Metabolitau Eilaidd Cyanobacteria fel Cynhwysion Biotechnolegol mewn Cosmetigau Gwrth-Heneiddio Naturiol 2
Aug 24, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
2.3.Gweithgareddau Biolegol
2.3.1.Gweithgarwch Sborion Radical
Mae'r radical anion superoxide yn radical rhydd ffisiolegol gyda phwysigrwydd eithafol i'r corff dynol. Pan fo'r ROS hwn yn cael ei orgynhyrchu yn ystod resbiradaeth aerobig, neu pan fydd y mecanweithiau dadwenwyno mewndarddol yn methu neu'n annigonol, mae risg uwch o ddifrod ocsideiddiol gydag effeithiau niweidiol difrifol. Yn yr ystyr hwn, mae dod o hyd i fecanweithiau i atal effeithiau niweidiol Oz* yn allweddol bwysig, nid yn unig ym maes colur ond hefyd wrth ystyried lliniaru ac atal amrywiaeth eang o afiechydon. Mae ymddygiad sborion O2" o echdynion cyanobacteria i'w weld yn Ffigur 1, ac mae'r gwerthoedd IC wedi'u crynhoi yn Nhabl 6.
Roedd yr echdynion dyfrllyd yn sylweddol fwy effeithiol mewn sborion Oz*- na'r echdynion aseton (Tabl 6) ac yn cyflwyno gweithgaredd dos-ddibynnol (Ffigur 1), gyda'r straenau dŵr croyw yn sefyll allan o'r straen morol. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 oedd y straen mwyaf effeithiol, gan gyflwyno'r gwerth ICso isaf (65.5 ug dyfyniad sych / ml, t.<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">
Mae cymhariaeth o'r galluoedd gwrthocsidiol ymhlith gwahanol syanobacteria yn heriol oherwydd y gwahanol ddulliau a ddefnyddir. Gwerthusodd Morone a'i gydweithwyr allu chwilota radical darnau ethanol (70 y cant v/v) o wahanol fathau o cyanobacteria [26], a'r gwerth ICso isaf oedd 822.70 ug/mL ar gyfer Phormidium sp.LEGE 02 05292, tra na canfuwyd gweithgaredd ar gyfer Nodosilinea nodulosa LEGE 06102. Adroddodd lopes a chyd-weithwyr am weithgaredd chwilota O2 ar gyfer Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarctica LEGE13457 a Cuspidothrix issatschenkoi dyfyniadau aseton LEGE 03282, gyda gwerthoedd IC25 o 28, 28 a 31 , a 28-forfor-forum fel sp.LEGE 13412 [27]. Nododd yr awduron hefyd effeithiolrwydd uwch yn y darnau aseton o'u cymharu â darnau ethanol. Datgelodd astudiaeth arall a gynhaliwyd gan Amaro a chydweithwyr werthoedd IC50 o 1394 a 826 ug/mL ar gyfer Gloeothece sp. a Scenedesmus obliquus (M2-1), yn y drefn honno [37]. Mae'r canlyniadau a geir yma ar gyfer darnau aseton yn ymddangos yn llai addawol na'r rhai a adroddwyd yn flaenorol, er eu bod o fewn yr un drefn maint. Ar y llaw arall, datgelodd y darnau dyfrllyd botensial enfawr a oedd yn werth ei ddefnyddio ymhellach o ran cymwysiadau cosmetig ym maes heneiddio croen.
2.3.2.Ensymau Atal
Mae MMPs yn deulu o ensymau allgellog sy'n ddibynnol ar sinc, a'u prif swyddogaeth yw ailfodelu a diraddio'r ECM[38], deunydd tebyg i gel sy'n hanfodol i ddal celloedd ynghyd a darparu llwybr ar gyfer maetholion ac ocsigen [39]. Mae newidiadau yn y cydrannau ECM, fel colagen ac elastin, a achosir gan MMPs yn sail i niwed i'r croen a ffurfio crychau [40]. Ynghyd â'r ensymau hyn, sy'n gysylltiedig â strwythur y croen a ffurfio crychau, mae un arall yn cymryd rhan hanfodol yn y broses heneiddio oherwydd ei weithgaredd mewn melanogenesis: tyrosinase. Ymhlith ffactorau eraill, mae amlygiad UVR yn achosi croniad o swm annormal o melanin, oherwydd cynnydd mewn cynhyrchiad ROS. Mae'r rhywogaethau adweithiol hyn yn effeithio ar weithgaredd melanocytes, sy'n cynyddu trosi tyrosin yn melanin trwy ocsidiad, gan arwain at hyperpigmentation a chlytiau croen afreolaidd [41].
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Wrth chwilio am ddewisiadau amgen naturiol i gynhwysion gwrth-heneiddio masnachol, gan ganolbwyntio ar yr ensymau a grybwyllir uchod, archwiliwyd gweithgaredd echdynion cyanobacteria (Ffigur 2). O ran HAase, dim ond tri straen oedd yn gallu atal yr ensym hwn, gan weithredu mewn modd sy'n dibynnu ar ddos: echdyniad dyfrllyd Leptolyngbya cf. ectocarpiLEGE 11479 (IC50=863 ug/mL), a darnau aseton o Cephalothrix lacustris LEGE 15493 a Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, gyda'r ddau olaf ond yn cyrraedd IC25(832 a 995 ug/mL, yn y drefn honno). Er bod y gwerthoedd hyn yn ymddangos yn uchel, roedd ystod eu gweithgaredd yn debyg i un y cyffur cyfeirio deu-sodiwm cromoglicate （DSCG） (IC50=105 ug/mL). (1 mg/mL), Leptolyngbya cf. ataliodd ectocarpi LEGE 11479 yr ensym hwn mewn 80 y cant (Ffigur 2), sy'n gwneud y darn hwn yn addawol fel cynhwysyn cosmetig.
Ychydig iawn o astudiaethau sydd wedi adrodd ar effaith bosibl cyfansoddion a darnau cyanobacteria ar weithgaredd hyaluronidase, a dylai unrhyw gymhariaeth ar botensial biolegol echdynion gymryd i ystyriaeth fod metaboledd cyanobacterial yn dioddef amrywiad sylweddol yn dibynnu ar yr amodau tyfu, gan ddylanwadu ar gyfansoddiad cemegol echdynion. Gwerthusodd Morone a chydweithwyr [26] effaith darnau ethanol o Tychonema sp. LEGE 07196 a Cyanobium sp. LEGE 07175 ar hyaluronidase, a chanfuwyd gweithgaredd ataliol cryfach, gyda gwerthoedd ICso o 182.74 a 208.36 ug/mL, yn y drefn honno. Mae gweithgaredd echdynion ethanol hefyd wedi'i adrodd ar gyfer ffracsiwn anhydawdd o Spirulina platensis, gydag IC5o o 150 ug/mL[42]. Dangosodd astudiaeth arall, a gynhaliwyd gan Yamaguchi a Koketsu [19], fod Nostochopsis lobatus MAC0804NAN yn cynhyrchu llawer iawn o polysacaridau gydag effaith ataliol uchel (IC50=7.18 ug/mL). Adroddwyd hefyd bod Arthrospira- gall peptid deilliadol fod yn rhan o ataliad hyaluronidase [4]. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi potensial cyfansoddion cyanobacteria a detholiadau fel cynhwysion gwrth-heneiddio ar gyfer cymwysiadau cosmeutical.
O ystyried elastase, dim ond darnau aseton oedd yn cyflwyno bioactifedd diddorol. Leptolyng-bya cf. ectocarpi LEGE 11479 oedd y mwyaf gweithgar eto (Ffigur 2), sef yr unig straen i gyrraedd yr ICso, gyda gwerth o 391 ug/mL. Cyrhaeddodd Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalothrix lacustris LEGE 15493, a Leptolyngbya boryana LEGE 15486 IC25 yn unig, gyda gwerthoedd o 126,86, a 99 ug/mL, yn y drefn honno. O ran hyaluronidase, dangoswyd mai straeniau morol yw'r rhai mwyaf addawol.
Hyd eithaf ein gwybodaeth, nid oes unrhyw adroddiadau blaenorol ar weithgarwch ataliol elastase ar gyfer y straeniau a archwilir yma. Ynglŷn â straenau eraill, darganfuwyd bod Nostoc minutum yn cynhyrchu peptidau math microviridins a notopeptinau, gydag ICso =1.3 a 11.0 ug/mL [44,45]. Roedd microviridins B ac Wedi'i gynnwys o Microcystis aeruginosa hefyd yn atal elastase yn effeithiol, gyda gwerthoedd ICso o 0.044 a 0.084 ug/mL [46]. Mae'r rhan fwyaf o'r data sydd ar gael ynghylch ataliad elastase yn canolbwyntio ar gyfansoddion ynysig, felly mae'n anodd cymharu â'r detholiadau o'n straen.
Mae pigmentiad croen anwastad, sy'n gysylltiedig â heneiddio ac amlygiad UV, yn parhau i fod yn bryder mawr i boblogaethau sy'n heneiddio a diwydiannau cosmetig. Mae mwyafrif yr astudiaethau sydd ar gael yn ddibwys ac yn defnyddio tyrosinase madarch fel model ensymatig, gan ei gwneud hi'n anodd trosi'r canlyniadau i'r amgylchedd dynol, serch hynny, mae gan yr ensym hwn debygrwydd a homoleg uchel â thyrosinase dynol[47]. Felly, defnyddiwyd yr un model enzymatig yma i archwilio potensial echdynion cyanobacteria mewn ataliad tyrosinase. O ran elastase, dim ond darnau aseton oedd yn gallu atal tyrosinase. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 oedd y mwyaf effeithiol (Ffigur 2), sef yr unig straen i gyrraedd yr IC#N (989.26±4.3 ug/mL). Isod roedd Leptolyngbya boryana LEGE 15486, gydag IC25=784 78±4.33 ug/ mL, ac yn olaf Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, gyda'r canlyniadau mwyaf addawol i'w cael ar gyfer y rhywogaethau morol.
Archwiliodd Morone a chyd-weithwyr [26] weithgaredd darnau cyanobacteria ethanolig yn yr un model yn flaenorol, ond ni chanfuwyd unrhyw weithgaredd. Un agwedd ddiddorol ar hyn yw mai un o'r straeniau a astudiwyd oedd Nodosilinea nodulosa LEGE 06102, a ddangosodd y canlyniadau gorau yma, gan bwysleisio unwaith eto bwysigrwydd y toddyddion echdynnu wrth gael echdynion bioactif wedi'u targedu. O ran yr ensymau eraill a archwiliwyd, mae arolygon sy'n canolbwyntio ar syanobacteria hefyd yn brin ar gyfer tyrosinase. Ir gwaith a gynhaliwyd gan Yabuta a'i dîm [48], dywedwyd bod y dyfyniad dŵr poeth ofNostochopsis spp. rhwystro gweithgaredd tyrosinase yn sylweddol (IC50=250 ug/mL). Mae hwn yn ganlyniad diddorol iawn, o ystyried ei fod yn deillio o echdynnyn dyfrllyd, na chanfuwyd unrhyw weithgaredd ar ei gyfer yn yr astudiaeth bresennol. Mae'r awduron yn priodoli'r canlyniad i'r cyfansoddion pwysau moleciwlaidd isel a ryddhawyd o PBPs trwy driniaeth wres, sef moiety biline sy'n gweithredu fel sborionydd radical perocsyl cryf. Gwerthusodd astudiaeth arall weithgaredd ataliol darnau Arthrospira platensis ethanol (IC50=14,000 ug/mL) a dŵr (IC50 =72,000 ug/mL), lle mae'r priodolwyd gwerthoedd i bresenoldeb cyfansoddion ffenolig fel asidau ferulig a chaffeic yn y dyfyniad ethanol [49].
2.3.3.UV Amddiffyn
Er bod nifer cynyddol o gwmnïau cosmetig yn ymgorffori atalyddion haul yn eu cynhyrchion, mae'n dal yn anodd argyhoeddi defnyddwyr am fanteision eu defnydd bob dydd i arafu heneiddio croen cynamserol. Os ar y naill law, mae cymhwyso atalyddion haul bob dydd ychydig yn arferiad cynhenid, ar y llaw arall, mae yna ofn penodol wrth ddefnyddio sylweddau synthetig, oherwydd eu risgiau cysylltiedig digroeso[50]. Yn dilyn ymlaen o hyn, mae ymchwil ar ffotoprotection naturiol wedi cynyddu'n sylweddol yn ystod yr ychydig flynyddoedd diwethaf, gan ystyried eu potensial ar gyfer bioddiraddadwyedd a gwenwyndra is, gan eu gwneud yn fwy buddiol i bobl a'r amgylchedd. Er mwyn archwilio echdynion cyanobacteria yn y maes hwn, gwerthuswyd eu gallu i weithredu fel eli haul yn vitro ar gyfer UVR-B, gan mai dyma'r ymbelydredd mwyaf niweidiol. Cyflwynir y canlyniadau a ddarganfuwyd ar gyfer echdynion dyfrllyd cyanobacteria ac aseton yn Nhabl 7.
O ran darnau aseton, darganfuwyd y gwerth mwyaf addawol (19.2) ar gyfer Leptolyngbya boryana LEGE 15486, ac yna Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479(10.7), y ddau ar y crynodiad isaf a brofwyd, 200 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 oedd y lleiaf addawol ymhlith darnau aseton. Mewn darnau dyfrllyd, cafwyd y canlyniadau mwyaf addawol ar gyfer y crynodiad uchaf a brofwyd, gyda Leptolyngbya boryana LEGE 15486 a Cephalothrix lacustris LEGE 15493 yn sefyll allan gyda gwerthoedd SPF in vitro o 17.1 a 14.9, yn y drefn honno (Tabl 7).estyniad bywyd cistancheWrth drafod astudiaethau blaenorol yn y maes hwn, adroddodd Hossain a'i dîm [51] mai gwerth SPF ar gyfer dyfyniad Cephalothrix komarekiana oedd 2.37. Canfu grŵp arall mai SPF dyfyniad methanol o Aphanizomenon flos-aquae oedd 4 [52]. Fodd bynnag, nid oedd y wybodaeth am y crynodiad o'r dyfyniad a ddefnyddiwyd gan yr awduron ar gael, gan wneud cymariaethau posibl yn anodd.
Mae nifer y straeniau cyanobacteria a archwilir ym maes colur, yn enwedig o ran SPF, yn brin iawn, o ystyried potensial yr adnoddau hyn. Mae'r canlyniadau a gyflwynir yma yn dangos y gall y rhywogaeth sy'n cael ei hastudio fod yn opsiynau da fel amddiffynwyr lluniau biolegol, ac o bosibl yn gweithredu fel atgyfnerthu i eli haul eraill sy'n cael eu marchnata ar hyn o bryd, gan ganiatáu gostyngiad yn y crynodiad o eli haul synthetig yn y fformiwlâu. Felly, mae'n hanfodol cynyddu ymchwil ar yr organebau hyn, yn enwedig eu hechdynion bioactif, sydd, oherwydd eu bod yn costio llawer llai, yn cynhyrchu mwy, ac yn cael eu caffael yn gyflymach na chyfansoddion ynysig, yn fwy ecogyfeillgar ac yn fwy deniadol yn economaidd.
2.4. Gwahaniaethu ar Detholiad Cyanobacteria yn ôl Dadansoddiad PCA
Mae'r chwilio am gyfansoddion bioactif o ffynonellau naturiol, gyda'r potensial i'w defnyddio fel cynhwysion ym maes colur, wedi tyfu yn ystod y blynyddoedd diwethaf. Yn ogystal â bod yn llai gwenwynig o bosibl ac yn gwbl fioddiraddadwy, mae cyfansoddion sy'n deillio o syanobacteria ar gael o ffynonellau adnewyddadwy a gellir eu cael am gost isel mewn amgylchedd rheoledig.cistanche nzGall dosbarthu echdynion bioactif yn ôl eu cyfansoddiad cemegol a gweithgareddau biolegol fod yn werthfawr i dynnu sylw at berthnasoedd posibl. Yn hyn o beth, defnyddiwyd dadansoddiad prif gydrannau (PCA), gan ystyried cyfansoddiad cemegol echdynion cyanobacteria a bioactifedd y crynodiad uchaf a brofwyd ym mhob assay (Ffigur 3). Fel y gwelir, gellid esbonio 72.99 y cant o'r amrywioldeb gan y ddau ddimensiwn cyntaf: PCl oedd yn cyfrif am 50.41 y cant o'r amrywiant, tra bod PC2 yn gyfrifol am 22.58 y cant. Gwahaniaethwyd rhwng tri grŵp (Ffigur 3A). ): Gl, yn cynnwys y dyfyniad dŵr Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479; G2, yn cynnwys echdynion dŵr Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 a Nodosilinea nodulosa LEGE 06104; a G3, sy'n cynnwys yr holl echdynion aseton. Yn ôl Ffigur 3B, mae Gl yn wahanol yn gemegol i'r samplau eraill oherwydd y cynnwys AG; Mae darnau dŵr Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486, a Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 yn cael eu grwpio yn ôl eu cynnwys yn PC, APC, a chyfanswm proteinau (G2), tra bod yr holl echdynion aseton i'w cael yn yr un grŵp (G3)due i'w cynnwys mewn carotenoidau, a chloroffyl a a'i ddeilliadau. Mae'r cyfansoddion y tu hwnt i'r gweithgareddau ensymatig yn cael eu harddangos, gyda'r planau wedi'u ffurfio gyda'r echel PCl positif (Ffigur 3B). Gellir arsylwi bod cysylltiad agos rhwng samplau â chynnwys uwch mewn cloroffyl a a carotenoidau ag ataliad elastase a thyrosinase. Dangosir hyn gan y gydberthynas gadarnhaol gref rhwng carotenoidau ac elastase (0.725,p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05).Yn gyffredinol, roedd y dadansoddiad PCA yn caniatáu grwpio echdynion yn ôl y gweithgareddau biolegol a arddangosir ym maes heneiddio croen, gan arwain at y casgliad bod echdynion aseton yn fwy effeithiol wrth atal ensymau sy'n gyfrifol am y diraddio o'r matrics dermol a cholli strwythur y croen, tra bod echdyniadau dyfrllyd yn fwy effeithiol wrth chwilio am radicalau rhydd ac amddiffyn y croen rhag effeithiau niweidiol ymbelydredd UV.
Hyd y gwyddom, dyma'r tro cyntaf i berthynas gael ei sefydlu rhwng cyfansoddiad cemegol a gweithgareddau biolegol echdynion o'r straenau cyanobacteria hyn.
3.Materials a Dulliau
3.1. Cynhyrchu Biomas Cyanobacteria
Pedwar math cyanobacterial ffilamentaidd, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 a Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486, o ecosystemau dŵr croyw Brasil, a Leptolyngbya cf. Defnyddiwyd ectocarpi LEGE 11479 a Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, o ecosystemau morol Portiwgal, yn yr astudiaeth hon. Cynhaliwyd y straen yn y Casgliad Diwylliant Biotechnoleg Glas ac Ecotocsicoleg (LEGE CC) yn y Ganolfan Ryngddisgyblaethol ar gyfer Ymchwil Forol ac Amgylcheddol (CIIMAR). amodau rheoledig, wedi'u graddio'n ddilyniannol hyd at 4 L. Tyfwyd y straenau mewn cyfrwng Z8 [53], wedi'i ategu â 10 ug / L fitamin B12 a 25g / LNaCl ar gyfer straen morol. Roedd diwylliannau'n cael eu cynnal ar 25 gradd, gyda dwyster golau o 10 umol photons m-2 s-4, a chyda photoperiod o 14h golau:10 h tywyll. Casglwyd y biomas ffres ar ôl 120 neu 150 diwrnod o dyfiant (yn dibynnu ar y straen) trwy hidlo, a'i rewi, ei rewi-sychu, a'i storio ar -20 gradd nes paratoi'r echdyniad.
3.2.Paratoi Detholiad
Paratowyd dau ddyfyniad gwahanol yn olynol o bob straen: aseton a dyfrllyd. Yn gyntaf, paratowyd y detholiad aseton, gan ddefnyddio 2g o fiomas sych. Ataliwyd y biomas mewn aseton a'i dynnu am 10 munud mewn baddon ultrasonic (Fisherbrand [FB15053, Loughborough, UK). Ar ôl echdynnu aseton, gadawyd y beled canlyniadol i sychu yn y cwfl mygdarth, ac yna ei dynnu â 70 ml o ddŵr distyll, gan ddilyn yr un weithdrefn. Tynnwyd malurion celloedd trwy allgyrchu ar 10,00 × × g Gs am 5 munud ar 4 gradd , mewn microcentrifuge HERAEUS MegafugeTM 16R (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, UDA). gwasgedd (BUCHIR-210 Rotari Anweddydd) (detholiad aseton), neu wedi'i rewi a'i lyophilized (dyfyniad dyfrllyd). Ailadroddwyd echdynnu gyda'r uwchnat cyfatebol 3 gwaith. Cadwyd yr echdynion sych ar -20 gradd tan ddadansoddiad cemegol a biolegol pellach.
3.3.Tystiadau Cell
3.3.1.Diwylliant Cell
Defnyddiwyd keratinocytes dynol HaCAT(ATCC), ffibroblastau llygoden 3L1(ATCC), a chelloedd endothelaidd dynol hCMEC (a ddarparwyd gan Dr. POCouraud (INSERM)) ar gyfer gwerthuso cytotocs-icity. Cafodd llinellau celloedd eu meithrin yn ‘Adified Eagle Medium’ Dulbecco (DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Glasgow, DU), wedi’i ategu gan 10 y cant (v) serwm buchol ffetws (Gibco), 1 y cant penisilin-streptomycin (Pen-Strep 100 IU /mL a 10 mg/mL, yn y drefn honno)(Gibco) a 0.1 y cant Amphotericin B (Gibco). Perfformiwyd cynnal a chadw celloedd a phrofion ar 37 gradd mewn awyrgylch lleithiwyd 5 y cant o CO2, ac adnewyddwyd y cyfrwng diwylliant bob dau ddiwrnod. Ar gydlifiad celloedd 80-90 y cant, golchwyd celloedd ymlynol â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS, Gibco), wedi'u gwahanu ag ensym cyflym TrypLEX (1 ×) (Gibco), a basiwyd i'w cynnal a'u cadw, a'u hadu ar gyfer y profion a gynlluniwyd.
3.3.2.Sytowenwyndra - Assay MTT
Gwerthuswyd hyfywedd cellog gan y gostyngiad yn y {{{0}}}(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-bromid diphenyltetrazolium (MTI, Sigma-Aldrich, yr Almaen) assay, fel yr adroddwyd yn flaenorol [26]. Cafodd yr holl linellau cell (celloedd endothelaidd, ffibroblastau, a keratinocytes) eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon, ar ddwysedd o 1.0 × 10 celloedd / mL, 3.3 × 104 celloedd / mL, a 2.5 × 104cells / mL, yn y drefn honno.maint pidyn cistancheAr ôl 24 h o adlyniad celloedd, tynnwyd y cyfrwng diwylliant, a datgelwyd y celloedd am 24 a 48 h i gyfrwng ffres sy'n cynnwys y gwahanol ddarnau cyanobacteria mewn pum crynodiad cyfresol, o 12.5 i 200 ug / mL. Ar gyfer y darnau aseton, paratowyd hydoddiannau stoc mewn dimethyl sulfoxide (DMSO) (Gibco), a'u gwanhau â DMEM cyn datguddiad celloedd fel nad oedd y crynodiad DMSO uchaf yn fwy nag 1 y cant. Paratowyd echdynion dyfrllyd yn PBS a'u gwanhau â DMEM cyn i'r celloedd ddod i gysylltiad. Y rheolaeth negyddol oedd PBS, a'r rheolaeth ar gyfer marwolaeth celloedd oedd DMSO 20 y cant . Ar ôl deori, cynhaliwyd assay cytotoxicity MIT. Yn gryno, ychwanegwyd 20 μL o hydoddiant MTT at bob ffynnon a'i ddeor ar 37 gradd am 3 h. Yn dilyn deori, tynnwyd y cyfrwng yn ofalus, a diddymwyd yr halwynau formazan lliw porffor yn DMSO. Darllenwyd yr amsugnedd ar 550 nm gyda darllenydd microplate aml-ganfod Synergy HT (Biorek, Bad Friedrichshall, yr Almaen) a weithredir gan feddalwedd GEN51M. Roedd yr assay yn cael ei redeg mewn pedwarplyg a chyfartaledd. Ar gyfer atgynhyrchu, ailadroddwyd pob assay yn annibynnol o leiaf dair gwaith. Mynegwyd sytowenwyndra fel canran hyfywedd celloedd, gan ystyried hyfywedd 100 y cant yn y rheolaeth toddyddion.
3.4. Proffil Cemegol o Detholiad Cyanobacteria
3.4.1.Cyfanswm Cynnwys Ffenolig (TPC)
I bennu TPC y darnau, defnyddiwyd assay colorimetrig, yn seiliedig ar fethodoleg Folin-Ciocalteu [54] gydag addasiadau bach. Cafodd y darnau aseton eu hydoddi mewn DMSO, a'r echdynion dyfrllyd mewn dŵr. Yn gryno, roedd 25 μL o bob dyfyniad (10mg/mL) wedi'i gymysgu'n llwyr â 25 μL o adweithydd Folin-Ciocalteu （Sigma-Aldrich）20{{20}} μL o hydoddiant NagCO3, a 500 μL o ddŵr deionized. Ar gyfer y gwag, disodlwyd yr adweithydd Folin-Ciocalteu gan ddŵr deionized. Mesurwyd amsugnedd y cynnyrch lliw a ffurfiwyd ar 725 nm, gan ddefnyddio darllenydd microplate Aml-ganfod Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, yr Almaen) a weithredir trwy feddalwedd GEN51M. Cafwyd cromliniau safonol ar gyfer meintioli TPC gan ddefnyddio saith crynodiad o asid galig (GA) (0.025 i 0.5 mg/mL), a baratowyd yn yr un toddydd â'r echdynion i'w profi (y=2.097x＋0.01560 R²{{{). 22}}.9989,ar gyfer aseton, ac y=2.204x＋0.01401,R2=0.9982,ar gyfer dŵr, lle mae "y" yn cyfeirio at yr amsugnedd a "x" yn cyfeirio at y crynodiad) . Cyflawnwyd tri phenderfyniad annibynnol yn ddyblyg. Mynegwyd cyfanswm y cynnwys ffenolig fel ug cyfwerthoedd GA (GAE) fesul mg o echdyniad sych.
3.4.2.Cyfanswm Proteinau
Penderfynwyd ar gyfanswm y crynodiad protein gan ddefnyddio pecyn assay protein BCA (#23227, Thermo-Scientific). Paratowyd echdynion dyfrllyd mewn dŵr, tra paratowyd echdynion aseton yn DMSO.Yn fyr, mewn 96-plât ffynnon, Cymysgwyd 25 uL o bob echdyniad (1 mg/mL) â 200 μL o'r adweithydd gweithredol. Mesurwyd yr amsugnedd ar 562 nm, gan ddefnyddio darllenydd microplate Aml-ganfod Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Ger-many) a weithredir trwy feddalwedd GEN5IM. Cromlin safonol(y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R2=0.999,ac y=162.87x3-248.51x²＋932.13x Cafwyd -11.715;R2=0.99,lle mae "y" yn cyfeirio at yr amsugnedd a "x" yn cyfeirio at y crynhoad) ar gyfer pob dyfyniad, gan ddefnyddio naw crynodiad o albwmin (BSA)(25 i 2000 ug/mL) i feintioli'r proteinau. Cynhaliwyd tri arbrawf annibynnol yn driphlyg. Mynegwyd cyfanswm y cynnwys protein fel ug o albwmin serwm buchol (BSA) cyfatebol fesul mg o echdyniad sych.
3.4.3.Pigmentau
Cafodd y pigmentau a oedd yn bresennol mewn echdynion dyfrllyd ac aseton eu meintioli'n benodol-troffotometrig. Cafodd cloroffyl a a'i ddeilliadau eu meintioli gan ddefnyddio cromlin raddnodi a gafwyd gyda'r safon fasnachol (Sigma-Aldrich): y=8.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996), lle mae "y" yn cyfeirio at yr amsugnedd ac mae "x" yn cyfeirio at y crynodiad. Cafodd cyfanswm y carotenoidau eu meintioli fel -caroten (Sigma-Aldrich), trwy ei gromlin graddnodi （y=17.133x＋0.0099; R²=0.990, lle mae "y" yn cyfeirio at yr amsugnedd a "x" yn cyfeirio at y crynodiad). Mynegwyd cyfanswm y crynodiad carotenoid fel ug o -caroten fesul mg o echdyniad sych. Cafwyd cromliniau graddnodi ar gyfer y ddwy safon gan ddefnyddio pum crynodiad gwahanol (0.001 i 0.025 mg/mL). Perfformiwyd y penderfyniadau sbectroffotometrig mewn 96-blatiau ffynnon, sef 450 nm ar gyfer -caroten a 663 nm ar gyfer cloroffyl a, gan ddefnyddio darllenydd microplate aml-ganfod Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, yr Almaen) a weithredir trwy feddalwedd GEN5TM.
Penderfynwyd ar gynnwys PBP yn sbectroffotometrig trwy fesur amsugnedd y darnau dyfrllyd ar donfeddi gwahanol (562,615, a 645 nm), a chymhwyso'r fformiwlâu cyfatebol, fel y disgrifiwyd yn flaenorol gan Pagels et al. [34]: Cafodd echdynion dyfrllyd eu hailddarparu i grynodiad terfynol o 0.5 mg/mL. Cynhaliwyd yr arbrawf yn driphlyg, a mynegwyd y canlyniadau mewn ug/mg o echdyniad sych. 3.5.Gweithgareddau Biolegol
3.5.1.Superocsid Anion Radical (O2*-) Sborion
Perfformiwyd y prawf sborion radical rhydd o Oz * - i werthuso potensial gwrthocsidiol y darnau cyanobacteria, yn ôl Barbosa a chydweithwyr [55], gyda mân addasiadau. Paratowyd y darnau dyfrllyd mewn dŵr, tra paratowyd darnau aseton yn DMSO. Paratowyd pum gwanediad cyfresol ar gyfer pob dyfyniad a'u profi er mwyn gwerthuso ymddygiad y detholiadau a gwerthoedd IC. Diddymwyd yr holl adweithyddion mewn byffer ffosffad (19 uM, pH7.4). Cymysgwyd cyfaint o 50μL o bob gwanediad gyda 50 ul o hydoddiant ffurf lleihäol adenine dinucleotid 166 uM -nicotinamide (NADH) a 150 uL o 43 uM nitrotetrazolium glas clorid (NBT) mewn 96-plât ffynnon. Ar ôl ychwanegu 50 μL o 2.7 μM methosylffad phenazine （PMS）, cafodd gweithgaredd sborionu radical y samplau ei fonitro gyda darllenydd microplate Aml-ganfod Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, yr Almaen) a weithredir trwy feddalwedd GEN51M, mewn swyddogaeth cinetig, ar dymheredd ystafell am 2 funud ar 562 nm. Perfformiwyd tri asesiad annibynnol yn driphlyg. Defnyddiwyd GA fel rheolaeth gadarnhaol. Mynegwyd y canlyniadau fel canran y chwilota radical o'i gymharu â'r rheolaeth heb ei drin. Mynegwyd y canlyniadau ar gyfer y gwerthoedd IC a gyfrifwyd fel cymedr ± SD (ug / mL) o leiaf dri asesiad annibynnol a gyflawnwyd yn ddyblyg. Cyfrifwyd y gwerthoedd IC a'r cromliniau ymateb dos cyfatebol gyda meddalwedd Graphpad Prism@ (San Diego, CA, UDA; fersiwn 9, ar gyfer MacOS).
3.5.2.Gwahardd Hyaluronidase
Addaswyd y assay atal hyaluronidase ychydig o'r hyn a gynigiwyd gan Ferreres et al.【56】. Yn gryno, 25 μL o bob dyfyniad (9mg/mL), 175 μL asid hyaluronig (HA) (0.7 mg/mL), a 25 μL o hyaluronidase (HAase) (90{{). 14}} Roedd U/mL yn NaCl0.9 y cant ） yn gymysg mewn tiwb adwaith. Paratowyd echdynion dyfrllyd mewn dŵr, a pharatowyd darnau aseton mewn DMSO. Ar ôl 30 munud o ddeor ar 37 gradd, stopiwyd yr adwaith trwy ychwanegu 25 μL o detraborate deu-sodiwm (0.8 M mewn dŵr), ac yna deor am 3 munud ar 90 gradd mewn baddon dŵr. Cafodd y tiwbiau adwaith eu hoeri i dymheredd ystafell cyn ychwanegu 375 uL o hydoddiant DMAB[4-(Dimethylamino)benzaldehyde]. Ar ôl 20 munud o ddeori ar 37 gradd, mesurwyd amsugnedd y cynnyrch lliw a ffurfiwyd ar 560 nm, mewn darllenydd microplate aml-ganfod Synergy, HT (Biotek, Bad Friedrichshall, yr Almaen) a weithredir trwy feddalwedd GEN5IM. Perfformiwyd y rheolaeth negyddol yn absenoldeb dyfyniad. Defnyddiwyd disodium cromoglycate (DSCG) fel rheolaeth gadarnhaol.
Perfformiwyd tri asesiad annibynnol mewn triphlyg, a mynegwyd y canlyniadau fel canran ataliad ensymau o'i gymharu â'r rheolaeth heb ei drin.
3.5.3.Elastase Ataliad
Perfformiwyd assay ataliad elastase pancreatig mochyn yn ôl Mota a chydweithwyr [57] gydag addasiadau bach. Paratowyd echdynion dyfrllyd mewn dŵr, tra paratowyd darnau aseton yn DMSO.Yn fyr, mewn 96-plât ffynnon, cymysgwyd 50 μL o'r dyfyniad â 90 uL o glustog HEPES (0.1 M), 10 uL o swbstrad p-nitroanilide N-succinyl-Ala-Ala-Ala (100 uM）, 70 uL o glustogfa asetad (200 mM), a 30 μL o elastase (1 U/mL) Deorwyd y plât 3 ar radd 3. 10 munud, a mesurwyd amsugnedd y cynnyrch adwaith yn 405 nm, mewn darllenydd microplate Aml-ganfod Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, yr Almaen) a weithredir trwy GEN51M. Perfformiwyd y rheolaeth negyddol yn absenoldeb echdyniad, a defnyddiwyd asid asgorbig fel rheolaeth gadarnhaol.powdr cistanchePerfformiwyd tri asesiad annibynnol yn driphlyg. Mynegwyd y canlyniadau fel canran yr ataliad ensymau o'i gymharu â'r rheolaeth heb ei drin.
3.5.4.Atal Tyrosinase
Perfformiwyd yr assay ataliad tyrosinase yn ôl Adhikari et al.[58] gyda mân addasiadau. Yn gryno, mewn 96-plât ffynnon, cafodd 20 μL o bob echdyniad ei gymysgu â 100 μL o tyrosinase (30 U/mL mewn byffer ffosffad）). Paratowyd echdynion dyfrllyd mewn dŵr, tra bod darnau aseton yn cael eu paratoi mewn DMSO. Deorwyd y gymysgedd ar 30 gradd am 8 munud. Yna, ychwanegwyd 80 μL o L-DOPA （L-3,4-hydoddiant dihydroxyphenylalanine） (2.5 mM mewn byffer ffosffad), ac roedd yr amsugniad (T0, amsugnedd ar y tro "sero") ar unwaith. wedi'i fesur gyda darllenydd microplate aml-ganfod Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, yr Almaen) a weithredir trwy feddalwedd GEN5TM, ar 475 nm. Roedd pennu'r amsugnedd yn T0 (cyn i'r cynnyrch adwaith gael ei ffurfio) yn fodd i ddileu ymyriadau posibl oherwydd lliw naturiol y darnau dan sylw. Ar ôl 8 munud o ddeori ar 30 gradd, mesurwyd yr amsugnedd eto (T8). Cyfrifwyd canran yr ataliad tyrosinase ym mhresenoldeb echdynion cyanobacteria o'i gymharu â'r rheolaeth heb ei drin (negyddol), lle mae'r gwahaniaeth rhwng yr amsugnedd (T{). {21}}T0) yn cyfateb i 100 y cant o actifedd ensymau. Perfformiwyd y rheolaeth negyddol yn absenoldeb dyfyniad, a defnyddiwyd asid kojic fel rheolaeth gadarnhaol. Perfformiwyd tri asesiad annibynnol yn driphlyg. Mynegwyd y canlyniadau fel canran yr ataliad ensymau o'i gymharu â'r rheolaeth heb ei drin.
3.5.5.Ffactor Diogelu'r Haul (SPF)
Penderfynwyd ar y ffactor amddiffyn rhag yr haul in vitro yn ôl Rohr a chydweithwyr[59] gyda mân addasiadau. Paratowyd echdynion dyfrllyd mewn dŵr, tra bod darnau aseton yn cael eu paratoi mewn aseton. Yn gryno, mesurwyd amsugnedd 2mL o bob echdyniad (20 a 1000 ug/mL), mewn sbectroffotomedr (o 290 i 320 nm, 5 mewn 5 nm). Cyfrifwyd y SPF gan ddefnyddio'r fformiwla a gynigiwyd gan Mansur [60]: lle EE (A) yw'r sbectrwm effaith erythemal, I (A) yw'r sbectrwm dwyster solar, Abs (λ) yw'r amsugnedd echdynnu, a CF yw'r cywiriad ffactor (28) a bennir gan ddefnyddio eli haul masnachol gyda gwerth SFP hysbys o 30.
3.6.Dadansoddiad Ystadegol
Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd ystadegau IBM SPSS (fersiwn 23.0 ar gyfer macOS, IBM Corporation, Efrog Newydd, NY, UDA, 2015). Dadansoddwyd data ar gyfer normalrwydd a homogenedd yr amrywiannau gan Kolmogorov-Smirnov a Leven's profion, yna'n cael eu cyflwyno i ANOVA unffordd gan ddefnyddio HSD Tukey (gwahaniaeth gwirioneddol arwyddocaol) fel prawf ôl-doc, neu i brawf t heb ei baru. Defnyddiwyd prawf cydberthynas Pearson i gymharu'r data mynegiant normaleiddio rhwng proffiliau cemegol a gweithgareddau biolegol echdynion cyanobacteria.
3.7.Dadansoddiad Prif Gydran (PCA)
Defnyddiwyd PCA i drawsnewid nifer o newidynnau a allai fod yn gydberthynol yn nifer o newidynnau cymharol annibynnol, y gellir eu rhestru ar sail eu cyfraniad at egluro amrywiad y set ddata gyfan[61]. Gellir adnabod cydrannau cymharol bwysig patrymau dimensiwn uchel yn llwyddiannus. Gellir mapio'r data dimensiwn uchel gwreiddiol ar ofod dimensiwn is, ac felly mae cymhlethdod problem dosbarthu patrwm dimensiwn uchel yn cael ei leihau'n fawr [62]. Ar gyfer yr astudiaeth bresennol, perfformiwyd adnabyddiaeth patrwm yn seiliedig ar PCA gan ddefnyddio meddalwedd ystadegau IBM SPSS (fersiwn 23.0 ar gyfer macOS, IBM Corporation, Efrog Newydd, NY, UDA, 2015). Roedd y matrics data yn cynnwys y metabolion a oedd yn bresennol yn y darnau dyfrllyd ac aseton o'r pedwar math cyanobacteria, a'u gweithgaredd ar y crynodiad uchaf a brofwyd.
4. Casgliadau
Profwyd bod cydberthynas amlwg rhwng y gweithgaredd biolegol a ddangosir gan y darnau cyanobacteria a ddadansoddwyd yma. Yn ôl presenoldeb PBPs bioactif, y darnau dyfrllyd oedd y rhai mwyaf effeithiol ar gyfer amddiffyniad UV sydd, ynghyd â'u gallu i chwilota'n radical, yn eu hawgrymu fel cynhwysion addawol i'w defnyddio mewn fformwleiddiadau gwrth-heneiddio gyda'r nod o atal heneiddio croen sy'n cael ei waethygu gan ffactorau allanol. Ar y llaw arall, bu'r darnau aseton yn fwy effeithiol wrth atal gweithgaredd ensymau sy'n gyfrifol am ddiraddio'r matrics dermol a cholli strwythur y croen, gan fod yn fwy addas ar gyfer heneiddio croen sy'n gysylltiedig ag oedran.dyfyniad salsa cistancheGallai’r cynllun echdynnu dilyniannol a gynigiwn fod yn fanteisiol, gan ganiatáu cael echdynion bioactif sy’n gemegol wahanol drwy roi gwerth ariannol ar fiomas cyanobacteria, gan wneud y broses yn fwy cynaliadwy ac economaidd ddeniadol. Ar y cyfan, roedd echdynion cyanobacteria yn werth eu hecsbloetio ymhellach ym maes heneiddio croen, gan dargedu'r chwilio am gynhwysion naturiol, diogel a chynaliadwy ar gyfer fformwleiddiadau cosmetig.
Daw'r erthygl hon o Mar. Drugs 2022, 20, 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs
