12a yn rheoleiddio ymatebion macrophage yn y perfedd.
Er mwyn deall yn well sut mae Clec12a yn dylanwadu ar fioleg macrophage mewn ymateb i ligandau microbaidd, cafodd macroffagau sy'n deillio o fêr esgyrn (BMDMs) wedi'u hynysu o anifeiliaid WT neu Clec12a-/- eu trin ag amrywiaeth o ligandau microbaidd cyffredin gan gynnwys LPS, Pam3CysK, a Flagellin. Perfformiwyd dadansoddiad cytocin ar yr holl samplau hyn. Ni chafodd llawer o'r cytocinau a brofwyd eu hysgogi o dan yr amodau hyn, fodd bynnag, canfuwyd MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a, ac IL-6 yn gyson yn y diwylliannau hyn ( Ffigur 5D). Roedd gan Clec12a-/- BMDMs fynegiant sylweddol uwch o'r cytocinau hyn mewn ymateb i lawer o'r ligandau microbaidd a gwelwyd yr ymatebion gwahaniaethol mwyaf mewn ymateb i'r agonydd TLR2 Pam3CysK. Mae'r data hwn yn gyson â rôl hysbys Clec12a wrth dymheru ymatebion llidiol yn ystod llid di-haint (Neumann et al., 2014).
system imiwnedd sy'n cynyddu planhigion cistanche
Perfformiwyd RNA-seq ar BMDMs o WT neu Clec12a-/- wedi'u trin â F. rodentium i benderfynu sut mae Clec12a yn rheoleiddio ymatebion y celloedd hyn i'r organeb bacteriol benodol hon. Aseswyd yr ymateb gwahaniaethol drwy gymharu Clec12a-/- BMDMs a oedd yn agored i F. rodentium dros reolaethau cerbydau â rhai BMDMs WT. Dangosodd dadansoddiad cyfoethogi o enynnau a fynegwyd yn wahaniaethol fod gan macroffagau diffygiol Clec12a gynnydd sylweddol mewn genynnau sy'n ymwneud â rheoli cylchredau celloedd pan gânt eu herio gyda F. rodentium (Ffigur S5A). Mae cylchred celloedd wedi'i gysylltu'n gynhenid â ffagocytosis a bu gostyngiadau sylweddol hefyd mewn genynnau sy'n gysylltiedig â ffagocytosis a'r ymateb llidiol (Ffigur 5E) (Luo et al., 2005). Yn gyson ag astudiaeth ddiweddar ar Clec12a a Salmonela, mae'r data hyn yn awgrymu bod ffagocytosis yn ddiffygiol yn absenoldeb Clec12a mewn ymateb i'r preswylydd perfedd arferol F. rodentium (Begun et al., 2015). I brofi hyn, casglwyd macroffagau peritoneol o anifeiliaid WT a Clec12a-/- a'u cyd-ddiwyllio â Sybr®-green wedi'i labelu'n F. rodentium. Roedd gan Clec12a-/- macroffagau gryn dipyn yn llai o ficrobau fesul cell (Ffigur 5F, G; Ffigur S5B), sy'n dangos bod diffyg Clec12a yn arwain at lai o organebau'n cael eu cymryd a'i fod yn gyson â llai o ffagocytosis yn y set ddata RNA-seq. Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos bod Clec12a yn chwarae rôl ddeuol o liniaru ymatebion llidiol amlwg i ligandau microbaidd cyffredin tra'n hyrwyddo cymeriant bacteriol macrophage.
Mae Clec12a yn rhwymo'n ffafriol i gymesuredd gram-bositif
Gan fod ffagocytosis yn cael ei gychwyn trwy rwymo microbau ac yna mewnoli a lladd, fe wnaethom ddamcaniaethu bod Clec12a yn gallu rhwymo i aelodau penodol o'r microbiota, fel F. rodentium. Er mwyn mynd i'r afael â'r posibilrwydd hwn, crëwyd protein ymasiad sy'n cynnwys parth rhwymo allgellog murine Clec12a a'r gyfran Fc o IgG1 dynol (Clec12a-Fc) (Ffigur 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf et al., 2019). Cafodd y protein ei buro a'i sgrinio i'w rwymo i banel o facteria gram-bositif a gram-negyddol amrywiol y gwyddys eu bod yn bresennol yn y coludd homeostatig, gan gynnwys F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia mucinophila, Bacteriodes iformis, a'r cymesurol ffwngaidd Candida albicans, gan cytometreg llif. Cynhwyswyd Salmonela enterica hefyd gan fod astudiaethau blaenorol yn dangos y gallai Clec12a gysylltu â mynediad S. enterica i'r gell (Begun et al., 2015). Clec12a wedi'i rwymo i raddau amrywiol gyda nifer o facteria ffylogenetig wahanol, gan gynnwys F. rodentium, ond nid y ffyngau, C. albicans (Ffigur 6B). Clymodd Clec12a fwyaf i'r organebau gram-bositif F. rodentium ac aelod o'r teulu Lachnospiaceae Roseburia sp., a rhyngweithiai leiaf â B. animalis, B. unffurfis, ac S. enterica (Ffigur 6B), gan nodi'r can Clec12a rhwymo i aelodau penodol o'r microbiota gan ffafrio organebau gram-bositif. Gyda’i gilydd mae ein data yn nodi Clec12a fel mecanwaith a ddefnyddir gan y system imiwnedd i arolygu cymuned ficrobaidd y perfedd a thocio’r microbiota trwy rwymo’n uniongyrchol a ffagocytosis tra’n atal ymatebion llidiol amlwg i ficrobau gram-bositif toreithiog sy’n hanfodol i gynnal iechyd y perfedd.
TRAFODAETH
Mae homeostasis yn y coluddyn yn gofyn am fecanweithiau i gyfyngu ar ficrobau commensal heb gychwyn llid niweidiol (Macpherson et al., 2000). Mae IgA, yn ystod y blynyddoedd diwethaf, wedi dod i’r amlwg fel un o’r ffyrdd hollbwysig y gall imiwnedd perfedd reoli’r microbiota (Pabst a Slack, 2020). Yn wir, mae IgA yn gallu rhwymo'n uniongyrchol i ficrobau a/neu eu cynhyrchion a'u dileu o'r perfedd heb ysgogi llid proto-nodweddiadol. Nid yw moleciwlau imiwnedd eraill sy'n meddu ar y priodweddau deuol hyn wedi'u hastudio hyd yma. Mae lectinau math-C yn cynnwys dosbarth amrywiol o broteinau a all adnabod amrywiaeth o foleciwlau protein, carbohydrad, a lipid o gynhyrchion microbaidd a lletyol (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Fodd bynnag, ychydig sydd wedi’u hastudio yng nghyd-destun imiwnedd y perfedd a’r microbiota (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Felly, hyd y gwyddom, dyma'r arddangosiad cyntaf bod diffyg Clec12a yn newid cyfansoddiad y microbiota sy'n gyrru difrifoldeb afiechyd.
budd-daliadau cistanche-cryfhau system imiwnedd
Mae Clec12a wedi'i astudio'n bennaf yng nghyd-destun adnabod monosodiwm urate (MSU) neu asid wrig, sy'n aml yn arwydd o farwolaeth cellog (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). Mae asid wrig yn gallu actifadu ymatebion llidiol trwy'r NLRP3 inflammasome, felly, er mwyn atal dinistrio meinwe yn ystod marwolaeth cellog, rhaid rheoli'r llid hwn (Martinon et al., 2006). Dangoswyd bod Clec12a yn cydbwyso'r ymateb ymfflamychol hwn trwy is-reoleiddio signalau Syk (Marshall et al., 2004). Yn gyson â hyn, mae dileu Clec12a mewn model o lid di-haint a model awtolidiol o arthritis yn achosi gwell gweithrediad neutrophil a gwaethygu afiechyd, gan wneud Clec12a yn frêc llidiol pwysig (Redelinghuys et al., 2016). Fodd bynnag, yn fwy diweddar dangoswyd bod Clec12a hefyd yn gwella signalau interfferon math I mewn ymateb i haint firaol a chyfryngu’r nifer sy’n cael Salmonela drwy’r llwybr awtophagi gwrthfacterol (Begun et al., 2015; Li et al., 2019). Mae hyn yn dangos nad yw Clec12a yn gweithredu i gyfyngu ar lid yn unig, yn hytrach, gall chwarae amrywiaeth o rolau yn dibynnu ar y cyd-destun. Mae'r coluddyn yn wahanol gan fod yna nifer fawr o gelloedd imiwnedd hyd yn oed yn absenoldeb afiechyd. Mae hyn oherwydd presenoldeb y microbiota, sy'n chwarae rhan bwysig wrth gyfarwyddo datblygiad imiwnedd ac atal cytrefu organebau pathogenig. Mae gan y microbiota yr un patrymau arwyneb a ganfyddir gan TLRs sydd hefyd yn adnabod pathogenau, ac felly mae'n rhaid i'r system imiwnedd berfeddol fod â mecanweithiau rheoleiddio llym ar waith i atal llid yr organebau tramor hyn (Blander et al., 2017).
Daethom i ymddiddori yn Clec12a yn wreiddiol oherwydd i ni nodi bod ffwng perfedd, Saccharomyces cerevisiae yn achosi asid wrig i waethygu colitis (Chiaro et al., 2017). Ar ben hynny, mae astudiaethau eraill wedi nodi y gall y microbiota ddylanwadu ar glefyd berfeddol trwy sefydlu metaboledd purin, a'r cynnyrch terfynol mewn mamaliaid yw asid wrig (Zhu et al., 2019). Mae'r data hyn yn awgrymu y gall mecanweithiau i synhwyro asid wrig, fel Clec12a, ddylanwadu ar homeostasis berfeddol. Fodd bynnag, ni welsom unrhyw newidiadau yn lefelau asid wrig mewn serwm neu feces, sy'n dangos nad oedd mwy o ddifrifoldeb afiechyd mewn anifail Clec12a-/- yn cael ei ysgogi gan fwy o asid wrig. Fodd bynnag, mae difrifoldeb cynyddol colitis yn Clec12a-/- yn cael ei yrru gan gyfansoddiad y microbiota. Felly, yn seiliedig ar ein data, gallai mynegiant llai o Clec12a-/- ddylanwadu ar gyfansoddiad y microbiota mewn cleifion IBD (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Yn ddiddorol, canfuom fod gwrthfiotigau sy'n targedu organebau gram-bositif yn gallu lleddfu difrifoldeb colitis mewn anifeiliaid Clec12a-/-. Mae hyn yn wahanol i nifer o adroddiadau sydd wedi nodi Enterobacteriaceae gram-negyddol estynedig yn ystod llid y coluddion, felly, dyma un o'r ychydig astudiaethau sydd wedi nodi ehangu mewn organebau gram-bositif sy'n gysylltiedig â datblygiad colitis. Er nad dyma'r unig organeb fwy na thebyg i ddylanwadu ar ddifrifoldeb colitis yn y model hwn, gwelwyd ehangiad dramatig o F. rodentium mewn anifeiliaid Clec12a-/-. Mae F. rodentium yn aelod gram-bositif, ocsidas, a chatalas-negyddol o'r ffyla Firmicutes (Bacillota) (Chang et al., 2015). Mae cyflwyno F. rodentium bob dydd i hyd yn oed llygod WT yn gwella colitis, gan gefnogi bod lefelau estynedig o F. rodentium yn y perfedd yn niweidiol ac yn debygol o yrru colitis difrifoldeb yn y Clec12a-/-. Dangosodd adroddiad diweddar y gall F. rodentium gynyddu trosiant epithelial ac atal mynegiant ensymau o fewn epithelia sy'n is-reoleiddio ymatebion llidiol ac felly mae'n unol â'r afiechyd gwaeth a welwn pan fydd F. rodentium yn cael ei ehangu yn y perfedd (Cao et al., 2022). Wrth i fodau dynol gael eu cytrefu ag organeb tebyg i F. rodentium (Zagato et al., 2020), dylai astudiaethau pellach egluro dylanwad y bacteria hyn sy'n debyg i rodentiwm F. ar agweddau ar ffisioleg ddynol sy'n gysylltiedig â cholitis.
Gan gefnogi rôl Clec12a ymhlith celloedd imiwnedd cynhenid, gwelsom fod y microbiota colitogenig yn dal i gael ei ffurfio mewn anifeiliaid Clec12a-/- sydd heb system imiwnedd addasol. Y ganran uchaf o gelloedd yn y perfedd sy'n mynegi Clec12a oedd macroffagau a arweiniodd ni i ganolbwyntio ar swyddogaeth Clec12a yn y celloedd hyn. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod Clec12a yn gyfryngwr pwysig ar gyfer cynhyrchu interfferon math I mewn ymateb i haint firaol (Li et al., 2019). Fodd bynnag, nid yw sut mae Clec12a yn effeithio ar ymatebion i sbectrwm eang o ligandau bacteriol wedi'i asesu; mae hyn yn berthnasol iawn yn y coluddyn lle mae digonedd o ligandau TLR yn bodoli. Yma, rydym yn dangos bod Clec12a yn gwasanaethu i dymheru adweithiau macrophage yn y perfedd a swyddogaethau tebygol i sicrhau homeostasis mewn ymateb i'r microbiota. Amlygodd RNA-seq o macroffagau sydd wedi'u deor â F. rodentium fod diffyg Clec12a yn arwain at ddiffygion cylchred celloedd a ffagocytosis mewn ymateb i'r bacteria cymesurol hyn. Dangosodd astudiaeth ddiweddar fod Clec12a-/- macroffagau wedi lleihau awtoffagi mewn ymateb i Salmonela (Begun et al., 2015). Mae ein data yn ategu ac yn ymestyn y canfyddiadau hyn i gynnwys bod Clec12a hefyd yn gweithredu i reoli organebau cymesurol anfewnwthiol. Mae eraill wedi dangos bod F. rodentium yn dylanwadu ar fioleg epithelial, sy'n awgrymu bod F. rodentium yn gorwedd yn agos at y gwesteiwr ac felly mae'n rhaid iddo gael ei reoli'n dynn gan y system imiwnedd. Mae ein data cefnogi bod Clec12a yn rheoli F. rodentium drwy reoleiddio ffagocytosis. Mae ffagocytosis yn cael ei gychwyn trwy rwymo ligand neu ficrob yn gorfforol, a gall lectinau math-C gysylltu â ligandau lluosog, a arweiniodd ni i brofi a all Clec12a gysylltu'n uniongyrchol â bacteria sy'n byw yn y perfedd. Yn ddiddorol, roedd Clec12a wedi'i rwymo'n bennaf i'r organebau gram-bositif F. rodentium a Roseburia a llawer llai i'r organebau gram-negyddol A. muciniphila a B. unffurfis ac nid o gwbl i C. albicans. Mae'r data hwn yn dangos bod Clec12a yn dueddol o rwymo aelodau penodol o'r microbiota. Mae hyn yn ein galluogi i adeiladu model lle gall ymgysylltiad Clec12a a ffagocytosis dilynol reoli rhai aelodau o'r microbiota ac atal effeithiau andwyol posibl eu hehangiad. Mae hyn yn amlygu swyddogaeth ddeuol Clec12a a all atal llid yn erbyn ligandau microbaidd tra hefyd yn adnabod a rheoli aelodau penodol o'r microbiota. Felly, mae Clec12a yn cynrychioli ffordd unigryw y mae'r system imiwnedd gynhenid yn ei defnyddio i sicrhau homeostasis o fewn y llwybr gastroberfeddol.
CHWEDLAU FFIGUR
Ffigur 1. Mae Clec12a yn atal afiechyd berfeddol yn annibynnol ar y system imiwnedd addasol
(A) Er mwyn asesu difrifoldeb colitis cafodd llygod WT neu Clec12a-/- C57BL/6 penodol heb bathogen (SPF) eu trin â 2.5% o sodiwm sylffad dextran (DSS) ad libitum am 7 diwrnod mewn dŵr yfed. Aseswyd y golled pwysau canrannol bob dydd. Cymedrig +/- SEM, mae data'n cael eu cronni o dri arbrawf annibynnol gan ddefnyddio ANOVA Dwyffordd a phrawf cymharu lluosog Śídák.
(B) Mesurwyd hyd colon (cm) yr anifeiliaid a nodwyd adeg aberth. Plot gwasgariad yw'r SEM cymedr +/-, mae data'n cael eu cronni o dri arbrawf annibynnol gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden
(C) Mesurwyd Lipocalin Fecal-2 (ng/mL) o anifeiliaid a nodwyd fel allddarlleniad llid. Y graff bar yw'r SEM cymedr +/-, mae data'n cael eu cronni o ddau arbrawf annibynnol gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden
(D) Cynrychiolwyr H&E rhannau o'r colon wedi'i staenio o anifeiliaid a nodwyd ar ôl colitis a achosir gan DSS.
(E) Cynhyrchwyd sgorau histoleg ar gyfer anifeiliaid a nodwyd o adrannau'r colon yn
(D). Y graff bar yw'r SEM cymedr +/-, wedi'i gymharu gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
(F) model trosglwyddo cell T o colitis ei berfformio i asesu colitis cronig. Roedd pwysau TCRb-/- a Clec12a-/-;TCRb-/- anifeiliaid yn cael ei fesur yn wythnosol. Mae'r graff yn dangos canran pwysau'r anifeiliaid a nodwyd drwy gydol yr arbrawf. Cymedr +/- SEM, o'i gymharu â 2-ffordd ANOVA.
(G) Mesurwyd hyd cytref yr anifeiliaid a nodwyd o (I) adeg aberth. Y graff bar yw'r SEM cymedr +/-, wedi'i gymharu gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
(H) WT, Clec12a-/- , Rag-/- neu Rag-/- ; Clec12a-/- C57BL/6 Cafodd llygod SPF eu hasesu ar gyfer colitis acíwt. Rhoddwyd 2.5% o DSS ad libitum i anifeiliaid a nodwyd am 7 diwrnod. Aseswyd y golled pwysau canrannol bob dydd. Cymedr +/- SEM, mae data'n gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol. Prawf cymharu lluosog ANOVA a Śídák dwy ffordd.
(I) Mesurwyd hyd colon (cm) yr anifeiliaid a nodwyd adeg aberth. Y graff bar yw'r cymedr +/- SEM, mae data'n gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol sy'n defnyddio profion t heb eu paru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
Ffigur 2. Mae'r microbiota a ffurfiwyd mewn anifail Clec12a-/- yn rhoi colitis gwaeth
A) Perfformiwyd trawsblaniadau microbiota fecal (FMT) trwy drosglwyddo supernatants fecal o anifeiliaid WT neu Clec12a i lygod WT di-germ. Caniatawyd i ficrobiotasau homogeneiddio am bedair wythnos, ac ar ôl hynny, cafodd hanner llygod WTFMT a hanner llygod Clec12a-/- FMT eu cyd-gartrefu a chaniatáu pedair wythnos arall i gymysgu. Yna derbyniodd pob grŵp 2.5% DSS ad libitum yn eu dŵr yfed a chawsant eu haberthu ar ddiwrnod 7.
B) Roedd colli pwysau canrannol yr anifeiliaid a nodwyd yn cael ei asesu'n ddyddiol. Mae'r graff yn dangos cymedr +/- SEM, mae data'n cael eu cronni o ddau arbrawf annibynnol gan ddefnyddio ANOVA Dwyffordd a phrawf cymhariaeth lluosog Śídák.
C) Mesurwyd hyd colon (cm) o'r anifeiliaid a nodwyd adeg aberth. Plot gwasgariad yw'r SEM cymedr +/-, o'i gymharu gan ddefnyddio ANOVA Unffordd Gyffredin â phrawf cymariaethau lluosog Dunnett. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
D) Toriadau colon wedi'u staenio gan H&E cynrychioliadol o anifeiliaid a nodwyd ar ôl FMT a cholitis a achosir gan DSS.
E) Cynhyrchwyd sgorau histoleg o adrannau'r colon yn (D). Y graff bar yw'r SEM cymedr +/-, wedi'i gymharu gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
F) Pellteroedd Unifrac wedi'u pwysoli o ddilyniannu genynnau rRNA 16S o WTFMT, Clec12a-/- FMT, neu anifeiliaid sy'n cael eu cyd-gartrefu. Plotiau blwch a wisger yn dangos yr holl bwyntiau (cymhariaeth pellter pâr) a'u cymharu gan ddefnyddio prawf Kruskal-Wallis.
G) Pellteroedd Unifrac heb eu Pwysoli o ddilyniannu genynnau rRNA 16S o WTFMT, Clec12a-/- FMT, neu anifeiliaid cyd-gartrefu. Plotiau blwch a wisger yn dangos yr holl bwyntiau (cymhariaeth pellter pâr) a'u cymharu gan ddefnyddio prawf Kruskal-Wallis.
H) Pellteroedd Bray-Curtis o ddilyniannu genynnau rRNA 16S o WTFMT, Clec12a-/- FMT, neu anifeiliaid cyd-gartrefu. Plotiau blwch a wisger yn dangos yr holl bwyntiau (cymhariaeth pellter pâr) a'u cymharu gan ddefnyddio prawf Kruskal-Wallis.
Ffigur 3: Mae cyfansoddiad microbiota a ffurfiwyd mewn anifeiliaid Clec12a-/- yn annibynnol ar imiwnedd addasol
A) Diagram sgematig yn dangos ailgyfansoddiad mêr esgyrn gyda FMT dilynol. C57Bl/6 WT Cafodd llygod eu harbelydru'n angheuol a'u hailgyfansoddi â naill ai WT neu Clec12a-/- mêr esgyrn. Ar ôl 8 wythnos, cymerwyd feces o'r llygod hyn a'u trosglwyddo i lygod di-germ WT fel yr eglurir yn (A). Yna darparwyd 2.5% DSS ad libitum i'r anifeiliaid cimerig a ail-gyfansoddwyd yn wreiddiol yn eu dŵr yfed.
B) Roedd canran pwysau colli llygod FMT o (F) yn cael ei asesu'n ddyddiol. Cymedrig +/- SEM, gan ddefnyddio prawf cymharu lluosog ANOVA dwy ffordd a Tukey.
C) Mesurwyd hyd colon (cm) o'r anifeiliaid a nodwyd adeg aberth. Plot gwasgariad yw'r prawf-t cymedr +/- SEM, heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden
D) Perfformiwyd FMTs i asesu rôl y system imiwnedd addasol ar siapio microbaidd a difrifoldeb colitis trwy drosglwyddo supernatants fecal o Rag-/- neu Rag-/-; Clec12a-/- anifeiliaid SPF i mewn i lygod di-germau WT fel y disgrifir yn (A). Cafodd llygod eu trin â 2.5% DSS am 7 diwrnod. Aseswyd y golled pwysau canrannol bob dydd. Y graff yw'r cymedr +/- SEM, gan ddefnyddio prawf cymharu lluosog ANOVA dwyffordd a Tukey.
E) Mesurwyd hyd colon (cm) o anifeiliaid a nodir yn (F) adeg aberth. Cymedr +/-, SEM yn cymharu gan ddefnyddio ANOVA Cyffredin Unffordd a phrawf cymhariaeth lluosog Dunnet. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
Ffigur 4. Mae Clec12a yn cyfyngu ar ehangu cnofilod Faecalibaculum, microb sy'n gwaethygu colitis
A) WT neu Clec12a-/- C57BL/6 SPF Rhoddwyd coctel gwrthfiotig (A) (neomycin, gentamycin, ampicillin, erythromycin), cephalothin, neu gentamycin (B, C) i lygod mewn crynodiad o 0. 5g/L am bedwar diwrnod ar ddeg. Ar ôl saith diwrnod roedd anifeiliaid yn cael 2.5% DSS yn eu dŵr yfed tan aberth. Mesurwyd hyd colon (cm) o'r anifeiliaid a nodwyd adeg aberth. Plot gwasgariad yw'r prawf-t cymedr +/- SEM, heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
B) Roedd colli pwysau canrannol yr anifeiliaid a nodwyd yn cael ei asesu'n ddyddiol. Y graff yw'r cymedr +/- SEM, gan ddefnyddio prawf cymharu lluosog ANOVA dwyffordd a Tukey
C) Hyd colon (cm) yr anifeiliaid a nodwyd wedi'i fesur adeg aberth. Plot gwasgariad yw'r prawf-t cymedr +/- SEM, heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
D) Nodweddion a arsylwyd o WT neu Clec12a-/- feces, rRNA 16S yn dilyniannu amrywiaeth alffa. Cymedr +/- SEM, o gymharu gan ddefnyddio prawf Mann-Whitney.
E) Pielou Evenness o WT neu Clec12a-/- feces, rRNA 16S dilyniannu amrywiaeth alffa. Cymedr +/- SEM, o gymharu gan ddefnyddio prawf Mann-Whitney.
F) Cymedr Entropi Shannon +/- SEM, o gymharu gan ddefnyddio prawf Mann-Whitney.
G) Dadansoddiad ANCOM gan WT a Clec12a-/- feces. Enwau tacsonomig yw'r dosbarthiadau gorau o ASVs gan ddefnyddio'r Gronfa Ddata Tacsonomeg Genom (GTDB).
H) Digonedd cymharol o ASVs Faecalibaculum rodentium. Wedi'i gymharu gan ddefnyddio Mann Whitney * p < {{0}}.05; **p <0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
I) C57Bl/6 WT SPF llygod wedi eu trin ymlaen llaw gyda 1x108 CFU o F. rodentium drwy gavage llafar am dri diwrnod. Yna cafodd anifeiliaid 2.5% DSS yn eu dŵr yfed am 7 diwrnod tra'n parhau i dderbyn mesurydd dyddiol o F. rodentium. Aseswyd y golled pwysau canrannol bob dydd. Cymedrig +/- SEM, Mae data yn cael eu cronni o bedwar arbrawf ar wahân gan ddefnyddio ANOVA Dwyffordd a phrawf cymhariaeth lluosog Tukey.
J) Roedd hyd Colon (cm) yr anifeiliaid a nodwyd yn cael ei fesur adeg aberth. Y graff bar yw'r cymedr +/- SEM, Mae data'n cael eu cronni o bedwar arbrawf gwahanol o'u cymharu gan ddefnyddio ANOVA Unffordd Gyffredin â phrawf cywiro lluosog Dunnet. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
Ffigur 5. Mae Clec12a yn cyfyngu llid ac yn hyrwyddo ffagocytosis mewn macroffagau.
A) Perfformiwyd imiwnoffenoteipio trwy sytometreg llif ar gelloedd wedi'u hynysu o'r lamina propria colonig (cLP) ar anifeiliaid WT a Clec12a-/-. Mae Heatmap yn dangos amlder mynegiant Clec12a ar gelloedd imiwnedd cynhenid ac addasol
B) Mae'r graff bar yn dangos amledd celloedd cyn-giât, CD38+ (macroffagau M1) o CLP anifeiliaid a nodir. Cymedr +/- SEM, wedi'i gymharu gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
C) Mae'r graff bar yn dangos amledd celloedd cyn-giât, EGR2+ (macroffagau M2) o'r clLP o anifeiliaid a nodir. Cymedr +/- SEM, wedi'i gymharu gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
D) Cynaeafwyd BMDMs o WT a Clec12a-/- esgyrn hir a'u meithrin ym mhresenoldeb M-CSF (20ng/mL) am 7 diwrnod. Ar ddiwrnod 8 cafodd BMDMs eu curo â LPS (100ng/mL), MDP (10mg/mL), Pam3cysk (1mg/mL), neu, Flagellin (1mg/mL) am 24 awr. Casglwyd cyfryngau a'u hassay ar gyfer cynhyrchu cytocin. Mae'r map gwres yn dangos y newid plyg Log2 o cytocinau a nodir o Clec12a-/- dros WT.
E) Roedd BMDMs o WT a Clec12a-/- llygod wedi'u hynysu a'u meithrin fel yn (A) ac yna'n cael eu cyd-ddiwyllio â F. rodentium mewn MOI o 10 am 24 awr. Ar ôl golchi BMDMs, casglwyd RNA a'i baratoi ar gyfer dilyniannu RNA. Y 10 categori termau GO symlaf (proses fiolegol) uchaf wedi'u cyfoethogi ymhlith Clec12a-/- wedi'i isreoleiddio
F) Cafodd macroffagau peritoneol eu hynysu oddi wrth WT a Clec12a-/- llygod ac yna eu cyd-ddiwyllu â F. rodentium lliw gwyrdd Sybr er mwyn asesu ffagocytosis. Chwith: WT macrophages. Ar y dde: Clec12a-/- macrophages. Darlunnir delweddau cynrychioliadol o faes llachar (colofnau chwith), fflworoleuedd (colofnau canol), a chyfuniad (colofnau dde). Mae pennau saethau melyn yn dynodi enghreifftiau o gelloedd F. cnofilod wedi'u hamlyncu gan facroffagau. bar graddfa=20 µm. Mae'r delweddau'n cynrychioli dau arbrawf ar wahân.
G) Mae'r graff bar yn dangos organebau fesul cell, fel y gwelir yn (F). Cafodd 250 o gelloedd WT a 269 o gelloedd Clec12a-/- eu cyfrif i fesur faint o F. rodentium fesul cell.
Ffigur 6: Mae Clec12a yn rhwymo'n uniongyrchol i aelodau penodol o'r microbiota.
A) Diagram sgematig yn darlunio Clec12a-IgG dynol1-Fc fusion protein neu fector gwag (rhan Fc yn unig) B) Histogramau o ddadansoddiad cytometrig llif yn cynrychioli rhwymiad gwahaniaethol Clec12a-Fc i wahanol facteria neu C. albicans.
CHWEDLAU FFIGUR ATODOL
Ffigur Atodol 1. Nid yw absenoldeb Clec12a yn amharu ar lefelau asid wrig.
A) Mesurwyd asid serwm wrig (µM) anifeiliaid a nodwyd i asesu metaboledd purin rhwng WT a Clec12a-/- llygod C57Bl/6. Y plot gwasgariad yw'r SEM cymedr +/-, mae data'n cael eu cronni o dri arbrawf annibynnol gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
B) Mesurwyd asid wrig fecal (µM) anifeiliaid a nodwyd i asesu ysgarthiad asid wrig yn y perfedd rhwng WT a Clec12a-/- llygod C57Bl/6. Y plot gwasgariad yw'r SEM cymedr +/-, mae data'n cael eu cronni o dri arbrawf annibynnol gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru. Mae pob pwynt yn cynrychioli un llygoden.
Ffigur Atodol 2. Mae microbiotas WT a Clec12a-/- yn gyrru clefyd gwahaniaethol
Canran colli pwysau anifeiliaid WT a Clec12a-/- sy'n cael eu trin â choctel gwrthfiotig sy'n cynnwys neomycin, gentamycin, ampicillin, ac erythromycin.
Ffigur Atodol 3. Mae Clec12a yn dylanwadu ar gyfansoddiad y microbiota.
A) Lleiniau PCoA o’r 3 echelin gyntaf yn seiliedig ar bellteroedd Bray-Curtis yn dangos cydberthnasau microbiota cyffredinol a’r plotiau blwch a whisger cyfatebol yn meintioli annhebygrwydd o fewn pob grŵp ac yn cymharu â phrawf Mann-Whitney.
B) Lleiniau PCoA yn seiliedig ar bellteroedd Unifrac pwysol a'r plotiau blwch a chwisger cyfatebol yn meintioli annhebygrwydd o fewn grŵp o'i gymharu â phrawf Mann-Whitney heb ei baru.
C) Tabl yn dangos canlyniadau profion PERMANOVA ar gyfer WT vs Clec12a-/- microbiota fecal gyda Bray-Curtis a phellteroedd Unifrac pwysol.
Ffigur Atodol 4: Clec12a mewn macroffagau yn cyfyngu llid.
A) Mae plotiau ffidil yn darlunio dwyster fflwroleuol cymedrig geometrig (MFI) celloedd imiwn a ddangosir yn (A). Cymedrig +/- SEM, prawf Kruskal-Wallis gyda chywiriad Dunn ar gyfer cymariaethau lluosog. Mae llythyrau'n dynodi grwpiau sy'n sylweddol wahanol.
B) Lleiniau cytometreg llif cynrychioliadol o macroffagau M1 a M2 o cLP llygod WT neu Clec12a-/- ar ôl colitis DSS. Mae celloedd wedi'u rhag-adwyo ar CD45+ byw,, Ly6C-, CD11b+, MHCII+, a CD64+. O Ffigur 5A
Ffigur Atodol 5. Mae Clec12a yn sefydlogi rheolaeth cylchred celloedd ac yn rheoleiddio ffagocytosis mewn macroffagau.
A) 10 categori term GO symlach (Proses Fiolegol) uchaf wedi'u cyfoethogi ymhlith genynnau Clec12a-/- wedi'u huwchreoleiddio o gymharu â WT mewn ymateb i F. rodentium. Cafodd BMDMs o WT a Clec12a-/- llygod wedi'u cyd-ddiwyllio ag F. rodentium eu hynysu a'u dadansoddi fel yn Ffigur 7A.
B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Cafodd 200 o macroffagau eu cyfrif. Mae'r graff bar yn dangos nifer cyfartalog F. rodentium o 4 ffynnon unigol i ddangos cysondeb cyfrif ac effaith ar draws ffynhonnau. Cymedr +/- SEM wedi'i gymharu gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru.
DIOLCHIADAU
Hoffem ddiolch i Gordon Brown am ddarparu'r anifeiliaid Clec12a-/- ar gyfer y prosiect hwn. Cefnogwyd y gwaith hwn gan Sefydliad Helen Hay Whitney (KSO), Grant Hyfforddi Pathogenesis Microbaidd T32 (KSO) Prifysgol Utah NRSA, Gwobr Ymchwil Uwch CCFA (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 a NCCAM R01AT011423 (JLR), Edward Mallinckrod Sefydliad Jr. (JLR), gwobr GYRFAOEDD NSF (IOS-1253278) (JLR), Cymrodoriaeth Packard mewn Gwyddoniaeth a Pheirianneg (JLR), Gwobr Ymchwilydd Croeso mewn Pathogenesis Burroughs (JLR), Sefydliad Asthma America (JLR), Margolis Sefydliad (JLR), grant Canolfan y Gymdeithas MS (JLR), a Gwobr Arloeswr Newydd Sefydliad WM Keck (JLR) NIH DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), Grant Ymchwil Cymdeithas Canser America (RMO), Gwobr Ysgolhaig Kimmel (RMO), R01AG047956 (RMO), a NIAID R01AI141202 (ASI). Cefnogwyd y gwaith hwn gan Gyfleuster Cytometreg Llif Prifysgol Utah yn ogystal â'r Sefydliad Canser Cenedlaethol trwy Ddyfarniad Rhif 5P30CA042014-24. Mae cefnogaeth ac adnoddau'r Ganolfan Cyfrifiadura Perfformiad Uchel ym Mhrifysgol Utah yn cael eu cydnabod yn ddiolchgar.
CYFRANIADAU AWDUR
Helpodd TRC genhedlu'r astudiaeth, perfformio'r rhan fwyaf o'r arbrofion llygoden ac imiwnoleg, rhoi'r data at ei gilydd yn ffigurau, a helpu i ysgrifennu'r llawysgrif. Sefydlodd RB arbrofion di-germ a chynnal pob anifail di-germ. Helpodd ESV gydag arbrofion imiwnoleg gut lamina propria. Helpodd KSO gyda chynaeafu llygod a rhoddodd fewnwelediad a chyfeiriad. Helpodd KMB gyda chynaeafu llygoden a sytometreg llif. Bu MCN yn helpu gyda chynaeafu llygod. Darparodd WV help i adeiladu'r lluniad ar gyfer y protein ymasiad a'r puro. Darparodd TJ help gyda phrofion ffagocytosis. Dadansoddodd JH sleidiau microsgopeg ffagocytosis. Darparodd MH help gyda phuro a defnyddio'r protein ymasiad. Mae KAK yn darparu unigion bacteriol. Darparodd ROC arbenigedd a mewnwelediad imiwnoleg. Helpodd WZS genhedlu'r astudiaeth gan wneud dadansoddiadau biowybodeg, helpu gyda pharatoi ffigurau ac ystadegau, a helpu i ysgrifennu'r llawysgrif. Helpodd JLR genhedlu a chyfarwyddo'r astudiaeth, goruchwylio cynllun a chanlyniadau arbrofol, trefnu cydweithwyr ac adweithyddion, casglu cyllid ar gyfer yr astudiaeth, a helpu i ysgrifennu'r llawysgrif.
DULLIAU
Straenau llygoden
Roedd pob llinell llygoden a ddefnyddir yma ar gefndir C57BL/6. Darparwyd clec12a-/- llygod yn garedig gan Gordon Brown (Canolfan y Cyngor Ymchwil Feddygol ar gyfer Mycoleg Feddygol, Prifysgol Caerwysg) ac roeddent yn genoteip yn ôl eu protocol a ddisgrifiwyd yn flaenorol (Redelinghuys, et al. 2016). Cafwyd Rag2-/- a TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) gan Jackson Laboratories a’u cynnal yn ein cytref llygoden am sawl cenhedlaeth. Ar gyfer pob colitis in vivo, defnyddiwyd arbrofion rhwng 8 a 12-llygod sy'n cyfateb i ryw wythnos oed. Defnyddiwyd llygod gwrywaidd a benywaidd. Roedd llygod yn cael eu cynnal dan amodau penodol heb bathogenau.
Mathau bacteriol a ffwngaidd
Cafwyd yr organebau canlynol o Gasgliad DSMZ-Almaeneg o Ficro-organeb a Diwylliannau Celloedd GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM#26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM#26074). Prynwyd gwisg Bacteroides o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd (ATCC® 8492™). Cafodd Roseburia sp (dynodiad straen JLR.KK002) ei ynysu ar agar Schaedler o lygod C57BL/6 lle roedd microbiota wedi'i gyfoethogi â sbôr yn flaenorol. Perfformiwyd cyfoethogi cyn sborau fel y disgrifiwyd yn flaenorol a chynhaliwyd llygod am genedlaethau lluosog gyda'r microbiota hwn yn ein cyfleuster gnotobiotig cyn i JLR.KK002 gael ei ynysu oddi wrth feces (Browne et al., 2016). Fe wnaethom chwyddo PCR a Sanger ddilyniannu’r genyn rRNA 16S ac yna ei ddosbarthu gyda gwasanaeth SILVA ACT a chronfa ddata SILVA (Pruesse et al., 2012). Defnyddiwyd straen Salmonela typhimurimum ST2. Defnyddiwyd straen Candida albicans sc5314. Disgrifir straenau bacteriol a ddefnyddir yn y gymuned synthetig PhyLo11b isod.
Colitis arbrofol a achosir gan DSS
Cafodd colitis ei achosi gan ychwanegu 2.5% neu 3% (w/v) 36,000-50,{5}MW Dextran sodiwm sylffad (DSS) (MP Biomedicals) yn y dŵr yfed am 7 diwrnod. Roedd difrifoldeb colitis yn cael ei fonitro'n ddyddiol trwy newidiadau ym mhwysau'r corff, cysondeb y carthion, a gwaed fecal. Ar gyfer yr arbrawf achub monocyte derbyniodd pob llygod 2.5% DSS am 5 diwrnod, ac ar ôl hynny rhoddwyd dŵr rheolaidd; roedd monitro pwysau yn parhau i ddiwrnod 10 pan gafodd anifeiliaid eu cynaeafu. Gosodwyd terfynau difrifoldeb o fwy na 20% o golli pwysau fel trothwy difrifoldeb. Ar ddiweddbwyntiau arbrofol, tynnwyd MLNs a cholon. Mesurwyd y colon o'r cecum i'r rectwm i ganfod yr hyd. Yna proseswyd meinweoedd ar gyfer histoleg, echdynnu RNA, neu ddadansoddiad cytometrig llif.
Histoleg a Sgorio'r Colon
Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).
Lipocalin-2 (LCN-2) ELISA
Perfformiwyd protocol yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (Fischer Scientific DY1857-05). Yn gryno, cafodd feces eu casglu, eu pwyso a'u stwnsio mewn HBSS 1X ar grynodiad o 100mg / mL. Yna trowyd samplau ar 50 xg am 5 munud i gael gwared â malurion mawr. Yna tynnwyd y supernatant a'i roi mewn tiwb newydd a'i droelli ar 8000 xg am 5 munud er mwyn pelenni bacteria. Yna cafodd yr uwchnatant hwn ei wanhau yn ôl salwch anifeiliaid ond yn gyffredinol roedd yn amrywio o 1:100- 500 (iach) – 1:500-1000 (wedi'i drin gan DSS). Mesur asid wrig Perfformiwyd crynodiad asid wrig yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (pecyn assay gweithgaredd Invitrogen™ Amplex™ Red Uric/Uricase, cat# A22181). Yn gryno, casglwyd gwaed o WT neu Clec12a-/- llygod trwy dyllu cardiaidd i mewn i diwbiau gwahanydd serwm aur. Caniatawyd i'r tiwbiau geulo am 30 munud ac yna eu troelli ar 1300 xg am 10 munud. Tynnwyd y serwm a'i roi mewn tiwbiau Eppendorf 1.5ml, wedi'i rewi â fflach, a'i storio ar -80 gradd Celsius nes ei brofi. Perfformiwyd asid wrig fecal trwy gael pelenni fecal ffres gan WT a Clec12-/- llygod. Cafodd pelenni eu pwyso a'u cofnodi ac yna eu stwnsio mewn 1ml o glustogiad adwaith 1x. Ar ôl stwnsio corfforol, trowyd y tiwbiau ar 50 xg am 5 munud i gael gwared â malurion mawr. Assayed y slyri fecal oedd yn weddill ar gyfer asid wrig.
Colitis arbrofol trosglwyddo celloedd T
Cafodd dueg WT eu hynysu a'u stwnsio mewn RPMI sy'n cynnwys 10% o serwm buchol ffetws, penisilin, a streptomycin. Trowyd celloedd ar 367 xg i ynysu celloedd. Yna ataliwyd y beled canlyniadol mewn byffer lysis 1x RBC am 5 munud, yn y tywyllwch, ar dymheredd yr ystafell. Yna cafodd y celloedd gwaed gwyn canlyniadol eu pasio trwy golofn MACS CD Miltenyi i ynysu celloedd T CD4+. Yna cafodd celloedd T eu staenio â CD4 a CDRB a'u didoli ar FACS Aria Fusion (BD Biosciences). Casglwyd celloedd CD4+ CDRBhi a'u gweinyddu i TCRb-/- neu TCRb-/-; Clec12a-/- llygod yn fewnberitoneol (IP). Derbyniodd pob llygoden 5 x 105 o gelloedd. Roedd difrifoldeb a datblygiad colitis yn cael eu monitro'n wythnosol trwy asesu colli pwysau. Yn y man terfyn arbrofol, tynnwyd MLNs a cholonau a mesurwyd colonau o'r cecum i'r rectwm i asesu difrifoldeb y clefyd.
Ynysu leukocytes o'r lamina propria colonig
Cynaeafwyd colonau murine gyda ceca ynghlwm a'u gosod mewn 1X PBS mewn 6-blatiau ffynnon ar iâ. Tynnwyd unrhyw fraster a oedd yn weddill i'w weld a meinwe gyswllt a chafodd y cecum ei dorri o'r colon. Roedd coluddion yn cael eu gwasgaru ar agor a mwcws a feces yn cael eu tynnu'n ofalus o'r colon cyn eu gosod yn ôl ym mhlât y ffynnon. Unwaith y byddai pob colon wedi'i wasgaru a'i grafu, roedd pob colon yn cael ei ddeisio ar gaead dysgl petri gan ddefnyddio llafn rasel a'i roi mewn tiwb 5{50 mL ar wahân. Ychwanegwyd 10 ml o doddiant daduniad wedi'i gynhesu'n barod (1X HBSS w/o Ca+ a Mg+, 1.5 mM DTT, 10 mM HEPES, a 30 mM EDTA) a gwyrdroi'r tiwbiau'n fyr. Deorwyd colonau am tua 25 munud. ar 37 gradd gydag ysgwyd ar 150 rpm nes bod atebion yn gymylog o wahaniad IEC. Cafodd samplau eu hysgwyd 3X a'u vortexed am 15 eiliad yna eu harllwys dros ffilter 100 mM ar gonigol 50 ml i gael gwared ar gelloedd di-imiwn fel IECs, a rinsiwyd yr hidlwyr yn fyr gyda 2 ml o oerfel iâ 1X PBS. Casglwyd y meinwe sy'n weddill ar yr hidlydd gyda gefeiliau a'i symud i gonigol 50 ml newydd. 15 ml o doddiant treulio cyn-gynhesu (1X HBSS gyda Ca+ a Mg, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, cath # 4942078001], 0.5 mg/ml DNAse I [Worthington Biocemegol, cath # LS002139] a 0.5 mg/mL ychwanegwyd Collagenase D [Millipore-Sigma, cath # 11088866001]), cafodd samplau eu troi'n fyrtecs, a'u deor wedyn am 45 munud. ar 37 gradd gydag ysgwyd ar 150 rpm, neu nes i'r ateb ddod yn gymylog. Yna cafodd samplau eu hysgwyd 3X a'u fortecs am 15 eiliad. Er mwyn casglu gweddill y celloedd CLP imiwnedd, yna arllwyswyd y meinwe wedi'i dreulio dros hidlydd 40 mM ar diwb conigol 50 mL yn cynnwys 10 mL 1X PBS. Mae samplau'n cael eu rinsio a'u hidlo nesaf gyda 2 ml o 1X PBS oerfel iâ a'u troelli ar 800 xg am 10 munud ar 4 gradd . Nesaf, tynnwyd y supernatant a'i daflu â gwactod. Yna cafodd celloedd eu hailddarlledu mewn 500 ml o RPMI cyflawn, a'u cyfrif gyda staen gwahardd glas Trypan.
Cytometreg llif
Cafodd leukocytes wedi'u hynysu o'r CLP eu staenio ar gyfer hyfywedd gan ddefnyddio lliw zombie 510 (AmCyan) am 10 munud yn RT yn y tywyllwch. Yna cafodd samplau eu rhwystro gan Fc Receptor gyda CD-16/32 am 20 munud ar 4 gradd yn y tywyllwch. Ar ôl troelli i lawr ar 367 xg am 5 munud celloedd wedi'u tywallt eu staenio am 30 munud yn y tywyllwch ar 4 gradd. Defnyddiwyd pob gwrthgyrff ar wanhad o 1:250 oni nodir yn wahanol. Roedd panel Myleloid yn cynnwys CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (mewngellog, 1:50). Gwahaniaethwyd celloedd T gan: llifyn Zombie 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (mewngellol 1:50), IL{{ 50}}PE (mewngellog 1:50), IFN-g (BV605) (mewngellog 1:50), RORgt-PE610 (mewngellog 1:50), IL-17A-BV785 (mewngellol 1:50). Ar ôl staenio, golchwyd celloedd 2 waith am 5 munud yr un gyda byffer colofn (1X HBSS w/o Ca2+, Mg2+ a HEPES, EDTA, FBS). Gosodwyd celloedd O/N gyda 2% PFA os nad oedd angen staenio mewngellol ac yna eu golchi yn y byffer colofn 2X cyn rhedeg ar y cytomedr llif. Os oedd angen staenio mewngellol, dilynwyd y pecyn Clustogi Staenio Ffactor FoxP3 / Trawsgrifio (Tonbo Biosciences) a phrotocol. Yna cafodd yr holl samplau eu hailddarparu mewn 300 ul o glustogiad colofn a'u rhedeg ar BD LSR Fortessa ar ôl gwneud iawn ag eBeads UltraComp (ThermoFisher Scientific) a defnyddio rheolyddion staen sengl.
Bacteria staenio IgA
Cafodd bacteria eu hynysu o belenni fecal trwy eu stwnsio i HBSS w/ Ca2+ a Mg2+, ar grynodiad o 100 mg feces fesul ml HBSS. Yna cafodd carthion stwnsh eu nyddu ar 50 xg am 5 munud i gael gwared â malurion mawr. Tynnwyd y supernatant a'i roi mewn tiwb newydd. Yna cafodd hwn ei nyddu ar 8000 xg am 5 munud i beledu bacteria. Tynnwyd y supernatant a golchwyd pelenni yn HBSS w/ Ca2+ a Mg2+. Yn olaf, cafodd pelenni eu haildynnu yn HBSS ar grynodiad o 100mg/mL, a gosodwyd 10uL o hwn mewn 96-plât ffynnon a'i rwystro gyda HBSS w/ Ca2+ a Mg2+ yn cynnwys 10% FBS am 20 munud yn RT. Yna ychwanegwyd 100uL o wrth-IgA (PE) yn uniongyrchol at y sampl a'i ddeor am 30 munud ar 4 C yn y tywyllwch. Yna golchwyd celloedd mewn hydoddiant HBSS+FBS 2x ac yn olaf eu hailddarparu yn HBSS+1x Sybr®-green a chaniatáu iddynt ddeor am 20 munud yn y tywyllwch yn RT. Yna darllenwyd samplau yn uniongyrchol ar y cytomedr llif.
Ynysu mêr esgyrn
Roedd mêr esgyrn wedi'i ynysu fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Yn gryno, roedd esgyrn hir o anifeiliaid math C57Bl/6 Wild neu Clec12a-/- yn cael eu tynnu a'u glanhau â thywel papur trwy rwbio'n ysgafn. Roedd esgyrn glân yn cael eu cadw ar iâ tra bod anifeiliaid yn cael eu prosesu. Cafodd pennau'r esgyrn eu torri ychydig er mwyn amlygu'r mêr. Gosodwyd asgwrn (pen agored yn wynebu i lawr) i mewn i diwb Eppendorf 0.5mL a oedd wedi'i dyllu â nodwydd 18g. Yna gosodwyd y tiwb Eppendorf 0.5mL hwn y tu mewn i diwb Eppendorf 1.5mL a'i droelli ar 13,000 x g am 1 munud. Yna cafodd ei nyddu trwy fêr esgyrn ei lysio gan RBC, gan ddefnyddio byffer RBC-lysis (Biolegend) yn unol ag argymhellion y gwneuthurwr. Ar ôl lysis RBC, cafodd celloedd eu hailddarparu yn Eryr Cyfrwng Addasedig Dulbecco (DMEM) cyflawn yn cynnwys: 10% FBS, 1mg/mL Pen/Strep, HEPES 10mM, 1x asid amino nad yw'n hanfodol, Sodiwm Pyruvate 1mM. Yna trowyd celloedd ar 367 xg am bum munud i gelloedd pelenni. Yna defnyddiwyd celloedd ynysig i ddatblygu BMDMs, neu i ynysu monocytes ymhellach.
Macroffagau sy'n deillio o fêr esgyrn
Cafodd leukocytes eu hynysu rhag ynysu mêr esgyrn, eu hatal mewn DMEM cyflawn, a'u cyfrif trwy staen gwaharddiad glas trypan ar hemocytomedr. Roedd celloedd yn cael eu platio ar ddysglau 10cm wedi'u trin â meithriniad meinwe ar grynodiad o 5-8 x 106 o gelloedd/plât mewn 10 mL o gyfrwng cyflawn + M-CSF (20ng/mL). Ychwanegwyd cyfryngau ffres, gan gynnwys M-CSF, at gyfryngau presennol ar ddiwrnodau 4 a diwrnodau 7. Defnyddiwyd BMDMs cwbl wahaniaethol ar gyfer defnydd arbrofol rhwng dyddiau 7-9.
Unigedd Monocyt
Cynaeafwyd mêr esgyrn o anifeiliaid WT a Clec12a-/- fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Cafodd monosytau eu hynysu gyda'r Pecyn Ynysu Monocyte (BM), llygoden (Miltenyi Biotec), a cholofn LS MACS yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
F. rodentium BMDM cyd-ddiwylliant a RNAseq
Cafodd diwylliannau cnofilod F. eu meintioli gan OD 600nm (gan ddefnyddio 1 OD 600nm=1 x 10^8 cell/mL), golchi 2x mewn PBS di-haint, a'u cyd-ddiwyllio â 1 x 106 cell/mL BMDM gwahaniaethol llawn ar a MOI o 10 mewn 6-blatiau meithrin meinwe ffynnon. Ar ôl 24 awr o gyd-ddiwylliant, casglwyd cyfryngau a'u storio ar -20 C nes eu defnyddio ymhellach. Cafodd BMDMs eu golchi â PBS oer, di-haint, 2x. Qiazol (Qiagen cath # 79306) RNA-sefydlogi adweithydd, ychwanegwyd wedyn yn uniongyrchol i bob ffynnon. Cafodd ffynhonnau eu crafu â chrafwr celloedd a gasglwyd i mewn i 1.5 tiwb Eppendorf a'i rewi ar -20 gradd nes echdynnu RNA. Perfformiwyd echdynnu RNA gan ddefnyddio pecyn miniprep RNA Direct-zol (Zymo Research cat # R2070) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr a pharatowyd llyfrgelloedd dilyniannu gan gyfleuster craidd Genomeg trwybwn Uchel Sefydliad Canser Huntsman. Cafodd cyfanswm RNA ei hybrideiddio gyntaf gyda phecyn Disbyddu rRNA NEBNext v2 (NEB, cath # E7400) i leihau rRNA o'r samplau. Paratowyd llyfrgelloedd dilyniannu RNA llinynnol gan ddefnyddio Pecyn Paratoi Llyfrgell RNA Cyfeiriadol Ultra II NEBNext ar gyfer Illumina (NEB, cath # E7760L). Cymhwyswyd llyfrgelloedd wedi'u puro ar TapeStation Agilent Technologies 4150 gan ddefnyddio assay ScreenTape D1000 (Agilent, cat# 5067-5582 a 5067-5583). Diffiniwyd molarity moleciwlau a addaswyd gan addasydd gan PCR meintiol gan ddefnyddio Pecyn Quant Llyfrgell Kapa Biosystems Kapa (Roche, cat # 07960140001). Cafodd llyfrgelloedd unigol eu normaleiddio i 5 nM wrth baratoi ar gyfer dadansoddiad dilyniant Illumina a'u dilyniannu ar NovaSeq 6000 gyda rhediad dilyniannu beiciau 150-pen pâr.
Dadansoddiad cytocin
Roedd BMDM yn cael eu hynysu a'u tyfu fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Platiau BMDM cwbl wahaniaethol ar 1 x 105 o gelloedd/ffynnon mewn 12-blatiau meithrin meinwe ffynnon. Ysgogwyd BMDMs gyda 100ng/mL LPS; 1 ug/mL Pam3Cysk; neu fflangell 1ug/mL. Ysgogwyd celloedd am 24 awr, casglwyd cyfryngau a'u cadw ar -20 C i'w dadansoddi. Dadansoddwyd cytocinau gyda Phanel Llid Llygoden LEGENDplex™ (13-plex) (Biolegend, cat# 740150). Dadansoddwyd data gan ddefnyddio meddalwedd dadansoddi data LEGENDplex™.
Dilyniant genyn rRNA 16s
Casglwyd pelenni fecal neu gynnwys ileal o lygod unigol a'u rhewi ar unwaith ar {{0}} gradd mewn tiwbiau cap sgriw 2mL yn cynnwys 250 mg o gleiniau garnet 0.15 mm (MoBio, cat# {{5 }}). Echdynnwyd DNA gan ddefnyddio Pecyn Ynysu DNA Power Fecal (MoBio neu QIAGEN), fesul cyfarwyddiadau cit, ac roedd yn cynnwys 2 gylchred o 1 munud o guro gleiniau ar 4 gradd ar Mini-Glain-Beater 16 (BioSpec Products). Mwyhawyd rhanbarthau V3 a V4 y genyn rRNA 16S gydag un rownd o PCR gan ddefnyddio paent preimio a oedd yn cynnwys (disgrifiwyd 3' i 5') dilyniant targedu genyn rRNA rhanbarth V3/4 rhanbarth 16S, pad niwcleotid 2- yn dilyn gan ddilyniannau paent preimio Illumina, dilyniant mynegai niwcleotid 8- a'r dilyniant addasydd Illumina sy'n weddill. Cymerwyd y dilyniannau targedu V3/4 16S-targed o Takahashi (Takahashi et al., 2014), a chymerwyd y Mynegeion o Kozich (Kozich et al., 2013). Y dilyniannau oligonucleotid llawn a ddefnyddiwyd oedd (mynegeion a ddynodwyd gan Xs): Prok16SV34_Ar gyfer: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Parch: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Roedd amodau beicio PCR fel a ganlyn: dadnatureiddio cychwynnol 98 gradd am 2 funud; 26 cylch o 20 eiliad dadnatureiddio 98 gradd, aneliad 20 eiliad 51.5 gradd, estyniad 20 eiliad 72 gradd; ac estyniad 72 gradd terfynol sengl am 2 funud. Gwnaethpwyd pob PCR (a berfformiwyd mewn triphlyg ar gyfer pob sampl) mewn cyfaint 25 ul gan ddefnyddio Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, cat # M0492L), 5 pmol o bob paent preimio a 50 ng DNA templed. Ar ôl ymhelaethu, cafodd PCRs triphlyg o bob sampl eu cronni, rhedwyd 5 ul ar gel agarose i gadarnhau ymhelaethu, a glanhawyd y cyfaint a oedd yn weddill gan ddefnyddio gleiniau glanhau Axygen AxyPrep MAG PCR (Corning, cat# MAG-PCR-CL{{53) }}) wedi'i wanhau i 62.5% mewn dŵr i gael gwared yn effeithlon ag unrhyw dimer paent preimio a fyddai'n cael ei ddilyniannu'n ffafriol. Ychwanegwyd gleiniau wedi'u gwanhau ar gyfaint 1.8X o'r adweithiau PCR, eu glanhau yn unol â chanllawiau'r gwneuthurwr a'r amplicons wedi'u glanhau wedi'u hegluro â 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8.0. Yna mesurwyd amplicons gyda assay pico green dsDNA (ThermoFisher, cath #P11495) ar ddarllenydd microplate, ac yna cafodd y llyfrgelloedd dilyniannu unigol wedi'u glanhau a'u mynegeio eu amlblecsu'n gyfartal (gan ng DNA) a'u dilyniannu ar offeryn Illumina MiSeq mewn parau modd beicio 300 yng nghyfleuster adnoddau a rennir Genomeg Trwybwn Uchel Sefydliad Canser Huntsman.
Prosesu data dilyniant biowybodeg
Cafodd darlleniadau amrwd genynnau rRNA 16S eu dad-amlblecsu gan ganiatáu 0 anghysondebau mewn mynegeion a gafodd eu prosesu a'u dadansoddi o fewn fframwaith QIIME2 (Bolyen et al., 2019) fel yr ydym wedi'i ddisgrifio'n flaenorol (Stephens et al., 2021). Yn gryno, cafodd dilyniannau wedi’u dad-amlblecsu ac wedi’u hidlo o ansawdd eu tocio gyntaf o ddilyniannau paent preimio a chysylltwyr gyda’r ategyn Cutadapt, yna eu dadwneud â DADA2 (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). Yna neilltuwyd tacsonomegau i ASVs gyda'r dull classifysklearn yn yr ategyn dosbarthwr nodwedd, yn erbyn y set gyfeirio GTDB (release89) wedi'i docio i'r rhanbarth V3/4 chwyddedig a'i hyfforddi gyda'r dull dosbarthwr-ffit-naïf-bayes (Bokulich et al. , 2018; Parks et al., 2018; Pedregosa et al., 2011). Cyfrifwyd metrigau amrywiaeth, pellteroedd, ac arwyddocâd ystadegol grwpiau amrywiaeth beta fesul permanova yn QIIME2 (Anderson, 2001).
Ar gyfer RNA-seq o BMDMs, roedd y darlleniadau crai o ansawdd yn gyntaf ac wedi'u tocio gan addasydd gan ddefnyddio llwyth trim, yna mesurwyd cyfrif trawsgrifiadau gan ddefnyddio Eog yn erbyn y trawsgrifiad o'r cynulliad GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{{{{}). 16}}17). Darllenwyd meintoliadau lefel trawsgrifiad i R gan ddefnyddio'r pecyn amser a'u crynhoi i gyfrif lefel genynnau cyn dadansoddi mynegiant gwahaniaethol gyda DESeq2 gan ddefnyddio'r fformiwla ddylunio '~ Genoteip + Triniaeth + Genoteip: Triniaeth' (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Roedd ymatebion gwahaniaethol i F. rodentium yn cynrychioli'r gwahaniaeth rhwng ymateb pob genoteip i driniaeth F. rodentium byw dros gelloedd a reolir gan gerbydau. Diffiniwyd genynnau wedi'u mynegi'n sylweddol wahaniaethol fel y rhai gyda gwerth-p wedi'i addasu < 0.05 a newid plyg log2 > |0.58| (1.5 plyg-newid). Yna defnyddiwyd rhestrau genynnau sydd wedi’u his-reoleiddio a’u huwchreoleiddio yn sylweddol i brofi am gyfoethogiad mewn termau ontoleg genynnau (GO) gan ddefnyddio’r pecyn clwstwrProfiler gan gynnwys y swyddogaeth symleiddio i leihau diswyddiad termau GO a nodi prosesau biolegol allweddol (S, 2020; Wu et al ., 2021).
F. her DSS rodentium
Tyfwyd F. rodentium fel y disgrifiwyd yn flaenorol a'i feintioli i 1 x 109 CFU/mL mewn PBS di-haint. Roedd F. rodentium yn sefydlog trwy olchi 2x yn gyntaf mewn PBS di-haint ac yna ei ail-ddarparu mewn 1mL 10% Fomalin-PBS am 10 munud. Yna cafodd celloedd eu golchi ddwywaith eto mewn PBS di-haint 10mL i baratoi ar gyfer gavage llafar. Roedd ansefydlog yn cael eu golchi fel celloedd sefydlog a'u cadw ar iâ nes y gavage. WT C57BL/6 SPF llygod wedi'u gagio ar lafar gyda 100uL o hydoddiant yn cynnwys naill ai PBS yn unig (cerbyd), F. rodentium (byw), neu F. rodentium (sefydlog) o ddyddiau -3 i 10. Rhoddwyd anifeiliaid 3.0% DSS ar ddyddiau 0-7; Roedd dŵr ffres DSS yn cael ei ddisodli bob yn ail ddiwrnod. Gosodwyd terfynau difrifoldeb o fwy na 20% o golli pwysau fel trothwy difrifoldeb. Ar ddiweddbwyntiau arbrofol, tynnwyd MLNs a cholon. Mesurwyd y colon o'r cecum i'r rectwm i ganfod yr hyd. Yna proseswyd meinweoedd ar gyfer histoleg, echdynnu RNA, neu ddadansoddiad cytometrig llif.
Assay ffagocytosis
Cafodd macroffagau peritoneol eu hynysu trwy chwistrellu 5mL o PBS Sterile i'r ceudod peritoneol. Roedd PBS yn cynhyrfu'n ysgafn tra yn y ceudod bob ychydig eiliadau. Ar ôl 2 funud, tynnwyd y PBS yn ôl gan ddefnyddio nodwydd 28 medr a'i ddosbarthu i DMEM cyflawn oer. Cafodd celloedd eu nyddu ar 367 xg a'u golchi mewn cyfrwng cyflawn. Yna cyfrifwyd celloedd â hemosytomedr a'u platio i 12-blatiau meithrin meinwe ffynnon ar grynodiad o 2.5 x 105 o gelloedd/mL. Caniatawyd i gelloedd lynu dros nos. Y diwrnod wedyn, cymysgwyd ffynhonnau'n ysgafn gan chwyrlïo a dyheuwyd y cyfryngau. Yna golchwyd celloedd ymlynol ddwywaith gyda 500uL o PBS oer, di-haint. Yna ychwanegwyd DMEM cyflawn wedi'i gynhesu ymlaen llaw yn cynnwys F. rodentium mewn MOI o 10 at adlyn (macrophages). Yna cafodd platiau eu nyddu'n ysgafn ar 200 xg, ar dymheredd yr ystafell am dri munud ac yna eu deor o dan amodau diwylliant cell safonol (37 C, 5% CO2) am 90 munud. Paratowyd F. rodentium fel y disgrifiwyd ar gyfer cyd-ddiwylliant BMDMs ar gyfer dilyniannu RNA yn unig, ar ôl golchi, cafodd celloedd eu hail-ddarparu mewn gwyrdd 1x Sybr® (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), yn RT am 20 munud. Yna cafodd celloedd bacteriol eu pelennu ar 4000 rpm am 5 munud eu hailddarparu gyda DMEM cyflawn a'u cynhesu ymlaen llaw ar gyfer macroffagau peritoneol. Ar ôl 90 munud o gyd-ddiwylliant, dyheadwyd y cyfryngau, a golchwyd celloedd ddwywaith gyda PBS oer, di-haint. Gosodwyd celloedd a oedd yn cynnwys F. rodentium â lliw gwyrdd Sybr® â 2% o baraformaldehyd (PFA) am 10 munud. Allsugnwyd PFA a gosodwyd PBS di-haint ar gelloedd. Yna cafodd celloedd eu delweddu ar gyfer ffagocytosis o F. rodentium
Dadansoddiad Delwedd Macrophage
Tynnwyd delweddau Brightfield a fflworoleuedd o ddiwylliannau macrophage wedi'u trin â F. rodentium gan ddefnyddio System Ddelweddu m7000 EVOS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Cymerwyd tri i bum delwedd ar wahân ar hap ar gyfer pob diwylliant, a gynhaliwyd mewn tri chopi.
Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).
CLEC12A-Fc adeiladu protein ymasiad and purificatiymlaen
Cafodd y cDNAs sy'n amgodio parthau allgellog llygoden Clec12a eu chwyddo gan PCR o gelloedd gwyn y gwaed wedi'u hynysu o fêr esgyrn C57Bl/6 WT SPF a'u cadarnhau trwy ddilyniannu. Cyfunwyd y cDNAs â therminws C IgG dynol1-Fc yn y fector mynegiant pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Trawsnewidiwyd lluniadau yn cynnwys Clec12a neu fector gwag i gelloedd Lx293 wedi'u meithrin â DMEM +10% FBS a Pen/strep (1mg/mL). Cafodd proteinau ymasiad cyfrinachol eu cynaeafu o'r cyfryngau 24-48 ar ôl eu trawsblannu. Cafodd y cyfryngau ei nyddu ar 367 xg am 5 munud i gael gwared ar falurion/celloedd marw, a chafodd y supernatant ei rewi ar -20 C nes ei ddefnyddio. Cafodd proteinau ymasiad Clec12a-Fc neu Fc-yn-unig eu hynysu â Phecyn IP/Cyd-IP Magnetig Clasurol Pierce™ (Thermo Fisher Scientific, Rhif Catalog: 88804), wedi’i feintioli â Phecyn Assay Protein BCA Pierce™ (rhif Catalog Gwyddonol Thermo Fisher: 23227) a chadarnhawyd gan blot gorllewinol gan ddefnyddio gwrthgorff gwrthClec12a (Novus Biologicals NBP2-27346SS).
Clec12a-Fc-rhwymo assay
Gwanhawyd lluniadau wedi'u puro i 0.4 mg/mL yn HBSS w/ Ca2+ a Mg2+. Tyfwyd bacteria yn eu hamodau cyfryngol ac aerobig priodol a'u normaleiddio gan OD 600nm. Cafodd bacteria eu golchi gyda HBSS w/ Ca2+ a Mg2+ a'u rhwystro â HBSS w/ Ca2+ a Mg2+ +10% FBS am 20 munud yn RT. Cynhaliwyd yr holl weithdrefnau staenio o dan amodau atmosfferig. Rhoddwyd 1 x 107 o gelloedd bacteria mewn 96-plât ffynnon gwaelod crwn, eu troelli ar 3,000 xg, a'u hardywallt. Rhoddwyd 50uL o luniadau ar gelloedd bacteria, eu cymysgu'n ysgafn, a'u deor ar 4 C am 1 awr. Cafodd celloedd bacteria eu golchi gyda HBSS w/ Ca2+ a Mg2+ + 10% FBS, 2x. Ychwanegwyd 50uL o Fc gwrth-ddynol gafr (PE) (Catalog ebiowyddoniaeth # 12-4998-82) at gelloedd a'i ddeor ar 4 C am 1 awr, yn y tywyllwch. Yna golchwyd celloedd fel o'r blaen a'u gosod yn HBSS w/ Ca2+ a Mg2+ yn cynnwys 1x Sybr® green (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Deorwyd celloedd yn RT am 20 munud yn y tywyllwch a'u darllen ar unwaith ar sytomedr llif Fortessa BD LSR.
Arbelydru ac ailgyfansoddi mêr esgyrn
Cynaeafwyd mêr esgyrn o anifeiliaid WT a Clec12a-/- fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Cafodd llygod derbynnydd eu harbelydru'n angheuol gyda 500 Rads ar y diwrnod -1, ac yna 400 Rads ar ddiwrnod 0. Pedair awr ar ôl yr arbelydru diwethaf, rhoddwyd llygod derbynnydd o dan anesthetization isoflurane, a 100uL o rai ynysig Dosbarthwyd celloedd mêr esgyrn mewn daliant mewn PBS di-haint (1 x 108 cell/ml) trwy nodwydd 28.5 mesur i'r gofod ôl-orbitol. Roedd gennym ddiddordeb yn y microbiota felly ni roddwyd anifeiliaid ar wrthfiotigau, ac ar ôl 8 wythnos casglwyd pelenni fecal ar gyfer trosglwyddo microbiota i anifeiliaid GF.
CYFEIRIADAU
Anderson, MJ (2001). Dull newydd ar gyfer dadansoddiad aml-amrywedd heb fod yn baramedrig o amrywiant. Ecol Awstralia. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.
Dechreuwyd, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, et al. (2015). Genomeg integredig o amrywiad risg clefyd Crohn
yn nodi rôl i CLEC12A mewn awtophagi gwrthfacterol. Cell Rep. 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045 .
Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF, ac Artis, D. (2017). Rheoleiddio llid gan ryngweithiadau microbiota gyda'r gwesteiwr. Nat. Imiwnol. 18, 851-860. 10.1038/ddim.3780.
Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA, a Caporaso, JG (2018). Optimeiddio dosbarthiad tacsonomig o ddilyniannau amplicon genyn marcio gydag ategyn QIIME 2 ''sq2-feature-classifier. Microbiome 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.
Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., et al. (2019). Gwyddor data microbiome atgynhyrchadwy, rhyngweithiol, graddadwy ac estynadwy gan ddefnyddio QIIME 2. Nat. Biotechnol. 37, 852-857. 10.1038/s41587-019-0209-9.
Brown, GD, Willment, JA, a Whitehead, L. (2018). Lectinau math C mewn imiwnedd a homeostasis. Nat. Parch Immunol. 18, 374-389. 10.1038/s41577-018-0004-8.
Browne, HP, Forster, SC, Anonye, BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., a Lawley, TD (2016). Mae meithrin microbiota dynol 'anddiwylliannol' yn datgelu tacsa newydd ac ysbeilio helaeth. Natur 533, 543-+. 10.1038/natur 17645.
Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., et al. (2008). Rôl allweddol ar gyfer awtophagi a'r genyn awtophagi Atg16l1 yng nghelloedd y llygoden a'r coluddion Paneth dynol. Natur 456, 259-263. 10.1038/natur07416.
Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA, a Holmes, SP (2016). DADA2: Casgliad sampl cydraniad uchel o ddata amplicon Illumina. Nat. Dulliau 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.
Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., a Garrett, WS (2022). Mae Faecalibaculum rodentium yn ailfodelu signalau asid retinoig i reoli cartrefostasis epithelial coluddol sy'n ddibynnol ar eosinoffiliau. Gwesteiwr cell & microb 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.
Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK, a Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. tach., sp. Tach., wedi'i ynysu o feces llygoden labordy. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10.1007/s10482-015-0583-3.
Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., et al. (2017). Mae aelod o'r perfedd mycobiota yn modiwleiddio metaboledd purin gwesteiwr gan waethygu colitis mewn llygod. Sci. Cyfieithiad. Med. 9, .
Drouin, M., Saenz, J., a Chiffoleau, E. (2020). Derbynyddion tebyg i lectin Math C: Pen neu gynffon mewn imiwnedd marwolaeth celloedd. Blaen. Imiwnol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.
Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H., a Zoetendal, EG (2021). Sefydlogrwydd a gwytnwch microbiome perfedd: egluro'r ymateb i aflonyddwch er mwyn modiwleiddio iechyd y perfedd. Perfedd 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.
Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C., ac Eliopoulos, AG (2014). Y microbiota perfedd mewn modelau llygoden o glefyd y coluddyn llid. Ffiniau mewn Microbioleg Cellog a Heintiau 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.
Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T., a Cao, XT (2004). Mae KLRL1, derbynnydd cell lladdwr newydd tebyg i lectin, yn atal sytowenwyndra celloedd lladd naturiol. Gwaed 104, 2858-2866. DOI 10.1182/gwaed-2004-03-0878.
Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012). Mae rhyngweithiadau rhwng ffyngau cymesurol a'r derbynnydd lectin math C Dectin-1 yn dylanwadu ar colitis. Gwyddoniaeth 336, 1314-1317. 10.1126/gwyddoniaeth.1221789.
Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell a June L. Rownd (2015). Mae amrywiad MHC yn cerflunio cymunedau microbaidd unigol sy'n rheoli tueddiad i haint enterig. Cyfathrebu Natur. 0.1038/ncomms9642.
Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F., a Rock, KL (2010). Mae asid wrig yn hyrwyddo ymateb llidiol acíwt i farwolaeth celloedd di-haint mewn llygod. J. Clin. Buddsoddi. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.
Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK, a Schloss, PD (2013). Datblygu Strategaeth Dilyniannu Mynegai Deuol a Phiblinell Curaduro ar gyfer Dadansoddi Data Dilyniant Amplicon ar Lwyfan Dilyniannu MiSeq Illumina. Microbioleg Gymhwysol ac Amgylcheddol 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.
Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM, a Round, JL (2015). Mae signalau MyD88 mewn celloedd T yn cyfeirio rheolaeth trwy gyfrwng IgA ar y microbiota i hybu iechyd. Cell Host Microb 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.
Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS, a Ruland, J. (2019). Mae'r derbynnydd grisial asid wrig Clec12A yn cryfhau ymatebion interfferon math I. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.
Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., et al . (2015). Mae dadansoddiadau cymdeithas yn nodi 38 o loci tueddiad ar gyfer clefyd y coluddyn llidiol ac yn amlygu risg genetig a rennir ar draws poblogaethau. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.
Love, MI, Huber, W., ac Anders, S. (2014). Amcangyfrif wedi'i gymedroli o newid plyg a gwasgariad ar gyfer data RNA-seq gyda DESeq2. Genom Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.
Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M., a Patro, R. (2020). Tximeta: Gwiriadau dilyniant cyfeiriol ar gyfer adnabod tarddiad mewn RNA-seq. Plos Bioleg Gyfrifiadurol 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.
Luo, Y., Tucker, SC, a Casadevall, A. (2005). Mae actifadu derbynnydd Fc- ac ategu yn ysgogi dilyniant cylchred celloedd macrophage o G1 i SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.
Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H., a Zinkernagel, RM (2000). Mecanwaith cell-T cyntefig o ymatebion IgA mwcosaidd berfeddol i facteria commensal. Gwyddoniaeth 288, 2222-+. DOI 10.1126/gwyddoniaeth.288.5474.2222.
Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH, a Lepenies, B. (2014). Llwyfan i sgrinio ar gyfer carbohydradau sy'n rhwymo derbynyddion lectin math-C a'u potensial ar gyfer targedu celloedd-benodol a modiwleiddio imiwnedd. Dyddiadur Rhyddhad Rheoledig 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.
Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S., a Brown, GD (2004). Nodi a nodweddu derbynnydd tebyg i lectin c-math-c dynol newydd Myeloid sy'n cael ei fynegi'n bennaf ar granulocytes a monocytes. J. Biol. Cemeg. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.
Martin, M. (2011). Mae Cutadapt yn Dileu Dilyniannau Addasydd o Ddilyniannu Trwybwn Uchel yn Darllen. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, AS, et al. (2019). Mae Synhwyro Microbiota gan Echel Mincle-Syk mewn Celloedd Dendritig yn Rheoleiddio Cynhyrchu Interleukin-17 a -22 ac yn Hyrwyddo Uniondeb Rhwystrau Coluddol. Imiwnedd 50, 446-461 e449. 10.1016/j.imiwni.2018.12.020.
Martinon, F., Petrilli, V., Maer, A., Tardivel, A., a Tschopp, J. (2006). Mae crisialau asid wrig sy'n gysylltiedig â gowt yn actifadu'r inflammasome NALP3. Natur 440, 237-241. 10.1038/natur04516.
Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Mab, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). Mae IgA yn rheoleiddio cyfansoddiad a swyddogaeth metabolig microbiota perfedd trwy hyrwyddo symbiosis rhwng bacteria. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.
Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , et al. (2014). Mae Clec12a yn dderbynnydd ataliol ar gyfer crisialau asid wrig sy'n rheoleiddio llid mewn ymateb i farwolaeth celloedd. Imiwnedd 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.
Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et al. (2016). Mae IgA monoclonaidd affinedd uchel yn rheoleiddio microbiota'r perfedd ac yn atal colitis mewn llygod. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.
Pabst, O., a Slack, E. (2020). IgA a'r microbiota berfeddol: pwysigrwydd bod yn benodol. Immunol Mwcosol. 13, 12-21. 10.1038/s41385-019-0227-4.
Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, a Hugenholtz, P. (2018). Mae tacsonomeg bacteriol safonol sy'n seiliedig ar genom ffylogene yn adolygu coeden bywyd yn sylweddol. Nat. Biotechnol. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.
Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, a Kingsford, C. (2017). Mae eog yn darparu meintioliad cyflym a ymwybodol o fynegiad trawsgrifiad. Nat. Dulliau 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.
Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-lear: Dysgu Peiriannau yn Python. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.
Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, a Brown, GD (2008). Nodweddu MICL murine (CLEC12A) a thystiolaeth ar gyfer ligand mewndarddol. Eur. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.
Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). Mae'r derbynnydd lectin math-C CLEC12A yn cydnabod hemozoin plasmodial ac yn cyfrannu at ddatblygiad malaria yr ymennydd. Cell Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015 .
Ray, A., a Dittel, BN (2015). Cydberthynas rhwng dysbiosis ym microbiota'r perfedd oherwydd diffyg imiwnedd a threiddiad clefyd colitis. Imiwnoleg 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.
Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, et al. (2016). Mae MICL yn rheoli llid mewn arthritis gwynegol. Ann. Rheum. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.
