Mae Mynegiant Clr-f yn Rheoleiddio Homeostasis Imiwnedd Arennau A Metabolaidd Ⅲ
Nov 24, 2023
Trafodaeth
Infammation ac imiwnedd cell-mediateddifrod yn chwarae rhan flaenllaw yn natblygiad a dilyniant anaf arennol a chamweithrediad. Yn yr astudiaeth hon, rydym yn adrodd am ofyniad i Clr-f wrth gynnal a chadwiechyd yr arennaua swyddogaethfel rheolaeth homeostatig gynhenid yn erbyndifrod arennol wedi'i gyfryngu gan imiwn a metabolig. Mae ein canfyddiadau yn dangos ymdreiddiad celloedd imiwnedd, ac imiwnoglobwlin ac yn ategu dyddodiad protein yn arennau llygod diffygiol Clr-f. Mae'r nodweddion imiwnedd hyn o lygod diffygiol Clr-f yn cael eu paru ag ymddangosiad briwiau tiwbaidd a glomerwlaidd sy'n gysylltiedig ag oedran, cronni lipidau ectopig, a dadreoleiddio prosesau trawsgrifio niferus.
Cliciwch i cistanche herba ar gyfer clefyd yr arennau
Mae'r proteinau Clr sydd wedi'u hamgodio o fewn y NKC ymhlith eu derbynyddion NKR-P1 sy'n gysylltiedig yn enetig wedi bod yn ffocws astudiaeth fel cyfryngwyr dosbarth I-annibynnol MHC nad ydynt yn ddiangen o hunan-adnabod coll gan NKR-P1 yn mynegi celloedd imiwn9,27-31. Adroddir hefyd bod mynegiant cynyddol proteinau Clr dethol mewn ymateb i straen celloedd yn atal yn swyddogaethol ymatebion imiwn celloedd imiwnedd sy'n byw mewn meinwe7,12,32. Yn unol â hynny, roedd Clr-f berfeddol yn barod i gyfrannu at oddefgarwch imiwnedd o fewn amgylchedd y perfedd hynod imiwnogenig trwy ei ryngweithio â'r lymffocytau mewnepithelaidd sy'n mynegi derbynyddion NKR-P1G7 ataliol7. Gwaith a wnaed gan Leibelt et al. yn dangos bod llygod a heriwyd gyda poly(I:C) yn arddangos mwy o fynegiant Clr-f a bod rhyngweithiadau Clr-f/NKR-P1G in vitro yn rhwystrol cryf i gelloedd mynegi NKR-P1G. Gyda'i gilydd, gellir dehongli'r canfyddiadau hyn fel mecanwaith posibl lle gall Clr-f atal adweithedd is-setiau positif NKR-P1G intraepithelial berfeddol tuag at y rhwystr epithelial sy'n cael ei ysgogi'n gyson gan ysgogiadau microbaidd7.
Rhoddodd y genhedlaeth o lygod diffygiol Clr-f y cyfle cyntaf i ni asesu'rgoblygiadau swyddogaetholo fynegiant Clr-f in vivo ac yn caniatáu i ni ymchwilio i rolau homeostatig imiwnedd posibl Clr-f yn yr aren. Mae'r difrod i'r arennau a welwyd mewn llygod Clr-f -/ - yn cyd-fynd â'r model bod is-reoleiddio Clr-f yn ddangosydd o straen ac anaf celloedd sy'n rhyddhau cyfyngiadau ar gelloedd effeithydd sy'n mynegi NKR-P1G. Mae'r cynnydd yn NKR-P1G ar gelloedd T yn arennau Clr-f - / - llygod yn awgrymu naill ai bod mynegiant NKR-P1G yn cynyddu ymhlith celloedd T preswyl yr arennau yn absenoldeb Clr-f, neu fod arennau Clr- f -/ - mae llygod yn destun ymdreiddiad i gelloedd T sy'n mynegi NKR-P1G. Gallai absenoldeb newid canfyddadwy ym mhresenoldeb neu ddosbarthiad celloedd NKR-P1G-mynegi ym mherfedd Clr-f - / - llygod nodi bod canlyniadau swyddogaethol y rhyngweithio NKR-P1G: Clr-f yn y perfedd yn gyfyngedig i reoli adweithedd imiwn yng nghyd-destun haint yn hytrach na goddefgarwch imiwn. Fel arall, gall rhyngweithiadau diangen hefyd reoli gweithgaredd celloedd mynegi NKR-P1G. Ategir hyn gan ganfyddiadau bod NKR-P1G yn rhwymo nid yn unig i Clr-f ond hefyd i Clr-d a Clr-g33, y mae'r olaf ohonynt wedi'i fynegi'n gymedrol ym meinweoedd yr aren a'r perfedd6. Er bod ein canfyddiadau'n datgelu gofyniad i Clr-f amddiffyn rhag niwed i'r arennau awtoimiwn, mae rôl cyfryngol NKR-P1G yn patholegau arennau hunanimiwn Clr-f - / - llygod yn anghyflawn. Yn nodedig, er bod cynnydd mewn celloedd T sy'n mynegi NKR-P1G yn aren Clr-f - / - llygod, mae'r gwahaniaeth yn fychan. Mae'n bosibl bod derbynnydd amgen yn cymryd rhan yn y gwyliadwriaeth o Clr-f yn yr aren. Er mwyn mynd i'r afael yn llawn â'r echel hon o reolaeth mewn homeostasis arennau, mae angen ymchwiliadau pellach
Nodweddir niwed i'r arennau sy'n cael ei gyfryngu gan imiwnedd gan ymdreiddiad o gelloedd llidiol i'r gofod rhyng-ranol neu i'r glomerwlws34. Mae croniadau arennol monocytes, celloedd B a T, gwrthgyrff gwrth-glomerwlaidd, cytocinau IL-12 ac IFN uchel, a phatholegau glomerwlaidd amrywiol mewn llygod Clr-f−/- yn debyg iawn i dirwedd hunanimiwn y modelau llygoden LN ( hy, MRL-Faslpr)35–37. Er bod yr arennau Clr-f−/− yn arddangos dyddodion mesangial dominyddol IgA gyda dyddodiad IgM ac IgG cysylltiedig, a chlystyru proffiliau trawsgrifio Clr-f−/− ac IgAN, mae’n gynamserol debygol i awgrymu bod y ffenoteipiau hyn yn arwydd o fath o CKD ag IgAN38. Yn hytrach, mae'r anafiadau hyn, ynghyd â phresenoldeb mesangiolysis, tewychu GBM, a marwolaeth podocyte yn yr arennau Clr-f - / - yn ogystal â newidiadau tubulointerstitial, cronni braster, a'r dadreoleiddio sylweddol mewn llwybrau metabolaidd yn elfennau sy'n gyffredin i amrywiaeth o batholegau. yn deillio o ddiffygion metabolig a waethygwyd gan y system imiwnedd37,39,40. Waeth beth fo'r achos sylfaenol neu'r math o afiechyd o gamweithrediad arennau'r llygoden Clr-f−/-, mae'n ymddangos bod Clr-f yn chwarae rhan lliniarol yn erbyn datblygiad hunanimiwnedd gyda phatholeg glir sy'n gysylltiedig â glomerulonephritis.
Mae ein harchwiliad o'r llygod Rag1 -/ -Clr-f - / - yn dynodi cyfraniad amlwg cyfryngwyr cell-annibynnol T a B i ymatebion hunanimiwn llygod Clr-f - / -. Yn benodol, roedd y casgliad o gelloedd periglomerwlaidd CD11c+, celloedd F4/80+, a chelloedd NKp46+ hyd yn oed yn fwy amlwg yn absenoldeb celloedd T a B ac yn cydberthyn â phresenoldeb sylweddol o ddifrod glomerwlaidd. Mae hyn yn awgrymu, er y gall celloedd T a B gyfrannu at haint sy'n niweidio'r arennau a chymhlethdodau awto-wrthgyrff, mewn llygod Clr-f-/ - efallai nad yw'r rhain yn benderfynyddion canolog patholeg, ond naill ai'n cyfrannu'n eilaidd at weithgaredd llidiol celloedd imiwn eraill neu o bosibl gwasanaethu rôl imiwn-reoleiddio mewn llygod sydd â diffyg Clr-f. Mae hyn yn cyferbynnu tystiolaeth o fodel llygoden ddY o IgAN sy'n dangos ymateb polariaidd T1 cryf, gyda chelloedd T sy'n cynhyrchu IFN yn cynyddu gydag oedran a dilyniant anaf glomerwlaidd41. Mae ymdreiddiad arennol celloedd B mewn llygod diffygiol Clr-f hefyd wedi'i ddangos mewn modelau llygoden o SLE42. Hyd yn hyn, nid yw’n glir a yw celloedd B yn yr aren yn cyfrannu at y niwed niweidiol mewn CKD neu’n chwarae mwy o rolau rheoleiddio43. Canfu tystiolaeth ddiweddar o CKD mewn cleifion oedrannus fod gostyngiadau ym mhoblogaethau celloedd B yn gysylltiedig â datblygiad clefyd yr arennau44. Dangoswyd bod tystiolaeth o gelloedd T a B yn cynnwys gweithgarwch imiwn-ataliol mewn clefydau arennau awtoimiwn45,46, ac felly mae angen ymchwilio ymhellach i ba raddau y maent yn cyfrannu neu'n rheoleiddio patholegau Clr-f−/- llygod.
Mae ein canfyddiadau gyda'i gilydd yn dangos gofyniad am fynegiant Clr-f yn epitheliwm tiwbaidd y tiwbiau troellog procsimol, podocytes, a/neu'r epitheliwm berfeddol. Mae colli mynegiant Clr-f yn arwain at raeadru awtoimiwn a llidiol amlwg sy'n arwain at niwed i'r arennau a diposity cysylltiedig. Mae'n ymddangos bod yr ymatebion imiwn sy'n deillio o golli Clr-f yn annibynnol ar gelloedd T a B. Yn gyffredinol, gellir rhagweld rôl swyddogaethol ar gyfer Clr-f yn yr aren fel moleciwl ataliol ar gyfer celloedd imiwnedd sy'n effeithio ar wyliadwrus yn yr aren fel y'i lleolir yn y perfedd, neu felrheolydd cynhenid swyddogaeth celloedd tiwbaidd.
Defnyddiau a dulliau Llygod.
Roedd yr holl lygod yn cael eu cynnal a'u cadw mewn amgylchedd pwrpasol heb bathogenau. Prynwyd llygod C57BL/6 (WT) a B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) o Labordy Jackson (Bar Harbour, ME, UDA). Cynhyrchwyd llygod sy'n cario'r treigladau nwl cyfun yn Rag1 a Clr-f (Rag1 -/ -; Clr-f -/ -) trwy groesi llygod Clr-f-defcient (Clr f -/ - -) gyda llygod (Rag1 -/ -) . Roedd yr holl fridio a thrin anifeiliaid yn unol â chanllawiau'r brifysgol ac wedi'u cymeradwyo gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Prifysgol Dalhousie a Phwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol (IACUC) Prifysgol Ottawa. Cynhaliwyd yr holl gynlluniau astudio anifeiliaid, arbrofion ac adroddiadau yn unol â chanllawiau ARRIVE.
Cynhyrchu llygod diffygiol Clr-f. Cynhyrchwyd llygod clr-f-ddiffygiol (Clr-f −/ -) trwy ailgyfuniad homologaidd o lun targedu sy'n cynnwys casét ffosffoglycerate kinase (PGK)-neomycin llwynog a dilyniant genomig yn rhychwantu exons 3, 4, a rhan o exon 5 o'r Genyn Clr-f. Cadarnhawyd y lluniad targedu cyflawn trwy ddilyniannu yn Sefydliad Ymchwil Ysbytai Ottawa (OHRI) cyn electroporeiddio i gelloedd bonyn embryonig C57BL/6 Bruce{-4. Perfformiwyd detholiad clon ES gan G{{1{0}}resistance gan Gyfleuster Craidd Trawsgenig IRCM (Sefydliad Ymchwil Clinigol Montreal) (Montreal, QC, Canada). Yn y cyfamser, profwyd y stilwyr 5′ a 3′ Clr-f mewn dadansoddiad polymorphism hyd darn cyfyngiad (RFLP) gan ddefnyddio DNA genomig thymig o lygoden WT B6, a gafodd ei dreulio gyda BamHI a PstI, yn y drefn honno. Cafodd darnau DNA wedi'u treulio eu datrys ar gel agarose 1% a'u trosglwyddo i flotiau bilen neilon. Cafodd stilwyr Clr-f cDNA eu labelu â 32P-dCTP ymbelydrol (Perkin Elmer, Guelph, ON, Canada) gan ddefnyddio pecyn lot NEB (New England Biolabs, UDA). Archwiliwyd blotiau gyda chwiliedyddion cDNA Clr-f wedi'u labelu â 32P mewn datrysiad hybrideiddio (10% (w/v) dextran sulfate; 1 M NaCl; 1% SDS). Cynhaliwyd hybrideiddio dros nos ar 65 gradd a pherfformiwyd golchiadau ôl-hybrideiddio gyda datrysiad sy'n cynnwys 2 × SSC a 1% SDS wedi'i gynhesu ymlaen llaw i 65 gradd. Roedd te blots yn agored i ffilmiau ffotograffig i ddatgelu'r signalau hybrideiddio (Ffigs. S1A, S3B). Cafodd y pilenni eu tynnu gyda 0.2% SSC/0.2% SDS am 30 munud ar 85 gradd rhwng gwahanol hybrideiddiadau. Sgriniwyd clonau gwrth-nomycin gan ddadansoddiad blot y De, a gwelwyd effeithlonrwydd targedu o ~15%. Cafodd clonau ES dethol eu micro-chwistrellu i blastocysts yng Nghyfleuster Gwasanaeth Micro-chwistrellu IRCM i gynhyrchu'r llygod sylfaenydd Clr-flox chimerig. Cafodd y llygod eu sgrinio gan ddadansoddiad blot y De ac yna cawsant eu bridio gyda benywod B6 i gynhyrchu llygod heterosygaidd Clr-fwt/lox. Cafodd llygod heterosygaidd eu rhyngfridio i gael llygod Clr-flox/lox. I gael gwared ar y casét neomycin, cafodd llygod Clr-flox/lox eu bridio â llygod trawsgenig homosygaidd CMV-cre ar gefndir B6 (Labordy Jackson). Y CMV-CreTg/0 heterosygaidd dwbl dilynol; Roedd clr-f -/+ llygod wedi'u rhyngfridio i gynhyrchu Clr-f -/ - llygod oedd heb y trawsgene CMV-cre. Cafodd llygod eu genoteipio gan ddefnyddio paent preimio penodol (Tabl 1, Ffig. S1B, C, a Ffig. S3C, D). Perfformiwyd ymhelaethiad PCR gan ddefnyddio polymeras DNA AccuStart II Taq (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, UDA). Paratowyd y cymysgedd PCR gan ddilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Defnyddiwyd DNA clust wedi'i dynnu o ffenol/clorofform fel templedi. Defnyddiwyd y paramedrau beicio PCR canlynol: 30 cylch ymhelaethu o 94 gradd am 40 s, 60 gradd am 45 s, 72 gradd am 60 s. Defnyddiwyd WT a Clr-f −/− sbwriel ym mhob arbrawf oni nodir yn wahanol.
Croesrywio yn y fan a'r lle.
Cyflawnwyd dadansoddiadau hybrideiddio yn y fan a'r lle o Clr-f trwy glonio'r llinyn synnwyr hyd llawn CDS a llinyn antisense sy'n rhychwantu Clr-f yn fector Hawdd pGEM-T fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Trawsgrifiwyd stilwyr RNA antisense a synnwyr digoxi wedi'u labelu â genin o plasmidau llinol gan amgodio'r genyn Clr-f â T7 polymeras gan ddefnyddio cymysgedd labelu DIG RNA (Roche, Basel, y Swistir). Casglwyd meinweoedd o lygod B6 oedolion ac fe'u gosodwyd naill ai mewn 10% formalin ar RT neu mewn paraformaldehyd 4% ar 4 gradd gydag ysgwyd ysgafn am hyd at 24 h. Yna gosodwyd meinweoedd mewn paraffin a pharatowyd darnau 4 µm ar sleidiau gwydr. Cafodd sleidiau meinwe eu dadgarboneiddio trwy driniaeth â 0.2 N HCl am 15 munud a 30 µg/mL o broteinas K ar 37 gradd am 20 mun. Gosodwyd meinwe mewn 4% PFA am 10 munud ac yna triniaeth ag anhydrid asetig 0.25% mewn 0.1 M triethanolamine ddwywaith am 5 munud yr un. Yna cafodd sleidiau eu rhag-hybrideiddio gyda hydoddiant hybrideiddio (50% (v/v) formamide/5×SSC, pH 4.5; 2% (w/v) powdr blocio (Roche); 0.05% (w/v)) CHAPS; 5 mM EDTA; heparin 50 µg/ mL; RNA burum 1 µg/mL) mewn popty 58 gradd am o leiaf 1 h, ac yna wedi'i ddeor â hydoddiant hybrideiddio sy'n cynnwys chwiliedydd 500 ng/mL wedi'i labelu â digoxigenin dros nos ar 58 gradd. Perfformiwyd golchiadau ôl-hybrideiddio gyda 50% formamide / 2 × SSC, pH 4.5 ar 55 gradd 3 × am 20 munud yr un, a chafodd sleidiau eu staenio â gwrthgorff cyfunol ffosffatase alcalïaidd gwrth-digoxigenin defaid ar wanhau 1:1000 mewn toddiant blocio ( Roche). Perfformiwyd datblygiad lliw trwy ychwanegu swbstradau nitro blue tetrazolium/5-Bromo, 4-chloro, a 3-indoylphosphate (NBT/ BCIP, Roche) at y sleidiau. Cadwyd sleidiau yn y tywyllwch yn RT nes bod y signalau gorau posibl yn ymddangos. Perfformiwyd labeli rheolaeth gan ddefnyddio chwiliedydd llinyn synhwyrau ac astudiaethau rhwymo cystadleuol gyda stiliwr synnwyr a gwrthsynnwyr yn cadarnhau penodoldeb. Yna cafodd y sleidiau eu gwrth-staenio â gwyrdd golau neu wyrdd methyl a'u delweddu o dan ficrosgop golau.
RT-PCR. Cafodd meinweoedd arennau o WT a Clr-f −/- sy'n cyfateb i oed a rhyw eu tynnu allan, eu rinsio â PBS, a'u rhewi ar -80 gradd . Cafodd RNA ei ynysu o feinweoedd wedi'u rhewi gan ddefnyddio adweithydd echdynnu RNA RiboZol (AMRESCO Inc., Gorllewin Caer, PA, UDA) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Trawsgrifiwyd tua 1 ug o RNA i cDNA gan ddefnyddio pecyn Verso cDNA (Thermo Scientific, Waltham, MA, UDA). Perfformiwyd ymhelaethiad PCR ar 1 μL o gynnyrch cDNA gan ddefnyddio paent preimio penodol (Tabl 1). Yr amodau PCR a ddefnyddiwyd oedd 94 gradd am 30 s, 58 gradd am 30 s, 72 gradd am 60 s, a 35 o gylchoedd ymhelaethu. Cafodd cynhyrchion PCR eu delweddu ar gel agarose 1% wedi'i staenio â bromid ethidium (Ffig. 1 C, Ffig. S3A).
Imiwnohistocemeg.
Cafodd meinweoedd yr arennau o WT a Clr-f −/− sy'n cyfateb i oed a rhyw eu dadbaraffinio gan dri deoriad 5 munud mewn sylene, dau ddeoriad 5 munud mewn 100% ethanol, ac yna 90 % ethanol, yna 80% ethanol, ac yn olaf 70% ethanol. Ailhydradwyd sleidiau trwy olchi mewn dŵr distyll (20 dips), a pherfformiwyd adalw epitope a achosir gan wres gan ddefnyddio popty pwysedd mewn byffer citrad (pH 6.0). Cafodd perocsidasau mewndarddol eu rhwystro â 3% hydrogen perocsid mewn dŵr di-haint am 10 munud, a rhwystrwyd proteinau gan ddefnyddio Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, UDA). Yna deorwyd adrannau â gwrthgyrff gwrth-Clr-f monoclonaidd gwrth-lygoden7 ar 4 gradd dros nos. Y diwrnod wedyn, rinsiwyd y sleidiau â 0.1 M PBS a'u deor am 1 h mewn gwrthgyrff eilaidd. Datblygwyd staenio gan ddefnyddio pecyn HRP-Polymer Goat-on-Rodent (Biocare Medical) a Betazoid DAB Bufer (Biocare Medical), ac yna gwrth-staenio hematocsilin. Defnyddiwyd yr un broses i staenio adran meinwe arennol ar gyfer labelu IHC o gelloedd NKp46+ a CD{3+, gan ddefnyddio gwrth-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, USA, clôn 29A1.4, CAT# 48-3351-82) a gwrth-CD3 (BioLegend CAT#100,327) yn y drefn honno fel gwrthgyrff cynradd. Perfformiwyd labeli IHC o F4/80 ar adrannau arennau wedi'u rhewi gan ddefnyddio gwrthgorff monoclonaidd BM8 gwrth-F4/80 llygod mawr. Defnyddiwyd gwrthgorff eilaidd cyfunedig IgG H&L HRP gwrth-lygoden gafr (Abcam, Caergrawnt, UK CAT#ab97057) fel yr uchod a datblygwyd IHCs gyda swbstrad marchruddygl peroxidase (HRP) yn cael ei ddefnyddio DAB Substrate Kit (Abcam, CAT# ab64238).
Immunofluorescence.
Cafodd meinweoedd arennau a/neu berfeddol llygod WT a Clr-f -/- sy'n cyfateb i oed a rhyw eu cadw'n gryop mewn 30% swcros ar −80 gradd mewn cyfansoddyn tymheredd torri optimaidd Meinwe-Tek (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, UDA). Gosodwyd adrannau cryostat 20 μm gydag aseton mewn cwfl mygdarth ar dymheredd yr ystafell am 16 munud a'u sychu am o leiaf 30 munud, ar ôl golchi mewn 0.01 M PBS, pH 7.4. Rhwystrwyd rhwymiad amhenodol gyda serwm asyn o 10%. Deorwyd adrannau dros nos ar 4 gradd gyda'r gwrthgyrff cynradd: gwrth-Clr-f7, gwrth-NKR-P1G (gwrthgorff monoclonaidd gwrth-lygoden a ddisgrifiwyd yn flaenorol7 ), gwrth-IgA (gadwyn alffa IgA gwrth-lygoden gafr (Abcam, Caergrawnt). , UK CAT#ab97235), gwrth-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, UDA CAT # 405324, gwrth-IgM-FITC (Technolegau Bywyd, Carlsbad, CA, UDA CAT #A21042), Ategu corff gwrth C3 (11H9) ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), gwrth-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), gwrth-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), gwrth-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), gwrth-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), gwrth-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116), a gwrth-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) ar grynodiad 1:100 mewn serwm arferol o 5% mewn siambr llaithedig. Labelu gwrthgyrff eilaidd o wrthgyrff. Perfformiwyd gwrthgyrff -Clr-f a gwrth-NKR-P1G gan ddefnyddio gwrthgyrff polyclonaidd cyfun FITC yn RT ar gyfer deoriad 1 h. Samplau oedd staen niwclear DAPI yn RT am 5 munud, ei olchi gyda PBS, a'i osod ar sleidiau gwydr gydag un diferyn o VECTASHIELD PLUS cyfryngau mowntio gwrth-ffâd (Vector Laboratories, San Francisco, CA, UDA) ac wedi'i orchuddio â slip clawr gwydr. Archwiliwyd sleidiau gan ddefnyddio microsgop confocal sganio laser Zeiss LSM 510.
Sgorio histoleg a phatholeg.
Roedd adrannau arennau o WT sy'n cyfateb i oed a rhyw, Clr-f -/ -, Rag1 - / - a Rag1 - / - Clr-f - / - llygod (3 μm) wedi'u staenio ag asid Cyfnodol-Schif (PAS). Aseswyd meinwe arennol ar gyfer cellogedd mesangial (a ddiffinnir fel 4 neu fwy o gnewyllyn fesul ardal mesangial), ymlediad endocapilari, cilgantau, a sglerosis glomerwlaidd. Aseswyd adrannau hefyd ar gyfer presenoldeb twbwlopathi, ffibrosis rhyng-ranol, atroffi tiwbaidd, ac ymdreiddiadau celloedd tiwbolointerstitial. Ar gyfer sgorio patholeg glomeruli defnyddiwyd sgôr lled-feintiol i werthuso graddau'r difrod glomerwlaidd. Archwiliwyd lleiafswm o 50 glomeruli ym mhob grŵp a graddiwyd difrifoldeb y briw o 0 i+3: a+1 roedd briw yn cynrychioli ymglymiad Llai na neu hafal i 30% o'r glomerwlws,+2 o 30–60%, tra bod +3 briwiau yn dynodi Mwy na neu'n hafal i 60% o'r glomerwlws dan sylw. Perfformiwyd mesur trwch GBM ar ficrograffau electron glomerwlaidd o WT a Clr-f −/ - gan ddefnyddio Delwedd J V1.53a47. Cafodd meinwe arennol wedi'i staenio gan PAS o ddau Rag1 -/ - a dau Rag1 - / - Clr-f - / - llygod sgôr ddall ychwanegol am bresenoldeb y nodweddion patholegol uchod, a chyfrifwyd y nodweddion meintiol o'r pedair adran arennau cymedrig fesul llygoden.
Microsgopeg electron.
Roedd meinwe prosesu ar gyfer microsgopeg electron trawsyrru yn dilyn y protocol cyhoeddedig48. Yn gryno, gosodwyd darnau bach o feinwe'r arennau o 12-Wythnos WT a Clr-f −/− llygod mewn hydoddiant glutaraldehyde 2.5% ac yna eu prosesu gan ddefnyddio'r dull osmiwm tetroxide/wranyl asetad 1%. Mewnosodwyd samplau mewn resin Epon Araldite cyn ei dorri gan ddefnyddio ultramicrotome E ultra-doriad Reichert-Jung. Delweddwyd samplau ar ficrosgop electron trawsyrru JEOL JEM 1230 a chafodd delweddau eu dal gan ddefnyddio camera digidol Hamamatsu ORCA-HR.
Gwastraff cemegol wrin a phlasma a mesur electrolytau.
Casglwyd tua 150 μL o wrin yn ddyddiol o 12-wryw wythnos oed WT a Clr-f −/- llygod ar yr un adeg o'r dydd am 5 diwrnod yn olynol. Cafodd wrin ei allgyrchu ar 10,000 rpm i gael gwared ar falurion ac yna ei storio ar −80 gradd . Casglwyd gwaed gwythïen wyneb o'r un llygod mewn tiwbiau heparinedig a'i ynysu trwy allgyrchiad ar 3000g am 5 munud a'i storio ar −80 gradd. Anfonwyd samplau wrin a phlasma i Idexx Laboratories (Markham, Ontario) ar gyfer mesuriadau crynodiad protein, creatinin a electrolyte.
Mesuriadau pwysedd gwaed ar lygod 12 a 24 wythnos oed. Mesurwyd pwysedd gwaed systolig a diastolig (BPs) gan blethysmograffi cyffion cynffon ar WT gwrywaidd 12 a 24-wythnos oed WT a Clr-f -/- llygod ar gyflwr cyson gan ddefnyddio model BP2000 Visitech. Roedd BP yn cael ei fesur yn ddyddiol yn yr un ystafell ac ar yr un awr o'r dydd am 5 diwrnod yn olynol. Defnyddiwyd gwerthoedd BP y 3 mesuriad olynol diwethaf i gyfrifo'r gwerth BP cymedrig gan fod y 2 ddiwrnod cyntaf yn cael eu hystyried yn hanfodol ar gyfer addasu llygod.
Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30 × 106 dyfnder darllen fesul sampl.
RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{05}}.05 a thoriad newid plyg log o 1.5. Darperir gwerthoedd FPKM ar gyfer pob pwynt amser a samplau (Ffeil Set Ddata Atodol 1). Dadansoddiad cyfoethogi swyddogaethol. Perfformiwyd ontoleg genynnau a Dadansoddiad Cyfoethogi Swyddogaethol gan ddefnyddio g: Profiler (fersiwn e102_ee49_p15_7a9b4d6) gyda g: Dull cywiro profion lluosog SCS gan gymhwyso'r trothwy arwyddocâd o 0.05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 a System Ddosbarthu PANTHER gyda'r union brofion Fisher a throthwy FDR o<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53.
Crëwyd rhwydweithiau cyfoethogi swyddogaethol gan ddefnyddio setiau genynnau o Brosesau Biolegol GO (GO:BP) ar gyfer Musculus Musculus (GRCm38. t6) rhyddhau BioMart: 2020-12-08 wedi'i lawrlwytho o g: Profiler ( https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). Perfformiwyd Dadansoddiad Cyfoethogi Set Genynnau (GSEA) gan ddefnyddio GSEA V4.0354,55 gan ddefnyddio cyfoethogi Rhwydwaith yn seiliedig ar FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).
Dadansoddiad lipidau abdomenol ac ectopig. Roedd crynhoad braster yn cael ei bennu gan bwysau braster yr abdomen a rannwyd oddi wrth lygod unigol. Cymerwyd mesuriadau pwysau corff cyn echdynnu braster. Ar gyfer staenio Oil Red O (ORO), torrwyd rhannau o'r arennau wedi'u rhewi ar 10 μm gan ddefnyddio cryostat ac yna eu sychu yn yr aer am 30 munud. Perfformiwyd staenio ORO trwy osod yr adrannau gyda 3 golchiad o isopropanol 60%, gan eu deor gyda chrynodiad gweithio (66%) o staen ateb ORO (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, UDA) am 15 munud. Yna cafodd sleidiau eu golchi'n gyflym gyda 60% isopropanol, eu staenio'n gyflym â hematoxylin Mayer i dynnu sylw at niwclysau, ac yna eu gosod gan ddefnyddio VectaMount AQ Aqueous Mowning Media (Vector Laboratories).
Dadansoddiad pathoteip. Perfformiwyd dadansoddiad pathoteip gan ddefnyddio Genes a Fynegwyd yn Wahanol (DEGs) gyda q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation.
Roedd meinwe wedi'i dreulio yn cael ei basio trwy hidlydd neilon 70-μm, wedi'i olchi gan PBS, a chafodd gweddill y celloedd coch eu gorchuddio â byffer lysing ACK am 5 munud ar rew. Cafodd celloedd imiwnedd yr arennau eu hynysu gan allgyrchiad RT ar 2000 rpm am 30 munud mewn 40% Percoll. Ailddaliwyd y belen gell yn PBS a chafwyd cyfrif celloedd trwy hemocytomedr. Defnyddiwyd mAbs amrywiol i wirio mynegiant protein arwyneb celloedd, cafodd celloedd eu staenio ar gyfer dadansoddiad cytometreg ffow gyda gwrthgyrff llygoden â label fflworocrom: gwrth-CD45 (eBioscience, clon 30-F11), gwrth-TCR (eBioscience, clôn H{ {12}}), gwrth-NK1.1 (eBiowyddoniaeth, clôn PK136), gwrth-CD19 (BioLegend, clôn 1D3/CD19), gwrth-CD11b (BioLegend, clôn M1/70), gwrth-F4/80 (BioLegend, clôn BM8), gwrth-MHCII(IA/IE) (BioLegend, clôn M5/114.15.2), gwrth-Ly6G (BioLegend, clôn 1A8), gwrth-NKp46 (eBiowyddoniaeth, clôn 29A1.4), a rheolyddion isoteip. Pennwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio Lliw Hyfywedd y gellir ei Drwsio (eBioscience, Cat# 65-0865-14). Er mwyn nodi a meintioli poblogaethau celloedd imiwnedd yn yr arennau WT a Clr-f -/ -, defnyddiwyd dadansoddiadau cytometreg ffow amlbarametrig gan ddefnyddio gwrthgyrff yn erbyn marcwyr cell-benodol i adnabod niwtroffiliau (CD11b + Ly6G +), macroffagau (CD11b + Ly6G - F4 / { {57}}MHCII+), celloedd NK (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+), a NKp46+ celloedd (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), celloedd T (Ly6G−NK1 .1−TCR+) a chelloedd B (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Cafwyd yr holl samplau ar sytomedr BD-Fortessa fow.
Cyfeiriadau
1. Hato, T. & Dagher, PC Sut mae'r system imiwnedd gynhenid yn synhwyro trafferth ac yn achosi trafferth.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1459–1469 (2015).
2. Krüger, T.et al.Adnabod a nodweddu swyddogaethol celloedd dendritig yn yr aren murine iach ac mewn arbrofolglomerulonephritis.J. Am. Soc. Nephrol.15, 613–621 (2004).
3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Celloedd dendritic a macroffagau: Sentinels yn yr aren.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1841–1851 (2015).
4. Woltman, ACet al.Meintioli is-setiau celloedd dendritig mewn meinwe arennol ddynol o dan amodau arferol a patholegol.Arennau Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.et al.Mae celloedd dendritig dibynnol yn y nod lymff arennol yn achosi goddefgarwch yn erbyn antigenau sy'n cylchredeg.J. Am.Soc. Nephrol.24, 543–549 (2013).
6. Zhang, Q.et al.Llygoden Nkrp{0}}Mae dilyniant clwstwr genynnau Clr a dadansoddiadau mynegiant yn datgelu cadwraeth MHC meinwe-benodolimiwn wyliadwriaeth annibynnol.PLoS Un7, e50561 (2012).
7. Leibelt, S.et al.Synhwyro imiwnedd pwrpasol o epitheliwm berfeddol y llygoden wedi'i hwyluso gan bâr o lectin tebyg i lectinderbynyddion.Immunol Mwcosol.
8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAet al.Te llygoden NKR-P1B: Mae system adnabod Clr-b yn rheolydd negyddol o ymatebion imiwnedd cynhenid.Gwaed125, 2217–2227 (2015).
9. Carlyle, JRet al.Hunan-adnabod Ocil/Clr-b ar goll gan dderbynyddion celloedd lladd naturiol ataliol NKR-P1.Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004).
10. Rutkowski, E.et al.Clr-a: Moleciwl tebyg i lectin math C sy'n gysylltiedig ag imiwn wedi'i fynegi'n gyfan gwbl gan epitheliwm coludd llygoden.J. Imiwnol.198, 916–926 (2017).
11. Balaji, GRet al.Mae cydnabod gwesteiwr Clr-b gan y derbynnydd ataliol NKR-P1B yn darparu sail ar gyfer hunan-adnabyddiaeth coll.Nat.Cymmun.9, 4623 (2018)
12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Dewiswch mynegiant Clr-g ar gelloedd dendritig actifedig yn hwyluso rhyngweithio cytrasgydag is-set bach o gelloedd NK splenig yn mynegi'r derbynnydd Nkrp1g ataliol.J. Immunol.200, 983–996 (2018).
13. Abou-Samra, E.et al.Mae angen mynegiant NKR-P1B mewn celloedd lymffoid cynhenid sy'n gysylltiedig â'r perfedd ar gyfer rheoli gastroberfeddolheintiau'r llwybr.Cell. Mol. Imiwnol.16, 868–877 (2019).
14. Germain, C.et al.Nodweddu amrywiadau trawsgrifiad amgen o enyn CLEC2D.J. Biol. Cemeg.285, 36207–36215 (2010).
Gwasanaeth Cefnogol Wecistanche - Yr allforiwr cistanche mwyaf yn Tsieina:
E-bost:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950
Siop Am Fwy o Fanylion:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
