Mae Echinacoside yn Gwrthdroi Ailfodelu Myocardaidd Ac yn Gwella Gweithrediad y Galon

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Haniaethol

Mae ailfodelu myocardaidd yn sail patholegol bwysig o HF, mae straen ocsideiddiol mitocondriaidd yn hyrwyddwr hypertroffedd myocardaidd, ffibrosis, a apoptosis. ECH yw prif elfen weithredol meddyginiaeth draddodiadol Tsieineaidd Cistanches Herba, mae digon o astudiaethau'n dangos bod ganddo allu gwrthocsidiol cryf mewn celloedd nerfol a thiwmorau, mae'n atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd, yn amddiffyn swyddogaeth mitocondriaidd, ond mae'r mecanwaith penodol yn aneglur. Mae SIRT1/FOXO3a/MnSOD yn echel gwrthocsidiol bwysig, mae astudiaeth yn canfod bod ECH yn clymu'n cofalent i SIRT1 fel ligand ac yn uwch-reoleiddio mynegiant SIRT1 yng nghelloedd yr ymennydd. Rydym yn rhagdybio y gallai ECH wrthdroi ailfodelu myocardaidd a gwella swyddogaeth y galon HF trwy reoleiddio echel signalau SIRT1/FOXO3a/MnSOD ac atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd mewn cardiomyocytes. Yma, rydym yn gyntaf yn cymell model cellog o straen ocsideiddiol gan ISO gyda chelloedd AC-16 ac yn rhag-drin ag ECH, lefel ROS mitocondriaidd, anaf ocsideiddiol mtDNA, MMP, protein carbonylated, perocsidiad lipid, ROS mewngellol, a apoptosis yn cael eu canfod, cadarnhau effaith ECH mewn straen ocsideiddiol mitocondriaidd a swyddogaeth in vitro. Yna, rydym yn sefydlu model llygod mawr HF a achosir gan ISO ac yn rhag-drin ag ECH. Mae mynegeion o weithrediad y galon, ailfodelu myocardaidd, straen a swyddogaeth ocsideiddiol mitocondriaidd, mynegiant echel signal SIRT1/FOXO3a/MnSOD yn cael eu mesur, mae'r data'n dangos bod ECH yn gwella gweithrediad y galon, yn atal hypertroffedd myocardaidd, ffibrosis ac apoptosis yn cynyddu mynegiant SIRT1/FOXO3a/ Echel signalau MnSOD, yn lleihau'r iawndal ocsideiddiol mitocondriaidd, yn amddiffyn swyddogaeth mitocondriaidd. Rydym yn dod i'r casgliad bod ECH yn gwrthdroi ailfodelu myocardaidd ac yn gwella swyddogaeth y galon trwy uwchraddio'r echel SIRT1 / FOXO3a / MnSOD ac atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd mewn llygod mawr HF.

ALLWEDDOL Sechinacoside, methiant y galon, straen ocsideiddiol mitocondriaidd, ailfodelu myocardaidd

cistanche perlysiau ffresistraen ocsideiddiol mitocondriaidd

1|RHAGARWEINIAD

Methiant y galon (HF) yw canlyniad terfynol y rhan fwyaf o glefydau cardiofasgwlaidd gyda chyffredinolrwydd uchel a phrognosis gwael, a chyda thuedd waethygol poblogaeth sy'n heneiddio, cynyddodd nifer yr achosion o ysbytai a marwolaethau oherwydd methiant cronig y galon (CHF) yn sydyn ledled y byd.1 Yn ystod yr 20 mlynedd diwethaf, mae triniaethau cyffuriau ar gyfer HF wedi gwneud cynnydd mawr, ond mae'r effaith yn gyfyngedig iawn, felly mae angen cyffuriau newydd ar frys. Mae ailfodelu myocardaidd yn sail patholegol bwysig o HF ac fe'i nodweddir gan hypertroffedd myocardaidd, apoptosis, ffibrosis interstitial, mae'r celloedd myocardaidd yn anhrefnus, ac yn arwain at ostyngiad yn y ffracsiwn alldafliad (LVEF), cynnydd mewn dimensiynau diwedd-diastolig a systolig fentriglaidd chwith. (LVIDd a LVIDs), a gostyngiad mewn byrhau ffracsiynol fentriglaidd chwith (LVFS).2 Ond nid oedd y mecanweithiau gwaelodol yn cael eu deall yn llawn o hyd. Yn y blynyddoedd diwethaf, mae nifer o astudiaethau wedi cadarnhau bod straen ocsideiddiol yn hyrwyddwr pwysig o ailfodelu myocardaidd.3-7

Mae straen ocsideiddiol yn gyflwr lle mae rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) neu radicalau rhydd yn cael eu cynhyrchu'n ormodol ac yn arwain at ddifrod ocsideiddiol i gydrannau celloedd, mae hyn, yn ei dro, yn achosi camweithrediad celloedd.8Mitochondria yw prif ffynhonnell ROS mewngellol, o ganlyniad i gollyngiadau o'r gadwyn cludo electronau anadlol, a mitocondria yw'r sefyllfa fwyaf sensitif i effeithiau ROS.9 Nododd astudiaethau yn HF fod mwy o ROS yn cael ei gynhyrchu o gymhleth I o'r gadwyn resbiradol.8 Mae cynhyrchu mwy o ROS yn ymosod ar gydrannau mitocondriaidd yn gyntaf ac yn arwain at straen ocsideiddiol gormodol , yn amlygu fel carbonylation proteinau, perocsidiad lipid, a difrod DNA,10 a chamweithrediad mitocondria, sydd o ganlyniad yn arwain at ffurfio gormod o ROS,8 yn ffurfio cylch dieflig. Dangosir y gall y straen ocsideiddiol parhaus achosi hypertroffedd myocardaidd a ffibrosis myocardaidd,11-13 ac achosi apoptosis o gelloedd myocardaidd trwy actifadu apoptosis sy'n ddibynnol ar mitocondria o ganlyniad i garbonyliad proteinau pilen mitocondriaidd a cholli potensial pilen mitocondriaidd.14 Felly , ystyrir y gallai atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd fod yn strategaeth newydd i atal ailfodelu myocardaidd a hyd yn oed HF.15-17

Echinacoside (ECH), glycoside ffenylethanoid naturiol, yw prif elfen weithredol Cistanches Herba, sef meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae ECH wedi'i astudio'n helaeth yn y system nerfol a thiwmorau, ac adroddwyd ei fod yn meddu ar amrywiaeth o effeithiau ffarmacolegol, megis eiddo gwrthocsidiol, gwrthlidiol, gwrth-apoptosis, a gwrth-tiwmor.18,19In celloedd nerfol, mae ECH yn gwella gallu gwrthocsidiol yn sylweddol, yn lleihau cynhyrchiad ROS, yn gwella potensial pilen mitocondriaidd (MMP), ac yn cynyddu hyfywedd celloedd, mae 20 yn arddangos effeithiau amddiffynnol ar swyddogaeth mitocondriaidd ac yn atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd, mae'n amddiffyn rhag anaf ocsideiddiol ac yn gwella cof, yn y pen draw yn atal niwroddirywiad.21,22 Mae ECH hefyd yn cynyddu gweithgaredd SOD ac yn chwarae rhan amddiffynnol ym meinwe'r ymennydd a meinwe retina,19,23 ond nid yw'r mecanwaith penodol ar gyfer ei effaith gwrthocsidiol yn glir.

Mae SIRT1 yn gysylltiedig yn agos â straen ocsideiddiol, ac echel signalau SIRT1 / FOXO3a / MnSOD yw'r echel gwrthocsidiol bwysicaf ac mae'n gyfrifol am atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd, mae MnSOD yn dosbarthu'n eang mewn mitocondria ac mae'n bennaf gyfrifol am glirio ROS mitocondriaidd, felly atal straen ocsideiddiol, gall cyfansoddion sy'n actifadu'r echel gwrthocsidiol hwn atal straen ocsideiddiol.24,25 Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod ECH yn cyflawni ei effeithiau ffarmacolegol trwy reoleiddio llwybrau signalau lluosog, megis p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads , a llwybr signalau SIRT1.26-29 mae astudiaeth newydd yn canfod bod ECH yn clymu'n gofalent i SIRT1 fel ligand ac yn uwch-reoleiddio mynegiant SIRT1 yng nghelloedd yr ymennydd.26Mae'n awgrymu y gallai ECH atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd mewn cardiomyocytes a myocardaidd gwrthdro ailfodelu. Fodd bynnag, mae ymchwil ar effeithiau ECH wedi canolbwyntio ar y system nerfol neu diwmor, mae effeithiau a mecanweithiau ECH ar straen ocsideiddiol mitocondriaidd mewn cardiomyocytes ac ailfodelu myocardaidd yn parhau i fod yn anhysbys. Yma, rydym yn gyntaf yn ysgogi model cellog o straen ocsideiddiol gan ISO ac yn cadarnhau effaith ECH ar straen ocsideiddiol mitocondriaidd a swyddogaeth in vitro. Yna, rydym yn sefydlu model llygod mawr HF a achosir gan ISO ac yn dangos bod ECH yn gwrthdroi ailfodelu myocardaidd ac yn gwella swyddogaeth gardiaidd trwy uwch-reoleiddio echel signalau SIRT1/FOXO3a/MnSOD ac atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd mewn llygod mawr HF. Bwriad y canlyniadau yw darparu tystiolaeth arbrofol ar gyfer datblygu cyffuriau newydd i atal methiant y galon.

2|DEUNYDDIAU A DULLIAU

2.1|Meithriniad celloedd a thriniaeth

Mae celloedd AC16 yn cael eu prynu o Bena Culture Collection. Mae'r celloedd yn cael eu cynnal mewn glwcos uchel Mae atodiad cyfrwng addasedig Dulbecco's Eagle's (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, UDA) gyda 10 y cant o serwm buchol ffetws (10 y cant FBS; Gibco) mewn fflasgiau T-75 (Corning Glassworks, Corning, NY, UDA). Cedwir yr amodau ar 37 gradd mewn awyrgylch llaith sy'n cynnwys 5 y cant o CO2. Unwaith y bydd y celloedd yn cyrraedd cydlifiad 70 y cant -80 y cant, mae celloedd grŵp ISO (Sigma, UDA) yn cael eu deor â chyfrwng sy'n cynnwys 10uM ISO (Sigma, UDA) am 24h, mae celloedd grŵp ECH yn cael eu trin ymlaen llaw gyda 50uM ECH (MCE , UDA) am 30 munud o amlygiad ISO blaenorol. Nid yw celloedd rheoli (Ctrl) yn cael eu trin dim.

cistanche ar werthdyfyniad

2.2|Canfod lefel ROS mitocondriaidd gan ddefnyddio cemiluminescence luminol

Mae mitocondria yn cael eu hynysu a'u puro o gelloedd AC-16 gan ddefnyddio Mitocondria Isolation Kit (Sigma, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mae crynodiadau protein yn cael eu pennu gan becyn assay protein BCA (Biotech). Mae lefel ROS mitocondriaidd yn cael ei ganfod gan luminal (3-hydrazide aminoffthalic 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione) gan ddefnyddio pecyn Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), mae'n adweithio â ROS ac yn achosi allyrru ffotonau, sef sbectrwm band sydd ag uchafbwynt o tua 460nm, ac mae Uned Golau Cymharol (RLU) yn cael ei ganfod gan offeryn mesur cemiluminescence a'i drawsnewid yn RLU / ug protein mitocondriaidd.

2.3|8-Defnyddir OHdG i werthuso niwed ocsideiddiol DNA mitocondriaidd

Mae difrod ocsideiddiol DNA mitocondriaidd yn cael ei werthuso trwy ganfod cynnwys 8-Hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHG). Mae mitocondria wedi'i buro mewn celloedd yn cael eu hynysu gan ddefnyddio pecyn ynysu mitocondria fel uchod (Sigma). Mae crynodiadau protein yn cael eu pennu gan becyn assay protein BCA (Biotech). Yna, maent yn cael eu datgysylltu i bennu lefel 8-OHdG gan ddefnyddio pecyn Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mae amsugnedd y newid lliw yn cael ei fesur mewn sbectroffotomedr ar donfedd 450 nm. Yna caiff y crynodiad o 8-OHdG yn y samplau ei bennu drwy gymharu OD y samplau â'r gromlin safonol a'i drawsnewid yn ng/ml.

2.4|Mesur MMP gan JC-1

Mae mitocondria yn cael eu hynysu a'u puro o AC-16 a phennir crynodiad protein fel y crybwyllwyd uchod. Yna mae'r mitocondria yn cael eu hailddarparu ar grynodiad 1mg/ml, mae'r MMP yn cael ei fesur gan ddefnyddio pecyn profi JC-1 yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mae dwyster y fflworoleuedd yn cael ei fesur ar donfedd cyffro: 490nm, hollt 5nm, tonfedd allyriadau: 590 nm, hollt 5nm gydag offeryn sbectroffotomedr,30 cynrychiolir y canlyniadau fel FLU/ugP.

2.5|Canfod celloedd apoptotig gan sytometreg llif mewn Celloedd AC-16

Defnyddir cytometreg llif i asesu apoptosis cellog. Defnyddir pecyn canfod apoptosis Annexin V-FITC/PI (CWBIO, Tsieina) i ganfod celloedd apoptotig a necrotig yn unol â chyfarwyddiadau'r cyflenwr. Mae apoptosis cyfnod cynnar, apoptosis neu necrosis cyfnod hwyr, malurion cellog, a chelloedd hyfyw yn cael eu nodi fel atodiad V ( plws ) / PI ( - ), atodiad V ( plws ) / PI ( plws ), atodiad V ( -) / PI ( plws ) ac atodiad V (−)/PI (−), yn y drefn honno. Mae dwyster fflworoleuedd yn cael eu dadansoddi gan ddefnyddio sytomedr llif (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, UDA). Mae pob arbrawf yn cael ei ailadrodd 3 gwaith.

2.6|Aseswyd y ROS mewngellol yn ôl cytomedr llif

Ar ôl triniaeth, caiff celloedd eu trypsineiddio, eu golchi ddwywaith gyda PBS. Yna caiff y celloedd eu hailddarlledu yn PBS, eu staenio â DCFH-DA (Beyotime, Tsieina) ar y crynodiad terfynol o 1 μM a'u deor am 1 h ar 37 gradd mewn deorydd gyda CO2, ac yna'n cael eu profi mewn cytomedr llif ar 488 nm excitation. . Mae dwyster fflworoleuedd yn cynrychioli lefel ROS mewngellol.

2.7|Profi cynnwys protein carbonyl mewn mitocondria o gelloedd AC-16

Ar ôl y driniaeth, mae mitocondria wedi'i buro yn cael eu hynysu a'u sonicated ar rew ac yn cael eu trin â sylffad streptomycin 1 y cant i waddodi asidau niwclëig mitocondriaidd, pennir crynodiad protein. Mae'r cynnwys protein carbonyl yn cael ei brofi gan ddefnyddio pecyn Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) yn seiliedig ar ddeillio'r grŵp carbonyl gyda dinitrophenylhydrazine (DNPH), yn unol â chyfarwyddiadau'r pecyn, mae OD yn cael ei fesur gan ddarllenydd microplat a'i drawsnewid yn nmol / mg o brotein trwy gymharu â'r gromlin safonol.

2.8|Pennu lefel perocsidiad lipid mewn mitocondria o gelloedd AC-16

Ar ôl triniaeth, mae celloedd yn cael eu casglu a'u gorchuddio, mae mitocondria yn cael eu hynysu a'u puro, a'u cracio gan uwchsain, mae crynodiad protein yn cael ei bennu gan becyn assay protein BCA (Biotech), mae perocsidiad lipid yn cael ei bennu gan lefel y malondialdehyde (MDA) trwy'r assay TBARS , gan ddefnyddio pecyn (Nan jing Jian cheng, Tsieina) a lefel MDA yn cael ei fesur yn dilyn protocol y gwneuthurwr. Mae OD yn cael ei ganfod ar 586 nm gan ddarllenydd microplate a'i drawsnewid yn brotein μmol/g trwy gymharu â'r gromlin safonol.

2.9|Anifeiliaid a thriniaeth

Mae llygod mawr Sprague-Dawley gwrywaidd ifanc sy'n pwyso 120-140g yn cael eu caffael o Ganolfan Anifeiliaid Labordy Prifysgol Xi'an Jiao tong (Shaanxi, Tsieina). Mae'r ymchwiliad yn cydymffurfio â The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, a gyhoeddwyd gan Sefydliadau Cenedlaethol Iechyd yr Unol Daleithiau (cyhoeddiad NIH rhif.85-23, a ddiwygiwyd ym 1996), a chymeradwywyd y protocolau arbrofol gan yr awdurdodau lleol ( Pwyllgor Moeseg Biofeddygol Adran Feddygol Prifysgol Xi ' a Jiao tong). Mae model llygod mawr HF wedi'i sefydlu fel y disgrifiwyd yn flaenorol gennym ni.31 Yn fyr, rhoddir Isoproterenol (10 mg/kg) unwaith y dydd trwy chwistrelliad mewnperitoneol am 2 wythnos (a ddiffinnir fel grŵp HF), rhoddir ECH gydag 20 ug/g unwaith y dydd trwy chwistrelliad mewnperitoneol ar 30 munud cyn i ISO gael ei drin (a ddiffinnir fel grŵp ECH), ac mae'r weinyddiaeth yn para am 2 wythnos. Mae anifeiliaid rheoli yn cael eu gweinyddu gyda 0.9 y cant NaCl (a ddiffinnir fel grŵp Ctrl). Perfformir mesuriadau ecocardiograffeg i werthuso gweithrediad y galon.

2.10|Mesuriadau ecocardiograffig

Mae anifeiliaid yn cael eu hanestheteiddio gan chwistrelliad mewnperitoneol o 300 mg/kg o hydrad cloral. Defnyddir system uwchsain SONOS-2500 gyda thrawsddygiadur uwchsain o 7.5 MHz (HP, UDA) i wneud archwiliadau ecocardiograffig. Y ffracsiwn alldafliad fentriglaidd chwith (LVEF), byrhau ffracsiynol fentriglaidd chwith (LVFS), dimensiynau diwedd-diastolig fentriglaidd chwith (LVIDd), dimensiynau systolig pen fentriglaidd chwith (LVIDs), cyfradd curiad y galon (HR), trwch septwm interfentriglaidd mewn diastole (IVSTd ), mae trwch wal ôl fentriglaidd chwith mewn diastole (LPWWTd) yn cael eu mesur fel y disgrifiwyd yn flaenorol gennym ni.32

Mae FFIGUR 1 50μmol ECH i bob pwrpas yn atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd o gelloedd AC-16 a achosir gan 10μmol/L ISO ac yn amddiffyn swyddogaeth mitocondriaidd ac yn lleihau apoptosis.

2.11|Mesurir cymhareb pwysau calon i bwysau corff (HW/BW).

Mae llygod mawr yn cael eu pwyso cyn anestheteiddio, mae'r galon ffres yn cael ei hynysu ac yn golchi gwaed gyda 0.1mol/L PBS, torri pibellau i ffwrdd a meinwe segur arall ac mae'r galon yn cael ei phwyso, yna HW/BW(mg/100g) yn cyfrifo.

2.12|Staeniad histolegol

Mae calonnau llygod mawr yn cael eu dyrannu a'u gosod mewn paraformaldehyd 4 y cant, wedi'u hymgorffori mewn paraffin, a'u rhannu'n dafelli 5 μm o drwch. Defnyddir staenio Haematoxylin-Eosin (AU) i arsylwi ar y newidiadau patholegol a defnyddir trichrome Masson i werthuso ffibrau colagen meinwe myocardiwm llygod mawr. Mae'r ffracsiwn cyfaint colagen cardiaidd (CVF) ac ardal drawsdoriadol cardiomyocytes yn cael ei fesur gyda Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, UDA).

2.13|staenio TUNEL

Cesglir meinwe myocardaidd o'r fentrigl chwith a chynhelir y prawf TUNEL fel y disgrifiwyd yn flaenorol gennym ni32

2.14|Microsgop electron trawsyrru

Mae meinwe calon ffres wedi'i osod mewn 2.5 y cant o glutaraldehyde ar 4 gradd, yna caiff meinwe ei dorri i 1mm3 mewn cyfaint a'i osod eto mewn 2.5 y cant o glutaraldehyde ar 4 gradd am 2 awr, yna caiff ei olchi gyda 0.1mol/L PBS, sefydlog mewn asid osmig 1 y cant, wedi'i ddadhydradu ag aseton, wedi'i fewnosod â resin epocsi, mae sleisys ultrathin sy'n denau tua 800nm yn cael eu gwneud, wedi'u staenio ag asetad wranyl a sitrad plwm, ac yna'n cael eu harsylwi o dan ficrosgop electron trawsyrru (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japan). Er mwyn mesur effaith amddiffynnol ECH mewn morffoleg mitocondriaidd, mae'r cylchedd mitocondriaidd cymedrig, ardal drawstoriadol cymedrig mitocondriaidd, canran y dirywiad, a chanran y gwagio mewn mitocondria yn cael eu dadansoddi'n ystadegol gyda Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, UDA).

2.15|PCR meintiol

Mae cyfanswm RNA yn cael ei baratoi o feinwe fentriglaidd chwith gydag adweithydd Trizol (Invitrogen, Carlsbad, UDA). Mae cDNA yn cael ei syntheseiddio gan ddefnyddio Pecyn Synthesis cDNA Llinyn 1af TUREscript (Takara, Japan). Mae dilyniannau preimio penodol o golagen a ddefnyddiais ar gyfer PCR amser real fel a ganlyn: ymlaen: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGGTC-3′, gwrthdroi: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH ymlaen 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', cefn 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Perfformir PCR meintiol amser real (qPCR) gyda SYBRPremix Ex Taq (Amser Real Perffaith) (Takara, Japan). Cyfrifir lefel gymharol mRNA trwy normaleiddio i GAPDH, yn ôl y dull 2-ΔΔCT.

2.16|Dadansoddiad blot gorllewinol o fynegiant protein SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Mae cyfanswm protein meinwe fentriglaidd chwith yn cael ei dynnu ar rew gan ddefnyddio Clustog RIPA oer (BioRad, UDA) gyda Choctel Atalydd Protease (Sigma-Aldrich). Mae'r crynodiad yn cael ei bennu gan y dull BCA. Disgrifir gweithdrefnau blot y Gorllewin yn flaenorol.33 Yn gryno, mae'r sampl protein yn cael ei ffracsiynu ar geliau polyacrylamid dodecyl dodecyl-sylffad-polyacrylamid 15 y cant, wedi'i drosglwyddo i bilenni PVDF (BioRad, UDA), wedi'i rwystro gan 5 y cant o laeth sgim, a'i ddeor â gwrthgorff MYH o'r llygoden (gwanhau 1:200, Santa Cruz, UDA). Yna, wedi'i ddeor gan wrthgorff llygoden gafr cyfun-ruddygl poeth perocsidas (wedi'i wanhau 1:2,000, Santa Cruz, UDA). Cyfrifir lefel gymharol y protein trwy normaleiddio gwerth cymedrig y pelydryn i -actin. Mae bandiau protein yn cael eu canfod gan system cemiluminescence (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Mesur straen ocsideiddiol mitocondriaidd mewn myocardiwm llygod mawr

Mae mitocondria puro myocardiwm llygod mawr yn cael eu hynysu gan ddefnyddio Pecyn Ynysu Mitocondria (Sigma, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, mae ROS mitocondrial, MMP, difrod ocsideiddiol mtDNA, cynnwys protein carbonyledig, a lefel perocsidiad lipid mewn mitocondria i gyd yn cael eu canfod gan ddefnyddio'r un dulliau â arbrofion cell a ddisgrifir uchod. Mae'n werth nodi, mae ROS mewn meinwe myocardaidd yn cael ei ganfod gyda chwiliedyddion fflwroleuol DCFH-DA, canfyddir dwyster fflworoleuedd gyda'r offeryn mesur labelu ensymau, cynrychiolir y canlyniadau fel protein mitocondriaidd RLU/ug.

2.18|Dadansoddiad ystadegol

Cyflwynir yr holl ddata fel modd ± SEM. Defnyddir ANOVA unffordd i gymharu gwahaniaethau rhwng grwpiau lluosog, ac yna prawf post hoc Tukey ar gyfer arwyddocâd. Penderfynir ar yr holl ystadegau gan ddefnyddio meddalwedd SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, USA). Ystyrir gwerth tebygolrwydd o P < .05="" yn="">

3|CANLYNIADAU

3.1|Mae 50 μM ECH yn atal difrod ocsideiddiol mitocondriaidd ac apoptosis mewn celloedd AC-16 yn effeithiol

Mae celloedd heb eu trin yn cael eu gosod fel grŵp Ctrl. Yn gyntaf, fel y dengys Ffigur 1A, mae ECH yn atal ROS mitocondriaidd a achosir gan ISO. Mae celloedd sydd wedi'u trin gan ISO yn dangos cynnydd sylweddol mewn ROS mitocondriaidd o gymharu â Ctrl ac mae'r cynnydd hwn yn cael ei wanhau'n sylweddol gan ragdriniaeth â 50 μM ECH. Yn ail, gall ECH atal difrod ocsideiddiol mtDNA a achosir gan ISO. 8-Credir mai OHdG yw un o'r briwiau DNA mwyaf niferus sy'n deillio o straen ocsideiddiol ac mae'n fiofarciwr o ddifrod ac atgyweirio DNA ocsideiddiol. Fel y dengys Ffigur 1B, mae cynnwys 8-OHdG mewn mitocondria wedi'i buro o gelloedd AC-16 yn cael ei ganfod, mae'r canlyniadau'n dangos bod lefel 8-OHdG mewn mitocondria o gelloedd wedi'u trin â ISO wedi cynyddu'n ddramatig, ond cafodd y cyfnewidiad ei wrthdroi gan 50 μM ECH. Yn drydydd, mae ECH yn effeithiol i amddiffyn y MMP, sy'n cael ei amharu gan ISO. Mae dwyster fflworoleuedd wedi gostwng yn sylweddol mewn celloedd sy'n cael eu trin ag ISO o'u cymharu â chelloedd Ctrl, tra bod rhag-driniaeth gyda 50 μM ECH yn hynod o wanhau gostyngiad MMP, fel y dengys Ffigur 1C. Yn bedwerydd, mae ECH yn amddiffyn rhag difrod ocsideiddiol i brotein mitocondriaidd mewn celloedd AC{-16. Fel y dengys Ffigur 1D, mae'r cynnwys protein carbonyl mewn mitocondria o gelloedd trin ISO yn cynyddu'n sylweddol ac mae ECH yn gwanhau'r effaith. Yn bumed, mae ECH hefyd yn atal perocsidiad lipid mitocondriaidd mewn celloedd AC{-16 a achosir gan ISO. Fel y dengys Ffigur 1E, mae lefel perocsidau lipid mewn mitocondria o gelloedd ISO yn amlwg yn uwch nag mewn celloedd Ctrl, tra bod y cynnydd hwn yn cael ei leihau'n sylweddol gan 50μM ECH cyn-driniaeth. Yn y pen draw, mae ECH yn atal cronni ROS mewngellol. Fel y dengys Ffigur 1F, mae lefel y ROS mewngellol mewn celloedd ISO yn cynyddu'n sylweddol ac yn gostwng yn amlwg mewn celloedd ECH sydd wedi'u trin ymlaen llaw. Mae Ffigur 1G yn dangos bod cyfradd apoptosis celloedd AC-16 wedi cynyddu'n sylweddol yn dilyn deoriadau 24h gyda 10μM ISO, o'i gymharu â'r celloedd Ctrl, tra bod celloedd cyn-driniaeth â 50 μM ECH yn lleihau apoptosis a achosir gan ISO yn sylweddol.

FFIGUR 2 Mae hypertroffedd cardiaidd llygod mawr HF a achosir gan ISO yn cael ei leddfu ac mae gweithrediad y galon yn cael ei wella'n sylweddol gan driniaeth ECH.

3.2|Mae ECH yn gwrthdroi ailfodelu myocardaidd ac yn gwella swyddogaeth gardiaidd llygod mawr HF a achosir gan ISO

Fel y dangosir yn Ffigur 2A, mae calonnau llygod mawr HF yn hypertroffedd amlwg ac yn cael eu gwrthdroi gan driniaeth ag ECH. Fel y dengys Ffigurau 2B-D ac L, mae ECH yn lleihau'r HW/BW. Mae canlyniadau ecocardiograffeg yn dangos bod LVEF a LVFS yn cael eu lleihau'n sylweddol yn y grŵp HF, mae LVIDd, LVIDs, ac IVSTd yn cynyddu'n sylweddol yn y grŵp HF. Fodd bynnag, mae ECH yn lleihau LVIDd, LVIDs, IVSTd yn sylweddol ac yn gwella LVEF a LVFS, nid oes gwahaniaeth sylweddol mewn AD ymhlith y tri grŵp, mae LVPWTd yn cynyddu mewn HF, ond dim gwahaniaeth rhwng ECH a Ctrl, na rhwng ECH a HF, i gyd fel Dengys Ffigur 2E-K. Mae canlyniadau staenio AU yn dangos bod hypertroffedd myocardaidd, anhwylder trefniadol neu necrosis dirywiad, ymdreiddiad celloedd llidiol a hyperemia ac oedema rhyng-raniadol mewn llygod mawr HF, ac ECH yn lleddfu'r iawndal hyn yn sylweddol, mae hypertroffedd myocardaidd ac anhrefn trefniadol yn cael eu lleddfu, y mae necrosis dirywiad ac ymdreiddiad llidiol yn cael eu lleihau, fel y dangosir yn Ffigur 3A. Mae arwynebedd trawsdoriadol y cardiomyocyte yn cael ei fesur, mae'n cynyddu'n sylweddol ar ôl ISO ac yn cael ei ostwng mewn grŵp sy'n cael ei drin ECH, fel y dengys Ffigur 3E. Mae asesiadau o ddyddodiad colagen gan staenio Masson yn datgelu bod cynnwys colagen fentriglaidd chwith mewn llygod mawr HF yn cynyddu'n amlwg ac yn gostwng i bob golwg ar ôl triniaeth gydag ECH, sy'n amlwg yn lleihau CVF. Mae dadansoddiad PCR amser real yn datgelu bod trawsgrifiadau math Ⅰ procolagen yn cael eu huwch-reoleiddio mewn llygod mawr ISO a'u his-reoleiddio mewn llygod mawr ECH, mae'r canlyniadau hyn yn gyson â'i gilydd, fel y dengys Ffigurau 3B a FG, mae'r data'n dangos bod ECH yn lleihau dyddodiad colagen yn effeithiol. . Mae nifer y celloedd TUNEL-positif mewn cardiomyocytes yn cynyddu'n sylweddol mewn llygod mawr HF o gymharu â Ctrl, mae ECH yn lleihau apoptosis celloedd myocardaidd yn sylweddol, ac mae Ffigur 3C-D yn dangos delwedd gynrychioliadol celloedd TUNEL-positif mewn meysydd pŵer isel ac uchel yn y drefn honno, a Ffigur Mae 3H yn dangos cyfradd apoptosis celloedd myocardaidd. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod ECH i bob pwrpas yn gwrthdroi hypertroffedd myocardaidd, ffibrosis interstitial myocardaidd, ac apoptosis, ac yn gwella gweithrediad y galon mewn llygod mawr HF a achosir gan ISO.

FFIGUR 3 Mae canlyniadau staenio histolegol yn dangos bod ECH yn gwrthdroi ailfodelu fentriglaidd chwith llygod mawr HF a achosir gan ISO.

3.3|Mae ECH yn amddiffyn uwch-strwythur myocardaidd mewn llygod mawr HF

Mae canlyniadau micrograffau electron trosglwyddo yn dangos y gallai ECH wanhau'r difrod i uwch-strwythur myocardaidd, fel y dengys Ffigur 4A-B. Mae myofibrils yn drefniant fertigol, mae'r strwythur sarcomer yn amlwg, mae'r myofilamentau wedi'u trefnu'n daclus, ac mae'r llinell Z yn glir. Mae mitocondria wedi'u trefnu'n daclus ac mae'r strwythur yn glir mewn llygod mawr Ctrl. Fodd bynnag, mae myofibrils yn anhrefnus, yn rhwygo, ac yn diddymu, mae'r strwythur sarcomere yn niwlog, absenoldeb y llinell Z, mae'r parth crebachiad myocardaidd yn weladwy, mae nifer a chyfaint y mitocondria yn cynyddu, mae mitocondria yn wahanol siapiau a meintiau, wedi'u trefnu mewn anhrefn, mae'r strwythur yn aneglur, yn chwyddo ac yn darnio crista, yn cwympo neu'n clwmpio ac wedi'i doddi i mewn i wactod mewn llygod mawr HF. Mae ECH yn amlwg yn gwanhau'r newidiadau hyn, mae mwyafrif y ffibrau cyhyrau cardiaidd wedi'u trefnu'n daclus ac mae ffilamentau myocardaidd yn glir, mae llinell Z yn bodoli, er bod rhywfaint o ddiddymiad ffilamentau yn amlwg, mae'r strwythur sarcomere yn glir, mae dwysedd mitocondriaidd yn gostwng, y siapiau ac mae meintiau'n cael eu lleddfu, eu trefnu'n fwy taclus, chwyddo mitocondria a darnio crista, cwymp neu glwmpio, a gwagoli yn amlwg yn cael eu lleihau gan ECH o'i gymharu â HF. Mae chwydd mitocondria a darniad crista, cwymp neu glwmpio, a gwagio rhannol yn cael eu nodi fel dirywiad mitocondriaidd. Mae'r canlyniadau'n dangos bod ECH yn amddiffyn uwch-strwythur myocardaidd yn effeithiol, ac yn arbennig yn amddiffyn morffoleg mitocondriaidd mewn llygod mawr HF, fel y dengys Ffigur 4C-F.

FFIGUR 4 Mae ECH yn amddiffyn uwch-strwythur cardiomyocytes a morffoleg mitocondriaidd llygod mawr HF a achosir gan ISO.

3.4|Mae ECH yn uwch-reoleiddio mynegiant protein SIRT1, FOXO3a, a MnSOD

Mae dadansoddiad Western Blot yn dangos bod lefel mynegiant protein SIRT1, FOXO3a, a MnSOD wedi'i is-reoleiddio'n sylweddol mewn llygod mawr HF, fodd bynnag, mae ECH yn amlwg yn uwch-reoleiddio'r mynegiant protein gostyngol. Dangosir y bandiau protein cynrychioliadol o ganlyniadau imiwnoblotting a dadansoddiad ystadegol yn Ffigur 5. Mae'r rhan o'r data yn dangos bod ECH yn cynyddu mynegiant protein SIRT1, FOXO3a, a MnSOD.

3.5|Mae ECH yn atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd mewn meinwe myocardaidd fentriglaidd chwith

Yn y rhan hon, mae ROS mitocondriaidd, MMP, difrod ocsideiddiol DNA mitocondriaidd, cynnwys protein carbonyl, a lefel perocsidiad lipid mewn mitocondria ym meinwe myocardaidd fentriglaidd chwith llygod mawr i gyd yn cael eu mesur, ac mae'r canlyniadau'n gyson ag arbrofion celloedd, hynny yw, Mae ECH yn lleihau ROS mitocondriaidd, yn amddiffyn MMP, yn lleddfu maint difrod mtDNA, yn lleihau cynnwys protein carbonyl a perocsidiad lipid mewn mitocondriaidd, fel y dengys Ffigur 6.

Mae FFIGUR 5 ECH yn uwch-reoleiddio lefel mynegiant protein SIRT1, FOXO3a, a MnSOD sydd wedi'i is-reoleiddio mewn llygod mawr HF.

4|TRAFODAETH

Mae'r astudiaeth hon yn dangos bod ECH yn chwarae rhan effeithiol wrth atal ailfodelu myocardaidd a gwella gweithrediad y galon trwy uwch-reoleiddio echel signalau SIRT1/FOXO3a/MnSOD ac atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd.

Mitocondria yw prif safle cynhyrchu ROS fel sgil-gynnyrch ffosfforyleiddiad ocsideiddiol, oherwydd eu hagosrwydd at ROS, credir mai proteinau mitocondriaidd, lipidau, a mtDNA yw prif dargedau difrod ocsideiddiol ar ôl allyriadau gormodol o ROS mitocondriaidd, 34,35 mae'r difrod hwn yn ysgogi cynhyrchu ROS ymhellach, mae'r cylch dieflig yn parhau, gallai ROS a straen ocsideiddiol arwain at hypertroffedd myocardaidd, apoptosis, ffibrosis interstitial, a HF trwy actifadu llwybrau signalau lluosog.35 Felly, mae'n ymddangos bod cyffuriau a dargedodd ataliad ocsideiddiol mitocondriaidd straen yn effeithiol ar gyfer atal ailfodelu myocardaidd. Mae ECH yn glycosid ffenylethanoid naturiol, sy'n rhan o'r perlysiau Tsieineaidd traddodiadol Cistanche tubulosa. caiff ei astudio'n eang a phrofwyd ei fod yn meddu ar fathau o weithgareddau ffarmacolegol yn ystod y blynyddoedd diwethaf, megis gwrth-tiwmor, gwrth-apoptosis, gwrth-heneiddio, gweithredu niwro-amddiffynnol, ac ati. Mae astudiaethau wedi profi bod gweithredoedd ffarmacolegol ECH yn dibynnu'n bennaf ar ei eiddo o weithgaredd gwrthocsidiol a gwrthlidiol, 18,21 ac mae ECH yn lleihau ROS mitocondriaidd ac yn amddiffyn swyddogaeth mitocondriaidd rhag difrod ocsideiddiol mewn celloedd nerfol.20,22 Yma, fe wnaethom ddangos yn gyntaf fod Mae ECH yn lleihau ROS mitocondriaidd o cardiomyocytes, felly, yn gwella MMP, lleihau difrod ocsideiddiol mtDNA, protein, a lipidau, gan atal difrod ocsideiddiol mitocondriaidd yn effeithiol a lleihau apoptosis in vitro ac in vivo, felly, mae'n gwrthdroi ailfodelu myocardaidd ac yn gwella swyddogaeth y galon. Mae'n golygu bod ECH yn gyffur newydd posibl ar gyfer atal ailfodelu myocardaidd a HF.

Mewn amodau arferol, mae ROS mitocondriaidd yn cael ei glirio'n bennaf gan MnSOD sy'n dosbarthu mewn mitocondria ac yn amddiffyn rhag difrod ocsideiddiol mitocondriaidd. Mae Ang II yn lleihau mynegiant MnSOD o cardiomyocytes yn sylweddol ac yn achosi hypertroffedd myocardaidd, fodd bynnag, gallai resveratrol gynyddu mynegiant MnSOD ac atal hypertroffedd myocardaidd a achosir gan Ang II.36 Yn HF, mae gweithgaredd MnSOD yn gostwng yn sylweddol ac mae cynhyrchu ROS mitocondriaidd yn cynyddu .37,38 Mewn llygod curiad genyn MnSOD cardiaidd-benodol, ni ellid clirio ROS mitocondriaidd a chynyddir ROS mewn cardiomyocytes, arweiniodd hyn at gamweithrediad mitocondriaidd ac ehangiad cardiaidd cynyddol, gan arwain yn y pen draw at fethiant y galon.39 Yn yr astudiaeth bresennol, rydym yn cadarnhau bod mynegiant MnSOD yn cael ei leihau'n sylweddol, sy'n cael ei wanhau gan driniaeth ECH, ac felly, mae ROS mitocondriaidd yn cael ei leihau ac mae straen ocsideiddiol mitocondriaidd yn cael ei atal. Mae'n golygu bod ECH yn amddiffyn cardiomyocytes rhag difrod ocsideiddiol trwy uwch-reoleiddio mynegiant MnSOD, rydym yn archwilio ymhellach y mecanweithiau moleciwlaidd sy'n sail i'r effeithiau hyn.

Mae mynegiant MnSOD yn cael ei reoleiddio gan FOXO3a, sy'n ffactor trawsgrifio ac yn rhwymo yn rhanbarth hyrwyddwr genynnau MnSOD ac yn arwain at hyrwyddo trawsgrifio genynnau.40 Mae SIRT1 yn foleciwlaidd i fyny'r afon o FOXO3a a gall actifadu FOXO3a trwy ddadacetyliad. Mae echel signalau SIRT1/FOXO3a/MnSOD yn chwarae rhan ganolog mewn amddiffyn rhag straen ocsideiddiol mewn mathau o fathau o gelloedd, mae actifadu'r echelin signalau gan estradiol yn atal straen ocsideiddiol ac yn rhoi amddiffyniad cardiaidd24; Mae actifadu'r echelin signalau gan resveratrol yn atal marwolaeth celloedd a achosir gan straen ocsideiddiol40; Fel arall, mae angiotensin II yn atal llwybr SIRT1/FoxO3a/MnSOD ac yn achosi straen ocsideiddiol mitocondriaidd, difrod mtDNA mewn osteoblastau,41types 5 adenylyl cyclase yn cynyddu straen ocsideiddiol trwy ataliad ar fynegiant MnSOD trwy Lwybr Sirt1/FoxO3a.42 Mae'r astudiaeth bresennol yn canfod bod yr astudiaeth bresennol yn canfod mae mynegiant SIRT1, FoxO3a, a MnSOD i gyd yn cael eu lleihau'n sylweddol mewn llygod mawr HF ac mae ROS mitocondriaidd yn uchel ac mae straen ocsideiddiol yn cael ei wella, fodd bynnag, mae ECH yn gwrthdroi'r newidiadau. Mae ymchwil newydd yn dangos bod ECH yn rhwymo SIRT1 yn uniongyrchol fel ligand ac yn ffurfio cymhlyg gyda 9 bond cofalent ac yn uwch-reoleiddio mynegiant SIRT1 mewn celloedd nerfol.26 Yn gyson â'r astudiaeth hon, mae'r astudiaeth bresennol yn dangos bod ECH hefyd yn uwch-reoleiddio'r mynegiant o SIRT1 mewn cardiomyocytes, mae wedyn yn uwch-reoleiddio mynegiant genynnau MnSOD trwy FoxO3a ac yn atal ROS mitocondriaidd a straen ocsideiddiol.

Gall isgemia cronig hirdymor achosi gaeafgysgu myocardaidd, mae'r celloedd myocardaidd gaeafgysgu hyn fel arfer yn dangos colli ffilamentau contractile, mae gronynnau glycogen gormodol yn y cytosol, reticwlwm sarcoplasmig, a cholli tiwbiau ardraws,43hefyd, mae annormaleddau mewn maint a siâp mitocondriaidd. , hypertroffedd myocardaidd adweithiol a ffibrosis interstitaidd, sy'n eilradd i golled myocyte.44 Gwelsom hefyd y newidiadau uchod mewn llygod mawr HF yn ein hastudiaeth, tra bod ECH yn lleddfu'r newidiadau hyn yn sylweddol, gan fod yr astudiaeth ddiweddaraf yn nodi y gallai adferiad gweithrediad cardiaidd ar ôl straen isgemig fod yn un nodwedd gaeafgysgu myocardaidd,45 mae lefel glycogen myocardaidd hefyd yn cael ei fesur, mae'r canlyniadau'n dangos nad oes gwahaniaeth arwyddocaol rhwng y tri grŵp, fel y dangosir yn Ffigur 7J.

Canfu'r astudiaeth flaenorol hefyd gaeafgysgu myocardaidd mewn model mochyn methiant y galon nad yw'n isgemig trwy gyflymu'r wal rydd LV ag amledd uchel,46 oherwydd bod rhwystr microfasgwlaidd yn chwarae rhan bwysig mewn gaeafgysgu myocardaidd a'r camweithrediad contractile sy'n deillio o hynny, ac mae hynny wedi gwella'n sylweddol pan fydd y mae rhwystr microfasgwlaidd yn cael ei wrthdroi gan gyffur.47 Ar hyn o bryd, mae rhai astudiaethau'n dod i'r casgliad bod therapi adfasgwlareiddio yn effeithiol wrth gaeafgysgu myocardiwm,43 trwy ddefnyddio staen AU a Masson, gwelwn fod capilari myocardaidd a dwysedd rhydwelïol yn lleihau'n amlwg mewn llygod mawr HF a'u bod yn cael eu lleddfu'n sylweddol gan ECH, fel y dangosir yn Ffigur 7A-H. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod cyfansoddion naturiol eraill, megis haidd beta-glwcan yn cael effeithiau cardioprotective trwy fynegiant cynyddol o MnSOD, 48,49, a chynnydd MnSOD yn gysylltiedig â'r dwysedd capilari myocardaidd cynyddol a mynegiant VEGF. Fe wnaethom berfformio RT-PCR i ganfod mynegiant VEGF, mae'r data'n gyson â chanfyddiad staenio histolegol, sy'n golygu y gallai ECH hyrwyddo angiogenesis a chynyddu dwysedd capilari myocardaidd trwy reoleiddio mynegiant VEGF, fel y dangosir yn Ffigur 7I. Mae'r astudiaeth bresennol yn canfod y gall ECH amddiffyn a chynyddu capilari myocardaidd a rhydwelïol trwy lwybr uwch-reoleiddio SIRTI/FOXO3a/MnSOD a mynegiant VEGF, a thrwy hynny atal myocardiwm gaeafgysgu a chyfrannu at wella gweithrediad y galon.

Mae Cistanche yn cyfrannuigwella gweithrediad y galon.

Am fwy o wybodaeth, cliciwch yma.

O bwys, mae'n hysbys bod apoptosis cardiomyocyte yn newid patholegol pwysig mewn methiant y galon, ac mae'r astudiaeth bresennol yn wir yn cadarnhau bod llawer iawn o gelloedd apoptotig mewn llygod mawr HF ac ECH yn lleihau'r apoptosis yn sylweddol trwy reoleiddio llwybr SIRTI / FOXO3a / MnSOD ac atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd, fel y crybwyllwyd uchod.

Yn anad dim, mae ECH yn gwrthdroi ailfodelu myocardaidd ac yn gwella gweithrediad y galon trwy uwch-reoleiddio echel signalau SIRT1/FoxO3a/MnSOD, gan atal straen ocsideiddiol mitocondriaidd a lleihau myocardiwm gaeafgysgu. Felly, awgrymir bod ECH yn gyffur posibl ar gyfer atal neu drin ailfodelu myocardaidd a HF.