Proffilio Cynhwysfawr o Fformwleiddiadau Cyfrinachol O Fôn-gelloedd Hylif Amniotig Ffetws a Dynol Amniotig Rhan 1
Jul 22, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Fe wnaethom adrodd yn flaenorol bod bôn-gelloedd sy'n deillio o hylif amniotig c-KIT ynghyd â htaman a gafwyd o samplau dros ben o ddiagnosis cyn-geni Ⅱ trimester arferol (HAFS ffetws) wedi'u cynysgaeddu ag effeithiau paracrine atgynhyrchiol sy'n ysgogi effeithiau goroesi, gwrth-ffibrotic ac ymledol. hefyd wedi cael eu hynysu oddi wrth samplau gwastraff clinigol III trimester yn ystod adrannau C a drefnwyd (HAFS amenedigol), gan gynnig dewis arall haws ei gyrraedd o'i gymharu â HAFS y ffetws. Serch hynny, ychydig a wyddys am broffil paracrinaidd HAFS amenedigol.Yma rydym yn rhoi disgrifiad manwl o gyfanswm secretome HAFS (hy, yr holl ffactorau paracrine hydawdd a ryddhawyd gan gelloedd yn y cyfrwng cyflyru, HAFS-CM) a'r fesiglau allgellog ( HAFS-EVs) o'i fewn, o Ⅱtrimester ffetws-yn erbyn III celloedd amenedigol trimester. Roedd HAFS ffetws ac amenedigol yn cael eu nodweddu ac yn destun rhag-amod hypocsig i wella eu potensial paracrine. Dadansoddwyd fformwleiddiadau HAFS-CM ac HAFS-EV ar gyfer cynnwys protein a chemocin / cytocin, ac ymchwiliwyd ymhellach i'r cargo EV trwy ddilyniannu RNA. Roedd ffenoteip HAFS ffetws ac amenedigol, ynghyd â'u fformwleiddiadau secretome cyfatebol, yn gorgyffwrdd; ac eto, dangosodd HAFS ffetws weithgaredd ffosfforyleiddiad ocsideiddiol anaeddfed o'i gymharu â rhai amenedigol. Datgelodd proffilio eu cargo paracrine rai gwahaniaethau yn ôl y cyfnod beichiogrwydd a rhag-amod hypocsig. Darparodd y ddwy ffynhonnell gell fformwleiddiadau wedi'u cyfoethogi â ffactorau ysgogol niwrotroffig, imiwnofodwlaidd, gwrth-ffibrotic, ac endothelaidd, a diffiniwyd secretome HAFS ffetws anaeddfed gan broffil pro-vasculogenig, adfywiol, pro-datrys a gwrth-heneiddio mwy amlwg. Dangosodd proffilio RNA bach gyfoethogi microRNA mewn cargo HAFS-EV ffetws ac amenedigol, gyda chraidd pro-datrys a fynegwyd yn sefydlog fel llofnod moleciwlaidd cyfeirio. Yma rydym yn cadarnhau bod HAFS yn ffynhonnell ddeniadol o ffactorau paracrine atgynhyrchiol; dylid gwerthuso'r dewis o fformiwleiddiadau secretome HAFS ffetws neu amenedigol ar gyfer therapi paracrine yn y dyfodol gan ystyried y senario clinigol penodol.
Geiriau allweddol:hylif amniotig; bôn-gelloedd; effeithiau paracrine; fesiglau allgellog; cyfrwng cell-cyflyru; cemocin; cytocinau; proteomeg; dilyniannu RNA; microRNA
1. Rhagymadrodd
Mae meddygaeth adfywiol wedi datblygu'n ddiweddar fel maes sy'n dod i'r amlwg i ddarparu adferiad swyddogaethol o feinwe anafedig trwy nifer o strategaethau. Wrth i ddulliau peirianneg meinwe ddatblygu'n sylweddol yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae'r ymchwiliad i effeithiau paracrine bôn-gelloedd wedi dwysáu'n gynyddol ar yr un pryd. Dangoswyd yn fras bod potensial therapiwtig bôn-gelloedd wedi'u trawsblannu yn cael eu cyfryngu'n bennaf gan eu ffactorau hydoddol cyfrinachol, a all drefnu micro-amgylchedd pro-adfywio yn y meinwe lletyol tra'n sbarduno actifadu mecanweithiau mewndarddol o adferiad swyddogaethol [1,2]. Felly, mae'r bôn-gelloedd yn cyfrinachu'r cyfan o foleciwlau troffig paracrine sy'n cael eu rhyddhau o'r celloedd, yn ogystal â fesiglau allgellog wedi'u rhwymo â philen wedi'u cynnig yn gynyddol fel cynnyrch meddyginiaethol therapi arloesol gan astudiaethau rhag-glinigol annibynnol lluosog sy'n targedu cardiofasgwlaidd, niwrolegol, a/neu ymfflamychol. clefyd. Yn unol â hynny, gellir ystyried bôn-gelloedd fel ffatrïoedd biolegol ar gyfer ymelwa ar eu cyfrinachau therapiwtig trwy gynnig triniaethau adfywiol parod i'w defnyddio ac oddi ar y silff. Trwy gymhwyso strategaeth o'r fath sy'n seiliedig ar gelloedd, ond heb gelloedd, gellir goresgyn llawer o agweddau cyfyngol sy'n gysylltiedig â therapi celloedd canonaidd, tra'n dal i sicrhau effeithiau buddiol.beth yw cistancheYn y persbectif hwn, mae celloedd stromal mesenchymal (MSC) wedi'u profi'n helaeth fel ymgeiswyr cell tybiedig? Yn wir, mae MSC a bôn-gelloedd / epilgell wedi'u peiriannu a / neu eu hysgogi gan wahanol strategaethau rhag-gyflyru i wella eu gallu adfywiol a'u potensial cyfrinachol [3,4] gyda diddordeb penodol ym mherthnasedd biolegol eu fesiglau allgellog cudd (EVs).
Mae EVs yn ronynnau maint nano wedi'u hamffinio gan haen ddeulipid ac yn cael eu secretu'n weithredol gan bob math o gell. Mae EVs yn cynnwys bach iawn (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); maent yn gweithredu fel cludwyr biolegol hanfodol o signalau rhynggellog trwy ddanfon eu cargo moleciwlaidd o gell rhiant i ymatebydd / targed [5,6]. O ystyried bod eu potensial paracrine rhyfedd wrth gael effeithiau buddiol yn debyg i'w celloedd tarddiad, mae EVs bôn-gelloedd wedi codi fel opsiynau therapiwtig apelgar mewn modelau rhag-glinigol o glefydau, megis isgemia, llid, neu anaf, fel y'i hadolygwyd yn helaeth yn [{{3] }}]. O safbwynt trosiadol, yn ogystal â photensial modiwleiddio celloedd, mae dichonoldeb ynysu a hunan-adnewyddiad uchel yn agweddau allweddol ar ffynhonnell ddelfrydol EVs therapiwtig a ffactorau hydawdd. Mewn sefyllfa o'r fath, gall MSC ffetws ac amenedigol gynnig opsiwn diddorol o ystyried eu potensial lluosog, a phroffil anaeddfed datblygiadol gyda nodweddion canolraddol rhwng epiliaid somatig embryonig ac oedolion [10,11]. Gellir ynysu MSC y ffetws o atodiadau all-embryonig yn ystod beichiogrwydd fel samplu dros ben a gafwyd yn ystod sgrinio cyn-geni (hy, villi corionig [12-14] a hylif amniotig [15,16]) neu ei gael fel epilyddion amenedigol ar enedigaeth, o ddeunydd gwastraff clinigol (hy, pilenni amniotig a brych [17-21], cydrannau llinyn bogail [22-24] a hylif amniotig term [25,26]).
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Yn nodedig, amlygwyd bôn-gelloedd hylif amniotig dynol (HAFS) fel strategaethau therapiwtig addawol mewn meddygaeth atgynhyrchiol. ac wedi cael eu dangos i fod yn fras amlalluog in vitro ac in vivo [16,27,28], yn cyfrannu at y llinach hematopoietig yn dilyn mewn trawsblaniad utero [29], ac yn engraft mewn organau anafedig tra'n cael effeithiau imiwnofodwlaidd [26,30] ac actifadu ymatebion gwneud iawn mewndarddol, fel y disgrifir yn gynhwysfawr yn [31]. Mae ein tîm ac eraill wedi dangos ymhellach bod AFS yn rhyddhau secretome sydd wedi'i gyfoethogi'n fawr â moleciwlau troffig bioactif sy'n gallu targedu gwahanol fecanweithiau gwneud iawn. Adroddwyd bod ffactorau paracrine HAFS yn darparu ysgogiadau pro-goroesi gyda diffodd llid [32], yn darparu cardioprotection yn erbyn isgemia hirhoedlog [33.34], a cardiotoxicity [35], ac yn ysgogi angiogenesis lleol gydag ailfynediad cylchred celloedd cardiomyocyte [32]. 34,36]. Gan fod gweinyddiaeth HAFS-EV yn unig wedi dangos bod y rhan fwyaf o'r effeithiau hyn yn cael eu hailadrodd, mae astudiaethau annibynnol wedi canolbwyntio ar ddyrannu eu proffil adfywiol yn erbyn gwahanol gefndiroedd patholegol, gan gynnwys anaf i gyhyrau ysgerbydol a chardiaidd, clefyd yr arennau, osteoarthritis, osteoporosis, enterocolitis necrotizing a niwroddirywiol. modelau [34,37-44].
Er y gallai tystiolaeth gefnogi'r cyfieithiad clinigol o HAFS-EVs ar gyfer therapi paracrine yn y dyfodol, mae'n bwysig ystyried bod y rhan fwyaf o'r astudiaethau hyn wedi ymchwilio'n bennaf i botensial modulatory HAFS y ffetws a gafwyd yn ystod sgrinio cyn-geni Ⅱ trimester Yn wir, proffil cyflawn o'r secretome o nid yw'r adran amenedigol wedi cael ei harchwilio'n fanwl eto (hy, o III trimester c-sections). Mae HAFS amenedigol trydydd tymor wedi dangos priodweddau rheoleiddio imiwnedd nodedig o gymharu â rhai mi-a II-trimester [26], tra'n cynnal potensial adfywiol endothelaidd perthnasol [25].faint o cistanche i'w gymrydO bwys, mae'r adroddiad diweddar ar forffoleg heterogenaidd HAFS y ffetws[45] wedi rhoi mewnwelediadau newydd i'w proffil stemrwydd a mynegiant genynnau.bioflavonoidauMae hyn yn gyfan gwbl wedi taflu goleuni newydd ar werth adfywiol y gwahanol ffracsiynau cellog o HAFS[46]. Felly, mae nodweddu cynhwysfawr y gwahanol isboblogaethau o HAFS yn denu sylw cynyddol. Fe wnaethom adrodd yn flaenorol fod ysgogiad hypocsig 24h a di-serwm yn strategaeth effeithiol i hybu potensial paracrine Ⅱ trimester AFS ffetws [34,35,37]. Gan mai ychydig sy'n hysbys am gyfansoddiad y secretome o III trimester HAFS, yma rydym yn adrodd ar y gymhariaeth gynhwysfawr o Ⅱ yn erbyn Ⅲ trimester HAFS a'u ffracsiynau secretome (gan gynnwys hetiau-EVs), er mwyn mynd i'r afael â dylanwad cyfnod beichiogrwydd a chell hypocsig. rhag-amod ar nodweddion cell a secretome.
2. Canlyniadau
2.1.AFS Amenedigol Cyflwyno Cydweddiad Ffenotypig Agos i'r Ffetws
Ni werthfawrogid unrhyw wahaniaeth ystadegol berthnasol yn oedran rhoddwr rhwng samplau hylif amniotig y ffetws Il trimester a samplau hylif amniotig amenedigol III trimester. C-KIT* ffetws Cadarnhaodd HAFS (f-hAFS o samplau hylif amniotig II trimester) a c-KIT* HAFS amenedigol (p-hAFS o wastraff clinigol hylif amniotig III trimester) nodweddion tebyg gyda morffoleg tebyg i ffibroblast a chrwn hirgrwn (Ffigur 1A) a ffenoteip stromal mesenchymal (data heb ei ddangos), fel yr adroddwyd yn flaenorol [16,25]. Roedd f-hAFS a p-hAFS a feithrinwyd in vitro hyd at ddarn 5 yn dangos lefelau dibwys o heneiddedd o actifadu sy'n gysylltiedig â heneiddedd (SA- -Gal) mewn tua 4 y cant o gelloedd (Ffigur 1B) . Cyflwynodd f-hAFS a p-hAFS lefel uchel o gydfynegiant o'r marcwyr mesenchymal CD107a a CD146, yr adroddwyd yn ddiweddar eu bod yn diffinio ffenoteip cyfrinachol iawn[47]. Roedd celloedd CD107at CD146* yn cynrychioli mwyafrif y boblogaeth f-hAFS (tua 64 y cant ,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">
Ffigur 1. Mae gan y ffetws ac amenedigol werthusiad ffenoteipaidd. (A) Delweddau cynrychioliadol o HAFS ffetws (f-hAFS, panel chwith) a HAFS amenedigol (p-hAFS, panel dde) wedi'u meithrin in vitro mewn amodau safonol; bar graddfa: 200 um. (B) Dadansoddiad o'r marciwr senescent beta-galactosidase (SA- -Gal, mewn glas) trwy staenio cytocemeg ar f-hAFS a p-hAFS ar ôl 5 darn mewn diwylliant; adroddir delweddau cynrychioliadol yn y panel chwith, bar graddfa: 200 um. Mae'r ganran gyfatebol o gelloedd/maes-Gal-positif yn cael ei adrodd yn y graff yn y panel ar y dde (f-hAFS: 4.12 ± 0.58 y cant a p-hAFS: 3.88 ± 2.10 y cant; p=0.1424,n{ {24}} arbrofion).(C)Imiwnoffenoteip o HAFS yn mynegi marcwyr mesenchymal CD146 a CD107a. Lleiniau cytometreg llif cynrychioliadol o f-hAFS a p-hAFS (panel chwith) a gwerthoedd cyfatebol y cyfeirir at CD107a positif dwbl ynghyd â chelloedd CD146 ynghyd; CD107a ynghyd â CD146* f-hAFS:63.68±5.82 y cant ,*p=0.016 o'i gymharu â gweddill36.32±5.82 y cant f-hAFS (Arall);CD107 ar CD146 ynghyd â p-haFS:52.07±6.76 y cant yn weddill 93±56.76 y cant p-hAFS (Arall);CD107a ynghyd â CD146 ynghyd â f-hAFS vs CD107a ynghyd â CD146 ynghyd â p-hAFS p=0.2403,n=4 arbrofion. Arall: cyfanswm gweddill CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS a CD107 ar CD146-hAFS. Mynegir yr holl werthoedd fel cymedr ± sem o arbrofion annibynnol. SA{73}}Gal: Galactosidase sy'n Gysylltiedig â Senescence.
2.2.AFS Ffetws Dangos Metabolaeth Wahanol i AFS Amenedigol
Er mwyn gwerthuso a allai'r cam beichiogrwydd ddylanwadu ar fetaboledd mitocondriaidd, dadansoddwyd f-hAFS a p-hAFS mewn amodau diwylliant in vitro safonol trwy ddadansoddiadau biocemegol. Dangosodd gwerthusiad o fetaboledd aerobig fod y gyfradd defnyddio ocsigen (OCR) a synthesis ATP yn is mewn f-hAFS mewn perthynas â p-hAFS, o'u hysgogi â pyruvate a malate (P/M; *** p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">
2.3.Nid yw Rhag-gyflyru Hypocsig yn Effeithio ar Ffetws ac Amenedigol - Mae'n Hyfywedd ac Yn Cynnal Eu Gweithgaredd Ysgrifenyddol
Er mwyn diffinio fformwleiddiadau secretome HAFS, cafodd celloedd eu meithrin mewn amodau di-serwm er mwyn osgoi unrhyw halogiad gan FBS. Fe wnaethom ddangos yn flaenorol nad oedd amodau diwylliant hypocsig 24 h heb serwm (SF) ac 1 y cant o O2 yn newid yn sylweddol hyfywedd Ⅱtrimester AFS ffetws (f-obaith), tra eu bod yn cefnogi rhyddhau ffactorau paracrine adfywiol yn eu cyfrwng cyflwr celloedd. (hAFS-CM) ac mewn fesiglau allgellog (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Yma, yn ogystal â phroffilio ffracsiynau secretome p-haFS am y tro cyntaf, fe wnaethom werthuso a yw p-wedi cyflwyno ymddygiad tebyg o dan yr un drefn rhag-gyflyru, gan ddefnyddio'r cyflwr diwylliant normocsig â'r rheolaeth. dadansoddwyd hyfywedd f-hAFS a p-hAFS ar ôl 24 h yn y gosodiadau canlynol: cyflwr normocsig (20 y cant O2) mewn cyfrwng diwylliant rheolaeth lwyr (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo a Ctrl p-haFSnormo), cyflwr normocsig mewn cyfrwng SF (SF f-hAFSnormo a SF p-hAFSnormo), cyflwr hypocsig (1 y cant O2) mewn cyfrwng rheoli cyflawn (Ctrlf-has hypo a Ctrl p-hAFSnypo), a chyflwr hypocsig mewn cyfrwng SF (SF f-has hypo a SF p -has hypo, Ffigur 3A). Gwnaethom gadarnhau nad oedd hyfywedd f-has wedi'i newid mewn amodau Ctrl a SF ac o dan ysgogiad hypocsig, gyda mwy nag 80 y cant (hyd at bron i 88 y cant) o gyfanswm y celloedd heb eu heffeithio. Roedd celloedd apoptotig cynnar a hwyr yn amrywio o ca. 13 y cant i 18 y cant mewn amodau SF, heb unrhyw berthnasedd ystadegol arwyddocaol. Yn yr un modd, roedd hyfywedd amenedigol yn yr ystod o 80-92 y cant , ac roedd celloedd apoptotig cynnar a hwyr yn cynrychioli hyd at 18 y cant mewn amodau SF. dylanwadwyd ychydig ar p-hAFS dan yr amodau hypocsig a SF cyfun yn unig; yn wir, er nad oedd rhag-gyflyru yn dylanwadu ar oroesiad celloedd pan gafodd p-hAFS eu meithrin mewn cyfrwng cyflawn, dangosodd y cyflwr SF cyfatebol gynnydd fesul ca. 4-plyg (* t<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">
Ffigur 2. Nodweddiad metabolaidd o ffetws ac amenedigol AFS. (A) Cyfradd yfed ocsigen (OCR), synthesis ATP trwy F1-F.ATP synthase, a chymhareb P/O mewn f-have a-have ym mhresenoldeb pyrwfad plws malate (P/M) neu succinate (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AwstraliaMae cymhariaeth y ganran o ataliad o synthesis OCR ac ATP mewn f-a-hAFS oherwydd yr atalyddion a nodir uchod yn cael ei adrodd yn y panel isaf B. Ar gyfer arbrofion OCR: HAFS ac Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">
Yna fe wnaethom werthuso cynnyrch ffracsiynau secretome a gafwyd o f-hAFS yn erbyn p-hAFS yn seiliedig ar gyfoethogi protein. Mae gan y cyfanswm gyfrinachedd, gan fod y cyfan o'r ffactorau paracrine cyfrinachol yn cael ei gynrychioli yma gan yr HAFS-CM. Crynodiad protein f-hAFS-CM a p-hAFS-CM mewn cyfrwng SF yn dilyn rhag-gyflyru celloedd hypocsig yn erbyn cyflwr normocsig rheoli fel llinell sylfaen (sef, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo, a p -hAFS-CMHypo,) ei werthuso gan assay BCA a'i fesur yn unol â 10§ celloedd.cistanchRoedd y canlyniadau a gafwyd yn awgrymu bod f-has-CM a p-haFS-CM yn dangos tueddiad positif cyfartal mewn cyfoethogi protein yn dilyn preimio hypocsig (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 celloedd gradd; p-hAFS-CMNypo∶182.30±29.71 ug/10 celloedd gradd) dros eu cymheiriaid normocsig (f-hAFS-CMnormo: 105.50 ±19.89 ug/10 celloedd gradd; p- Celloedd gradd HAFS-CMhypoi 91.12 ± 24.39 ug / 10. Yn yr un modd, mesurwyd crynodiad protein arwyneb HAFS-EVs mewn f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-haFS-EVSnormo, a p-haFS-EVShypo Dangosodd EVs gynnyrch tebyg o'u cael o f-hAFS neu p-hAFS Yn yr un modd â fformiwleiddiadau HAFS-CM, roedd tuedd gadarnhaol yn y cynnydd mewn cynnwys protein ar f-hAFS-EVs a p-hAFS. cyflwr normocsig cyfatebol （f-hAFS-EVSHypo∶2.03 ±0.67 ug/10 celloedd gradd a p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10 celloedd gradd;f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/10 celloedd gradd -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31 ug/10 celloedd gradd, Ffigur 3C).
2.4.AFS Ffetws ac Amenedigol Rhyddhau EVs gyda Morffoleg Analog a Dosbarthiad Maint
Fe wnaeth dadansoddiad morffolegol trwy ficrosgopeg electron trawsyrru (TEM) gynyddu'r doreth uchel o EV-secratory o f-hAFS a p-hAFS (Ffigur 4). Fe wnaethom ymchwilio ymhellach i faint ac arwynebedd f-hAFS-EVs a p-hAFS-EVs (Ffigur 4B) yn dilyn rhag-gyflyru hypocsig o gymharu â gwaelodlin normocsig. Mae ffetws ac amenedigol wedi rhyddhau EVs heterogenaidd o ran maint, yn yr ystod o 40-250 nm, gan gynnwys felly ecsosomau / EVs bach a microfesiglau / fesiglau gollwng. Roedd maint cyfartalog EVs/maes yn y gwahanol grwpiau yn gymaradwy, mesurwyd HAFS-EVs ffetws 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) a rhai amenedigol wedi'u mesur 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo: 94.60 ±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, Ffigur 4B, panel chwith). O ran y cynnyrch, dangosodd HAFS a ysgogwyd o dan hypocsia duedd gadarnhaol yn y cynnydd yn y nifer o EVs bach, er nad oedd y cynnydd hwn yn ystadegol arwyddocaol. Mesurodd f-hAFS-EVStypo 40-70 nm a oedd bron ddwywaith yn fwy na'u cymar normocsig. Roedd amenedigol-has-EVSHypo a fesurodd 40-70 nm,70-100 nm a 100-130 nm bron yn driphlyg y nifer a gafwyd mewn diwylliant normocsig (Ffigur 4B).
Dangosodd dadansoddiad olrhain nanoronynnau (NTA) nifer uwch o ronynnau mewn paratoadau f-hAFS-EV a p-hAFS-EV, a chadarnhaodd y cynnydd mewn EVs yn y samplau hypocsig, fel y gwelwyd hefyd o'r dadansoddiadau blaenorol (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'gronynnau/10 celloedd gradd; f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 gradd gronynnau/celloedd 10 gradd ; p-haFS-EVsnormo: 2.43 ± 0.80 × gronynnau 10 gradd / celloedd 10 gradd; p-hAFS-EVshypo: 3.05 ± 0.62 × gronynnau gradd 10 / celloedd 10 gradd, Ffigur 4C).
Ffigur 4. Nodweddiad morffolegol EVs ffetws ac amenedigol. (A) Delweddau cynrychioliadol o ficrosgopeg electron trawsyrru (TEM) o f-hAFS a p-hAFS (panel chwith uchaf ac isaf, yn y drefn honno, gyda saethau du yn nodi cyrff aml-fesicwlaidd mewnsytoplasmig ag EVs/ecsosomau bach ynddynt), ac o f -hAFS-EVs a p-hAFS-EVs (panel dde uchaf ac isaf, yn y drefn honno) a ryddhawyd mewn amodau di-serwm ac o dan rag-gyflyru normocsaidd yn erbyn hypocsig (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-haFS-EVSnormo; a f-hAFS-EVshypo, yn y drefn honno), barrau graddfa: 200 nm. (B) Panel chwith: dadansoddiad TEM o ddosbarthiad maint HAFS-EVs; panel ar y dde: ystyriwyd dosbarthiad y nifer f-hAFS-EVs a p-hAFS-EVs fesul maint cae o 40 nm hyd at 250 nm; mynegir gwerthoedd fel cymedrig±sem n=3 arbrofion annibynnol. (C) Dadansoddiad olrhain nanoronynnau ar gyfer maint a dosbarthiad AFS. Panel chwith: delwedd gynrychioliadol o'r allbwn graffigol; panel cywir: crynodiad HAFS-EVs wedi'i fesur fel gronynnau 10 gradd fesul celloedd secreting 10 gradd; nm: nanomedr; mL: mililitr.
2.5.Nodweddiad Proteomig Ffetws yn erbyn AFS Amenedigol Yn Amlygu'r Gwahaniaethau yn eu Cyfansoddiad Cyfrinachol Yn ôl Oedran Trosiadol a Rhagamod Hypocsig
Perfformiwyd nodweddiad proteomig o fformwleiddiadau secretome f-hAFS a p-hAFS trwy gyfrwng platfform di-label o ynnau saethu, yn seiliedig ar gyplu cromatograffaeth nano hylif a sbectrometreg màs cydraniad uchel (nLC-HRMS). Cafwyd pedwar deg wyth o broffiliau proteomig trwy ddadansoddiad dyblyg o dri atgynhyrchiad biolegol o HAFS-CM ac mae ganddynt-EVs o f-hAFS a p-hAFS sy'n cael rhag-amod celloedd hypocsig o'i gymharu â'r cyflwr normocsig fel rheolydd. Nodwyd cyfanswm o 4179 o grwpiau protein gwahanol gydag o leiaf un peptid unigryw a gyda phwysau moleciwlaidd yn amrywio o 2 i 3900 kDa a phwyntiau isoelectric o 3.6 i 13. Gwelwyd mynegiant protein cyfartalog uwch mewn HAFS-EVs o'i gymharu â HAFS-CM . Cyflawnwyd aliniad yr holl restrau protein a gafwyd ar sail proteinau a nodwyd. Ar gyfer pob cyflwr arbrofol, crëwyd rhestr unigryw yn normaleiddio a chyfartaleddu [50] y gwerthoedd paru sbectrwm peptid (PSMs) a briodolir i'r proteinau, sy'n cynrychioli nifer y sbectra màs a neilltuwyd i bob un ac yn cynrychioli'n anuniongyrchol eu helaethrwydd yn y samplau. Mae'r rhestr gyflawn o broteinau a nodir yn fformwleiddiadau HAFS-CM a have-EV i'w gweld yn Nhabl S1.
Roedd cymhwyso dadansoddiad gwahaniaethol llinol (LDA[51]) ar y brif restr hon yn caniatáu echdynnu proteinau o arwyddocâd ystadegol (Ffratio Yn fwy na neu'n hafal i 4.5 a** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 yn HAFS-CM a fformwleiddiadau wedi-EV yn cael eu hystyried ar wahân. Er bod tua 69.5 y cant a 69.9 y cant o broteinau wedi'u rhannu ymhlith cyflyrau HAFS-EVs a HAFS-CM yn y drefn honno, roedd y cynnwys sy'n weddill yn ymddangos yn gyfyngedig mewn gwahanol gyfrannau, yn amrywio o 3.7 y cant i 13.4 y cant, ymhlith y fformwleiddiadau.
Er mwyn archwilio'r newidiadau proteomig yn feintiol, cynhaliwyd dadansoddiad gwahaniaethol di-label trwy ddefnyddio meddalwedd MAProMa cartref a chymhwyso dau algorithm, DAve (Cyfartaledd Gwahaniaethol) a DCI (Mynegai Hyder Gwahaniaethol, sy'n cynrychioli'r gymhareb a'r hyder mewn mynegiant gwahaniaethol, yn y drefn honno), ar PSMs pob protein unigol rhwng y ddau derm cymaradwy. Defnyddio hidlwyr llym ar gyfer DAve a DCI i gynyddu hyder adnabod ac i ystyried proteinau ag amrywiad sy'n fwy na newid plyg o 1.5, cymariaethau pâr o f-hAFS-CM yn erbyn p-hAFS-CM ac o f-hAFS-EVs yn erbyn gwnaed p-hAFS-EVs yn ôl cyfnod beichiogrwydd y gell. Canfuwyd cyfanswm o 58 a 109 o broteinau wedi'u mynegi'n wahaniaethol yn yr adrannau has-CM a have-EV uchod, yn y drefn honno, (Ffigur S1B, C am fanylion dethol a Thablau S2-S3 ar ffurf estynedig). Ymhlith y rhain, arweiniodd 30 o broteinau i fyny-reoleiddio mewn f-hAFS-CM ac uwch-reoleiddiwyd 28 yn p-hAFS-CM (Ffigur S1B); yn yr un modd, arweiniodd 44 o broteinau gwahanol at uwchreoleiddio mewn f-have-EVs a chafodd 65 eu huwchreoleiddio mewn p-hAFS-EVs (Ffigur S1C). Yn nodedig, mae proteinau a arweiniodd at uwch-reoleiddio mewn f-have i'w hystyried yn is-reoleiddiedig mewn p-ha ac i'r gwrthwyneb.
adroddir ar werthoedd; gweler Tabl S2 am restr gyflawn a pharamedrau manwl y proteinau a adroddwyd. (C) Dadansoddiad cyfoethogi prosesau biolegol o broteinau a nodwyd ag amlder o 2 o leiaf mewn HAFS-CM (panel chwith) y ffetws a chael-CM amenedigol (panel dde) yn unol â rhag-gyflyru hypocsig celloedd. Yn seiliedig ar yr offeryn FunRich, dangosir termau ontoleg genynnau mewn siartiau bar sy'n nodi canran y genynnau a gyfoethogwyd ar gyfer pob categori (bariau pinc ar gyfer-have-CMnormo, bariau porffor ar gyfer bariau glas golau f-hAFS-CMhypor ar gyfer p-hAFS-CMnormo, a pheli glas ar gyfer p-hAFS-CMhypo).prynu cistancheTermau ontoleg genyn yn unig gyda Bonferroni a gywirwyd gyda *p<0.05 are="">
Mae'r erthygl hon wedi'i thynnu o Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms
