Effeithiau Glyeosides Cistanche Ar Ddysgu Gwybyddiaeth a Phlastigedd Synaptig mewn Llygod Mawr Model Amddifadedd Cwsg

ABSENOLDEB

Amcan:Archwilio a all glycosidau cistanche wella dysgu a swyddogaeth wybyddol llygod mawr model amddifadedd cwsg trwy reoleiddio plastigrwydd synaptig.

Dulliau: Rhannwyd hanner cant o lygod mawr Wistar gwrywaidd ar hap yn grŵp rheoli gwag (Rheoli), grŵp rheoli platfform (PC), grŵp model (Model),glycosidau grŵp cistanche (GCs), a grŵp estazolam ( Est ). Paratowyd y model amddifadedd cwsg o lygod mawr trwy ddull amgylchedd dŵr aml-lwyfan wedi'i addasu. Defnyddiwyd drysfa ddŵr Morris a phrawf maes agored i ganfod gweithrediad gwybyddol gofodol a newidiadau emosiynol llygod mawr. Defnyddiwyd staenio Nissl i arsylwi ar y newidiadau mewn morffoleg a maint y celloedd nerfol yn yHippocampal CAl ardal llygod mawr. Defnyddiwyd blot gorllewinol ac R'T - PCR i ganfod lefelau mynegiant synaptoffiseg (SY'N), sylwedd trwchus pilen postsynaptig 95 ( PSD {{ }} ), affactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF). 

Canlyniadau;Dangosodd canlyniadau drysfa ddŵr Morris, o gymharu â'r grŵp Rheoli, fod ydysgu a gallu gwybyddol llygod mawryn y grŵp Model wedi gostwng yn sylweddol (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasgwell triniaeth GCs ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the lefelau mynegiant protein a genynnau BDNF, SYN, a PSD -95yn y grŵp Mlodel wedi gostwng yn sylweddol (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

ATODIADAU FFURFIO GERBAL CISTANCHE AR GYFERGWELLA DYSGU A SWYDDOGAETH wybyddol

GEIRIAU ALLWEDDOLGlycosidau o cistanche; Hippocampus; Amddifadedd cwsg; Dysgu a chof; Pryder; Plastigrwydd synaptig

Anhwylder cysgu (SD)yn aanhwylder swyddogaethol cwsg annormala achosir gan gyfres o ffactorau cymhleth megisanhunedd, breuddwydion, adeffroad hawdd. Yn y blynyddoedd diwethaf,nifer yr achosion o DCwedi bod yn cynyddu yn raddol. Mae astudiaethau cysylltiedig wedi nodi y gall DC achosiafiechydon cardiofasgwlaidd,camweithrediad metabolig,afiechydon imiwnedd, asystem nerfol ganologafiechydon dirywiol megis clefyd Alzheimer [1]. Gall SD achosi niwed ocsideiddiol i niwronau hippocampal, achosi camweithrediad gwybyddol, a chynhyrchu newidiadau mewn hwyliau fel pryder ac iselder [2]. Mae Cistanche deserticola yn ddeunydd meddyginiaethol gwerthfawr y gellir ei ddefnyddio fel meddyginiaeth a bwyd yn Tsieina. Mae ganddo effeithiau tonychu'r aren ac ailgyflenwi qi, lleithio'r coluddion gan hyrwyddo symudiadau coluddyn, a chryfhau yang. Mae gan brif ddyfyniad Cistanche deserticola, glycosides cistanche (GCs), effeithiau gwrthocsidiol, gwrth-apoptotig, amddiffyn yr afu, a niwro-amddiffynnol [3]. Canfu ein hymchwil flaenorol y gall GCs wella dysgu a swyddogaeth wybyddol llygod SAMP8 trwy chwarae rôl gwrthocsidiol a gwrth-apoptotig [4].

Mae astudiaethau cysylltiedig wedi dangos bod camweithrediad gwybyddol a achosir gan DC yn perthyn yn agos i blastigrwydd synaptig [5]. Fodd bynnag, prin yw'r adroddiadau ar y mecanwaith y mae CGs yn ei ddefnyddio i reoleiddio plastigrwydd synaptig a gwella nam dysgu a chof a dirywiad gwybyddol mewn llygod mawr a achosir gan amddifadedd cwsg. Felly, nod yr astudiaeth hon yw archwilio a yw GCs yn effeithio ar blastigrwydd synaptig trwy reoleiddio mynegiant marcwyr sy'n gysylltiedig â synaptig, a thrwy hynny wella dysgu a swyddogaeth wybyddol llygod mawr â modelau amddifadedd cwsg, a darparu syniadau a chynlluniau triniaeth newydd i GCs drin dysgu a gwybyddol. nam a achosir gan anhwylderau cysgu.

1 Defnyddiau a dulliau

1.1 Anifeiliaid arbrofol

Prynwyd llygod mawr Wistar gwrywaidd rhwng 6 ac 8 wythnos oed, yn pwyso 280 i 300 g, o Beijing Sibeifu, gyda thrwydded cynhyrchu anifeiliaid [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Cadwyd yr holl anifeiliaid yng Nghanolfan Arbrofi Anifeiliaid Coleg Meddygol Baotou o dan yr amodau a ganlyn: tymheredd (24 ± 1) gradd, lleithder 50% i 55%, golau 12 h a 12 h tywyll, a dim cyfyngiadau ar fwyd a dŵr. Cymeradwywyd yr arbrawf hwn gan bwyllgor moeseg yr ysgol [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1. 2 Prif adweithyddion ac offerynnau

Prynwyd cyfanswm glycosidau Cistanche deserticola gan Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co, Ltd (rhif swp: KSM20220609011); Prynwyd tabledi Estazolam gan CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (rhif swp: 044220343); prynwyd byffer llwytho protein (P1015), byffer lysis RIPA (R0010), datrysiad cemiluminescent (PE0010), ac ati i gyd o Beijing Solebao; prynwyd sylwedd dwysedd postsynaptig mewn gwrthgorff 95 (PSD-95) (AB192757) a synaptoffiseg (SYN) (ab32127) gan Abcam, USA Company; prynwyd ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF) (48503-2) ac -actin (52901) oddi wrth SAB Company, UDA; prynwyd gwrthgorff eilaidd IgG gwrth-gwningen gafr (SA00001-20) gan Proteintech Company, UDA; prynwyd melatonin llygod mawr (MT) a Phecyn Ymchwil Gwyddonol ELISA (MM-0657R1) oddi wrth Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Sleisiwr paraffin (Leica, yr Almaen); microsgop optegol (Leica, yr Almaen);

Drysfa ddŵr Morris, blwch prawf maes agored (Shanghai Xinruan); cyfarpar electrofforesis fertigol (Cwmni Beijing Liuyi); ysgydwr decolorization (Cwmni Beijing Liuyi); system dadansoddi delweddu protein (Shanghai Tanon Technology); fflworoleuedd meintiol PCR offeryn (Xi'an Tianlong Technology Co, Ltd).

1.3 Dulliau arbrofol

1.3.1 Grwpio anifeiliaid a rhoi cyffuriau

Rhannwyd 50 o lygod mawr Wistar gwrywaidd ar hap yn grŵp rheoli gwag (Grŵp rheoli), grŵp rheoli platfform (Rheolaeth Plat-form, grŵp PC), grŵp model (Grŵp model), cyfanswm glycosidau grŵp Cistanche deserticola (grŵp GCs). , 50 mg/kg), a grŵp estazolin (grŵp Est, 0.54 mg/kg), gyda 10 llygod mawr ym mhob grŵp. Rhoddwyd 0.9% halwynog i'r grŵp Rheoli a'r grŵp PC trwy gavage. Cafodd pob grŵp ei gau am 7 am bob dydd ar ôl i'r modelu ddechrau, a pharhaodd y mesurydd am 21 diwrnod.

1.3. 2. Paratoi model anifeiliaid amddifadedd cwsg

Sefydlwyd y model amddifadedd cwsg gan ddefnyddio'r dull amgylchedd dŵr aml-lwyfan wedi'i addasu [6]. Yr offer arbrofol oedd tanc dwr resin polyethylen hirsgwar 130 cm × 50 cm × 45 cm. Gosodwyd platfform bach gyda diamedr o 5 cm ac uchder o 20 cm yn y tanc dŵr. Roedd gan blatfform y grŵp PC ddiamedr o 10 cm ac uchder o 20 cm. Llenwyd y tanc dŵr â dŵr i ddyfnder o tua 18 cm a chynhaliwyd tymheredd y dŵr ar (20 ± 1) gradd . Wythnos cyn dechrau'r arbrawf, rhoddwyd y llygod mawr yn y blwch amddifadedd cwsg bob dydd am 60 munud i ymgyfarwyddo â'r amgylchedd. Ar ôl sefydlu'r model, ac eithrio'r grŵp Rheoli, gosodwyd llygod mawr pob grŵp ar y platfform bach ar amser o 8 am i 8 pm bob dydd ar gyfer amddifadedd cwsg am 21 diwrnod yn olynol.

Roedd gan bob llygod mawr fynediad am ddim i fwyd a dŵr ac roeddent yn symud yn rhydd ar y platfform. Roedd y cylch golau a thywyll yn 12 awr bob dydd.

1. 3. 3 Arbrawf drysfa ddŵr Morris

Rhanwyd drysfa ddŵr Morris yn 4 ardal, wedi'i llenwi â dŵr, a gosodwyd y llwyfan yn y 4ydd cwadrant. Roedd wyneb y dŵr tua 2 cm uwchben y platfform. Ychwanegwyd melanin bwytadwy gradd bwyd at y dŵr, a chynhaliwyd tymheredd y dŵr ar (25 ± 1) gradd . (1) Arbrawf llywio lleoli: Dewiswyd canol pob ardal a gosodwyd y llygod mawr yn ysgafn yn y dŵr. Caniatawyd iddynt archwilio'n rhydd. Cofnodwyd yr amser a gymerodd i'r llygod mawr ddod o hyd i'r platfform targed o fewn 60 eiliad. Cafodd llygod mawr na ddaeth o hyd i'r platfform eu harwain i'r platfform ac aros am 20 eiliad. Parhaodd yr hyfforddiant am 5 diwrnod. (2) Prawf archwilio gofodol: Ar y 6ed diwrnod, tynnwyd y llwyfan a gosodwyd y llygod mawr yn y dŵr o ganol yr 2il cwadrant yn erbyn y wal. Cofnodwyd y nifer o weithiau y bu'r llygod mawr yn pasio'r platfform o fewn 120 s a'r amser y buont yn aros yn y 4ydd cwadrant.

1. 3. 4 Arbrawf maes agored

Defnyddiwyd blwch arbrofol 100 cm × 100 cm × 50 cm, a rhannwyd gwaelod y blwch yn 9 grid. Gosodwyd pob grŵp o lygod mawr yn yr ystafell arbrofol maes agored ymlaen llaw i addasu i'r amgylchedd dan do am 60 munud. Ar ddechrau'r arbrawf, gosodwyd y llygod mawr prawf mewn corneli sefydlog o'r blwch arbrofol maes agored yn eu tro, a chofnodwyd nifer yr amseroedd sefyll, pellter symud, ac amser statig y llygod mawr o fewn 5 munud gan ddefnyddio meddalwedd dadansoddi ymddygiad. Roedd yn ofynnol i'r amgylchedd fod yn dawel yn ystod yr arbrawf, a chafodd y ddyfais arbrofol ei sychu â dŵr ac alcohol yn y drefn honno rhwng dau arbrawf i atal arogl y llygoden fawr gyntaf rhag effeithio ar farn ymddygiadol y llygoden fawr nesaf.

1. 3. 5 Assay imiwnosorbent sy'n gysylltiedig ag ensymau (ELISA)

Canfod lefelau serwm MT mewn llygod mawr Anestheteiddiwyd llygod mawr gan chwistrelliad mewnperitoneol, a chasglwyd 5 ml o waed o'r aorta abdomenol. Ar ôl aros am 30 munud ar dymheredd yr ystafell, cafodd y gwaed ei allgyrchu i gael serwm. Ychwanegwyd 40 μL o wanedydd sampl at bob ffynnon, ac yna ychwanegwyd 10 μL o'r sampl i'w brofi. Ar ôl selio â ffilm selio, deorwyd y plât ar 37 gradd am 30 munud. Wedi'i olchi 5 gwaith, ychwanegwyd 50 μL o hydoddiant labelu ensym, a seliwyd y plât â ffilm selio a'i ddeor ar 37 gradd am 30 munud. Wedi'i olchi 5 gwaith, ac yna ychwanegwyd yr ateb datblygu lliw a'r ateb terfynu adwaith yn eu tro. Mesurwyd gwerth OD pob ffynnon gan labelwr ensym ar donfedd o 450 nm.

1. 3. 6 Nissl staenio

Dewiswyd tri llygod mawr o bob grŵp, a chafodd meinwe'r ymennydd ei dynnu trwy ddad-beniad a'i osod gyda datrysiad polyoxyethylen 4%. Cafodd y meinwe ei ddadhydradu, ei drochi mewn hydoddiant cwyr, ei fewnosod, a'i sleisio trwy ddulliau confensiynol. Cadwyd y sleisys â thrwch o 5 μm, wedi'u rinsio â PBS, wedi'u staenio â 0.1% toluidine glas am 0.5 h, wedi'u gwahaniaethu â 95% o alcohol, wedi'u dadhydradu â 100% o alcohol, wedi'u tryloywi gyda xylene, a'i selio â gwm niwtral. Arsylwyd y newidiadau ym morffoleg a nifer y niwronau yn rhanbarth CA1 yr hippocampus llygod mawr o dan ficrosgop a chasglwyd delweddau.

1. 3. 7 Arbrawf blot gorllewinol

Dewiswyd pedwar llygoden fawr o bob grŵp, a chafodd yr hippocampus ei ynysu gan ddad-bennaeth. Cymysgwyd meinwe'r hippocampus gyda byffer lysis RIP A mewn amgylchedd baddon iâ a chafodd y meinwe ei allgyrchu i gael y uwchnatant. Canfuwyd y crynodiad protein gan y dull BCA. Ychwanegwyd 20 ug o brotein gyda byffer llwytho protein ar gyfer electrofforesis. Ar ôl i'r electrofforesis protein gael ei gwblhau, trosglwyddwyd y bilen ar 300 mA o lif cyson, wedi'i rwystro â 5% o bowdr llaeth sgim, deorwyd y gwrthgorff cynradd ar 4 gradd dros nos, a deorwyd y gwrthgorff eilaidd ar dymheredd ystafell am 2 h. Ar ôl i'r datrysiad datblygu lliw gael ei ddefnyddio, dadansoddwyd y bandiau protein yn ystadegol gan ddefnyddio system dadansoddi delweddu cemiluminescence.

1. 3. 8 RT-PCR arbrawf

Dewiswyd tri llygod mawr o bob grŵp i baratoi homogenad meinwe hippocampal. Echdynnwyd cyfanswm yr RNA yn yr hylif meinwe gan y dull Trizol a mesurwyd y crynodiad. Defnyddiwyd pecyn synthesis cDNA ymprydio ar gyfer trawsgrifio o chwith, a pherfformiwyd adwaith mwyhau meintiol fflworoleuedd gan ddefnyddio pecyn meintiol fflworoleuedd i ganfod lefel mynegiant cymharol mRNA protein sy'n gysylltiedig â synaptig. Dadansoddwyd y canlyniadau gan ddefnyddio 2-ΔΔCt. Dangosir y dilyniannau preimio yn Nhabl 1.

Tabl 1 dilyniannau paent preimio RT-PCR

1.4 Dulliau ystadegol

Mynegwyd y canlyniadau data a oedd yn cydymffurfio â'r dosbarthiad arferol fel cymedrig ± gwyriad safonol (x ± s), a pherfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism 9.5. Defnyddiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant i gymharu samplau lluosog, a dangosodd P < 0.05 fod y gwahaniaeth yn ystadegol arwyddocaol.