Rheoli Lefel Mynegiad Genynnau Tunadwy wedi'i Gyfryngu gan CRISPRi Gyda RNA un canllaw wedi'i beiriannu yn Escherichia Coli
Oct 20, 2023
ABSENOLDEB
Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>{{0}plyg). Roedd y sgRNAs hyn hefyd yn galluogi rheoleiddio modiwlaidd gyda dilyniannau DNA targed amrywiol. Fe wnaethom gymhwyso'r system hon i ailddosbarthu'r fflwcs metabolig i gynhyrchu deilliadau feiolacein mewn cymhareb ragweladwy a gwneud y gorau o gynhyrchu lycopen. Byddai'r system hon yn helpu i gyflymu'r prosesau optimeiddio fflwcs mewn peirianneg metabolig a bioleg synthetig.
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche
【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
RHAGARWEINIAD
System holltiad DNA a arweinir gan RNA sy'n cynnwys RNA CRISPR (crRNA), RNA CRISPR traws-actifadu (tracrRNA) a phrotein Cas9 (1 ,2). Mae Cas9 o Streptococcus pyogenes wedi'i ddefnyddio'n helaeth mewn peirianneg genom oherwydd ei briodweddau â nodweddion da (3,4). Mae cymhlyg y protein spCas9, tracrRNA, a chrRNA yn clymu ac yn hollti'r protospacer DNA targed sy'n ategu dilyniant 20 niwcleotidau (nt) spacer y crRNA ym mhresenoldeb motiff protospacer cyfagos 5'-NGG{-3' (PAM ) dilyniant (5,6). Er mwyn symleiddio'r system, gellir defnyddio RNA canllaw sengl chimerig (sgRNA) lle mae cysylltydd artiffisial o'r enw tetraloop yn ymuno â crRNA a tracrRNA (5). Mae'n caniatáu amnewid dau RNA ar wahân gydag un moleciwl RNA, gan wneud y system yn fwy hylaw. Mae un o'r systemau sy'n seiliedig ar CRISPR, ymyrraeth CRISPR (CRISPRi), yn defnyddio Cas9 (dCas9) sy'n gatalytig anweithredol trwy ddisodli rhai asidau amino o bob parth endonuclease (7). Mae'r addasiad hwn yn gwneud ribonucleoprotein (RNP) cymhleth a all gyfeirio a rhwymo i dargedu DNA ac ymyrryd â RNA polymeras (RNAP) i atal trawsgrifio cychwyn neu elongation (7). Yn wahanol i ergyd gan system CRISPR/Cas9, mae CRISPR yn caniatáu ar gyfer dymchwel genynnau cildroadwy trwy fynegi dCas9 neu sgRNA o dan hyrwyddwr anwythol, gan ganiatáu ar gyfer mwy o hyblygrwydd wrth reoleiddio genynnau (7). Mae system CRISPRi i bob pwrpas wedi tawelu genynnau targed gannoedd o weithiau (7,8). Mae gormes genynnau targed-benodol yn galluogi ffenoteipio trwybwn uchel gan ddefnyddio pwll sgRNA genom-eang (9) neu'n ailgyfeirio fflwcs carbon mewn bacteria peirianneg tuag at y cemegyn targed (10-12). Yn ogystal, mae amlblecs CRISPRi wedi'i ddangos mewn gwahanol westeion gan ddefnyddio amrywiaeth o ddulliau i fynegi sgRNAs lluosog yn sefydlog, gan gynnwys araeau crRNA hir, integreiddio switsh toehold, ac araeau sgRNA extralong nad ydynt yn ailadrodd (13-16). Mae'r technegau hyn o atal genynnau lluosog ar yr un pryd wedi'u defnyddio i gyflawni tasgau mwy cymhleth, megis lleihau canolradd gwenwynig neu rwystro llwybrau cystadleuol mewn eplesu bacteriol (13,16-19). Fodd bynnag, nid yw gormes llwyr bob amser yn ddymunol ar gyfer peirianneg metabolig. Dylid rheoli lefelau mynegiant genynnau yn fanwl gywir i gyflawni'r gweithgaredd ensymau gorau posibl rhwng y llwybrau twf a chynhyrchu, gan gydbwyso mewn crynodiadau rhagflaenydd mewngellol ac osgoi cronni canolradd gwenwynig (20-22). Mae technegau amrywiol wedi'u datblygu i beiriannu effeithlonrwydd gormes CRISPRi. Cafodd sawl ffactor eu trin, megis faint o brotein sgRNA a dCas9 neu'r dewis o sgRNA. Roedd rheoli mynegiant dCas9 neu fynegiad dCas9 a sgRNA gan ddefnyddio hyrwyddwr anwythadwy yn rheoli mynegiant genynnau targed mwy na 30-plyg neu 300-plyg, yn y drefn honno (23,24). Fodd bynnag, sylwyd y gall modiwleiddio crynodiad dCas9 arwain at effeithlonrwydd gormesiad anghyson ar wahanol brotospacers (23). Mae'r nifer gyfyngedig o hyrwyddwyr anwythol sydd ar gael hefyd yn gwneud heriau dylunio er gwaethaf llawer o ymdrechion (25). Strategaeth arall yw gosod aptamer RNA ligand-benodol i mewn i'r sgRNA, lle gall moleciwl cytras bach amlygu'r spacer, gan alluogi rheolaeth dos-ddibynnol o CRISPRi ( 26 ). Mae'r sgRNA ligand-benodol yn ddefnyddiol os oes pâr addas o ligand ac aptamer ar gael. Mae'r pellter o'r safle cychwyn trawsgrifio a chyfeiriadedd rhwymo dCas9 hefyd yn effeithio ar effeithlonrwydd CRISPRi (7). Gall addasu'r pellter rhwng y safle rhwymo sgRNA a'r safle cychwyn trawsgrifio wneud y gorau o'r llwybr mewn peirianneg metabolig (17,27,28). Mae effeithlonrwydd hybrideiddio rhwng y dilyniannau spacer a'r protospacer hefyd yn newid effeithlonrwydd rhwymo cymhleth RNP (29-31). Felly, cyflwynwyd camgymhariadau a ddyluniwyd y tu allan i'r rhanbarth hadau i newid yr ynni rhydd i arallgyfeirio effeithlonrwydd CRISPRi (31,32). Fodd bynnag, mae dylunio'r sgRNA yn ofynnol ar gyfer pob dilyniant targed newydd, a gall cyflawni gwahaniaeth sylweddol mewn egni rhydd trwy ddim ond diffyg cyfatebiaeth fod yn heriol. Ar ben hynny, mae posibilrwydd o fwy o rwymo oddi ar y targed (33). Serch hynny, mae'n gyfyngedig o hyd i atal mynegiant genynnau lluosog yn union mewn modd modiwlaidd waeth beth fo'r dilyniant targed. Yn yr astudiaeth hon, rydym wedi datblygu system CRISPRi y gellir ei thiwnio sy'n rheoleiddio mynegiant genynnau yn fanwl gywir ac yn rhagweladwy. Trwy drefnu cell iteraidd yn seiliedig ar fflworoleuedd yn y llyfrgell sgRNA gan dargedu tetraloop a'i ranbarth ystlysol, fe wnaethom gyflawni effeithlonrwydd gormes trawsgrifiadol hyd at 45-plyg hyd yn oed pan fydd y DNA targed yn cael ei newid. Mae'r system hon yn caniatáu ar gyfer ailddosbarthu fflwcs metabolig rhagweladwy heb drin y genom gwesteiwr neu'r llwybrau synthetig, gan ddarparu offeryn addawol ar gyfer optimeiddio llwybrau metabolaidd.
DEUNYDDIAU A DULLIAU
Straenau bacteriol, plasmidau, ac adweithyddion
Rhestrir y straenau Escherichia coli a'r plasmidau a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl Atodol S1. Rhestrir y preimwyr a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl Atodol S2. Disgrifir gweithdrefnau clonio yn y dulliau atodol. Dangosir genynnau targed a'u dilyniannau DNA targed ar gyfer y system CRISPR yn Nhabl Atodol S3. Defnyddiwyd Mach1-T1R ar gyfer clonio cyffredinol. Adeiladwyd y llyfrgell gan ddefnyddio NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Perfformiwyd diwylliannau arferol ar gyfer adeiladu plasmidau a straen ar 37◦C mewn cawl Luria-Bertani (LB) neu ar blât agar LB yn cynnwys gwrthfiotigau priodol (34 g/ml cloramphenicol, 50 g/ml spectinomycin). Perfformiwyd PCR gan ddefnyddio Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Cafodd Plasmidau a chynhyrchion PCR eu puro gan ddefnyddio Kit SV Plasmid GeneAll® Exprep™ a Phecyn Gel SV (GeneAll Biotechnology). Effeithlonrwydd gormes mutants sgRNA Adnewyddwyd cyfryngau diwylliant dros nos i OD600 o 0.05 a'u deor nes iddo gyrraedd gwerth rhwng 0.6 a 0.8. Yna cafodd y cyfryngau diwylliant ei wanhau i OD600 o 0.05 gydag 20 ng/ml o ATc a'i ddeor am 4 h. Mesurwyd fflworoleuedd nythfa sengl ar 575 nm/616 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate Hidex Sense (Hidex), a phennwyd gwerth OD600 gan ddefnyddio sbectrophotometer Jenway 7300 (Jenway). Cyfrifwyd y fflworoleuedd cymharol fel yr unedau fflworoleuedd fesul gwerth OD600, gyda'r gwerth ar gyfer PC wedi'i osod fel 100%.
Effeithiau Cistanche tubulosa-trin rhwymedd
sgrinio llyfrgell sgRNA
Defnyddiwyd yr un dull diwylliannol â'r un a ddisgrifir uchod. Gwanhawyd cyfryngau diwylliant i [gell]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.
echdynnu RNA
Echdynnwyd cyfanswm RNA gan ddefnyddio RNeasy Mini Kit (Qiagen) dim ond pan fydd MiRNeasy Mini Kit (Qiagen) ar gyfer meintioli sgRNA, yn dilyn triniaeth ag Adweithydd Bacteria RNAprotect (Qiagen) a storio ar -80◦C. Cyflawnwyd treuliad DNA ar-golofn gan ddefnyddio Set DNase Heb RNase (Qiagen) yn ystod y broses echdynnu. Gwiriwyd halogiad DNA trwy PCR heb drawsgrifiad gwrthdro. Pennwyd crynodiad a phurdeb pob sampl gan ddefnyddio NanoDrop One (Thermo Scientific), a gwerthuswyd yr ansawdd gan ddefnyddio DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) ar LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
Dadansoddiad RT-qPCR
Roedd preimio ar gyfer RT-qPCR naill ai'n dod o stoc labordy neu wedi'u dylunio gan ddefnyddio'r offeryn Primer3Plus (34) ac wedi'u rhestru yn Nhabl Atodol S4. Defnyddiwyd y genyn CysG fel genyn cyfeirio (35) ar gyfer pob arbrawf RT-qPCR. Cynhyrchwyd cromlin safonol trwy 10-blygu templed o 107 copi/l i 10−1 copi/l. Pennwyd terfyn y meintioli trwy osod rhif y copi a'r gyfradd ymhelaethu positif i swyddogaeth sigmoid a chyfrifo gwerth rhif copi positif 95%. Diffiniwyd yr amrediad deinamig llinol fel y rhif copi isaf lle mae'r amrywiad Cq ôl-gyfrifedig yn llai na 35%. Dilyswyd gwerthoedd Cq uwchlaw 30 neu'r rhai nad ydynt wedi'u mwyhau mewn rheolaeth nad yw'n dempled. Mae data cromlin safonol ar gael yn Nhabl Atodol S5 a Ffigur Atodol S1. Defnyddiwyd cyfanswm o 2.5 ng o gyfanswm RNA mewn adwaith RT-qPCR 10 l gyda Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). Perfformiwyd RT-PCR yn driphlyg ar System PCR RealTime StepOnePlus™ (Biosystemau Cymhwysol) gyda'r camau canlynol: (i) trawsgrifio cefn ar 55◦C am 10 munud, ac yna dadnatureiddio ar 95◦C am 1 munud; (ii) 40 cylch thermol ar 95◦C am 10 s a 60◦C am 1 munud; (iii) dadansoddiad cromlin toddi ar 95◦C am 15 s a 60◦C am 1 munud, ac yna ramp o 60◦C i 95◦C ar gyfradd o 0.3◦C/min. Penderfynwyd meintioli cymharol RNA gan ddefnyddio'r dull delta-deltaCt (36) a'i ddadansoddi gyda Meddalwedd StepOnePlus™ (Biosystemau Cymhwysol).
Dilyniannu RNA (RNA-seq) a dadansoddi data
1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 yn seiliedig ar FPKM (Darnau Per Kilobase o drawsgrifiadau fesul Miliwn o ddarlleniadau wedi'u mapio). Cafwyd genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol o'r trothwy o 1.5 (seiliedig ar log2-) a 0.01 (gwerth).
Proviolacein a prodeoxyviolacein cynhyrchu a samplu
Ar gyfer cynhyrchu feiolacein a prodeoxyfiolacein, defnyddiwyd y cyfansoddiad canolig canlynol: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}}.2 g/l dyfyniad burum, ac 1{{20}} g/l glwcos. Cafodd cyfrwng diwylliant dros nos ei adnewyddu i OD600 o 0.1 a'i feithrin nes bod OD600 wedi cyrraedd rhwng 0.6 a 0.8. Yna cafodd y cyfryngau diwylliant ei wanhau i OD600 o 0.1 a'i ategu â 500 ng/ml aTc, 0.05 mM IPTG, a 0.1 g/l L-tryptoffan i gyfrol derfynol o 5 ml. Cafodd 300 l o gyfryngau diwylliant eu samplu a'u centrifugio ar 14 000 rpm am 5 munud i gael pelen cell ar gyfer dadansoddiad HPLC, a samplwyd 300 l o gyfryngau diwylliant ar gyfer echdynnu RNA.
Dadansoddiad HPLC
Ar gyfer dadansoddiad llwybr biosynthetig feiolasin, cafodd y belen gell ei haildynnu mewn {{0}} cyfaint methanol, ei sonigeiddio am 5 munud, ei allgyrchu, a'i hidlo trwy 0.22-m hidlydd neilon. Dilynodd dadansoddiad HPLC y dull (42) gyda Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 150 mm, colofn 4 m (Agilent). Defnyddiwyd dau gam symudol, A gyda 0.1% asid ffurfig yn DDW a B gyda 0.1% asid ffurfig mewn acetonitrile, ar gyfradd llif o 0.6 ml/munud gyda'r proffil graddiant canlynol: 95% A am 1.5 munud, rampio A o 95 % i 2% am 4 munud, gan gynnal 2% A am 2 funud, rampio A o 2% i 95% am 30 s, a chynnal 95% A am 10 munud. Canfuwyd samplau gan ddefnyddio synhwyrydd PDA, a phenderfynwyd ardal HPLC ar 600 nm ar gyfer fiolasin a 610 nm ar gyfer prodeoxyviolacein.
Cynhyrchu a samplu lycopen
Ar gyfer cynhyrchu lycopen, defnyddiwyd y cyfansoddiad canolig canlynol: 13.56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml o 1 M MgSO4, 0.1 ml o 1 M CaCl2 a 4 g/l o glwcos (22). Defnyddiwyd 27 g/ml cloramphenicol a 50 g/ml sbectinomycin. Adnewyddwyd cyfrwng diwylliant dros nos i OD600 o 0.1 i gyfrol olaf o 5 ml. Pan gyrhaeddodd yr OD600 rhwng 0.5 a 0.6, ychwanegwyd aTc at y crynodiad terfynol o 500 ng/ml, a phan gyrhaeddodd yr OD600 rhwng 0.9 ac 1, ychwanegwyd IPTG at y crynodiad terfynol o 0.02 mM. Echdynnwyd lycopen gan ddefnyddio aseton, fel y disgrifir yn y cyfeiriad (22). Cafwyd y crynodiad o lycopen o'r amsugnedd ar 475 nm gan ddefnyddio sbectrophotometer Jenway 7300 gan ddefnyddio cromlin safonol. Samplwyd 300 l o gyfryngau diwylliant ar gyfer echdynnu RNA.
manteision cistanche ar gyfer dynion-cryfhau system imiwnedd
CANLYNIADAU A TRAFODAETH
Effeithiau'r treigladau mewn sgRNA ar effeithlonrwydd gormes y system CRISPR
Gall system CRISPRi atal mynegiant genynnau pan fydd y cymhlyg teiran dCas9-sgRNA-DNA yn clymu'n gryf â'i gilydd. Tybiwyd gennym y gellid newid effeithlonrwydd gormes y system CRISPRi i lefel benodol trwy fodiwleiddio ffurfiant cymhleth yr RNP. Er mwyn mesur effeithlonrwydd gormes y system CRISPR, fe wnaethom ddylunio system adrodd fflworoleuedd yn seiliedig ar y gylched enetig lle mae dCas9 o S. pyogenes yn cael ei achosi gan anhydrotetracycline (aTc), ac mae amrywiadau genyn gohebydd (mCherry) a sgRNA yn cael eu mynegi'n gyfansoddiadol (Ffigur 1A). Unwaith y caiff aTc ei ychwanegu at y cyfrwng, mae dCas9-sgRNA- cymhleth teiran DNA yn blocio trawsgrifiad genyn y gohebydd, ac mae lefel fflworoleuedd yn dangos yn wrthdro effeithlonrwydd gormes y system CRISPR. Mae'r sgRNA yn cynnwys cyfanswm o 96 niwcleotidau (nt). Mae'r rhanbarth gwahanu (yr 20 nt cyntaf) yn clymu i'r dilyniant DNA targed, ac mae'r 76 nt arall yn cyfrannu at y ffurfiant cymhleth a'r sefydlogrwydd. Gan y gall camgymhariadau yn y rhanbarth spacer golli penodoldeb a chynyddu effeithiau oddi ar y targed yn y system sy'n seiliedig ar CRISPR (33,43), uchafswm hyd y sgRNA y gellir ei beiriannu yw 76 nts. Yn yr achos hwn, dylid cael llyfrgell maint 476 (tua 1045), ond mae'n rhy fawr i'w hadeiladu. Felly, mae'n ofynnol lleihau maint y llyfrgell trwy bennu safleoedd penodol ar y sgRNA. Yn gyntaf fe wnaethom ymchwilio i sut mae treigladau mewn sgRNA ym mhob rhanbarth yn effeithio ar ormes yn y system CRISPR. Nododd astudiaeth flaenorol fod treigladau yn y bôn-dolen 1 (sg mut01 a sg mut02) wedi arwain at leihad sylweddol yng ngweithgaredd niwcleas Cas9, tra bod treigladau yn y ddolen bonyn 2 (sg mut03) neu'r ddolen bonyn 3 (sg. mut04) heb effeithio ar ei weithgaredd (44). Mae sgRNA hail-greu (sg mut05) sy'n cynnwys treigladau yn y coesyn-dolen 1 rhanbarth ac ailadrodd, tetraloop, gwrth-ailadrodd, a coesyn-dolen 2 rhanbarthau hefyd yn gostwng gweithgaredd niwclease (44). Fodd bynnag, yn y system CRISPRi, ychydig o effaith a gafodd pob un o'r pum amrywiad sgRNA ar effeithlonrwydd gormes o'i gymharu â'r sgRNA math gwyllt (sg WT), gyda phob amrywiad yn arddangos lefel fflworoleuedd 2-4% o'i gymharu â'r rheolaeth gadarnhaol heb ranbarth gwahanu ( sg PC) (Ffigur 1B). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod ffurfio'r cymhleth dCas9-sgRNA yn llai sensitif i addasu dilyniant yn y rhanbarth bôn-dolen 1 yn y system CRISPRi, yn wahanol i'r system CRISPR/Cas9. Fe wnaethom ddamcaniaethu y gall cael gwared ar ranbarthau sy'n gysylltiedig â sefydlogrwydd y cymhleth fod yn fan cychwyn i reoli'r mynegiant ar lefelau lluosog ymhellach. I'r perwyl hwn, fe wnaethom adeiladu sgRNA cwtogi (sg trcSL1) heb y cysylltydd, y ddolen bonyn 2 a'r dolen goesyn 3. Ychydig iawn o gydrannau sydd gan y sgRNA cwtogi hwn a dangoswyd ei fod yn lleihau'n sylweddol actifedd niwcleas yn y CRISPR/ System Cas9 (5,44). Pan gafodd ei brofi yn y system CRISPRi, dangosodd y mutant diffygiol hwn lefel fflworoleuedd o 8% o'i gymharu â sg PC, sy'n awgrymu y gallai ddal i rwymo i dCas9 ac atal y genyn o ddiddordeb ar lefel benodol hyd yn oed gyda sefydlogrwydd teiran cymhleth llai (Ffigur 1B). Mae dadansoddiad adeileddol y cyfadeilad RNP yn awgrymu bod rhanbarthau cysylltydd, dolen bonyn 2, a dolen bonyn 3 o'r sgRNA yn gyfrifol am sefydlogi'r cymhlyg trwy eu rhyngweithiadau â pharth niwcleas dCas9, sy'n arwain at ostyngiad sylweddol mewn indel effeithlonrwydd yn y system CRISPR/Cas9 (44). Mewn cyferbyniad, mae'r ailadrodd: rhanbarth gwrth-ailadrodd a bôn-dolen 1 o'r sgRNA yn rhyngweithio'n bennaf â'r parth cydnabyddiaeth a pharth rhyng-weithredol PAM dCas9 ac nid ydynt yn effeithio'n sylweddol ar effeithlonrwydd indel yn y system CRISPR/Cas9 (44). Mae'r canlyniad hwn yn cefnogi'r sylw bod sg trcSL1 wedi dangos gostyngiad sylweddol mewn gweithgaredd niwcleas yn y system CRISPR/Cas9 tra'n effeithio ychydig yn unig ar yr affinedd rhwymol yn y system CRISPRi.
Ffigur 1. Adeiladu system a'r effaith ar yr effeithlonrwydd gormes trwy dreiglad sgRNA. (A) Dau system plasmid ar gyfer meintioli'r effeithlonrwydd gormes. Mae un plasmid â tharddiad p15A yn cynnwys y genyn dCas9 o dan hyrwyddwr aTc-inducible a'r genyn mCherry o dan hyrwyddwr cyfansoddol. Mae'r plasmid arall â tharddiad cloDF13 yn cynnwys sgRNA math gwyllt neu mutant o dan hyrwyddwr cyfansoddol. (B) Fflworoleuedd cymharol pob sgRNA mutant (sg mut01 ∼ sg mut05 a sg trcSL1) a sg WT o'i gymharu â sg PC. +1 i + 20 yw'r dilyniant spacer sy'n clymu i'r genyn mCherry. sg PC: sgRNA heb spacer fel rheolydd positif, sg WT: sgRNA math gwyllt. Mae bariau gwall yn dynodi gwyriad safonol (n=3). Pennwyd gwerthoedd-P gan brawf-t heb ei baru. ns: ddim yn arwyddocaol, **P< 0.01
Amrywio'r effeithlonrwydd ffurfio cymhleth ar gyfer rheolaeth mynegiant lefel lluosog
Mae Tetraloop yn gysylltydd artiffisial sy'n cysylltu crRNA a tracrRNA yn y system CRISPR-Cas9 (5). Mae strwythur grisial y cymhleth teiran, sy'n cynnwys dCas9, crRNA, a tracrRNA, wedi dangos nad oes gan y tetraloop a'i ranbarthau ystlysol 5 a 3 fawr o gysylltiad â dCas9 (44). Ar yr un pryd, ailadrodd: mae rhanbarthau gwrth-ailadrodd a choesyn-dolen 1 yn hanfodol ar gyfer y cymhleth swyddogaethol (44). Gan nad yw'n rhyngweithio'n uniongyrchol â dCas9, mae'r tetraloop, a'i ranbarthau ymylol wedi'u harchwilio fel safleoedd posibl ar gyfer sgRNA peirianneg gyda chydrannau ychwanegol, megis ymgorffori dilyniannau atamer i recriwtio proteinau ychwanegol i'r sgRNA (45,46). Mae'n gredadwy y gallai treigladau yn y rhanbarth hwn arallgyfeirio'r affinedd rhwymol rhwng sgRNA a dCas9 heb amharu'n llwyr ar y cymhleth. Adeiladwyd 12- mer lyfrgell ar hap (4 nt o ranbarth tetraloop a 4 nt o 5 a 3 rhanbarth ystlysu, yn y drefn honno) gan ddefnyddio sg trcSL1 fel templed i ostwng ymhellach yr effeithlonrwydd ffurfio cymhleth rhwng sgRNA a dCas9 (Ffigur 2A ). Fe wnaethom gymhwyso strategaeth ddidoli dau gam i gael gwahanol fwtaniaid sgRNA sy'n cwmpasu effeithlonrwydd gormes rhwng sg WT (cyflwr llethol llawn) a sg PC (cyflwr nad yw'n ormesol). Fe wnaethom rannu'r llyfrgell wreiddiol yn llyfrgelloedd llai gyda gwahanol ystodau dwysedd fflworoleuedd, ac yna'n unigol nodi fflworoleuedd pob amrywiad sgRNA o'r llyfrgell lai. Roedd dosbarthiad fflworoleuedd y llyfrgell wreiddiol a gafwyd trwy sytometreg llif bron yn union yr un fath â sg PC (Ffigur 2B). Fodd bynnag, ar ôl tri cham didoli yn olynol, roedd gan bob llyfrgell (uchel, canolig ac isel) lefelau fflworoleuedd canolrifol 63%, 24%, a 14% o gymharu â sg PC, yn y drefn honno (Ffigur 2B). Roedd wyth deg dau o gytrefi wedi'u hynysu o'r llyfrgelloedd llai hyn, gyda lefelau fflworoleuedd yn amrywio o 8% i 104% (Ffigur 2C). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall treiglo tetraloop a'i ranbarth ystlysol o'r sgRNA fodiwleiddio'r affinedd rhwymol rhwng dCas9 a sgRNA ar gyfer gwahanol effeithlonrwydd gormes. Dangosodd dadansoddiad meintiol PCR (RT-qPCR) o 10 mutants sgRNA (sg trcSL1c1-sg trcSL1c10, Tabl Atodol S6) gyda gwahanol signalau fflworoleuedd rhwng sg WT a sg PC ymhlith 82 o gytrefi sgRNA fod lefelau fflworoleuedd wedi cynyddu'n llinol gyda thrawsgrifiadau mCherry yn cynyddu. , sy'n nodi bod ein system CRISPRi yn rheoli mynegiant genynnau ar y lefel drawsgrifiadol (Ffigur Atodol S2). Mae ein system CRISPRi tiwnadwy yn defnyddio sgRNAs wedi'u peiriannu, a all gyflawni hyd at 45- reolaeth ormes plyg, gan ganiatáu ar gyfer mireinio'r effeithlonrwydd gormes heb newid y symiau o dCas9 neu sgRNA. Mantais nodedig ein system yw y gall fireinio'r effeithlonrwydd gormes trwy amrywiadau sgRNA penodol heb y potensial ar gyfer canlyniadau anfwriadol, er bod angen clonio ychwanegol. At hynny, mae'r gromlin twf yn awgrymu nad yw ein system yn gosod baich cellog sylweddol (Ffigur Atodol S3). Ymhellach, dangosodd RNA-Seq ar dri amrywiad sg trcSL1 gyda lefelau amrywiol o effeithlonrwydd gormes fod y mynegiant o 51 i 83 o enynnau wedi'i newid, mewn cyferbyniad â'r 262 o enynnau a newidiwyd yn y sg WT (Ffigur Atodol S4). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod yr amrywiadau sg trcSL1 wedi cael hyd yn oed llai o effeithiau oddi ar y targed na'r system CRISPRi gonfensiynol. Mae'n arbennig o berthnasol mewn cymwysiadau peirianneg metabolig, lle mae optimeiddio llwybrau metabolaidd yn aml yn golygu trin genynnau lluosog. Gall y gallu i fireinio mynegiant genynnau heb achosi sgîl-effeithiau negyddol gyflymu'r broses optimeiddio yn sylweddol a gwella effeithlonrwydd a chynhyrchiant cyffredinol y system.
Ffigur 2. Strwythur y llyfrgell sgRNA a sgrinio'r llyfrgell. (A) sgaffald sgRNA a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon. Mae 12-mer sy'n cynnwys tetraloop a'i ddilyniant ystlysu yn cael ei dreiglo ar hap o sg trcSL1 i gael llyfrgell sgRNA. (B) dosbarthiad fflworoleuedd a gafwyd o sytometreg llif cyn (chwith) ac ar ôl (dde) didoli. Mae pob dosbarthiad yn cynnwys 100,000 o gelloedd. (C) Fflworoleuedd cytrefi sengl a gafwyd o (B). Mae bariau gwall yn dynodi gwyriad safonol (n=2).
Effeithiau maint dCas9 a sgRNA ar effeithlonrwydd gormes
Gan y gallai modiwleiddio swm naill ai dCas9 neu sgRNA newid effeithlonrwydd gormes y system CRISPRi (23,24), mae'n hanfodol archwilio effaith maint dCas9 a sgRNA ar effeithlonrwydd gormes. Fe wnaethon ni brofi perfformiad ein system o dan amodau gwahanol trwy newid y symiau o dCas9 a sgRNA gan ddefnyddio deg mutant sgRNA (sg trcSL1c1-sg trcSL1c10). Defnyddiwyd tri chrynodiad gwahanol (20, 100, a 500 ng/ml) o'r inducer ar gyfer mynegiant dCas9. O'i gymharu â lefel mRNA dCas9 pan ddefnyddiwyd 20 ng/ml o anwythydd, fe'i cynyddwyd ymhellach gan 15-plyg (100 ng/ml) a 22-plyg (500 ng/ml) (Ffigur Atodol S5A ). Mae pryderon ynghylch gorfynegi dCas9 gan y gallai lefel uchel o dCas9 fod yn wenwynig i gelloedd (47,48) neu weithiau ddim (49). Fodd bynnag, gostyngwyd y gyfradd twf gan lai na 10% pan ddefnyddiwyd hyd at 500 ng/ml o ATc, yn ôl y cromliniau twf mewn crynodiadau anwythydd amrywiol (Ffigur Atodol S6). Mae hyn yn awgrymu na chafodd swm y dCas9 effaith wenwynig ar E. coli o dan yr amodau a brofwyd. Newidiwyd yr effeithlonrwydd gormes ychydig pan fynegwyd y swm gwahanol o dCas9 (Ffigur 3A). Roedd yn gyson ag astudiaeth flaenorol bod y system CRISPRi wedi cyrraedd yr effeithlonrwydd gormes mwyaf yn [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.
Ffigur 3. Nodweddu a modiwlaredd y system CRISPRi y gellir ei thiwnio. (A) Fflworoleuedd cymharol o dan grynodiadau aTc gwahanol (20, 100, a 500 ng/ml). (B) Fflworoleuedd cymharol o dan hyrwyddwyr gwahanol (J23100 a UPJ23119). (C) Fflworoleuedd cymharol o dan wahanol brotospacers. Mae'r echelin-x yn dynodi fflworoleuedd cymharol mCherry, ac mae'r echelin-y yn dynodi fflworoleuedd cymharol lacI33-mCherry (coch) ac araC33-mCherry (glas). Ychwanegwyd 33 bp o ddilyniannau ychwanegol o lacI ac araC at 5-ddiwedd mCherry (56). (D) Egni rhydd o 12-mer a'r fflworoleuedd cymharol. Mae llinellau toredig yn dynodi cyfwng rhagfynegi o 95% ac mae llinellau solet yn dynodi llinell atchweliad. Ni ellid cael gwerth dG sg trcSL1c2 gan ddefnyddio mFold ac felly ei eithrio o'r dadansoddiad. (A–D) Mae pob bar gwall yn dynodi gwyriad safonol (n=3).
Modiwlaidd y system CRISPRi y gellir ei thiwnio
Mae gan ein dull o ddefnyddio amrywiadau sgRNA penodol i gynnal lefel mynegiant penodol ar gyfer DNA targed y potensial i gael ei ddefnyddio fel system fodiwlaidd. Er mwyn dangos ymarferoldeb y system crispri tunadwy ar gyfer targedu gwahanol brotospacers, gwnaethom adeiladu dau enyn ymasiad (laci {{{{0}} mCherry ac arac 33- mCherry) trwy ychwanegu 33 bps o ddilyniannau o Laci ac aech i 5 -ddiwedd mCherry (56). Mae genom E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) yn cynnwys dau gopi o'r dilyniant protospacer ar gyfer lacI33- mCherry ac un copi ar gyfer araC{33-mCherry. Fodd bynnag, nid oes gan y dilyniannau cromosomaidd hyn ddilyniannau PAM ac, felly, ni ellir eu targedu gan y cymhlyg sgRNA dCas (43). Pan ddyluniwyd y siRNAs i dargedu pob protospacer, roedd yr effeithlonrwydd gormes yn cael ei gynnal yn gyson ar gyfer pob protospacer o lacI33, araC33, a mCherry (Ffigur 3C). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gall ein system CRISPRi tiwnadwy reoleiddio mynegiant genynnau yn effeithiol ar lefel benodol waeth beth fo'r dilyniant protospacer. Un esboniad posibl am y berthynas a arsylwyd rhwng ffurfiad cymhleth RNP ac effeithlonrwydd gormes yw'r newid mewn ynni rhydd pan fydd y cymhleth yn cael ei ffurfio. Mae'r cysylltydd tetraloop artiffisial a'i ranbarth ystlysu yn cynnwys dau bâr sylfaen A: U a G: C Watson-Crick a phâr sylfaen A: G nad yw'n Watson-Crick (44). Gan fod rhwymo crRNA a tracrRNA yn hanfodol ar gyfer y ffurfiant cymhleth, byddai treigladau sy'n targedu tetraloop yn effeithio ar yr affinedd rhwymol rhwng dCas9 a sgRNA. Gellir cyfrifo'r affinedd hwn o'r gwahaniaeth egni rhydd rhwng y cyflyrau ffiniol a'r cyflwr diderfyn. Fodd bynnag, mae cyfrifiadura egni rhydd gwladwriaethau ffiniol yn heriol (57). Roeddem yn tybio nad yw strwythur cyffredinol a sefydlogrwydd y wladwriaeth ffiniol yn newid gan nad oedd sgRNAs a ddidolwyd o'r llyfrgell yn tarfu'n llwyr ar ei swyddogaeth. At hynny, ychydig iawn o gysylltiad sydd gan y tetraloop a'i ranbarth ystlysol â dCas9 (44). Felly, byddai sefydlogrwydd strwythur eilaidd y tetraloop a'i ddilyniant ymylol yn effeithio'n bennaf ar yr affinedd rhwymol rhwng dCas9 a sgRNA. Yn seiliedig ar y syniad hwn, fe wnaethom gyfrifo egni rhydd y tetraloop a'i ddilyniannau ystlysu gan ddefnyddio llwydni (58). Diffinnir y gwahaniaeth mewn egni rhydd o blygu oherwydd y treigladau fel y gwahaniaeth rhwng egni rhydd y dilyniannau treigledig a gwyllt. Gellid ei gyfrifo'n uniongyrchol o egni rhydd plygu mutants gan fod egni plygu'r dilyniant gwyllt yn gyson ar -4.3 kcal/mol. Wrth i egni rhydd plygu gynyddu, cynyddodd y signal fflworoleuedd (Ffigur 3D). Roedd effeithlonrwydd ataliad ar ei uchaf pan oedd egni plygu'r rhanbarth sy'n cynnwys tetraloop yn agos at neu'n is na 0 kcal/mol ac yn gostwng yn llinol wrth i'r egni plygu fod yn fwy na 0 kcal/mol. Mae'r arsylwad hwn yn awgrymu bod effeithlonrwydd ffurfiant cymhleth rhwng dCas9 a sgRNA yn cael ei bennu gan strwythur eilaidd y rhanbarth tetraloop, sy'n helpu i egluro modiwlaredd ein system. Mesurwyd effeithlonrwydd gormes sgRNA 85 ychwanegol gyda 12-mer ddilyniannau gwahanol o'r llyfrgell i ddilysu'r berthynas hon ymhellach. Dangosodd hefyd y gydberthynas a welwyd o amrywiadau sg trcSL1 (Ffigur 3D a Thabl Atodol S7), sy'n awgrymu bod y cysylltydd tetraloop yn chwarae rhan hanfodol wrth ffurfio'r cyfadeilad RNP ac y gall treigladau yn y rhanbarth hwn effeithio ar effeithlonrwydd y system CRISPR. Yn ogystal, mae'r berthynas hon yn dangos y posibilrwydd o ddylunio amrywiadau sgRNA ar gyfrifiadur gydag effeithlonrwydd gormes a ddymunir.
Cymhwyso system CRISPRi tiwnadwy ar gyfer ailddosbarthu fflwcs yn llwybr biosynthetig ffidil yn E. coli
Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-plyg) o'i gymharu â genynnau eraill o'u cyfrifo o'r cromliniau safonol. Mewn cyferbyniad, roedd mynegiant ensymau eraill heb eu rheoleiddio yn y llwybr ffidil (vioA, vioB, a vioE) wedi newid. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall ein system dargedu a modiwleiddio mynegiant genynnau unigol yn benodol heb effeithio ar enynnau eraill yn y llwybr. Nid oedd yn bosibl meintioli PV a PDV yn uniongyrchol oherwydd diffyg safonau ar gael yn fasnachol ar gyfer dadansoddi HPLC. Felly fe wnaethom fesur y titers mewn unedau mympwyol gan ddefnyddio ardal brig HPLC. Cyrhaeddodd titer y cynnyrch uchafswm ar 8 h ar ôl ymsefydlu ac yna gostwng yn raddol (Ffigur Atodol S8), o bosibl oherwydd trosi'r cynnyrch i gynhyrchion ochr eraill, megis cromoviridans, trwy fecanwaith anhysbys (42,64). Roedd y mân uchafbwyntiau a arsylwyd ar y sbectrwm HPLC yn dangos presenoldeb mân gynhyrchion ochr ychwanegol. Mae ymchwil flaenorol wedi dangos y gellid rhagweld logarithm titer pob cynnyrch mewn unedau mympwyol trwy gyfuniadau llinol o gryfder hyrwyddwr pob genyn sy'n rhan o'r llwybr biosynthetig fiolasin (42). Roedd y model atchweliad llinol log hwn hefyd yn ddilys yn ein system, ac roedd mwy o drawsgrifiadau vioD yn gysylltiedig â chynhyrchu mwy o PV (Ffigur 4B). Mae'n hysbys bod peiriannu hyrwyddwr neu 5 -UTR pob genyn a oedd yn rhan o'r llwybr biosynthetig ffidil yn galluogi ailddosbarthu fflwcs ac optimeiddio llwybr (65,66). Gallai ein system weithio fel dull amgen sy'n dangos y rheolaeth trawsgrifio heb drin hyrwyddwyr sy'n ymwneud â'r llwybr gan ddefnyddio sgRNAs synthetig, sy'n fyr ac y gellir eu cydosod â dulliau un cam. Mae sgrinio drwy'r system CRISPRi diwnadwy yn ei gwneud hi'n bosibl ailgyfeirio'r llwybr gyda fflwcs rhagweladwy cyn trin straeniau gwesteiwr neu gasetiau genynnau yn uniongyrchol, gan gyflymu'r broses o bosibl.
Cymhwyso'r system CRISPRi tiwnadwy ar gyfer cydbwyso fflwcs carbon mewn E. coli sy'n cynhyrchu lycopen
Mae cynhyrchu cyfansoddion gwerthfawr yn effeithlon mewn peirianneg metabolig yn gofyn am gydbwyso'r fflwcs carbon. Mae'r llwybr methylerythritol 4-ffosffad (MEP) yn llwybr metabolig sy'n defnyddio rhagflaenwyr syml fel pyruvate a glyseraldehyde 3-ffosffad (GAP) i gynhyrchu blociau adeiladu isoprenoid, pyroffosffad dimethylallyl a pyroffosffad isopentenyl (67,68) . Mae'r moleciwlau hyn yn syntheseiddio geranyl pyrophosphate, sy'n cael ei drawsnewid i farnesyl pyrophosphate (FPP) (67,68). Mae lycopene, carotenoid gwerthfawr iawn sydd â phriodweddau gwrthocsidiol cryf a chymwysiadau amrywiol mewn amrywiol ddiwydiannau (69), yn cael ei syntheseiddio o FPP trwy gyfres o adweithiau ensymatig o crtE, crtB, a crtI (Ffigur 4C) (22,70). Mae rhagflaenydd GAP yn hanfodol nid yn unig ar gyfer y llwybr MEP ond hefyd ar gyfer y llwybr glycolysis (22). Dangoswyd bod mynegiant llai o'r genyn gapA, sy'n amgodio'r glyseraldehyde-3-ffosffad dehydrogenase (GAPDH) yn y llwybr glycolysis, yn gwella cynhyrchiad lycopen trwy gynyddu'r pwll GAP (22). Felly, fe wnaethom dargedu gapA gyda phum amrywiad, gan gynnwys tri amrywiad sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, a sg trcSL1c6) a ddangosodd effeithlonrwydd gormes amrywiol, sg PC, a sg WT. Fodd bynnag, mae gapA yn enyn hanfodol na ellir ei fwrw i lawr yn llwyr (71,72). Roedd ymdrechion i atal gapA gyda CRISPRi confensiynol gan ddefnyddio sg WT yn aflwyddiannus hyd yn oed gyda'r gollyngiad isel o dcas9 dan hyrwyddwr tet (73). Ar y llaw arall, cyflawnwyd gormesiad aml-lefel o fynegiant genyn gapA gan ddefnyddio'r system CRISPRi tiwnadwy heb ddiffyg twf ac arweiniodd at gynnydd 2.7-plyg gyda sg trcSL1c6 mewn cynhyrchu lycopen o'i gymharu â straen sy'n mynegi genyn gapA yn llawn ar ôl 15 h o amaethu (Ffigur 4D a Ffigur Atodol S9). Adroddwyd mai dim ond 10% o fynegiant naturiol y genyn gapA sy'n arwain at gronfa gynyddol o GAP heb newid sylweddol mewn metabolion i lawr yr afon yn y llwybr glycolysis, megis 2-phosphoglycerate a 3-phosphoglycerate ( 22). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall CRISPRi tiwnadwy atal mynegiant genynnau yn union ar lefelau lluosog heb beirianneg cromosomau.
Ffigur 4. Cymhwyso system CRISPRi tiwnadwy ar gyfer llwybr biosynthetig feiolacein. (A) Llwybr biosynthetig fiolasin a'r adeiladwaith plasmid. Cafodd pum genyn (vioA, vioB, vioC, vioD, a vioE) sy'n gyfrifol am gynhyrchu feiolacein eu clonio i mewn i dCas9-yn mynegi plasmid. Cynhyrchir pedwar prif gynnyrch (fideolacein, proviolacein, deoxyviolacein, a prodeoxyviolacein). sg WT ar gyfer vioC a phum sg trcSL1 amrywiad (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 a sg trcSL1c9) ar gyfer vioD, yn dangos gwahanol effeithlonrwydd gormes, eu clonio i mewn i'r plasmid arall. Trp: L-tryptoffan, V: fiolacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoxyviolacein, DV: deoxyviolacein, PDVA: asid protodeoxyviolaceinic, PVA: asid protoviolaceinic. (B) Perthynas rhwng trawsgrifiadau vioD, fflworoleuedd mCherry, a titer PDV a PV. Mae'r echelin-x yn nodi'r RNA vioD cymharol a gafwyd o RT-qPCR, mae'r echelin-y ar y chwith yn nodi'r fflworoleuedd mCherry cymharol o Ffigur 3, ac mae'r echelin-y ar y dde yn nodi cymhareb yr ardal HPLC. Gosodwyd samplau gyda'r gwerth RNA vioD uchaf i 100% ar gyfer normaleiddio. (C) Llwybr biosynthetig lycopen a'r adeiladwaith plasmid. Cafodd tri genyn (crtE, crtB, crtI) sy'n gyfrifol am gynhyrchu lycopen eu clonio i mewn i dCas sy'n mynegi plasmid. targedwyd gapA gydag amrywiadau sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) a sg cafodd PC ei glonio i mewn i'r plasmid arall. Glc: Glwcos, GAP: glyseraldehyde 3-ffosffad, 1,3-BPG: 1,3-bisphosphoglycerate, DMAPP: pyrophosphate dimethylallyl, IPP: isopentenyl pyrophosphate, FPP: farnesyl pyrophosphate. (D) Perthynas rhwng trawsgrifiadau gapA, fflworoleuedd mCherry, a chynhyrchu lycopen. Mae'r echelin-x yn nodi'r bwlch cymharol RNA a gafwyd o RT-qPCR, mae'r echelin-y ar y chwith yn nodi'r fflworoleuedd mCherry cymharol o Ffigur 3, ac mae'r echelin-y ar y dde yn nodi'r titer o lycopen. (B, D) Mae pob bar gwall yn dynodi gwyriad safonol (n=3).
CASGLIAD
Fe wnaethom ddylunio system CRISPRi y gellir ei thiwnio a allai reoli mynegiant genynnau yn union ar y lefel a ddymunir. Trwy dreiglo'r tetraloop a'i ranbarth ystlysol, gallai sgRNAs synthetig sy'n targedu dilyniannau protospacer amrywiol reoli'r genyn ar lefel benodol. Fe wnaethom gymhwyso'r system hon yn llwyddiannus i ailgyfeirio'r fflwcs metabolig o ddiddordeb yn y llwybr biosynthetig fiolacein i gynhyrchu deilliadau indole mewn cymhareb ragweladwy. Yn ogystal, rydym wedi dangos bod y defnydd o CRISPRi tiwnadwy wedi arwain at gynnydd 2.7-waith mewn cynhyrchiant lycopen, gan amlygu amlbwrpasedd ein system ar gyfer gwella cynhyrchiant cyfansoddion gwerthfawr eraill. Byddai'r system hon yn cyflymu'r prosesau optimeiddio fflwcs cyn trin gwybodaeth enetig gwesteiwr yn barhaol, megis disodli'r hyrwyddwr neu'r dilyniannau UTR 5-.
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
CYFEIRIADAU
1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. a Siksnys, V. (2011) Mae system Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas yn darparu imiwnedd yn Escherichia coli. Asidau Niwcleig Res., 39, 9275–9282.
2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. a Siksnys, V. (2012) Cas9-crRNA cymhleth ribonucleoprotein cyfryngu holltiad DNA penodol ar gyfer imiwnedd addasol mewn bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. UDA, 109, E2579–E2586.
3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA et al . (2013) Peirianneg genom amlblecs gan ddefnyddio systemau CRISPR/Cas. Gwyddoniaeth , 339, 819–823.
4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA a Zhang,F. (2013) Peirianneg genom gan ddefnyddio system CRISPR-Cas9. Nat. Protoc., 8 , 2281–2308.
5. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA a Charpentier,E. (2012) Endonuclease DNA deuol-arweiniedig rhaglenadwy mewn imiwnedd bacteriol addasol. Gwyddoniaeth , 337, 816–821.
6. Anders,C., Niewoehner,O., Duerst,A. a Jinek, M. (2014) Sail strwythurol cydnabyddiaeth DNA targed PAM-ddibynnol gan yr endonuclease Cas9. Natur, 513, 569–573.
7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP a Lim,WA (2013) Ailbwrpasu CRISPR fel llwyfan dan arweiniad RNA ar gyfer rheolaeth dilyniant-benodol ar fynegiant genynnau. Cell, 152, 1173–1183.
8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weissman,JS a Qi,LS (2013) Ymyrraeth CRISPR (CRISPRi) ar gyfer rheolaeth dilyniant-benodol o fynegiant genynnau. Nat. Protoc., 8 , 2180–2196.
9. McGlincy,NJ, Meacham,ZA, Reynaud,KK, Muller,R., Baum,R. ac Ingolia, NT (2021) Mae llyfrgell canllaw ymyrraeth CRISPR ar raddfa genom yn galluogi proffilio ffenoteipaidd cynhwysfawr mewn burum. Genomeg BMC, 22, 205.
10. Io,J. a Woo, HM (2018) CRISPR peirianneg metabolig wedi'i chyfryngu gan ymyrraeth o Corynebacterium glutamicum ar gyfer cynhyrchu homo-butyrate. Biotechnol. Bioeng., 115, 2067–2074.
11. Cleto,S., Jensen, JV, Wendisch, VF a Lu,TK (2016) Corynebacterium glutamicum peirianneg metabolig gydag ymyrraeth CRISPR (CRISPRi). Synth ACS. Biol., 5, 375–385.
12. Zhang, GQ, Ren, XN, Liang, XH, Wang, YQ, Feng, DX, Zhang, YJ, Xian, M. a Zou,HB (2021) Gwella cynhyrchiant microbaidd asidau amino: o ddulliau confensiynol i dueddiadau diweddar. Biotechnol. Bioproc. E, 26, 708–727.
13. Kim,SK, Seong, W., Han,GH, Lee,DH a Lee,SG (2017) Ataliad amlblecs dan arweiniad ymyrraeth CRISPR o enynnau llwybr cystadleuol mewndarddol ar gyfer ailgyfeirio fflwcs metabolig yn Escherichia coli. Microb. Ffaith Cell., 16, 188 .
14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. a Machner,MP (2021) Offeryn ymyrraeth amlblecs CRISPR ar gyfer holi genynnau ffyrnigrwydd mewn pneumophila Legionella. Cymmun. Biol., 4, 157 .
15. Siu, KH a Chen,W. (2019) GRNA â gatiau traed blaen riborregulated ar gyfer swyddogaeth rhaglenadwy CRISPR-Cas9. Nat. Cemeg. Biol., 15, 217–220.
16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR a Salis, HM (2019) Atal genynnau bacteriol lluosog ar yr un pryd gan ddefnyddio araeau sgRNA all-hir nad ydynt yn ailadrodd. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.
17. Tian, T., Kang, JW, Kang, A. a Lee,TS (2019) Ailgyfeirio fflwcs metabolig trwy amlblecs cyfunol gormesiad cyfryngol CRISPRi ar gyfer cynhyrchu isopentenol yn Escherichia coli. Synth ACS. Biol., 8, 391–402.
18. Gauttam, R., Seibold, GM, Mueller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrick, R. ac Eikmanns,BJ (2019) System ymyrraeth CRISPR deublyg syml ar gyfer targedu genynnau lluosog yn Corynebacterium glutamicum. Plasmid , 103, 25–35.
19. Yao,L., Cengic,I., Anfelt,J. a Hudson, EP (2016) gormes genynnau lluosog mewn cyanobacteria gan ddefnyddio CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.
20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Parc,S. a Jung,GY (2016) Ail-gydbwyso'r 3-llwybr cynhyrchu asid hydroxypropionig o glyserol yn Escherichia coli yn y ffordd orau bosibl. Synth ACS. Biol., 5, 1247–1255.
21. Yang, Y., Lin, Y., Li, L., Linhardt, RJ ac Yan,Y. (2015) Rheoleiddio metaboledd malonyl-CoA trwy RNAs antisense synthetig ar gyfer biosynthesis gwell o gynhyrchion naturiol. Metab. Eng., 29, 217–226.
22. Jung,J., Lim, JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK a Jung,GY (2016) Ail-gydbwyso rhagflaenydd manwl gywir ar gyfer cynhyrchu isoprenoidau trwy reoli'n fanwl gapA mynegiant yn Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.
23. Li, XT, Meh, Y., Erickstad, MJ, Brown, SD, Parciau, A., Court, DL a Meh,S. (2016) tCRISPRi: rheolaeth un cam tunadwy a gwrthdroadwy ar fynegiant genynnau. Sci. Cyf., 6, 39076.
24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG a Carothers,JM (2018) Mynegiant rheoledig o alawon sgRNAs CRISPRi yn E. coli. Biotechnol. J., 13, e1800069.
25. Kim, NM, Sinnott, RW a Sandoval, NR (2020) Biosynhwyryddion trawsgrifio seiliedig ar ffactor a systemau anwythol mewn bacteria nad ydynt yn fodel: cynnydd cyfredol a chyfeiriadau'r dyfodol. Curr. Barn. Biotechnol., 64 , 39–46.
26. Kundert, K., Lucas, JE, Watters, KE, Fellmann, C., Ng, AH, Heineike, BM, Fitzsimmons, CM, Oakes, BL, Qu,J., Prasad,N. et al. (2019) Rheoli CRISPR-Cas9 gyda sgRNAs wedi'u hysgogi gan ligand ac wedi'u dadactifadu gan ligand. Nat. Cymmun., 10, 2127.
27. Ferreira, R., Skrekas, C., Hedin, A., Sanchez, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. a David, F. (2019) Tiwnio metaboledd carbon canolog mewn burum gyda chymorth model trwy reoleiddio ar sail dCas. Synth ACS. Biol., 8, 2457–2463.
28. Su, T., Guo, C., Zheng, Y., Liang, Q., Wang, Q. a Qi, Q. (2019) Tiwnio hemB gan ddefnyddio CRISPRi ar gyfer cynyddu 5-cynhyrchiant asid aminoevulinig yn Escherichia coli. Blaen. Microbiol., 10, 1731.
29. Zheng, T., Hou, Y., Zhang, P., Zhang, Z., Xu, Y., Zhang, L., Niu, L., Yang, Y., Liang, D., Yi,F . et al. (2017) Mae proffilio penodoldeb RNA un canllaw yn datgelu dilyniant craidd sensitif diffyg cyfatebiaeth. Sci. Cyf., 7, 40638.
30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. a Marraffini, LA (2013) golygu genomau bacteriol dan arweiniad RNA gan ddefnyddio systemau CRISPR-Cas. Nat. Biotechnol.,
31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor,H. a Gross,CA (2021) Piblinell gyfrifiadol ar gyfer dylunio RNAs canllaw ar gyfer diffyg cyfatebiaeth-CRISPRi. Protoc STAR, 2, 100521.
32. Hawkins, JS, Silvis, MR, Koo, BM, Peters, JM, Osadnik, H., Jost, M., Hearne, CC, Weissman, JS, Todor,H. a Gross,CA (2020) Mae Mismatch-CRISPRi yn datgelu’r perthnasoedd cyd-amrywiol mynegiant-ffitrwydd genynnau hanfodol yn Escherichia coli a Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.
33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR a Martin,SE (2019) Gall targedu genynnau lluosog a goddefgarwch diffyg cyfatebiaeth ddrysu dadansoddiad o genom- sgriniau CRISPR cyfun eang. Genom Biol., 20, 21 .
34. Rozen,S. a Skaletsky, H. (2000) Primer3 ar y WWW ar gyfer defnyddwyr cyffredinol ac ar gyfer rhaglenwyr biolegwyr. Dulliau Mol. Biol., 132, 365–386.
35. Zhou, K., Zhou, L., Lim, C., Zou, R., Stephanopoulos, G. a Rhy,HP (2011) Genynnau cyfeirio newydd ar gyfer meintioli ymatebion trawsgrifio Escherichia coli i orfynegiant protein gan PCR meintiol. BMC Mol. Biol., 12, 18 .
36. Livak, KJ a Schmittgen,TD (2001) Dadansoddiad o ddata mynegiant genynnau cymharol gan ddefnyddio PCR meintiol amser real a'r Dull 2 (-Delta Delta C(T)). Dulliau , 25 , 402–408.
37. Andrews,S. (2010) FastQC: Offeryn Rheoli Ansawdd ar gyfer Data Dilyniant Trwybwn Uchel. v0.11.9 gol.
38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. a Salzberg, SL (2009) Aliniad tra chyflym a chof-effeithiol o ddilyniannau DNA byr i'r genom dynol. Genom Biol., 10, R25.
39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM et al. (2021) Deuddeng mlynedd o SAMtools a BCFtools. Gigascience, 10, giab008.
40. Trapnell, C., Williams, BA, Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., van Baren, MJ, Salzberg, SL, Wold, BJ a Pachter,L. (2010) cydosod trawsgrifiad a meintioli gan RNA-Seq yn datgelu trawsgrifiadau heb eu hanodi a newid isoform yn ystod gwahaniaethu celloedd. Nat. Biotechnol., 28 , 511–515.
41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL a Pachter,L. (2013) Dadansoddiad gwahaniaethol o reoleiddio genynnau ar gydraniad trawsgrifiad gyda RNA-seq. Nat. Biotechnol., 31 , 46–53.
42. Lee,ME, Aswani,A., Han,AS, Tomlin,CJ a Dueber,JE (2013) Optimeiddio lefel mynegiant o lwybr aml-ensym yn absenoldeb assay trwybwn uchel. Asidau Niwcleig Res., 41, 10668–10678.
43. Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, Ran, FA, Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Gain, EJ, Wu, X., Shalem, O. et al. (2013) DNA yn targedu penodolrwydd niwcleasau Cas9 dan arweiniad RNA. Nat. Biotechnol., 31 , 827–832.
44. Nishimasu, H., Ran, F., Hsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F. a Nureki, O. (2014) Strwythur grisial o Cas9 yn gymhleth gyda Guide RNA a DNA targed. Cell, 156, 935–949.
45. Mae sgaffaldiau Fu, Y., Rocha, PP, Luo, VM, Raviram, R., Deng, Y., Mazzoni, EO a Skok, JA (2016) CRISPR-dCas9 a sgRNA yn galluogi delweddu byw lliw deuol o ddilyniannau lloeren a loci unigol wedi'i gyfoethogi dro ar ôl tro. Nat. Cymmun., rhif 7, 11707.
46. Khosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta,H. a Houben, A. (2020) Mae Cymhwyso Aptamers yn Gwella Delweddu Byw yn Seiliedig ar CRISPR o Telomeres Planhigion. Blaen. Plant Sci., 11, 1254.
47. Nielsen, AA a Voigt,CA (2014) Cylchedau genetig aml-fewnbwn CRISPR/Cas sy'n rhyngwynebu â rhwydweithiau rheoleiddiol. Mol. Syst. Biol., 10, 763.
48. Lee,YJ, Hoynes-O'Connor,A., Leong,MC a Moon,TS (2016) Rheolaeth raglenadwy o fynegiant genynnau bacteriol gyda'r 44, 2462-2473.
49. Vigouroux, A., Olddewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. a van Teeffelen, S. (2018) Mae tiwnio gallu dCas9 i rwystro trawsgrifio yn galluogi dymchweliad cadarn, di-swn o enynnau bacteriol. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.
50. Zhang, Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang, Y. a Wen, T. (2012) Datblygu a chymhwyso system mynegiant arabinose-inducible trwy hwyluso'r nifer sy'n derbyn inducer yn Corynebacterium glutamicum. Appl. Amgylch. Microbiol., 78, 5831–5838.
51. Thompson, MG, Sedaghtian, N., Barajas, JF, Wehrs, M., Bailey, CB, Kaplan, N., Hillson, NJ, Mukhopadhyay,A. a Keasling,JD (2018) Ynysu a nodweddu treigladau newydd yn y tarddiad pSC101 sy'n cynyddu nifer y copïau. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens, J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. a Phôl, T. (2020) Mynegiant tiwnadwy L-arabinose-anwythadwy plasmid ar gyfer y bacteriwm asid asetig Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267–9282.
53. Nguyen, TT, Nguyen, NH, Kim, Y., Kim, JR a Park,S. (2021) Nodweddiad in vivo o'r system hyrwyddwr anwythol o 3-hydroxypropionic dehydrogenase mewn denitrificans Pseudomonas. Biotechnol Bioproc E , 26, 612–620.
54. McCarty,NS, Graham,AE, Studena,L. a Ledesma-Amaro, R. (2020) Technolegau CRISPR lluosog ar gyfer golygu genynnau a rheoleiddio trawsgrifiadol. Nat. Cymmun., rhif 11, 1281.
55. Ian, Q. a Fong,SS (2017) Astudiaeth o effeithiau rhwymo trawsgrifiadol in vitro a sŵn gan ddefnyddio hyrwyddwyr cyfansoddol ynghyd â dilyniannau elfen UP yn Escherichia coli. J. Biol. Eng., 11, 33.
56. Yma, SW, Yang, JS, Kim, I., Yang, J., Min, BE, Kim,S. a Jung,GY (2013) Dyluniad rhagfynegol o ranbarth cychwyn cyfieithu mRNA i reoli effeithlonrwydd cyfieithu procaryotig. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel, K., Jarmoskaite, I., Vaidyanathan, PP, Greenleaf, WJ, Herschlag,D. a Das,R. (2019) Profion dall o ragfynegiad affinedd rhwymol RNA-protein. Proc. Natl. Acad. Sci. UDA, 116, 8336–8341.
58. Zuker,M. (2003) Mfold gweinydd gwe ar gyfer asid niwclëig plygu a rhagfynegi hybridization. Asidau Niwcleig Res., 31, 3406–3415.
59. Xiong, B., Zhu, Y., Tian, D., Jiang, S., Fan, X., Ma, Q., Wu, H. a Xie,X. (2021) Ailddosbarthu fflwcs o fetaboledd carbon canolog ar gyfer cynhyrchu l-tryptoffan yn Escherichia coli yn effeithlon. Biotechnol. Bioeng., 118, 1393–1404.
60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. a Hu, H. (2019) (13)C peirianneg metabolig Escherichia coli wedi'i harwain gan ddadansoddiad fflwcs metabolig ar gyfer cynhyrchu asetol gwell o glyserol. Biotechnol. Biodanwydd, 12, 29 .
61. Duran, G. a Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: adolygiad o safbwyntiau ffarmacolegol a diwydiannol. Crit. Parch Microbiol., 27, 201–222.
62. Balibar, CJ a Walsh, CT (2006) Biosynthesis in vitro o feiolacein o L-tryptoffan gan yr ensymau VioA-E o Chromobacterium violaceum. Biocemeg , 45, 15444–15457.
63. Gwon,DA, Seok, JY, Jung, GY a Lee,JW (2021) Esblygiad labordy addasol gyda chymorth biosynhwyrydd ar gyfer cynhyrchu ffidil. Int. J. Mol. Sci., 22, 6594.
64. Sanchez, C., Brana,AF, Mendez,C. a Salas, JA (2006) Ailwerthusiad o'r llwybr biosynthetig feiolacein a'i berthynas â biosynthesis indolocarbazole. Cemeg. Bio. Cemeg., 7, 1231–1240.
65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress,B., Linhardt, RJ a Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a dull cyfunol ar gyfer cydbwyso trawsgrifiadol o lwybrau metabolaidd. Sci. Cyf., 5, 11301.
66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. a Wang, Y. (2021) Peirianneg RBS Uniongyrchol o'r clwstwr genynnau biosynthetig ar gyfer cynhyrchiant effeithlon ffidil mewn E. coli. Microb. Ffaith Cell., 20, 38 .
67. Hunter, WN (2007) Llwybr di-fevalonate biosynthesis rhagflaenydd isoprenoid. J. Biol. Cemeg., 282, 21573–21577.
68. Rohmer,M. (1999) Darganfod llwybr mevalonate-annibynnol ar gyfer biosynthesis isoprenoid mewn bacteria, algâu a phlanhigion uwch. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.
69. Muller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. a Bohm, V. (2016) Lycopen a'i rôl gwrthocsidiol wrth atal clefydau cardiofasgwlaidd - adolygiad beirniadol. Crit. Gwydd Bwyd y Parch. Nutr., 56, 1868–1879.
70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, PD a Misawa,N. (1998) Cynhyrchu'r carotenoidau lycopen, beta-caroten, ac astaxanthin yn y burum bwyd Candida utilis. Appl. Amgylch. Microbiol., 64, 1226–1229.
71. Goodall, ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund, PA, Cole, JA a Henderson, IR (2018) Genom hanfodol Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.
72. Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL a Mori, H. (2006) Adeiladu Escherichia coli K-12 mutants knockout un-genyn mewn ffrâm: casgliad Keio. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.
73. Bertram,R. a Hillen, W. (2008) Cymhwyso gwrthwasgydd Tet mewn rheoleiddio a mynegiant genynnau procaryotig. Microb. Biotechnol., 1 , 2–16.
