Cydosod Trawsgrifiad De Novo A Darganfod Genynnau O Cistanche Deserticola Bonyn Cnawdol-Ⅰ

Cefndiroedd

Mae Cistanche deserticola yn blanhigyn parasitig cwbl anffotosynthetig gyda gwerth meddyginiaethol gwych ac fe'i dosberthir yn bennaf yn anialwch Gogledd-orllewin Tsieina. Mae ei goesyn cigog sych yn donig hollbwysig ynmeddygaeth Tsieineaidd traddodiadolgyda rolau o wella swyddogaeth rywiol gwrywaidd yn bennaf a chryfhau imiwnedd, ond ychydig o astudiaethau mecanistig sydd wedi'u cynnal yn rhannol oherwydd diffyg adnoddau genomig a thrawsgrifio.

MEDDYGINIAETH TRADDODIADOL TSEINEAIDD PHGS75% ECH 30% DEDDF 12% CISTANCHE NATURIOL TUBULOSA

Canlyniadau

Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom ddilyniannu trawsgrifiad dwfn yng nghoes cigog C. deserticola, a chynhyrchwyd tua 80 miliwn o ddarlleniadau gan ddefnyddio dilyniant pen pâr Illumina ar lwyfan HiSeq2000. Gan ddefnyddio cydosodwr y drindod, cawsom 95,787 o ddilyniannau trawsgrifio gyda hyd trawsgrifiadau yn amrywio o 200bp i 15,698bp, gyda hyd cyfartalog o 950 sylfaen a hyd N50 o 1,519 o seiliau. Nodwyd bod 63,957 o drawsgrifiadau wedi’u mynegi’n weithredol gyda FPKM Mwy na neu’n hafal i 0.5, lle cafodd 30,098 o drawsgrifiadau eu hanodi â disgrifiadau genynnau neu dermau ontoleg genynnau yn ôl dadansoddiadau tebygrwydd dilyniant yn erbyn nifer o gronfeydd data cyhoeddus (Uniprot, NR, ac Nt yn NCBI, a KEGG) . At hynny, fe wnaethom nodi genynnau ensymau allweddol sy'n ymwneud â biosynthesis glycosidau lignin a ffenylethanoid (PhGs) y gwyddys eu bod yn gynhwysion gweithredol sylfaenol. Nodwyd pedwar genyn amonia-lyase ffenylalanîn (PAL), yr ensym allweddol cyntaf mewn biosynthesis lignin a PhG yn seiliedig ar gymharu dilyniant a dadansoddiad ffylogenetig. Cynigiwyd dau lwybr biosynthesis PhGs am y tro cyntaf hefyd.

Casgliadau

At ei gilydd, cwblhawyd dadansoddiad byd-eang o drawsgrifiad coesyn cigog C. deserticola gan ddefnyddio technoleg RNA-seq. Nodwyd casgliad o genynnau ensymau sy'n gysylltiedig â biosynthesis glycosidau lignin a ffenylethanoid o'r trawsgrifiadau wedi'u cydosod a'u hanodi, a rhagwelwyd teulu genynnau PAL hefyd. Bydd y data dilyniant o'r astudiaeth hon yn adnodd gwerthfawr ar gyfer cynnal ymchwil biosynthesis glycosidau ffenylethanoid yn y dyfodol ac astudiaethau genomig swyddogaethol yn y planhigyn meddyginiaethol pwysig hwn.

Rhagymadrodd

Genws byd-eang o blanhigion anialwch lluosflwydd o'r teulu Orobanchaceae yw C. deserticola ac mae'n rhywogaeth gwbl anffotosynthetig ac fel arfer mae'n tyfu planhigyn holoparasitig o dan y ddaear. Mae'n cael ei barasiteiddio ar wreiddiau psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), sy'n byw yn bennaf mewn anialwch a lled-anialwch oherwydd ei oddefgarwch uchel i sychder a halltedd. Mae C. deserticola yn dangos ymwrthedd cryf i amodau amgylcheddol llym ac fe'i dosberthir yn bennaf yng Ngogledd-orllewin Tsieina, yn enwedig ym Mongolia Fewnol, Gansu, a Xinjiang. Mae'n cael ei hystyried yn rhywogaeth wyllt sydd mewn perygl yn ystod y blynyddoedd diwethaf oherwydd bod pobl yn bwyta mwy. Mae C. deserticola, a elwir yn aml yn ginseng anialwch, yn cael ei alw'n gyffredin fel banadl yr anialwch ac mae'r coesyn cigog sych wedi'i ddefnyddio'n helaeth fel tonic traddodiadol bwysig yn Tsieina a Japan ers blynyddoedd lawer. Fe'i cofnodwyd i ddechrau yn Shen Nong Ben Cao Jing (Dictionary of Chinese Materia Medica, 1977) tua 1800 o flynyddoedd yn ôl ac fe'i hystyriwyd yn un o brif ffynonellau'rPerlysiau meddyginiaethol Tsieineaidd Cistanche.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mae darnau o C. deserticola yn meddu ar ystod eang o swyddogaethau meddyginiaethol, yn enwedig i'w defnyddio i wella swyddogaeth rywiol, tonifying arennau, amddiffyn yr afu, gweithgaredd aperient, gwella cof, immunomodulatory, gweithgaredd gwrthocsidiol, gwrthlidiol, gweithgaredd gwrthfeirysol, ac ati. prif gydrannau bioactif C. deserticola yw glycosidau Phenylethanoid (PheGs, PhGs). Hyd yn hyn, mae mwy nag 20 glycosidau ffenylethanoid wedi'u hynysu o goesyn suddlon C.deserticola. Yn eu plith,acteosid ac echinacosideyn ddwy brif elfen gyda gweithgareddau ffarmacolegol sylweddol ac wedi'u dogfennu fel safonau ansawdd C. deserticola yn y Pharmacopoeia Tsieineaidd (rhifynnau 2005 a 2010). Tair elfen gemegol PhGs yw asid organig, saccharid, a ffenylethanoid, fodd bynnag, nid yw C.deserticola yn deall y manylion ynghylch llwybrau biosynthetig ffenylethanoid yn dda o hyd.

Er gwaethaf pwysigrwydd masnachol a meddyginiaethol C.deserticola, mae data genomig a thrawsgrifio'r rhywogaeth hon yn gyfyngedig iawn. Nid oes unrhyw ESTs ar gael yng nghronfa ddata NCBI ac nid yw'r wybodaeth genom gyflawn ar gyfer y rhywogaeth hon ar gael o hyd heblaw am y dilyniant genom cloroplast. Mae'r data trawsgrifomig cyfyngedig yn rhwystro astudiaeth o fecanweithiau biosynthetig PhG. Gall technoleg RNA-seq gynhyrchu dilyniannau o'r rhannau a fynegwyd o'r genom wedi'i dargedu a nodi genynnau [18] gan ddefnyddio llwyfannau technoleg NGS (fel Biosystemau Cymhwysol SOLiD, Illumina HiSeq, a Roche 454). Mae'n dod yn fwyfwy poblogaidd yn y cynulliad transcriptome de novo, gan ei fod yn ddull cost-effeithiol a phwerus gyda chydraniad uchel ac ystod ddeinamig eang, yn enwedig gan fod ganddo fantais archwilio trawsgrifiadau nifer isel. Oherwydd y manteision amrywiol, mae RNA-seq yn benodol ddeniadol i organebau nad ydynt yn fodel gydag adnoddau genetig cyfyngedig. Fodd bynnag, nid oes unrhyw ymchwil manwl ar drawsgrifiad C. deserticola gan RNA-seq.

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddilyniannu trawsgrifiad coesyn yn fyd-eang ar gyfer C. deserticola gan ddefnyddio platfform Illumina Hiseq2000 a chawsom ddata crai 7.9G. Trwy gydosod ac anodi, fe wnaethom gloddio'r genynnau sy'n ymwneud â biosynthesis PhG a'r genynnau sy'n gyfrifol am fiosynthesis lignin cyfan. Cynhyrchodd ein dadansoddiad RNA-seq y trawsgrifiad consensws C. deserticola cyntaf a darparodd fewnwelediadau newydd i ddealltwriaeth gynhwysfawr o werth meddyginiaethol C. deserticola. Yn ogystal, gellir cymhwyso'r dull a ddisgrifir yma yn eang i drawsgrifiadau proffil i hwyluso darganfod genynnau sy'n ymwneud â llwybrau biosynthesis cydrannau meddyginiaethol penodol mewn planhigyn meddyginiaethol arall sydd ag adnoddau genomig cyfyngedig iawn.

Defnyddiau a Dulliau

Casgliad deunydd planhigion

Casglwyd y coesyn suddlon ffres ar gyfer C. deserticola yn ystod y cam cloddio o sylfaen blanhigion yng Nghynghrair Dinas Alxa BayanHot ym Mongolia Fewnol yng ngogledd-orllewin Tsieina. Cafwyd y drwydded gasglu gan berchennog (HongKui CongRong Group) sylfaen y planhigyn. Adneuwyd y sbesimen taleb yn y Cyfleuster Genomig Craidd yn Sefydliad Genomeg Beijing, Academi Gwyddorau Tsieineaidd. Ar ôl glanhau, torrwyd y meinweoedd coesyn suddlon yn ddarnau bach a'u rhewi ar unwaith mewn nitrogen hylifol, ac yna eu storio ar -80 gradd nes eu prosesu ymhellach.

Echdynnu RNA, adeiladu llyfrgell cDNA, a dilyniannu Illumina

Tynnwyd cyfanswm RNA o'r coesyn suddlon gan ddefnyddio TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., California, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd y samplau canlyniadol eu trin â DNase I i gael gwared ar unrhyw DNA genomig. Cafodd RNAs a echdynnwyd eu meintioli gan ddefnyddio bio-ddadansoddwr Agilent 21{{00 (Agilent Technologies) a'u gwirio am gyfanrwydd gan ddefnyddio electrofforesis gel agarose dadnatureiddio gyda staen bromid ethidium. Defnyddiwyd samplau RNA gyda chymarebau A260/A280 rhwng 1.9 a 2.1, cymarebau RNA 28S:18S yn uwch nag 1.0, a rhifau cyfanrwydd RNA (RINs) -8.5 mewn dadansoddiadau dilynol.

Cynhyrchwyd y llyfrgelloedd RNA-seq gan ddefnyddio Pecynnau Paratoi Sampl RNA Illumina Truseq. Cafodd Poly(A)+ RNA ei ynysu o gyfanswm RNA gan ddefnyddio gleiniau Dynal ligo(dT)25 yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn dilyn puro, ychwanegwyd byffer darnio i dorri'r mRNA yn ddarnau byr. Cafodd cDNA llinyn cyntaf ei syntheseiddio gan ddefnyddio'r darnau byr hyn fel templedi, ynghyd â thrawsgrifiad gwrthdro SuperScript III a primer hecsamer ar hap N6. Yna cafodd cDNA ail-linyn ei syntheseiddio gan ddefnyddio byffer, dNTPs, RNaseH, a DNA polymeras I. Bu'r cDNA dwy-linyn canlyniadol yn destun atgyweirio terfynol gan ddefnyddio DNA polymeras T4, darn DNA polymeras I Klenow, a kinase polyniwcleotid T4, a'i glymu i addaswyr gan ddefnyddio ligas DNA T4. Cafodd darnau wedi'u clymu gan addasydd eu puro gan ddefnyddio pecyn echdynnu PCR QiaQuick a'u cuddio â byffer EB. Ar ôl dadansoddi gan ddefnyddio electrofforesis gel agarose, dewiswyd darnau addas fel templedi ar gyfer ymhelaethu PCR. Gwnaed trefn ar y llyfrgell cDNA a ddeilliodd o hynny gyda system Illumina HiSeq 2000.

Trawsgrifiadau de novo cydosod a meintioli mynegiant genynnau

Cafodd darlleniadau crai a gynhyrchwyd o ddilyniannu eu glanhau trwy dynnu'r dilyniannau addasydd (ATCTCGTATGCCGTC) gan ddefnyddio dull mewnol. Yna fe wnaethom gynnal proses hidlo llym o ansawdd isel. Yn gyntaf, byddai seiliau gyda sgôr ansawdd phred yn is nag 20 yn cael eu tocio o 3' pen y dilyniant, nes eu rhedeg i mewn i un sylfaen ag ansawdd uwch (Yn fwy na neu'n hafal i 20). Pe bai'r hyd a ddarllenwyd yn fyrrach na 50bp, byddai'n cael ei daflu. Yn ail, bydd darlleniadau'n cael eu hidlo ymhellach gan y maen prawf bod gan 70% o'r seiliau mewn un darlleniad sgoriau ansawdd uchel (Yn fwy na neu'n hafal i 20). Yn drydydd, dim ond darlleniadau pen pâr a ddefnyddiwyd ar gyfer gwasanaeth pellach. Cynhaliwyd cydosod trawsgrifiad de novo gan ddefnyddio Trinity release_20130216 [30] a oedd yn cynnwys tri modiwl meddalwedd olynol: Inchworm, Chrysalis, a Butterfly. Gosodwyd paramedrau'r cynulliad fel a ganlyn:-seqType fq-JM 300G -min_contig_hyd 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20.

I fesur helaethrwydd trawsgrifiadau, cafodd y darlleniadau pen pâr wedi'u dilyniannu eu hail-alinio i'r trawsgrifiadau a gasglwyd gan ddefnyddio sgript yn Trinity. Defnyddiwyd darlleniadau wedi'u mapio ar gyfer meintioli gan feddalwedd RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization). Cynrychiolwyd helaethrwydd genynnau neu isoform gan y darn fesul kilobase o drawsgrifiad fesul miliwn darn wedi'i fapio (FPKM) gwerth, diffiniwyd y trawsgrifiadau hynny â gwerth FPKM sy'n hafal i neu'n fwy na 0.05 fel y'u mynegwyd.

Anodi swyddogaethol o drawsgrifiadau wedi'u mynegi

Nid oes unrhyw setiau anodi genynnau o C. deserticola ac eithrio'r genom cloroplast [1]. Fe wnaethom anodi'r trawsgrifiadau a fynegwyd trwy eu cymharu â setiau data wedi'u diweddaru Genbank Nt, Genbank Nr, a TAIR10_ pep{2}} wedi'u diweddaru ar wahân gan ddefnyddio'r rhaglen BLAST (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

Ontoleg Genynnau ac anodi llwybr KEGG Yn ôl dilyniant aliniad tebygrwydd â chronfa ddata Uniprot (cafodd anodiad Gene Ontology (GO) o'r holl drawsgrifiadau a gasglwyd trwy ddefnyddio ffeil cysylltu a lawrlwythwyd o (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/) cronfeydd data/GO/goa/UNIPROT/gene_cymdeithas goa_uniprot.gz). Categorïau CC, BP, a MF ar wahân.

Neilltuwyd gwybodaeth llwybr KEGG ar gyfer yr holl ddilyniannau protein a ragwelir gan ddefnyddio'r offeryn ar-lein KAAS (Gweinydd Anodi Awtomatig KEGG) [34]. Cyflwynwyd dilyniannau mewn fformat fasta i gais KAAS, a lawrlwythwyd y ffeiliau canlyniadol o'r holl wybodaeth llwybrau yn ymwneud â thrawsgrifiad coesyn C. deserticola. Defnyddiwyd setiau data genynnau 13 o organebau planhigion yn KEGG ar gyfer anodi gan ddefnyddio'r dull BBH (trawiad gorau deugyfeiriadol).

DYFYNIAD NATURIOL CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Dadansoddiad RT-qPCR

Ar ôl treulio gyda DNase I, troswyd tua 5ug o gyfanswm yr RNA yn cDNA llinyn cyntaf trwy'r adwaith trawsgrifio gwrthdro gyda phremio oligo(dT)15 a System Trawsgrifio Gwrthdroi GoScript (Promega). Yna cafodd y cynhyrchion cDNA eu gwanhau 10-plyg â dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio heb niwcleas cyn ei ddefnyddio fel templed mewn PCR amser real. Cafodd cDNAs penodol eu chwyddo gan system GoTaq 2-Step RT-qPCR (Promega) mewn cyfaint o 20 ul. Perfformiwyd ymhelaethiad PCR ar y tymheredd anelio o 60 gradd gyda'r System Canfod PCR Amser Real 7500 (Biosystemau Cymhwysol) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyfrifwyd helaethrwydd trawsgrifiadau cymharol yn ôl y dull trothwy cylch cymharol gyda genyn "comp10579_c0" fel safon fewnol, gan ddefnyddio meddalwedd 7500 Manager.

Dyluniwyd parau cysefin ar gyfer RT-PCR yn seiliedig ar feddalwedd ar-lein (http://primer3.ut.ee/) ac fe'u rhestrir yn Set Ddata S1.

Canlyniadau

Dilyniant RNA a chydosod trawsgrifiad de novo o goesyn cigog C. deserticola

Mae coesyn C. deserticola wedi cael ei ddefnyddio'n helaeth fel tonic o bwysigrwydd traddodiadol yn Tsieina a Japan ers blynyddoedd lawer. Er mwyn cael trosolwg byd-eang o fynegiant genynnau yn y coesyn cigog C. deserticola, casglwyd samplau o goesyn deserticola C. o’r un sylfaen planhigion yn 2013 a 2014, yn y drefn honno. Cyfanswm RNAs eu tynnu a polyA + RNAs eu puro ar gyfer adeiladu paru-diwedd RNA-seq llyfrgelloedd. 79,433,734 a 86,019,176 darlleniadau pen pâr yn cyfateb i bron i 8 biliwn a chafwyd 8.6 biliwn o seiliau'r dilyniant gan ddefnyddio dilyniant Illumina HiSeq 2000

platfform mewn 2013-samplau blwyddyn a 2014-blwyddyn (Tabl 1). Ar ôl tynnu dilyniannau addaswyr a hidlo darlleniadau o ansawdd isel (gweler y manylion yn Methods), defnyddiwyd 64,831,040 o ddarlleniadau pen pâr o ansawdd uchel yn y sampl 2013-blwyddyn ar gyfer cydosod de novo transcriptome. Gan ddefnyddio cydosodwr dilyniant Trinity [30], cynhyrchwyd 51,719 o enynnau a 95,787 o ddilyniannau trawsgrifio gyda hyd trawsgrifiadau yn amrywio o 200 bp i 15,698 bp. Hyd cyfartalog trawsgrifiadau wedi'u cydosod yw 950 sylfaen a hyd N50 yw 1,519 o seiliau. Datgelodd nifer y trawsgrifiadau o wahanol hyd fod 57.32% o'r trawsgrifiadau a gasglwyd tua 500 bp neu fwy (Ffig 1A). Cafodd darlleniadau pen pâr o ansawdd uchel yn y sampl 2014-flwyddyn eu mapio i'r trawsgrifiad a gydosodwyd. Ar ben hynny, canfuom fod y nifer trawsgrifio ar gyfer pob genyn a gasglwyd yn amrywio a 69% o enynnau ag un isoform wedi'i fynegi tra bod 31% o enynnau yn mynegi dau drawsgrifiad neu fwy (Ffig 1B).

Meintoli mynegiant ac anodi swyddogaethol o drawsgrifiadau wedi'u cydosod

Mesurwyd helaethrwydd genynnau neu drawsgrifiadau gan ddefnyddio'r pecyn RSEM, lle cafodd y darlleniadau wedi'u dilyniannu eu hail-alinio i'r dilyniannau genynnau neu drawsgrifiadau a gasglwyd gan ddefnyddio Bowtie, a defnyddiwyd y darlleniadau hynny wedi'u mapio ar gyfer meintioli. Cyfrifwyd gwerth FPKM ar gyfer pob genyn neu drawsgrifiad, ac yn olaf, fe wnaethom nodi 63,957 a 52,857 o drawsgrifiadau a fynegwyd yn weithredol (gwerth FPKM Yn fwy na neu'n hafal i 0.5) mewn samplau coesyn cigogol C. deserticola yn 2{{17} }13 a 2014, yn y drefn honno. Mynegwyd 44,776 o drawsgrifiadau (70.01% yn y 2013-sampl blwyddyn, 84.71% yn y 2014-sampl blwyddyn) yn gyffredin yn y ddau atgynhyrchiad, a'r gydberthynas (cyfernod cydberthynas Pearson: 0.91979) o'u data mynegiant oedd a ddangosir yn Ffig S1. Roedd y data crai dilyniannu wedi'i lanlwytho i gronfa ddata SRA NCBI (rhifau derbyn: SRX857402 a SRX858938). Defnyddiwyd genynnau wedi'u mynegi a nodwyd yn y 2013-sampl blwyddyn i'w dadansoddi ymhellach. Cafwyd gwybodaeth anodi swyddogaethol ar gyfer pob trawsgrifiad a fynegwyd gan ddefnyddio dau ddull. Yn gyntaf, roedd yr holl drawsgrifiadau a fynegwyd wedi'u halinio â chronfeydd data dilyniant niwcleotid hysbys (GenBank nt) a dilyniant peptid (GenBank nr a peptid Arabidopsis) ar wahân gan yr algorithm BLAST. Allan o 63,957 o drawsgrifiadau a fynegwyd,

Cafodd 29,220 (45.7%) eu hanodi gan ddangos homoleg i ddilyniannau mewn unrhyw un o'r tri chronfa ddata pwnc gyda thoriad E-werth 1e-20. Yn y cyfamser, rhagfynegwyd y rhanbarthau codio ymgeiswyr ar gyfer yr holl ddilyniannau trawsgrifiad a fynegwyd gan ddefnyddio meddalwedd TransDecoder, a defnyddiwyd yr ORFs hiraf ar gyfer pob trawsgrifiad ar gyfer chwiliad parth Pfam. O ganlyniad, cafodd 21,358 (33.4%) o drawsgrifiadau eu hanodi yn seiliedig ar gronfa ddata Pfam. Yn gyffredinol, cafodd 30,098 (47.1%) o drawsgrifiadau eu paru’n sylweddol â genynnau hysbys yn y cronfeydd data cyhoeddus drwy gyfuno’r ddau ddull uchod. Dangoswyd y rhestr gyflawn o drawsgrifiadau wedi'u mynegi gydag anodiad ffwythiant mewn data atodol (S2 Dataset).

Fe wnaethom arolygu’r 20 trawsgrifiad a fynegwyd amlaf (Tabl 2) sy’n cyfateb i 18.99% o’r holl ddarlleniadau dilyniannu, a chanfod bod y rhan fwyaf ohonynt yn enynnau sy’n ymateb i anfiotig

ysgogiad straen. Dehydrin (DHNs), dosbarth o broteinau straen hydroffilig a thermostable gyda nifer uchel o asidau amino wedi'u gwefru sy'n perthyn i'r teulu Embryogenesis Hwyr (LEA) Grŵp II, yw'r genyn a fynegir amlaf. Canfuwyd bod tri thrawsgrifiad Dehyrin gwahanol (comp28713_c0_seq1/2/4) wedi'u mynegi'n uchel mewn coesynnau cigog a allai fod yn gysylltiedig ag amddiffyn celloedd rhag difrod a achosir gan straen sychder. Canfuwyd bod genynnau eraill sy'n gysylltiedig â straen fel protein sioc gwres, protein sy'n gysylltiedig â pathogen, a metallothionein hefyd wedi'u mynegi'n uchel, a allai fod yn gysylltiedig â'i amgylchedd goroesi difrifol. Yn ogystal, mae rhai genynnau cyfansoddol gan gynnwys genyn RNA ribosomaidd 26S (comp22329_c2_seq1), protein sy'n gysylltiedig â auxin-repressed/ cysgadrwydd (comp20999_c0_seq1), Roedd ffactor ribosylation ADP (comp20499_ c0_seq1) hefyd yn drawsgrifiedig iawn.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA Imiwnedd PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%