Derbynyddion Unigryw tebyg i Dollau Mynegiant Genynnau Ac Ymateb Glial mewn Gwahanol Ranbarthau Ymennydd o Glefyd y Crafu Naturiol Rhan 3

Fe wnaethom ymchwilio i'r cydberthynas bosibl rhwng nodweddion niwropatholegol clefyd prion a mynegiant genynnau TLR mewn pedwar rhanbarth ymennydd gwahanol o ddefaid sydd wedi'u heintio'n naturiol â chlefyd y crafu. Ym mhob un o bedwar maes yr ymennydd, gwelsom wahaniaethau sylweddol mewn dyddodiad PrPSc, sbyngiosis, astrogliosis, a microgliosis yn y defaid sydd wedi'u heintio'n naturiol yn erbyn y defaid rheoli.

Mae clefyd Prion, a elwir hefyd yn glefyd ffair deml, clefyd bwyta cwyr, ac ati, yn haint firaol acíwt a achosir gan prions. Mae'r afiechyd yn cael ei drosglwyddo'n bennaf trwy fwyta bwyd heb ei goginio sy'n cynnwys prionau. Unwaith y bydd wedi'i heintio â phrions, gall achosi llid yr ymennydd a niwed i'r system nerfol, a gall symptomau fel cur pen, chwydu a thwymyn ddigwydd.

Fodd bynnag, wrth ddod ar draws sefyllfa o'r fath, ni allwn golli hyder yn ein cof oherwydd bodolaeth clefyd prion. Gall y rhan fwyaf o bobl heintiedig wella ac adfer eu cof ar ôl triniaeth.

Wrth gwrs, o safbwynt ataliol, gallwn geisio bwyta mwy o fwyd wedi'i goginio er mwyn osgoi haint prion. Ar yr un pryd, os ydych chi'n teimlo unrhyw symptomau, dylech hefyd weld meddyg cyn gynted â phosibl i atal y clefyd rhag gwaethygu.

Mewn bywyd bob dydd, gallwn roi cynnig ar hyfforddiant cof syml, megis darllen, llunio rhestrau, trefnu digwyddiadau a gwybodaeth, ac ati i wella ein cof. Nid oes angen llawer o amser ac egni ar yr hyfforddiant hwn, ond maent yn bwysig iawn ar gyfer cynnal ymennydd iach a swyddogaeth cof effeithiol.

Yn fyr, wrth ddod ar draws afiechydon fel clefyd prion, dylem ei wynebu'n gadarnhaol, ceisio triniaeth feddygol broffesiynol a mesurau ataliol, a rhoi sylw i ymarferion cof dyddiol i sicrhau ein hiechyd corfforol a'n gwaith effeithlon. Gellir gweld bod angen i ni wella cof, a gall Cistanche wella cof yn sylweddol oherwydd gall hefyd reoleiddio cydbwysedd niwrodrosglwyddyddion, megis cynyddu lefelau acetylcholine a ffactorau twf, sy'n bwysig iawn ar gyfer cof a dysgu. Yn ogystal, gall Cistanche hefyd wella llif y gwaed a hyrwyddo darpariaeth ocsigen, a all sicrhau bod yr ymennydd yn cael digon o faeth ac egni, a thrwy hynny wella bywiogrwydd a dygnwch yr ymennydd.

Cliciwch gwybod ffyrdd i wella gweithrediad yr ymennydd

Roedd y gwahaniaethau hyn yn fwyaf amlwg yn y medulla oblongata, y mwyaf caudalarea. Mewn cyferbyniad, gwelwyd y briwiau ysgafnaf yn y cortecs blaen, y mwyaf rostralarea. Mae'r patrwm dilyniannol hwn yn cyd-fynd â llwybr niwro-ymlediad prion a lledaenu ledled y CNS, gan ddechrau ar safleoedd mynediad ym madruddyn y cefn ac obex ac yn y pen draw yn cyrraedd y cortecs blaen [1,5,51].

Yn annisgwyl, o ystyried eu hagosrwydd anatomegol, gwelsom ostyngiad aruthrol mewn dyddodiad a gwagio PrPSc, a dirywiad sylweddol mewn astrogliosis, wrth symud o'r thalamws i'r hipocampws, heb ddilyn dilyniant caudo-rostral graddol y patholeg.

Gwelwyd microgliamorffoleg benodol o'r enw rod microglia yn agosrwydd cellneuronau pyramidaidd yn CA3 ond roedd yn absennol o bob un o'r rhanbarthau niwroanatomig eraill a astudiwyd.

Yn ôl ein gwybodaeth, nid yw'r proffil microglial hwn wedi bod yn gysylltiedig â niwro-fflamiad a sbardunwyd gan prionau hyd yn hyn, er bod astudiaeth ddiweddar wedi nodi presenoldeb microglia siâp gwialen yn serebelwm cleifion dynol â CJD [52].

Er mai ychydig a astudiwyd ers y disgrifiadau cyntaf yn y 1900au, mae gwialen microglia wedi'u hadrodd yn ddiweddar mewn anhwylderau niwrolegol megis epilepsi, dementia corff Lewy, clefyd Huntington, ac AD, yn benodol mewn ardaloedd sydd wedi'u difrodi'n gymedrol o'r cortecs cerebral a hippocampus [40,41,53]. Nid yw mynegiant thephenoteipig a swyddogaethau microglia gwialen yn glir eto.

Fodd bynnag, mae'r ffaith bod y nodwedd morffolegol hon fel arfer yn cyd-fynd â phresenoldeb elfennau niwronaidd sydd wedi'u difrodi neu sy'n agored i niwed yn awgrymu rôl niwro-amddiffynnol [42,54,55].

Ni chredir bod gwialen microglia yn gysylltiedig â briwiau difrifol, gan fod disgwyl y dilyniant tuag at forffoleg ameboid yn yr amodau hyn [56]. Gall presenoldeb rodmicroglia yn hippocampus defaid sydd wedi'u heintio â chlefyd y crafu, ond nid mewn rhanbarthau eraill yr ymennydd, fod yn arwydd o amgylchedd niwro-amddiffynnol, mewn cytundeb da â'r golled niwronau gyfyngedig a welwyd yn y maes hwn.

Mae ein dadansoddiad o fynegiant TLR yn datgelu cydberthynas uniongyrchol rhwng difrifoldeb y briw a gorfynegiant genynnau TLR sy'n cyd-fynd â'r dilyniant caudo-rostral a grybwyllwyd uchod o niwropatholeg prion.

I'r gwrthwyneb, roedd TLR4 yn yr un modd wedi'i or-fynegi ym mhob maes, waeth beth fo difrifoldeb y briw. Gall gorfynegiant TLR4 mewn meysydd o niwed niwronaidd mwynach (hy, yr hippocampus a'r cortecs blaen) adlewyrchu rôl anewro-amddiffynnol, fel y disgrifiwyd yn flaenorol ar gyfer celloedd ffagosytaidd megis macrophages a microglia [23,57]. Mae upregulation TLR7 wedi'i adrodd yn flaenorol mewn modelau llygoden o clefyd y clefyd a chleifion dynol [22,26,31].

Dim ond yn y medulla oblongata y gwnaethom arsylwi ar uwch-reoleiddio TLR7, yr ardal a ddifrodwyd fwyaf lle canfuwyd y lefelau uchaf o sbyngiosis a dyddodiad PrPSc.

Mae marwolaeth niwronaidd trwy apoptosis wedi'i gysylltu'n flaenorol ag ysgogiad TLR7 [58,59], ac mae ei orfynegiant yn y medulla oblongatamay yn gysylltiedig â'r mecanwaith hwn [60]. Er nad yw rôl TLR1 mewn clefydau niwroddirywiol yn glir eto, mae cyfranogiad TLR2 mewn actifadu microglial wedi'i ddangos yn gynyddol mewn sglerosis ochrol amyotroffig, MS, ac AD [61,62].

Er nad yw rôl clefydau prion TLR2in yn cael ei ddeall yn llawn, mae effeithiau buddiol wedi'u cynnig: mae amser goroesi yn cael ei leihau mewn llygod nad ydynt yn mynegi TLR2 yn dilyn brechiad mewncerebral â chrafu [22].

Gall gorfynegiant TLR2 a MyD88 hefyd fod yn arwydd o ffenoteip proinflammatorymicroglia, a allai esbonio'r cynnydd mewn TNF- ac IL-6 a welsom yn y thalamws [8,63].

Yn ddiddorol, mae arbrofion sy'n defnyddio celloedd EOC 13.31, llinell gell llygoden anfarwoledig tebyg imicroglia, wedi dangos dadreoleiddio'r llwybr ymateb llidiol mewn ymateb i actifadu TLR2 ac wedi awgrymu cysylltiad rhwng mynegiant TLR2 a chroniad microglia mewn cyflwr nad yw'n optimaidd ar gyfer ffagocytosis [26] .

Felly, mae gorfynegiant TLR2 yn y medulla oblongata a'r thalamws, yr ardaloedd sydd wedi'u difrodi fwyaf lle canfuwyd lefelau gormodol o ficroglia phagocytig hefyd, yn awgrymu y gallai clirio PrPSc yn gamweithredol arwain at groniad parhaus o PrPSc a difrod niwronaidd [9,17].

Mae ein canfyddiadau yn yr hipocampws o ddefaid sydd wedi’u heintio â chlefyd y crafu yn datgelu patrwm gwrthgyferbyniol o’i gymharu ag ardaloedd ymennydd eraill a ddadansoddwyd, gyda’r is-reoleiddio TLR1, TLR2, a MyD88 a dim newidiadau cytocinau.

Gall hyn ddangos bod microglia yn ymateb yn wahanol yn yr hippocampus; yn wir, dangoswyd bod diffyg TLR2 mewn diwylliannau celloedd cynraddmicroglial, o lygod newyddenedigol (0-3 diwrnod oed) ac wedi'i ysgogi â PrP neurotoxicpeptide106-126, yn symud actifadu microglial o ffenoteip niwrowenwynig i niwro-amddiffynnol [63 ].

Fodd bynnag, cwestiynwyd perthnasedd y peptid PrP106-126 mewn patholeg prion [64]. Mae CD36 yn fath gwahanol o dderbynnydd adnabod patrwm, sy'n gallu adnabod ligandau sy'n deillio mewnendogenaidd fel peptidau sy'n ffurfio amyloid, sydd wedi sefydlu rolau yn y nifer sy'n derbyn y cydrannau hynny mewn endocytig [65,66]. Mae'r derbynnydd hwn wedi'i gysylltu â statws microglial proinflammatory [67].

In vitro, mae ysgogi celloedd BV-2, math o gell microglial anfarwoledig, gyda PrP106-126 yn arwain at ddadreoleiddio CD36, cynyddu cytocinau proinflammatory a chynhyrchiad iNOS a NO [68,69].

Yn ogystal, mae adnabod peptid -amyloid gan CD36 yn sbarduno cydosod CD36 cymhleth heterotrimeric newydd36-TLR4-TLR6 sy'n actifadu'r ymateb imiwn cynhenid ​​[70,71].

Yn ein hastudiaeth, dangosodd pob rhanbarth uwch-reoleiddio sylweddol o CD36 ac eithrio'r hippocampus. Mae uwch-reoleiddio CD36, TLR4, a TLR6 yn yr ardaloedd sydd wedi'u difrodi fwyaf, y medulla oblongata ac obex, yn awgrymu bod y triawd hwn yn ymwneud â sbarduno statws microglial pro-llidiol mewn ymateb i haint prion.

I'r gwrthwyneb, mae absenoldeb gor-expression CD36 a TLR6 yn yr hippocampus yn awgrymu nad yw'r heterotrimer hwn yn cael ei ffurfio, sy'n arwydd eto o amgylchedd anewroprotective yn y rhanbarth ymennydd hwn.

Er y gallai tropism celloedd straen-benodol prion bennu patrwm microgliosis ac astrogliosis, mae canfyddiadau diweddar yn awgrymu bod y ddau adwaith yn cael eu dylanwadu'n bennaf gan y rhanbarth ymennydd [18,72].

Nid yw microglia nac astroglia yn ymateb yn unffurf ar draws y CNS, a gallai'r ymateb rhanbarth-benodol hwn arwain at fregusrwydd detholus rhai rhanbarthau ymennydd mewn clefydau prion [16,18].

Yn hyn o beth, mae wedi'i ragdybio bod ymateb llidiol microglia i haint prion yn cael ei reoleiddio gan sialylation PrPSc [14,73-75] a bod sialylation PrPSc yn dibynnu ar ranbarth yr ymennydd [18]. Yn benodol, canfyddir lefel uwch o sialylation PrPSc yn yr hippocampus a'r cortecs nag yn y thalamws a'r brainstem, gan awgrymu rôl bosibl yn y bregusrwydd detholus o'r rhanbarthau ymennydd hyn [18,73,75].

Mae’n bosibl bod y lefel uchel o siayleiddiad PrPSc yn yr hippocampus yn gysylltiedig ag atgynhyrchu prion arafach, gan arwain at actifadu microglial nodedig a achosir gan prion yn y rhanbarth hwn, sy’n gyson â thueddiad llai y rhanbarth hwn a awgrymir gan ein canfyddiadau.

Yn ddiddorol, mae canfyddiadau blaenorol yn awgrymu y gallai'r hippocampus gael ei amddiffyn rhag niwro-wenwynedd mewn haint CJD naturiol [76,77], ac mae astudiaethau niwropatholegol manwl o achosion CJD wedi nodi briwiau mwynach yn yr hippocampus nag mewn rhanbarthau ymennydd eraill [76].

Yn benodol, mae'n ymddangos bod yr archicortex, sy'n cynnwys yr hippocampus yn bennaf, yn gymharol arbed o'i gymharu â rhanbarthau cortigol eraill yn CJD [77]. Mae'r ymwneud bach hwn â hippocampal a ddisgrifir yn CJD naturiol yn cytuno â'r canfyddiadau mewn defaid sydd wedi'u heintio'n naturiol â chlefyd y crafu.

Yn ddiddorol, mae'r amddiffyniad rhannol hwn yn erbyn o leiaf dau glefyd prion naturiol yn digwydd yn yr hippocampus, sef rhanbarth hynaf y cortecs cerebral yn ffylogenetig ac sy'n cynnwys y math mwyaf sylfaenol o feinwe cortical.

Bydd angen astudiaethau pellach i archwilio perthnasedd y gydberthynas hon. I grynhoi, mae ein canlyniadau'n datgelu niwropatholeg arbennig o ysgafn yn hippocampus defaid naturiol sydd wedi'u heintio â chlefyd y crafu, a nodweddir gan lefelau is o sbyngiosis, PrPScdeposition, ac astrogliosis na'r disgwyl o ystyried y caudal-i. - lledaeniad rostral o sgrabelydredd.

Ar ben hynny, mae presenoldeb morffoleg microglial unigryw, rod microglia, a all chwarae rôl niwro-amddiffynnol [54], ynghyd â phroffil mynegiant genynnau derbynnydd adnabod patrwm penodol (genynnau TLR a CD36), yn gwahaniaethu ymhellach y rhanbarth ymennydd hwn oddi wrth y niwroanatomig arall. rhanbarthau mewn defaid naturiol sydd wedi'u heintio â chlefyd y crafu.

Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu rhywfaint o niwroamddiffyniad yn erbyn heintiad prion naturiol yn yrhippocampus sy'n haeddu ymchwiliad pellach. niwro-llid.

Gall torri ar draws y cylch dieflig hwn trwy dargedu actifadu microglia gan ddefnyddio atalyddion TLR penodol ar gam afiechyd penodol fod yn ddull addawol o gyfyngu ar niwro-lidiad pellach. Mae ein canfyddiadau yn tynnu sylw at ddadreoleiddio TLR2 fel targed posibl ar gyfer dull o'r fath, gan y gallai hyn arwain at newid mewn microglia o ffenoteip niwrowenwynig i anewroprotective [63].

Yn olaf, er bod cynnydd mawr wedi'i wneud wrth nodweddu amrywiaeth y ffenoteipiau glial gan ddefnyddio modelau llygoden o glefydau niwroddirywiol, mae p'un a yw modelau llygoden yn adlewyrchu agweddau allweddol ar glefydau prion yn ffyddiog yn destun dadl [78,79].

Roedd ein canlyniadau yn y model trawsenynnol tg338 yn atgynhyrchu'r arwyddion patholegol cyffredin o haint prion, gan gynnwys dyddodiad PrPSc wedi'i farcio, sbyngiosis niwropil, astrogliosis, a microgliosis.

Fodd bynnag, roedd llygod heintiedig yn dangos gorfynegiant sylweddol o TLR1 a TLR2 a thuedd at orfynegiant TLR7. Er bod dadreoleiddio'r genynnau hyn wedi'i ddisgrifio'n flaenorol mewn modelau llygoden eraill sydd wedi'u heintio â chlefyd y crafu [22,26], mae'r patrwm hwn yn cyferbynnu â'n canfyddiadau yn ymennydd y ddafad. Yn rhyfeddol, yn ymennydd y llygoden, ni welsom unrhyw newidiadau yn y mynegiant o TLR4, y genyn y gwelwyd y newidiadau mynegiant mwyaf ar ei gyfer yn y samplau defaid.

Gall y canfyddiadau gwrthgyferbyniol hyn fod yn ganlyniad y gwahanol lwybrau haint a/neu lefelau mynegiant protein prion mewn llygod tg338 [80,81]. Serch hynny, mae ein canlyniadau yn y pen draw yn dangos nad yw mewn-serebralinoculiad clefyd y crafu mewn llygod mawr tg338 yn atgynhyrchu'r ymateb imiwn a welir mewn haint clefyd y crafu naturiol.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Defaid wedi'u Heintio a Rheoli Clefyd y Crafu

Cynhwyswyd un ar hugain o ddefaid benywaidd Rasa Aragonesa (rhwng 2 a 6 oed) yn yr astudiaeth bresennol. Cafodd pob un eu genoteipio ar gyfer polymorphisms PRNP, fel yr adroddwyd yn flaenorol [82], a chanfuwyd eu bod yn arddangos genoteip ARQ / ARQ. Dewiswyd anifeiliaid rheoli (n=8) o ddiadell lle nad oedd unrhyw achosion o glefyd y crafu wedi'u hadrodd.

Cafwyd anifeiliaid heintiedig â chlefyd y crafu(n=13) o heidiau yr effeithiwyd arnynt gan glefyd y crafu a chawsant eu diagnosio gan imiwn-histocemeg (IHC) o fiopsïau mwcosa rhefrol. Cadarnhawyd haint gan imiwno-ganfodiad post-mortem o PrPSc yn yr obex yn dilyn meini prawf cyhoeddedig [83].

Cafodd yr anifeiliaid eu gwaedu gan orddos mewnwythiennol o farbitwradau a exsanguination.

Ar adeg ewthanasia, roedd yr holl ddefaid a oedd wedi’u heintio â chlefyd y crafu yn dangos arwyddion clinigol o ddifrifoldeb amrywiol: roedd rhai anifeiliaid yn dangos arwyddion cychwynnol fel pruritus y cefn a’r ochrau ar ôl ysgogiad digidol a gostyngiad ysgafn yng nghyflwr y corff, tra bod eraill yn arddangos arwyddion clinigol datblygedig fel crafu’r corff yn ddigymell. gwraidd cynffon, ardal meingefnol, ac aelodau, arwyddion niwrolegol gan gynnwys atacsia a chryndodau pen, a malu dannedd, colli gwlân, a cholli pwysau dwys [84].

4.2. Haint Llygoden Tg338

I werthuso mynegiadau genynnau TLR yn ymennydd model murine o glefyd y crafu, llygod tg338 deg wythnos oed (n=8) (yn gorfynegi'r VRQ/VRQ PrPC defig 8- i 10-blygu [ 85]) wedi'u brechu â phwll ymennydd o ddafad naturiol Rasa Aragonesa a oedd wedi'i heintio â chlefyd y crafu a aberthwyd ar y cam clinigol.

Cafodd y llygod eu brechu â 20 uL o'r inocwlwm clefyd y crafu (wedi'i wanhau 2% w/v yn PBS) i'r hemisffer ymenyddol dde o dan anesthesia isoflurane. Perfformiwyd pigiadau intracerebralin gan ddefnyddio chwistrell 50 µL a nodwydd 25G. Ar ôl brechu, rhoddwyd pigiad isgroenol o buprenorphine (0.3 mg/kg) i induceanalgesia i'r themice.

Fel rheolyddion, cafodd llygod tg338 (n=8) eu brechu â defaid homogenad ymennydd o glefyd y crafu-negyddol yn dilyn yr un driniaeth a ddisgrifiwyd uchod. Roedd y llygod yn cael eu monitro ar gyfer datblygu arwyddion clinigol ac yn cael eu lladd gan ddadleoliad ceg y groth pan ymddangosodd arwyddion terfynol afiechyd fel atacsia difrifol ac anallu i fwydo.

Dangosodd llygod a heintiwyd â'r brechiad positif i glefyd y crafu amser goroesi cymedrig o 187 ± 26 dpi.

4.3. Casgliad Meinwe

Casglwyd samplau o'r CNS a'u rhannu'n ddau hanner; roedd un wedi'i osod mewn fformalin clustog niwtral 10% ar gyfer dadansoddiad histopatholegol ac imiwn-histocemegol, a'r llall wedi'i rewi a'i gynnal yn uniongyrchol ar −80 ◦C ar gyfer dadansoddi protein neu sefydlogi yn RNAlaterTM Solution (InvitrogenTM, Waltham, MA, UDA) ar gyfer echdynnu RNA ac yna'i rewi a'i storio ar −80 ◦C.

4.4. Dilyniannu PRNP

Echdynnwyd DNA o samplau gwaed gyda phecyn Echdynnu DNA Meinwe Speedtools (Biotools, Madrid, Sbaen) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Gwnaed ymhelaethu a dilyniannu PCR fel y disgrifiwyd yn flaenorol [82].

4.5. Imiwnohistocemeg

Roedd meinweoedd wedi'u gosod yn fformalin yn cael eu prosesu yn unol â gweithdrefnau histopatholegol safonol. Roedd darnau meinwe wedi'u gwreiddio â pharaffin, wedi'u torri'n adrannau 4 µm o drwch, a'u staenio â hematocsilin-eosin (AU) ar gyfer gwerthuso gwagio a sbyngiosis niwropil.

Perfformiwyd IHC ar gyfer canfod PrPSc gan ddefnyddio gwrthgorff sylfaenol monoclonaidd y llygoden L42 mewn defaid (gwanhad o 1:500 ar dymheredd ystafell am 30 munud) (R-Biopharm, Darmstadt, yr Almaen) a gwrthgorff polyclonaidd cwningen R486 mewn llygod (1: 8000 o wanhau, dros nos yn 4 ◦C)(R. Jackman, heb ei gyhoeddi) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [86,87].

Roedd adrannau hefyd yn destun gwrthimiwnedd confensiynol ar gyfer y marciwr astrocyte protein asidig ffibrilaidd glial (GFAP)(1:500; Dako, Glostrup, Denmarc), a'r marciwr microglia moleciwl addasydd ïoneiddio calsiwm-rhwymo 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond). , VA, UDA), yn ôl protocolau cyhoeddedig [88]. Perfformiwyd yr holl werthusiadau histolegol a IHC gan ddau batholegydd milfeddygol wedi'u dallu i'r data clinigol.

Cynhaliwyd asesiadau o sbyngiosis a dwyster staenio PrPSc yn lled-feintiol ac fe'u haddaswyd gan ddilyn y meini prawf a ddisgrifiwyd mewn astudiaethau blaenorol: sgoriwyd gwagio'r niwropil a'r perikarya o 0 (absennol) i 5 (niferus iawn a chydlifol) [51], cafodd y signal PrPSc ei feintioli ar sail maint yr imiwno-leiddiad o 0 (dim labelu) i 5 (labelu unffurf dwys) fel yr adroddwyd yn flaenorol [89], a sgoriwyd graddau imiwn-labelu GFAP ac Iba1 ar raddfa yn amrywio o {{ 8}} i 5 (0=staenio gwan; 5=imiwn-labelu sylweddol drwyddo draw) fel y disgrifiwyd [88]. Gwerthuswyd pedwar rhanbarth yr ymennydd: cortecs blaen (Fc) thalamws (Th), ffurfiad hippocampal (Hc), a medulla oblongata (Mo), a dadansoddwyd pob ardal yn fyd-eang ar gyfer y sgorio a'i chynrychioli'n graffigol fel gwall cymedrig ± safonol.

4.6. Blot Gorllewinol

Roedd 100 mg o feinwe ymennydd pob ardal ymennydd (Fc, Th, Hc, a Mo) o 13 o ddefaid sydd wedi'u heintio â chlefyd y crafu, 8 ag arwyddion clinigol datblygedig a 5 ag arwyddion clinigol cychwynnol, wedi'u homogeneiddio mewn 1 mL o glustogiad lysis.

Cafodd hemienseffalonau'r 8 a heintiwyd ac 8 llygod rheoli eu homogeneiddio ar 10% (w/v) mewn byffer lysis. Roedd samplau meinwe yn diwbiau ingrindio homogenaidd (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) gan ddefnyddio homogenizer TeSeEPrecess 48 TM (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA), a mesurwyd y crynodiad protein gan ddefnyddio pecyn Assay Protein PierceTM BCA (ThermoScientificTM, Waltham, MA, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Ar gyfer y dadansoddiad PrPres, cafodd symiau protein cyfartal o homogenadau meinwe eu deor am 10 munud ar 37 ◦C gyda hydoddiant proteinase K, fel y disgrifiwyd yn flaenorol [90].

O ganlyniad, bu samplau yn destun electrofforesis mewn 12% Maen Prawf TM XT Bis-Tris Gel Protein (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) a'u trosglwyddo i bilenni PVDF a gafodd eu rhwystro am 1 h gyda 2% o laeth sych di-fraster yn TBST (Tris-). halwynog byffer gyda 0.1% Tween20).

Ar gyfer imiwnoblotio, deorwyd y pilenni dros nos ar 4 ◦C gyda gwrthgorff Sha31primary (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Ffrainc) ar grynodiad o 1 µg/mL wedi'i ddilyn gan ddeor 1 h ar dymheredd ystafell (RT) gyda marchruddygl peroxidase- gwrthgorff eilaidd gwrth-lygoden IgG cyfun (1:5000) (Biotechnoleg Santa Cruz, Dallas, TX, UDA).

Canfuwyd imiwn-actifedd gan ddefnyddio'r swbstrad cemiluminescent ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, yr Almaen). .

Llwythwyd deugain microgram o gyfanswm y protein fesul ffynnon, wedi'i redeg mewn 7.5% Maen Prawf TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA), a'i drosglwyddo i bilenni PVDF, a gafodd eu rhwystro wedyn am 2 h gyda albwmin serwm buchol 4%. (BSA)(Merck, Darmstadt, yr Almaen) yn TBST yn RT. Deorwyd y pilenni dros nos ar 4 ◦C gyda gwrthgorff gwrth-TLR4 polyclonal cwningen (Novus Biological, Minneapolis, MN, UDA) ar grynodiad o 0.5 µg/mL, ac yna eu golchi a'u deor ag IgG gwrth-rabbit gafr ( H + L) HRP gwrthgorff eilaidd (ThermoScientificTM, Waltham, MA, UDA) am 1:20,000 am 1 awr yn RT.

Delweddwyd blotiau fel y disgrifiwyd uchod. Nesaf, tynnwyd y pilenni â byffer RestoreTM Western Blot Stripping (ThermoScientificTM, Waltham, MA, UDA) am 15 munud ar 37 ◦C, ei olchi a'i rwystro eto.

Yna, cafodd y pilenni eu deori dros nos ar 4 ◦C gyda gwrthgorff cynradd monoclonaidd llygoden -actin (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, UDA) am 1:1000, eu golchi, a'u deor â gwrthgorff eilaidd gwrth-lygoden m-IgGкBP-HRP (Santa Cruz Biotechnoleg, Dallas, TX, UDA) am 1 h. Ar ôl golchi, datblygwyd y blotiau fel y disgrifir uchod.

Cynhaliwyd densitometryddion gyda meddalwedd ImageJ a normaleiddiwyd y gwerthoedd gan ddefnyddio -actin. Cynrychiolwyd y gwerthoedd normaleiddio gyda GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, UDA).

Perfformiwyd y dadansoddiadau ystadegol i gymharu'r grwpiau heintiedig a rheoli gyda phrawf-t Myfyriwr, a phenderfynwyd cydraddoldeb yr amrywiannau gan Levene'stest gan ddefnyddio meddalwedd SPSS (SPSS Statistics for Windows, Fersiwn 17.0, Chicago, IL, UDA). Ystyriwyd bod gwahaniaethau rhwng grwpiau yn ystadegol arwyddocaol ar * t<0.05.

4.7. Echdynnu RNA, Synthesis cDNA, a Mynegiant Genynnau

Echdynnwyd RNA cyfanswm defaid o 90 mg o samplau meinwe o'r cortecs blaen, thalamws, hippocampus, a medulla oblongata. Rhannwyd ymennydd y llygoden ar y llinell ganol a thynnwyd cyfanswm yr RNA ohono<90 mg obtained from the thalamic area. 

Roedd meinweoedd yn cael eu homogeneiddio gan ddefnyddio homogenizer TeSeEPrecess 48TM (Bio-Rad) gyda Kit Mini LipidTissue RNeasy (Qiagen, Hilden, yr Almaen) wedi'i gyfuno â TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, UDA) i gael gwared ar halogiad genomig DNA posibl. Pennwyd crynodiad RNA yn sbectroffotometrig gyda sbectroffotomedr NanoDrop (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, UDA), ac ar gyfer pob sampl, dadansoddwyd cymarebau 260/280 a 260/230 i wirio purdeb y sampl.

Cafodd un microgram o DNA cyflenwol (cDNA) ei syntheseiddio gan ddefnyddio qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn ogystal, aseswyd effeithiolrwydd y driniaethDNase mewn samplau RT-negyddol. Ar ôl trawsgrifio o chwith, roedd yr un swp o cDNA gwanedig yn destun qPCR i chwyddo TLRs.

Dewiswyd dau enyn cadw tŷ (HK) a ddefnyddir yn gyffredin i normaleiddio mynegiant y genynnau targed: glyseraldehyde-3-ffosffad dehydrogenase (GAPDH) acactin-beta (ACT) [91]. Dilyswyd sefydlogrwydd y genyn HK hwn o dan ein hamodau arbrofol. Pennwyd y mynegiant RNA negesydd (mRNA) gan qPCR ar gyfer 1 i 10 o enynnau TLR defaid, 1 i 9 genyn TLR murine, a'r genyn MyD88 ar gyfer y ddwy rywogaeth.

Astudiwyd cytocinau dauprolidiol (TNF- ac IL-6) a dau sytocinau gwrthlidiol (IL-10 a TGF-) yn y thalamws defaid a hippocampus hefyd. Roedd dilyniannau preimio ac arbedion effeithlonrwydd wedi'u cyhoeddi'n flaenorol neu wedi'u dylunio gan ddefnyddio'r offeryn Primer3Plus [92] (Tabl 2).

Fe wnaethom wirio effeithlonrwydd pob genyn gan gynhyrchu cromlin safonol trwy ymhelaethu ar wanediadau cyfresol 1:2 o reolaeth cDNA ac yna gwirio am linelloldeb rhwng y crynodiad templed cychwynnol a gwerthoedd trothwy cylch (Ct). Roedd pob genyn yn dangos cyfernod cydberthynas rhwng 0.9 a 0.99, gyda gwerth llethr y cromliniau safonol yn yr ystodau o -3.2 i −3.5 ac effeithlonrwydd qPCR o 90–110%.

Cafodd yr adweithiau qPCR eu rhedeg gan ddefnyddio System PCR RealTime QuantStudioTM 5 Cymhwysol BiosystemsTM, 96-yn dda gydag amodau ymhelaethu cyffredinol: cam dadnatureiddio actifadu cychwynnol acDNA o 10 munud ar 95 ◦C, ac yna 40 cylch o 3 s ar 95 ◦C a 30 yn eistedd 60 ◦C.

Er mwyn nodi presenoldeb amplicons PCR amhenodol neu lefelau uchel o preimio, gwnaethom berfformio protocol cromlin daduniad ar ôl pob adwaith qPCR. Dadansoddwyd pob sampl yn driphlyg mewn cyfanswm cyfaint adwaith o 10 µL, yn cynnwys 15 ng o cDNA, 5 µL Cymysgedd Meistr Gwyrdd Cyflym SYBR (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, UDA), a'r swm gofynnol o anfon ymlaen a gwrthdroi paent preimio (Tabl 2).

Ychwanegwyd dŵr di-niwcleas i gyfaint terfynol o 10 µL. Penderfynwyd ar lefelau mynegiant genynnau gan ddefnyddio'r dull Ct cymharol. Cynrychiolwyd y canlyniadau fel newid plyg a graddiwyd y gwahaniaethau mynegiant genynnau o gymharu â lefel gymedrig y grŵp rheoli i 1.

4.8. Dadansoddi Data ac Ystadegau

Profwyd yr holl ddata meintiol a gasglwyd am normalrwydd gyda'r Shapiro-Wilk Wtest. Gwerthuswyd gwahaniaethau histolegol ac imiwn-histocemegol rhwng y grwpiau heintiedig a rheoli gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr neu brawf Mann-Whitney U yn dibynnu ar y dosbarthiad data parametrig neu anparametrig.

Penderfynwyd ar wahaniaethau ystadegol rhwng y pedwar rhanbarth ymennydd gwahanol mewn defaid heintiedig clefyd y crafu gan ddefnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ac yna prawf post hoc Bonferroni neu brawf Kruskal-Wallis, yn dibynnu ar y dosbarthiad data parametrig neu nonparametrig. Cynhaliwyd dadansoddiadau ystadegol o'r data qPCR o'r gwerthoedd ∆Ct cymedrig ar gyfer pob genyn.

Ar gyfer y gymhariaeth ystadegol o grwpiau heintiedig a rheoli, cynhaliwyd prawf-t Myfyriwr neu brawf Mann-Whitney U yn dibynnu ar ddosraniad normal pob genyn, a phrawf Levene oedd yn pennu cydraddoldeb yr amrywiannau. Ystyriwyd bod gwahaniaethau mewn mynegiant yn arwyddocaol yn p < 0.05.

Defnyddiwyd y nodiannau canlynol i ddynodi gwerthoedd-p yn y ffigurau: * p < 0.05; ** p Llai na neu'n hafal i 0.01; # p < 0.1. Defnyddiwyd meddalwedd SPSS (Ystadegau SPSS ar gyfer Windows, Fersiwn 17.0, Chicago, IL, UDA) ar gyfer y dadansoddiadau ystadegol. Cynhyrchwyd graffiau gyda GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, UDA) ac mae'r data a ddangosir yn y ffigurau yn cynrychioli cymedr a gwall safonol y cymedr (cymedr ± SEM).

5. Casgliadau

Hyd y gwyddom, yr astudiaeth bresennol yw'r gyntaf i ddisgrifio lefelau mynegiant TLRgenes mewn rhanbarthau ymennydd gwahanol o ddefaid naturiol sydd wedi'u heintio â chlefyd y crafu a llygod mawr tg338 sydd wedi'u heintio'n arbrofol â chlefyd y crafu.

Mae ein hastudiaeth yn dangos yn glir bod TLRs, ac yn enwedig TLR4 mewn defaid a TLR1 a TLR2 mewn llygod, yn ymwneud â phathogenesis clefyd y crafu. a niwropatholeg ysgafn a welir yn yr hippocampus, yn awgrymu ymateb imiwn rhanbarth-benodol yr ymennydd mewn haint crafu naturiol.

Fodd bynnag, bydd angen astudiaethau pellach i nodweddu mynegiant TLR mewn microglia, astroglia, a niwronau mewn haint clefyd y crafu er mwyn deall union gyfraniad pob math o gell i niwro-lid. At hynny, nid yw wedi'i benderfynu eto a yw actifadu TLR yn ymateb uniongyrchol i wenwyndra prion neu'n digwydd yn eilradd i fecanweithiau llidiol eraill.

Mae TLRs yn darged addawol ar gyfer dulliau therapiwtig o atal clefydau, ac felly bydd angen gwell dealltwriaeth o ymatebion niwrolidiol a reoleiddir gan TLR er mwyn sicrhau datblygiadau pellach yn y maes hwn.

Deunyddiau Atodol: Mae'r canlynol ar gael ar-lein ynhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1 .

Cyfraniadau Awdur: Cysyniadoli, ymchwil, a churadu data, MCG ac LMC; ysgrifennu-paratoi drafft gwreiddiol, MG-M., MCG, ac LMC; methodoleg arbrofol, MG-M.; ysgrifennu-adolygu a golygu, MG-M., MCG, LMC, ac AO; methodoleg in vivo, MB; caffael cyllid, RB, a JJB; methodoleg moleciwlaidd, BS-P.; goruchwyliaeth, MCG, a JJB Mae pob awdur wedi darllen a chytuno i fersiwn gyhoeddedig y llawysgrif.

Ariannu: Ariannwyd yr ymchwil hwn gan "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Llywodraeth Aragon) trwy'r prosiect "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Datganiad y Bwrdd Adolygu Sefydliadol: Roedd yr holl weithdrefnau sy'n ymwneud ag anifeiliaid yn cydymffurfio â'r canllawiau a gynhwysir yn y Gyfraith Sbaen ar gyfer Diogelu Anifeiliaid RD53/2013 a Chyfarwyddeb yr Undeb Ewropeaidd 2010/63 ar amddiffyn anifeiliaid a ddefnyddir at ddibenion arbrofol. Cymeradwywyd y protocol gan Bwyllgor Moeseg Arbrofion Anifeiliaid Prifysgol Zaragoza (Rhif Trwydded: PI38/159 Hydref 2015 a PI19/14 11 Ebrill 2014).

Datganiad Cydsyniad Gwybodus: Amherthnasol.

Datganiad Argaeledd Data: Mae’r data a gyflwynir yn yr astudiaeth hon ar gael yn nhestun yr erthygl, y ffigurau, a’r deunydd atodol.

Diolchiadau: Diolchwn i Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) a VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) am ddarparu mor garedig â’r llygod tg338 a ddefnyddir ar gyfer yr arbrofion hyn.

Gwrthdaro Buddiannau: Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw wrthdaro buddiannau. Nid oedd gan y cyllidwyr unrhyw ran yn nyluniad yr astudiaeth; wrth gasglu, dadansoddi neu ddehongli data; yn ysgrifen y llawysgrif, neu yn y penderfyniad i gyhoeddi y canlyniadau. Mae'r lluniau a'r ffigurau yn y llawysgrif hon yn ddata gwreiddiol.

Cyfeiriadau

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J. ; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Cronni PrP(Sc) yn gynnar mewn lymffoid sy'n gysylltiedig â'r coludd a meinweoedd nerfol defaid sy'n dueddol o gael y clefyd o ddiadell Romanov â chrafu naturiol. J. Gen. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, clefydau SB Prion a'r argyfwng BSE. Gwyddoniaeth 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.A.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Mae lledaeniad cynnar ofcrapi o'r llwybr gastroberfeddol i'r system nerfol ganolog yn cynnwys ffibrau awtonomig o'r nerfau splanchnig a fagws.J. Firol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions a'u taith angheuol i'r ymennydd. Nat. Microbiol Parch. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A. ; Wemheuer, WE; Brenig, B. ; Bratberg, B. ; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc patrymau taenu yn ymennydd defaid yn gysylltiedig â gwahanol fathau o prion. milfeddyg. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Tystiolaeth ar gyfer ymateb llidiol cynnar yn y system nerfol ganolog o lygod â chlefyd y crafu. Niwrowyddoniaeth 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B. ; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandiwr, S.; Wadsworth, JD; et al. Mae niwropatholeg Prion yn dilyn cronni isoformau protein prion bob yn ail ar ôl i'r titerha heintio gyrraedd uchafbwynt. Nat. Cymmun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K. ; McColl, BW; Cancellotti, E.; Rhyddfreiniwr, TC; Manson, JC Diffinio Ymateb Microglia Yn ystod Cwrs Amser Niwroddirywiad Cronig. J. Firol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia mewn clefydau prion. J. Clin. Ymchwilio. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J. ; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Swyddogaeth Microglia Mewn Clefydau Prion: Paradeim o Amrywiaeth Swyddogaethol. Neurosci Heneiddio. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Heterogenedd yn nosbarthiad a morffoleg microglia yn ymennydd arferol y llygoden oedolion. Niwrowyddoniaeth 1990, 39, 151–170. [CrossRef]

12. Matyash, V. ; Kettenmann, H. Heterogeneity mewn morffoleg astrocyte a ffisioleg. Ymennydd Res. Dat. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com