Mae Cyfuno Trwyth Cell NK Mabwysiadol Gyda Pheptid sy'n Rhyddhau Dopamin yn Lleihau Celloedd Senescent mewn Llygod Henoed

Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth

RHAGARWEINIAD

Heneiddio yw un o'r prif ffactorau risg ar gyfer llawer o glefydau [1], a bydd datblygu dulliau i ymyrryd mewn heneiddio yn lleihau'n sylweddol y risg o gyfres o glefydau sy'n gysylltiedig ag oedran megis clefydau cardiofasgwlaidd a serebro-fasgwlaidd [2, 3], canser [4], a chlefyd Alzheimer [5]. Mae celloedd Senescent (SNCs) yn cronni'n raddol mewn meinweoedd yn ystod y broses heneiddio ac fe'u hystyrir yn brif achos clefydau sy'n gysylltiedig ag oedran [6-8]. Dangoswyd bod dileu SNCs mewn modelau llygoden yn atal neu'n gohirio camweithrediad meinwe ac yn ymestyn oes iach [9, 10]. Mewn cyferbyniad, mae trawsblannu symiau bach o SNCs yn achosi camweithrediad ffisiolegol mewn llygod ifanc [1]. Mae'r astudiaethau hyn wedi agor drysau ar gyfer datblygu dulliau sy'n targedu cael gwared ar SNCs i leddfu clefydau cronig sy'n gysylltiedig ag oedran.

Cliciwch yma i wybod mwy

Targedu clirio SNCs, a elwir yn "senolytics" oedd y cemotherapi cyntaf a brofwyd yn llwyddiannus mewn model preclinical in vivo, ac mae sawl asiant senolytig yn bodoli ar hyn o bryd [12]. Mae llawer o'r cyffuriau hyn yn targedu llwybrau gwrth-apoptotig uwch-reoledig mewn SNCs i glirio rhai mathau o SNCs yn ddetholus ac maent wedi dangos y potensial i ymestyn oes a gwella swyddogaethau'r corff [13, 14].Detholiad Cistanche Gwrth YmbelydreddEr gwaethaf gwrthdroi patholeg sy'n gysylltiedig ag oedran yn llwyddiannus mewn modelau anifeiliaid, efallai y bydd rhai rhwystrau i ddefnyddio cyffuriau senolytig mewn pobl oherwydd heterogeneity SNCs a'r risg uchel o wenwyndra [15]. Felly, dylid archwilio dull arall a all ddileu ystod eang o SNCs mewn bodau dynol yn ddiogel.

Gall SNPs gael eu hadnabod a'u dileu gan y system imiwnedd [16]. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod SNCs yn actifadu celloedd lladd naturiol (NK) trwy uwch-reoleiddio'r prif histocompatibility dosbarth I protein cadwyn A a B sy'n actifadu ligand [17]. Fodd bynnag, gydag oedran cynyddol, mae effeithlonrwydd y system imiwnedd yn lleihau, a all arwain at ddianc imiwnedd SNCs [18]. Mae dulliau i oresgyn dianc imiwnedd a achosir gan lai o swyddogaeth imiwn wedi'u harchwilio mewn therapi canser [19]. Mae cynnydd diweddar wedi'i wneud wrth drosglwyddo celloedd NK yn fabwysiadol i ddileu tiwmorau, sydd wedi dangos rhywfaint o effeithiolrwydd [20]; felly, roedd yn rhesymol tybio y gallai trwyth mabwysiadol o gelloedd NK gynhyrchu sytowenwyndra mewn SNCs.

Y systemau nerfol ac imiwnedd yw dwy system addasol bwysicaf y corff. Mae sawl astudiaeth wedi dangos bod dopamin (DA) fel rheolydd imiwnedd yn allweddol i gyfathrebu niwroimiwn [21]. Mae DA yn cyflawni ei swyddogaethau biolegol trwy ryngweithio â ac actifadu derbynyddion dopamin (DR), sydd wedi'u rhannu'n 2 is-grŵp, tebyg i D (D1 a D5), a D2-debyg (D2, D3,). a D4).O ran eu swyddogaethau gwahanol, mae ymgysylltu D1-fel DR yn ysgogi cynhyrchu cAMP, tra bod ymgysylltiad D fel DR yn atal cynhyrchu cAMP [22]. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod ysgogiad tebyg i D D yn gwella sytowenwyndra celloedd NK in vitro [23] ac in vivo [24]. Fodd bynnag, mae lefelau DA yn gostwng wrth i oedran dynol gynyddu [25]. Felly, rhagdybiwyd gennym y gallai cyffuriau dopaminergig wella sytowenwyndra trwyth mabwysiadol celloedd NK.

Gall Cistanche gwrth-heneiddio

Yma, rydym yn cynnig defnyddio'r nonapeptid Acein, a oedd yn rhyngweithio ag ensym trosi angiotensin (ACE I) i gymell secretiad DA [26], ar y cyd â therapi celloedd NK systemig i ddileu SNCs. Dangosodd canlyniadau in vitro fod celloedd NK yn dileu SNCs, yn annibynnol ar anwythyddion heneiddedd a mathau o gelloedd.cistanche herbaMewn model llygoden sy'n heneiddio, gostyngodd therapi celloedd NK mewn cyfuniad ag Acein yn sylweddol nifer y celloedd positif sy'n gysylltiedig â heneiddedd -galactosidase (SA- -gal)-positif mewn meinweoedd lluosog, gan leihau mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â heneiddedd mewn organau mawr a ffenoteipiau cyfrinachol sy'n gysylltiedig â heneiddedd (SSPs) wedi'u lleddfu. Mae canlyniadau'r astudiaeth hon yn rhoi cipolwg ar y posibilrwydd o adfer gwyliadwriaeth imiwnedd SNCs cronig gan ddefnyddio therapi celloedd NK ar y cyd ag Ace.

CANLYNIADAU

Mae trwyth mabwysiadol o gelloedd NK yn lleihau celloedd CD3 a T senescent mewn gwaed ymylol

Recriwtiwyd chwech ar hugain o wirfoddolwyr a dderbyniodd trwyth celloedd NK ar gyfer yr astudiaeth. Cyflwynir nodweddion a phriodweddau celloedd NK y gwirfoddolwyr yn Nhabl 1. Yr egwyl amser ar gyfer cofio gwaed ar ôl trallwysiad celloedd NK oedd tua 37(25-57)diwrnod. Roedd cyfran (Ffig.1A) a nifer absoliwt (Ffig.1B) o gelloedd NK yn y gwaed ymylol yn ymwneud yn wrthdro ag oedran y gwirfoddolwyr. Yn syndod, roedd cydberthynas gwrthdro rhwng purdeb y cynnyrch celloedd NK a ail-lenwyd i bob unigolyn ag oedran y gwirfoddolwyr (Ffig.1C).twf pidyn cistancheGall hyn fod oherwydd y gostyngiad graddol yn nifer y celloedd NK gydag oedran cynyddol. Er mwyn adlewyrchu effaith gwrth-heneiddio gweinyddiaeth celloedd NK, canfuwyd marcwyr senescent lluosog mewn celloedd gwaed ymylol CD3 ynghyd â T, sy'n adlewyrchu i raddau helaeth ffenoteip y corff sy'n gysylltiedig ag oedran [27], cyn ac ar ôl trwyth celloedd NK. O'i gymharu â'r marcwyr heneiddio a ffactor SASP celloedd CD3 ynghyd â T mewn gwaed ymylol cyn ac ar ôl trwyth celloedd NK awtologaidd, gostyngwyd cyfran y celloedd T SA- -gal-positif yn sylweddol ar ôl trwyth (Ffig.1D). Gostyngodd lefelau mRNA P16, P21, ac atalydd actifadu plasminogen 1(Pai1) yn sylweddol, tra bod y newidiadau yn lefelau mRNA o brotein cemoattractydd monocyte-1 (MCP-1) ac IL-6 nad oeddent yn arwyddocaol (Ffig. 1E). Nid oedd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol yn y mynegeion biocemegol (Tabl Atodol 1) yn y gwaed ymylol.

Mae celloedd NK dynol yn lleihau marcwyr heneiddio meinwe adipose a secretion cytocinau proinflammatory

Casglwyd meinwe adipose gan dri unigolyn gordew, gan fod gordewdra yn tueddu i achosi croniad o SNCs [28]. Yn ogystal, cafodd y meinwe adipose ei feithrin mewn cyfrwng wedi'i gyflyru o SNCs i ysgogi henaint meinwe adipose ymhellach. Ystyriwyd mai meinwe adipose wedi'i feithrin mewn cyfrwng cyflyru o rai nad ydynt yn SNCs oedd y rheolaeth. Cafodd mynegiant Perforin (Ffig.2A) a CD69 (Ffig.2B) mewn celloedd NK eu rheoleiddio'n sylweddol ar ôl cyd-deoriad â meinwe adipose senescent o'i gymharu â chyd-deoriad â meinwe adipose rheoli. Mynegiant marcwyr senescent t16 a t21 yn

gostyngwyd meinwe adipose senescent yn sylweddol ar ôl triniaeth celloedd NK (Ffig.2C, Ffig.1A Atodol, B). Gwelsom hefyd fod elfen allweddol SASP yn y cyfrwng cyflyru ar ôl cyd-deoriad â chelloedd NK yn y grŵp senescent wedi gostwng yn sylweddol (Ffig. 2 D). Awgrymodd y canlyniadau hyn y gallai celloedd NK ddileu SNCs o feinwe adipose a lleihau'r ffenoteip SASP.

Gellir actifadu celloedd NK Llygoden yn erbyn SNCs a rhoi sytowenwyndra iddynt

Yn gyntaf, fe wnaethom ni ysgogi heneiddedd celloedd ehedydd adipose llygoden trwy arbelydru neu Adriamycin fel y disgrifiwyd yn flaenorol [29]. Er mwyn penderfynu a oedd celloedd NK yn cael eu gweithredu'n benodol gan SNCs, cafodd celloedd rheoli heb eu harbelydru neu SNCs arbelydredig eu cyd-deor â chelloedd NK am 24 h. Dangosodd cytometreg llif fod lefelau mynegiant CD69 (Ffig.3A) ac IFN-y (Ffig.3B) mewn celloedd NK wedi'u huwchreoleiddio'n sylweddol mewn celloedd targed SNC o'u cymharu â chelloedd targed rheoli. Yn y cyfamser, ar ôl deori ar y cyd â chelloedd NK, roedd lefel apoptotig SNCs yn sylweddol uwch na lefel celloedd rheoli (Ffig.3C). Nesaf, fe wnaethom ganfod mynegiant ligandau NK sy'n ysgogi celloedd a ligandau ataliol yn y SNCs. Dangosodd canlyniadau qPCR fod lefel mynegiant ligandau actifadu mewn celloedd NK wedi'i uwch-reoleiddio'n sylweddol o'i gymharu â chelloedd rheoli, a bod lefel mynegiant rhai ligandau ataliol, megis microglobulin beta 2 (2m), wedi'i isreoleiddio o'i gymharu â chelloedd rheoli (Ffig. .3D). Rydym hefyd wedi archwilio gallu celloedd NK i ddileu SNCs in vivo.manteision cistanche salsaTrawsblannwyd celloedd rheoli wedi'u labelu gan DiR a SNCs â label DiR i mewn i geudod abdomen llygod, a rhoddwyd celloedd NK trwy wythïen y gynffon. Dangosodd canlyniadau delweddu in vivo fod y dwysedd fflworoleuedd mewn llygod a drawsblannwyd â SNCs ar ôl triniaeth celloedd NK yn sylweddol wannach na'r un mewn llygod a drawsblannwyd â chelloedd rheoli (Ffig. 3 E). Roedd hyn yn dangos bod gallu celloedd NK i ladd SNCs yn sylweddol uwch na gallu SNCs in vivo. Nesaf, fe wnaethom benderfynu a oedd sytowenwyndra celloedd NK yn erbyn SNCs yn ddibynnol ar ddos ​​ac yn benodol i gelloedd. Ar yr un pryd, fe wnaethom hefyd ddefnyddio heneiddedd a achosir gan doxorubicin i benderfynu a oedd sytowenwyndra celloedd NK yn erbyn SNCs wedi'i gyfyngu i anwythiad ymbelydredd. Dangosodd y canlyniadau fod gan gelloedd NK weithgaredd sytotocsig sylweddol yn erbyn SNCs mewn modd sy'n dibynnu ar ddos, ond ychydig o sytotocsigedd yn erbyn celloedd rheoli. Ni chafodd gwahanol ddulliau ysgogi heneiddedd unrhyw effaith ar allu celloedd NK i ladd SNCs (Ffig.3F). Awgrymodd y canlyniadau hyn y gallai celloedd NK gael eu gweithredu'n benodol gan SNCs a chynhyrchu sytowenwyndra sylweddol yn erbyn SNCs in vitro ac in vivo.

Mae DA yn gwella sytowenwyndra celloedd NK llygoden yn erbyn SNCs trwy dderbynyddion tebyg i D

Yn wyneb swyddogaeth gyfathrebu niwroimiwn bwysig DA [30], fe wnaethom asesu a allai DA wella sytowenwyndra celloedd NK llygoden yn erbyn SNCs. Cafodd celloedd NK eu deori ar y cyd â SNCs a ysgogwyd gan ymbelydredd, ac ychwanegwyd crynodiadau gwahanol o DA at y cyfrwng. Dangosodd y canlyniadau y gallai DA wella sytowenwyndra celloedd NK yn erbyn SNCs (Ffig. 4A, B). Er mwyn nodweddu'r llwybr signalau a ddefnyddiodd DA i wella effaith ladd celloedd NK ar SNCs, gwerthuswyd y newidiadau mewn mynegiant DR, cynnwys cAMP, a ffosfforyleiddiad protein elfen-rhwymo elfen ymateb cAMP (CREB) mewn celloedd NK. Mewn celloedd NK wedi'u cyd-deor â SNCs ynghyd â DA, cynyddwyd cynnwys cAMP (Ffig. 4C) a lefel ffosfforyleiddiad CREB (Ffig.4D, Ffig Atodol 2A) yn sylweddol, o'i gymharu â chelloedd NK a chyd-deoriad SNC heb DA. Er mwyn egluro pam mae DA yn gwella gweithgaredd lladd celloedd NK yn erbyn SNCs, gwnaethom gymharu newidiadau DR ar gelloedd NK ar ôl i gelloedd NK gael eu deori ar y cyd â SNCs neu gelloedd rheoli. Dangosodd y canlyniadau fod lefel mynegiant D1 a D5 DR wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol ar ôl i gelloedd NK gael eu deori ar y cyd â SNCs o'u cymharu â chelloedd rheoli (Ffig.4E). Nesaf, mae DA a D yn {1-hoffi antagonists derbyn neu D{2-hoffi).

ychwanegwyd antagonyddion derbynyddion at ei gilydd yn y system deori ar y cyd o gelloedd NK a SNCs. O'i gymharu ag ychwanegu DA yn unig, gostyngwyd lefel apoptosis SNCs wrth ychwanegu DA ynghyd â SCH-23300(D1-gwrthwynebydd derbynnydd)(Ffig.4F, G). Yn y cyfamser, is-reoleiddiwyd cynnwys cAMP (Ffig.4H) a lefel ffosfforyleiddiad CREB (Ffig.4l, Ffig Atodol 2B) mewn celloedd NK. Mewn cyferbyniad, ni wnaeth ychwanegu DA ynghyd â haloperidol (antagonist derbynnydd D2) newid yn sylweddol lefel apoptosis SNCs, cynnwys cAMP, a ffosfforyleiddiad CREB mewn celloedd NK, o'i gymharu ag ychwanegu DA yn unig. Dangosodd y canlyniadau hyn fod DA wedi gwella gweithgaredd lladd celloedd NK llygoden yn erbyn SNCs trwy D1-fel Drs.

Mae Ace ynghyd â chelloedd NK llygoden yn gwella'n sylweddol y broses o glirio SNCs in vivo

Mae astudiaeth flaenorol wedi dangos bod dopamin yn lleihau gydag oedran mewn bodau dynol [22]. Yn gyntaf fe wnaethom fesur lefel y dopamin ymylol mewn llygod ifanc a hen. Dangosodd y canlyniadau fod lefelau dopamin plasma'r hen lygod yn is na rhai'r llygod ifanc (Ffig. 5A). Nesaf, archwiliwyd rhyddhau dopamin ymylol ar ôl chwistrelliad mewnperitoneol o Acein mewn hen lygod. Canfuom fod lefelau dopamin plasma wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl pigiad Acein 10 mg/kg (Ffig.5B, Ffig.3 Atodol). Yn wyneb hyn, gwnaethom berfformio celloedd NK llygoden ynghyd ag Acein i drin llygod oedrannus. Canfuom statws celloedd NK yng ngwaed ymylol llygod ar ôl triniaeth a chanfuom fod nifer y celloedd NK yn y gwaed ymylol trwyth o gelloedd NK yn unig neu gelloedd NK ynghyd ag Acein yn sylweddol uwch na'r grŵp a driniwyd gan Ace a grŵp PBS, tra nad oedd nifer y celloedd NK yn sylweddol wahanol rhwng y grŵp celloedd NK a gafodd eu trin a'r celloedd NK wedi'u cyfuno â'r grŵp wedi'i drin ag Acein (Ffig.5C, D).dos cistanche tubulosa redditRoedd canfod lefel actifadu celloedd NK ymhellach yn dangos bod lefel mynegiant CD69 mewn celloedd NK gwaed ymylol yn y grŵp cyfunol wedi'i drin wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol o'i gymharu â'r grŵp celloedd NK a driniwyd (Ffig.5E). Nesaf, gwnaethom werthuso'r SNCs yn y meinwe. Canfuom fod trwyth o gelloedd NK yn unig yn lleihau mynegiant rhai marcwyr synhwyro o'i gymharu â'r grŵp PBS a'r grŵp wedi'i drin ag Acein, tra bod trwyth celloedd NK ynghyd ag Acein wedi lleihau'n sylweddol y celloedd gal-positif SA- - (Ffig. 5F). ) yn ogystal â lefelau mynegiant P16 a P21 (Ffig. 5G, Ffig Atodol 4A, B) yn y meinwe adipose, o'i gymharu â thrin celloedd NK yn unig. Cynyddwyd nifer y Ki67BrdUcells yn y meinwe adipose hefyd yn sylweddol (Ffig. 5H) gan brofi ymhellach bod cynnwys SNCs yn y meinwe adipose yn is yn y grŵp trin cyfunol. Dangosodd SA- -staenio gal o adrannau'r afu, yr ysgyfaint, yr arennau a braster hefyd y lefel isaf o SNCs yn y grŵp wedi'i drin ar y cyd (Ffig.5A-D Atodol). Dangosodd y canlyniadau hyn fod celloedd NK ynghyd â therapi Acein wedi gwella lefel actifadu celloedd NK mewn llygod, ac wedi achosi dileu sylweddol o SNCs in vivo.

Mae Ace ynghyd â chelloedd NK yn lleihau ffenoteipiau sy'n gysylltiedig ag oedran mewn llygod oedrannus

Er mwyn cadarnhau ymhellach ffenoteipiau sy'n gysylltiedig ag oedran mewn llygod, afu, yr ysgyfaint, yr arennau, braster, a meinweoedd llygaid eu casglu i ganfod amrywiaeth o farcwyr senescent gan gynnwys ffactorau P16, P21, a SASP. Dewiswyd y samplau hyn oherwydd bod y meinweoedd hyn yn fwy tebygol o fynd trwy heneiddedd gydag oedran [31]. Ym mhob meinwe, ar ôl trwyth celloedd NK yn unig, roedd lefelau mRNA o ffactorau P16, P21, a SASP yn sylweddol is na'r rhai yn y grŵp rheoli, tra bod lefelau marcwyr henebrwydd yn yr afu, braster, a meinweoedd noswyl yn y meinweoedd cyfunol a gafodd eu trin. gostyngwyd y grŵp ymhellach o'i gymharu â'r grŵp a gafodd ei drin â thrwyth celloedd NK yn unig (Ffig. 6A). Yn yr un modd, rydym hefyd wedi canfod y prif ffactor SASP yn y serwm llygod, ac roedd y canlyniadau'n gyson â'r canlyniadau mewn meinweoedd (Ffig.6B). Yn ogystal, rydym hefyd wedi archwilio lefelau NAD yn yr afu a meinwe adipose, sy'n gysylltiedig â heneiddio [32]. Canfuom fod trwyth o gelloedd NK yn unig neu mewn therapi cyfuniad yn cynyddu'n sylweddol gynnwys NAD yn yr afu a meinwe adipose, gyda lefel y gwelliant yn sylweddol uwch yn y grŵp therapi cyfun (Ffig. 6 C). Mae rhai mynegeion biocemegol serwm gan gynnwys ALT, AST, CREA, UA, CHOL, a BUN yn gysylltiedig â lefelau heneiddio [33]. Rydym wedi canfod mai dim ond AU a gafodd ei leihau'n sylweddol yn y serwm llygod yn y grŵp a driniwyd â chyfuniad, tra nad oedd y mynegeion biocemegol allweddol eraill yn gwneud hynny.

DEUNYDD A DULLIAU Trwyth o gelloedd NK dynol

Perfformiwyd trwyth celloedd NK Autologous gan Ysbyty Canser Shanghai Mengchao (Shanghai, Tsieina), a chymeradwywyd pob protocol gan eu pwyllgor moeseg (Rhif 05,2020, Pwyllgor Moeseg Feddygol Ysbyty Canser Mengchao Shanghai). Darparodd pob gwirfoddolwr ganiatâd gwybodus wedi'i lofnodi i gael gwaed ymylol. Yn gryno, echdynnwyd gwaed ymylol 50 ml o bob unigolyn, ac ar ôl hynny cafodd celloedd mononiwclear gwaed ymylol (PBMCs) eu hynysu a'u trosglwyddo i fflasg T75 gyda Chyfryngau Ehangu Cell NK Dynol ExCellerate (Systemau Ymchwil a Datblygu, UDA) yn cynnwys 1 × Cloudz CD2 / NKp46 , IL Dynol Ailgyfunol-2(27ng/mL), L Dynol ailgyfunol-12 (10 ng/mL), IL Dynol ailgyfunol-18 (10 ng/mL, ac L Dynol ailgyfunol{{ 13}}(10 ng/mL)(R&D Systems, USA) am 48 awr, ac yna ei ddisodli gan gyfrwng actifedig (270 ng/mL ailgyfunol IL Dynol-2, 20 ng/mL ailgyfunol IL Dynol-12 , IL Dynol ailgyfunol 20 ng/mL-18, ac IL Dynol ailgyfunol 20 ng/mL-21)ar gyfer meithriniad pellach Cadwyd dwysedd celloedd ar 1 × 10 gradd celloedd/mL Ar ddiwrnod 28 o ddiwylliant , casglwyd nifer fach o gelloedd NK awtologaidd ar gyfer rheoli ansawdd a'u hail-wampio'n fewnwythiennol ynghyd â chelloedd NK awtologaidd ar ddwysedd o gelloedd 4.15 × 10 gradd (3.76-5.87 × 10), gydag amser trwyth o 30 munud ■ Cynhaliwyd y broses arbrofol yn unol â'r drefn gyda'r Arfer Clinigol Da. Yr egwyl amser ar gyfer yr ail gasgliad gwaed oedd tua 37 (25-57) diwrnod.

Ynysu celloedd T gwaed ymylol dynol a chelloedd NK Cafwyd gwaed ffres gan wirfoddolwyr iach ar ôl rhoi caniatâd gwybodus, a chymeradwywyd y protocol gan fwrdd adolygu sefydliadol Prifysgol Fferyllol Tsieina (Rhif Trwydded: SYXK2016-0011). Defnyddiwyd Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Canada) i ynysu PBMCs dynol. Cafwyd celloedd dynol CD3 ynghyd â T gan PBMCs gan ddefnyddio gleiniau magnetig didoli celloedd T CD3 dynol (Miltenyi Biotec, yr Almaen) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Cafodd celloedd NK eu hynysu o waed ymylol gan ddefnyddio Coctel Cyfoethogi Cell NK Dynol RosetteSep (STEMCELL Technologies) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr

Gwahanu ac ehangu celloedd llygoden NK in vitro

Cafodd celloedd NK splenig llygoden eu hynysu gan ddefnyddio Pecyn Ynysu Cell NK (Miltenyi Biotec) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, cafwyd dueg y llygoden, cafodd celloedd dueg eu hidlo gan ddefnyddio hidlydd cell 70μm, a chafwyd lymffocytau dueg trwy allgyrchu graddiant dwysedd gan ddefnyddio pecyn gwahanu lymffocytau dueg llygoden (Solarbio, Tsieina). Casglwyd y lymffocytau splenig i gael celloedd NK purdeb uchel gan ddefnyddio gleiniau magnetig i wahanu celloedd NK llygoden. Cafodd y celloedd NK splenig ynysig eu meithrin mewn cyfrwng cynnal a chadw RPMI-1640 wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (FBS), 1 y cant L-glutamin, 1 y cant penisilin / streptomycin, 1 y cant cyfrwng hanfodol lleiaf (MEM) nad yw'n- asid amino hanfodol, asid pyruvate sodiwm 1 y cant, a 50 uM mercaptoethanol (pob un o Life Technologies, UDA). Yn ogystal, ychwanegwyd 200 o IU/mL ailgyfunol interleukin 2 (RL-2)(PeproTech, USA) a 10 ng/mL llygoden I-15(ml-15)(PeproTech) at y canolig. Yna casglwyd celloedd NK 10 gradd a lymffocytau splenig arbelydredig 10 gradd, a chyfrwng mwyhau 5 ml (cyfrwng cynnal a chadw wedi'i ategu â 1000 IU/mL rlL-2,10ng/ml ml-15, a 30ng/mL gwrth -NKp46 gwrthgorff (PA5-46986, Invitrogen, UDA)) oedd

Ffig.3 Mae SNCs yn actifadu celloedd NK ac yn cael eu lladd gan gelloedd NK. Perfformiwyd cytometreg llif i ganfod mynegiant (A) CD69 a (B) IFN-y ar ôl deoriad 24 h ar y cyd â chelloedd NK llygoden a preadipocytes neu preadipocytes a achosir gan arbelydru. n =3. Cyflwynir data fel modd ±SD. Aseswyd gwahaniaethau gan y prawf-t di-barametrig dwy gynffon. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Echdynnu preadipocytes a chelloedd lloeren cyhyr

Echdynnwyd y preadipocytes fel y disgrifiwyd yn flaenorol [11]. Yn fyr, tynnwyd braster dynol neu lygoden o dan amodau di-haint a'i dorri'n ddarnau 1-2 mm, ei olchi ddwywaith gyda PBS, a'i dreulio â collagenase ll （Solarbio） ar 37 gradd am 1 h. Yna cafodd celloedd eu hidlo â hidlydd celloedd 100 μm, eu centrifugio ar 300 g am 5 munud, a'u casglu. Cafodd y celloedd ymlynol eu meithrin mewn a-MEM wedi'u hategu ag 20 y cant FBS am 12 h a'u treulio â trypsin i gasglu celloedd ymlynol. Roedd y celloedd lloeren cyhyrau wedi'u hynysu fel y disgrifiwyd yn flaenorol [34]. Torrwyd y cyhyr quadriceps yn ddarnau 1-2 mm, ac ychwanegwyd 5 mL collagenase ll i'w dreulio ar 37 gradd C am 12 munud. Cymysgwyd y gymysgedd â phibed, ac ychwanegwyd cyfrwng cyflawn 5 ml ar ôl treulio ychwanegol am 12 munud. Cafodd y celloedd eu hidlo gan ddefnyddio hidlydd cell 70 μm a'u centrifugio ar 300 g am 5 munud. Yna celloedd oedd

diwylliedig gyda 5 ml o ganolig yn cael ei ychwanegu bob dydd am 4 diwrnod. Cafodd y celloedd ymlynol eu chwythu i ffwrdd gyda phibed a'u centrifugio ar 2000 × g am 5 munud. Ar ôl treuliad trypsin ar 37 gradd am 5 munud, cafodd celloedd eu hallgyrchu ar 2000 × g am 5 munud a'u casglu. Yna 5 mL F-10 cyfrwng Ham wedi'i ychwanegu at FBS 20 y cant a ffactor twf ffibroblast sylfaenol 4 ng/mL (PeproTech).

Canfuwyd sytowenwyndra celloedd NK splenig llygoden i SNC gan y assay lactate dehydrogenase

Cafodd y SNCs eu hysgogi gan 0.2 μM Adriamycin （MedChemExpress, UDA） am 24 awr neu drwy ddiwylliant parhaus am 20 diwrnod ar ôl ymbelydredd pelydr-X 10 Gy. Yna gosodwyd 5000 o SNCs ar blât, ac ychwanegwyd celloedd NK splenig (hyfywedd cell: 93. 5-97.1 y cant ) ar gymarebau effaithydd i darged o 50:1,25:1,12.5:1, 6.25: 1,3.125:1,a 1.563:1.Casglwyd y supernatants ar ôl cyd-ddiwyllio ar 37 gradd C am 24 h, a defnyddiwyd pecyn canfod Sytowenwynedd lactad dehydrogenas (LDH) (Cayman Chemical, UDA) i'w canfod. Cyfrifwyd sytotocsigedd gan y fformiwla ganlynol: cytotoxicity ( y cant )=(cell cymysgedd arbrawf-targed cell effaith digymell digymell) / (gell targed uchafswm- targed cell yn ddigymell) × 100.

Delweddu byw

Prynwyd deuddeg llygod C57BL/6 wythnos oed gan Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Tsieina). Yna 1 × 10 gradd 1,1'-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine ïodid (DiR) (Invitrogen)-rheolaeth label

Cafodd preadipocytes neu ragadipocytes senescent a achosir gan ymbelydredd eu hailddarparu mewn 200 halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) a'u chwistrellu i mewn i geudod abdomen llygod gyda nodwydd 22 mesurydd. Ar ôl tri diwrnod, chwistrellwyd celloedd NK allogenig 5 × 10 gradd (hyfywedd cell: 93.6-96.2 y cant) mewn 100uL PBS drwy wythïen y gynffon. Ar y 10fed diwrnod, anestheteiddiwyd y llygod ag isoflurane. Canfuwyd fflworoleuedd gan ddefnyddio System Delweddu Cyfres In Vivo MS 100 (PerkinElmer, MA, UDA).

Cytometreg llif

Er mwyn canfod apoptosis SNCs sydd wedi'u deor ar y cyd â chelloedd NK splenig â label DiR (hyfywedd cell: 91. 8-93.2 y cant ), cafodd SNCs 1 × 10 gradd eu treulio gyda chywirdeb ar 37 gradd am 10 munud ac yna eu staenio gyda Phecyn Lliwio Apoptosis Annexin V a Propidium ïodid (PI) (Multisciences Biotech Co, Ltd., China) yn ôl protocol y gwneuthurwr. Cafodd SNCs eu gosod yn y sefyllfa DiR-negyddol. I brofi gweithrediad celloedd NK, casglwyd celloedd NK llygoden a'u staenio â mNK1.1-allophycocyanin (APC)(S17016D) a gyda chlwstwr llygoden o wahaniaethu 69-R-phycoerythrin-cyanine7 (mCD{{). 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, UDA) ar 4 gradd am 30 munud. Yna cafodd celloedd eu prosesu gyda'r CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, UDA) a'u staenio â llygoden interfferon gama-wych fioled 421 (mlFNy-BV421)(XMG1.2) ar 4 gradd am 30 munud. Perfformiwyd staenio celloedd NK dynol gan Perforin-APC(S16009A) gan ddefnyddio'r un protocol â'r un a ddefnyddir ar gyfer staenio allgellog (CD56-fluorescein isothiocyanate [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) a staenio mewngellol (perforin-APC)(Biolegend).

I ganfod celloedd NK gwaed ymylol, casglwyd gwaed gwrthgeulo 100uL. Ar gyfer gwaed perifferol llygoden, ychwanegwyd CD3-FITC, NK1.1-APC, a CD69-PE-Cy7. Ar gyfer gwaed perifferol dynol, ychwanegwyd CD3-BV421 (OKT3) a CD56-FITC a'u deor am 20 munud ar dymheredd ystafell.

Yna ychwanegwyd 400 μL 1 × erythrocyte lysate (BD Biosciences) a'i ddeor am 3 munud, ac yna tri golchiad gyda PBS. Er mwyn canfod ymlediad celloedd mewn meinwe adipose, cafodd y llygod eu chwistrellu'n fewnperitoneol gyda 200 μL o 10 mg/mL bromodeoxyuridine （BrdU） 24 a 72h cyn ewthanasia. Ar ôl ewthanasia, tynnwyd y depos braster inguinal a'u torri'n ddarnau, eu treulio ar 37 C am 30 munud gyda collagenase ll a DNase, a'u hidlo gan ddefnyddio hidlydd cell 100 um. Cafodd celloedd eu prosesu gyda'r Pecyn Cytofix/Cytoperm Plus a'u staenio â BrdU-FITC (3D4) a Ki67-PE (16A8). Perfformiwyd cytometreg llif ar sytomedr llif CytoFLEX. Defnyddiwyd y Pecyn Staen Cell Marw Cell Marw BYW/MARW (Thermo Fisher Scientific, UDA) i gau celloedd marw allan ym mhob arbrawf. Dadansoddwyd data gan ddefnyddio meddalwedd FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, UDA).

Trawsgrifiad gwrthdro-PCR meintiol

Echdynnwyd RNA gan ddefnyddio adweithydd Trizol a'i wrthdroi a'i drawsgrifio i cDNA gan ddefnyddio Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, China). Perfformiwyd PCR meintiol (qPCR) gan ddefnyddio cymysgedd adwaith SYBR Green (Yepsen Biotechnology) ar System PCR Amser Real ABC QuantStudio 3 (Biosystemau Cymhwysol, UDA), gyda GAPDH yn gweithredu fel rheolaeth fewnol. Dadansoddwyd data gan ddefnyddio'r dull 2-△ACt. Adroddir y rhestr dilyniannau paent preimio yn Deunydd Atodol (Tabl 2-3).

Staeniad sy'n gysylltiedig â heneiddedd -galactosidase

Ar gyfer staenio celloedd, golchwyd celloedd unwaith gyda PBS, eu gosod mewn hydoddiant -galactosidase (SA- -gal) sy'n gysylltiedig â heneiddedd (Technoleg Signalau Celloedd, UDA) ar dymheredd ystafell am 15 munud, eu golchi dair gwaith gyda PBS, a'u deor. dros nos mewn hydoddiant staenio SA- -gal ar 37 gradd C. Cafodd y plât ei selio â pharafilm i atal anweddiad o'r cyfrwng staenio. Celloedd

eu golchi â PBS a'u harsylwi â microsgop. Ar gyfer staenio rhannau wedi'u rhewi, cafodd yr adrannau eu sychu ar 37 gradd am 3{30munud a'u gosod ar dymheredd yr ystafell mewn datrysiad sefydlogi SA- -gal am 15 munud. Golchwyd y darnau dair gwaith gyda PBS a'u deor dros nos mewn toddiant staenio SA- -gal ar 37 gradd C. Yna cawsant eu staenio ag eosin am 1 munud a'u rinsio â dŵr am 2 funud. Cafodd data staenio SA- -gal eu dadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd Image-Pro Plus 6.0.

Eglurhaol meinwe adipose dynol

Cafwyd meinwe adipose o dri unigolyn trwy liposugno. Gwryw oedd un o'r testynau, a dwy yn ferched. Oedran cymedrig y pynciau oedd 57.0±7.6 oed (cymedr±SD: ystod, 50-65). Cymedr BMI oedd 40.5 ± 5.1 kg/m² （ cymedrig ± SD; amrediad, 36.7-46.2）. Cymeradwyodd pwyllgor moeseg Ysbyty Canser Shanghai Mengchao (Rhif 05, 2020, Pwyllgor Moeseg Feddygol Ysbyty Canser Mengchao Shanghai) y cynllun arbrofol. Cafwyd caniatâd gwybodus ar gyfer yr holl wirfoddolwyr. Torrwyd meinwe adipose yn ddarnau bach gyda diamedr o tua 2 mm. Gosodwyd pum darn o feinwe ym mhob ffynnon o blât ffynhonnau 96-, a 200 uL o naill ai preadipocytes neu gyfrwng cyflyredig o preadipocytes senescent a achosir gan ymbelydredd, wedi'i ategu â serwm AB dynol 10 y cant, 1 y cant L-glutamin, 1 y cant penisilin / streptomycin, 1 y cant MEM asidau amino nad ydynt yn hanfodol, ac 1 y cant sodiwm pyruvate asid, at y cyd-ddiwylliant am 24 h. Yna disodlwyd y cyfrwng gyda chyfrwng ffres yn cynnwys celloedd NK awtologaidd 5 × 10 gradd (hyfywedd cell: 92. 3-95.7 y cant 6) a'i feithrin am 48 awr arall, ac ar ôl hynny casglwyd celloedd NK ar gyfer cytometreg llif. Golchwyd y meinwe adipose bum gwaith gyda PBS, ac ychwanegwyd yr un cyfrwng ar gyfer diwylliant pellach am 48 h; defnyddiwyd y supernatant (100 uL) ar gyfer canfod aml-ffactor. Roedd preadipocytes neu preadipocytes senescent a achosir gan ymbelydredd yn deillio o feinwe adipose yr un unigolyn.

Daw'r erthygl hon o Marwolaeth Celloedd a Chlefyd (2022) 13:305