Gweithgaredd Estrogenig Glycosidau O Cistanche Deserticola Fel Cynorthwyydd Derbynyddion Estrogen mewn Vitro

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

RHAGARWEINIAD

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" yn Tsieinëeg), meddyginiaeth perlysiau Tsieineaidd draddodiadol a gofnodwyd gyntaf yn ShenNongBenCaoJing, wedi'i ddefnyddio ar gyfer trin diffyg arennau, analluedd, rhwymedd henaint, a diffyg gwaed ers miloedd o flynyddoedd.[1] Fe'i dosberthir yn bennaf yn ardaloedd anialwch Gogledd-orllewin Tsieina, megis Gansu a Xinjiang.[2] Dangosodd ymchwil ffarmacoleg fodern y gall C. deserticola hyrwyddo swyddogaethau meddyginiaethol eang, megis rheoleiddio hormonau, imiwnofodiwlaidd, gwrthocsidiol, niwro-amddiffynnol, gwrthlidiol, ac estrogenig.[3,4] Ystyriwyd glycosidau Cistanches (GCs) fel un o'r prif gydrannau gweithredol gydag effeithiau biolegol amrywiol.[5,6]

Derbynyddion estrogen - (ERs- ) ac ER yw'r isdeipiau o'r ERs a allai reoleiddio swyddogaethau ffisiolegol.[7] Gallai'r proteinau hyn reoleiddio trawsgrifiad genynnau targed trwy rwymo dilyniannau rheoleiddio DNA cysylltiedig yn niwclews y gell. Mae'r ddau isdeip wedi'u mynegi'n amlwg yn y systemau nerfol cardiofasgwlaidd a chanolog.[8,9] Mae ER yn bodoli'n bennaf yn y chwarren famari, y groth, yr ofari, yr asgwrn, yr organ atgenhedlol wrywaidd, a'r prostad. Mae ER yn bresennol yn bennaf yn y brostad, yr ofari a'r bledren.[10,11] At hynny, mae rhai rolau ffisiolegol cyffredin ar gyfer y ddau isdeip, megis yn natblygiad a gweithrediad yr ofarïau ac wrth amddiffyn y system gardiofasgwlaidd. [12,13] Datgelodd ymchwil flaenorol yn ein grŵp fecanwaith tebyg i estrogenig GCs trwy'r dull dadansoddi metabolomig.[14] Mewn astudiaeth barhaus, dadansoddwyd mecanwaith gweithgaredd estrogenig GCs ar linellau cell MCF-7 sy'n gysylltiedig ag ERs.

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Offerynnau

Roedd deorydd ECO-170P-230 yn dod o New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., darllenydd microplate Bio-Rad 680, ac roedd cyfarpar electrofforesis o Bio-Rad Laboratories, Inc., microsgop CX21 yn dod o Olympus Co., Ltd. , Daeth system delweddu gel GIS-2019 o Tanon Science and Technology Co, Ltd., roedd y plât gwaelod gwastad yn dod o Corning Inc., roedd cytometreg llif EPICS-XL gan Beckman-Coulter Inc., ac adwaith cadwyn polymeras Amser Real StepOnePlus (PCR) system gan Thermo Fisher Scientific.

Cemegau ac adweithyddion

Paratowyd GCs yn ein labordy fel y dull a adroddwyd yn flaenorol,[14] a phenderfynwyd bod purdeb GCs yn 52 y cant (defnyddiwyd acteoside fel marciwr i bennu'r GCs) gan sbectrophotometreg uwchfioled. Prynwyd Estradiol (E2) gan Yuanye Biotechnology Co, Ltd. (Shanghai, Tsieina). Roedd serwm buchol ffetws (FBS) a RPMI-1640 yn dod o Gibco Co., Ltd., roedd plât gwaelod gwastad 96-ffynnon yn dod o Corning Inc., a dimethyl sulfoxide (DMSO) a 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl Prynwyd ]-2,5-bromid diphenyltetrazolium (MTT) gan Sigma-Aldrich Corporation. Prynwyd adweithydd TRIzol, Reverse Transcription (RT) Kit, a TB Green™ RT-PCR Kit gan TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Tsieina. Prynwyd Anti-ER Rabbit pab, anti-ER Rabbit pab, a gwrthgyrff -actin gan Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Prynwyd yr holl gemegau cyffredin eraill gan gyflenwyr masnachol safonol.

Paratoi sampl

Paratoi glycosidau o doddiant stoc Cistanches

Diddymwyd echdyniad GCs mewn DMSO i wneud hydoddiant stoc gyda'r crynodiad o 0.1051 g/ml a'i storio ar 4 gradd . Defnyddiwyd RPMI-1640 di-goch ffenol i wanhau'r hydoddiant stoc i grynodiadau amrywiol cyn ei ddefnyddio.

Paratoi datrysiad stoc estradiol

Cafodd dyfyniad E2 ei doddi mewn DMSO i wneud hydoddiant stoc gyda'r crynodiad o 0.27 mg/ml a'i storio ar 4 gradd . Defnyddiwyd RPMI-1640 di-goch ffenol i wanhau'r hydoddiant stoc i grynodiadau amrywiol cyn ei ddefnyddio.

Paratoi serwm buchol ffetws wedi'i drin â siarcol dextran

Cymysgwyd cannoedd o fililitrau o FBS â 250 mg o bowdr siarcol wedi'i actifadu a 25 mg o dextran. Ar ôl deor am 45 munud ar 55 gradd, cafodd y gymysgedd ei allgyrchu ar 4 gradd, 1000 rpm am 15 munud. Hidlwyd y supernatant gan ddefnyddio pilen PES Millipore Express i gael y siarcol dextran-drin (CDT)-FBS a'i storio ar −20 gradd .

Diwylliant celloedd

Cafwyd llinellau celloedd MCF-7 canser y fron dynol o'r casgliad diwylliant math Americanaidd (ATCC). Ar ben hynny, cafodd y celloedd eu meithrin â chyfrwng RPMI-1640 yn cynnwys 10 y cant FBS ac 1 y cant penisilin-streptomycin ar 37 gradd o dan awyrgylch CO2 llaith 5 y cant. Cafodd celloedd eu meithrin yn y cyfrwng RPMI-1640 di-goch ffenol sy'n cynnwys 5 y cant CDT-FBS 4 diwrnod cyn assay MTT fel y dylid clirio'r estrogen yn y celloedd.

Dadansoddiad amlhau celloedd o estradiol ar linellau cell MCF-7

Mesurwyd amlhau celloedd gan ddefnyddio'r assay MTT ar gyfer celloedd MCF-7.[15,16] Diddymwyd E2 mewn cyfrwng diwylliant RPMI-1640 yn cynnwys 0.1 y cant DMSO mewn crynodiadau terfynol o {{27) }}.1, 1, 10, 100, a 1000 nM. Cafodd llinellau cell MCF-7 eu meithrin mewn cyfrwng RPMI-1640 di-goch ffenol am 4 diwrnod. Ar ôl golchi â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) dair gwaith, ychwanegwyd 100 µL o gyfrwng RPMI-1640 di-FBS i blatiau 96-ffynnon ar 1.5 × 104 y ffynnon a'i ddeor ar 37 gradd am 24 h. Yn dilyn hynny, cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau amrywiol o'r hydoddiant E2 am 72 h. Yna, ychwanegwyd 100 µL o hydoddiant MTT (0.5 mg/mL) at bob ffynnon. Deorwyd celloedd am 4 h. Yn olaf, ychwanegwyd 150 µL o DMSO i hydoddi'r crisialau formazan. Mesurwyd yr amsugnedd ar 570 nm gan ddarllenydd microplate, a chyfrifwyd y gyfradd amlhau (PR).

Dadansoddiad amlhau celloedd o glycosidau Cistanches ar linellau cell MCF-7

Mesurwyd amlhau celloedd gan ddefnyddio'r assay MTT ar gyfer celloedd MCF-7. Diddymwyd GCs mewn cyfrwng diwylliant RPMI-1640 yn cynnwys 0.1 y cant DMSO mewn crynodiadau terfynol o 0.0175, 0.175, 1.75, 17.5, a 175 µg /ml. Cafodd llinellau cell MCF-7 eu meithrin mewn cyfrwng RPMI-1640 di-goch ffenol yn cynnwys 5 y cant CDT-FBS am 4 diwrnod. Ar ôl golchi gan PBS deirgwaith, ychwanegwyd 100 µL o gyfrwng RPMI-1640 di-FBS i blatiau 96-ffynnon ar 1.5 × 104 y ffynnon a'i ddeor ar 37 gradd am 24 h. Yn dilyn hynny, cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau amrywiol o'r hydoddiant GCs ar gyfer 24, 48, a 72 h, yn y drefn honno. Yna, ychwanegwyd 100 µL o hydoddiant MTT (0.5 mg/mL) at bob ffynnon. Deorwyd celloedd am 4 h. Yn olaf, ychwanegwyd 150 µL o DMSO i hydoddi'r crisialau formazan. Mesurwyd yr amsugnedd ar 570 nm gan ddarllenydd microplate, a chyfrifwyd y PR. RPMI-1640 di-goch ffenol a chyfrwng yn cynnwys E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) oedd y grwpiau negyddol a chadarnhaol, yn y drefn honno.

Dadansoddiad amlhau celloedd o glycosidau Cistanches gyda fulvestrant ar linellau cell MCF-7

Mesurwyd amlhau celloedd gan ddefnyddio'r assay MTT ar gyfer celloedd MCF-7. Diddymwyd GCs mewn cyfrwng diwylliant RPMI-1640 yn cynnwys 0.1 y cant DMSO mewn crynodiadau terfynol o 1.75, 17.5, a 175 µg/ml. Cafodd llinellau cell MCF-7 eu meithrin mewn cyfrwng RPMI-1640 di-goch ffenol yn cynnwys 5 y cant CDT-FBS am 4 diwrnod. Ar ôl golchi gan PBS deirgwaith, ychwanegwyd 100 µL o gyfrwng RPMI-1640 di-FBS i blatiau 96-ffynnon ar 1.5 × 104 y ffynnon a'i ddeor ar 37 gradd am 24 h. Yn dilyn hynny, cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau amrywiol o'r hydoddiant GCs a'u deor â fulvestrant (6.06 × 10 - 5 µg/ml) am 48 h. Yna, ychwanegwyd 100 µL o hydoddiant MTT (0.5 mg/mL) at bob ffynnon. Deorwyd celloedd am 4 h. Yn olaf, ychwanegwyd 150 µL o DMSO i hydoddi'r crisialau formazan. Mesurwyd yr amsugnedd ar 570 nm gan ddarllenydd microplate, a chyfrifwyd y PR. RPMI-1640 di-goch ffenol a chyfrwng yn cynnwys E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) oedd y grwpiau negyddol a chadarnhaol yn y drefn honno.

Assay cylchred celloedd

Diddymwyd GCs mewn cyfryngau diwylliant RPMI-1640 yn cynnwys 0.1 y cant DMSO mewn crynodiadau terfynol o 1.75, 17.5, a 175 µg/ml. Cafodd llinellau cell MCF-7 eu meithrin mewn cyfrwng RPMI-164 0 di-goch ffenol yn cynnwys 5 y cant CDT-FBS am 4 diwrnod. Ar ôl golchi gan PBS deirgwaith, ychwanegwyd 1 ml o gyfrwng RPMI-1640 di-FBS i blatiau 6 ffynnon ar 2.5 × 105 y ffynnon a'i ddeor ar 37 gradd am 24 h. Yn dilyn hynny, cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau amrywiol o'r hydoddiant GCs a'u deor â fulvestrant (6.06 × 10 - 5 µg/ml) am 48 h. Yn dilyn hynny, casglwyd y celloedd a'u golchi â PBS deirgwaith, eu centrifugio ar 4 gradd, 1000 rpm am 10 munud, a'u gosod gyda 70 y cant ethanol ar -20 gradd, dros nos. Ar ôl golchi gyda PBS ddwywaith, cafodd y celloedd eu staenio â hydoddiant PI (50 mg / mL) yn cynnwys 1 mg / mL o RNase A a 0.1 y cant Triton X-100 am 30 munud yn y tywyllwch ar 4 gradd. Canfuwyd y gylchred gell gan ddefnyddio cytometreg llif, a chyfrifwyd mynegai amlhau (PI) fel a ganlyn. RPMI-1640 di-goch ffenol a chyfrwng yn cynnwys E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) oedd y grwpiau negyddol a chadarnhaol, yn y drefn honno. DP=(S ynghyd â G2 M)/(G0 /G1 plws S plws G2 M) × 100 y cant

Ynysu RNA a dadansoddiad adwaith cadwyn polymeras meintiol amser real

I fesur lefel yr mRNA, defnyddiwyd assay PCR meintiol RT (qPCR). Echdynnwyd cyfanswm RNA cellog gydag adweithydd TRIzol. Ar gyfer qPCR, cafodd RNA ei drawsgrifio o chwith i cDNA o 4 µg o gyfanswm RNA gan ddefnyddio pecyn RT. Cynhaliwyd dadansoddiadau RT-PCR gan ddefnyddio TB Green™ RT-PCR Kit. Perfformiwyd yr holl brotocolau yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Y pâr preimio a ddefnyddiwyd i ymhelaethu ar ER oedd 5'‑GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG‑3' (ymlaen) a 5'‑TGGCTGGACACATATAGTCGTT‑3' (cefn); y pâr preimio a ddefnyddiwyd i ymhelaethu ar ER oedd 5'‑AGTGCCGCTTTGGGAGAGCTG-3' (ymlaen) a 5'‑CCTGGGTCGCTGTGACCAGA‑3' (cefn). Yr amodau PCR ar gyfer ER ac ER oedd 94 gradd am 3 munud ac yna 37 a 40 o gylchoedd, yn y drefn honno, o 94 gradd am 30 s, 58 gradd am 2 funud, a 72 gradd am 2 funud. Y pâr preimio a ddefnyddiwyd i ymhelaethu ar GAPDH oedd 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (ymlaen) a 5'-GCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (cefn). Yr amodau PCR ar gyfer GAPDH oedd 94 gradd am 3 munud ac yna 30 cylch o 94 gradd am 30 s, 58 gradd am 2 funud, a 72 gradd am 2 funud. Bob tro roedd arbrawf RT-qPCR yn cael ei ailadrodd fwy na dwywaith. Ar gyfer hyn, defnyddiwyd GAPDH fel rheolaeth fewnol. Cyfrifwyd mynegiant genynnau cymharol ER / ER o transfectants mewn perthynas â chelloedd rheoli: 2−(∆∆Ct).

Blotio gorllewinol

Canfuwyd mynegiant proteinau ER ac ER gan ddadansoddiad blot gorllewinol fel y dull a adroddwyd gyda mân addasiadau. Yn gryno, tyfwyd celloedd MCF-7 mewn platiau 6 ffynnon ar 2.5 × 105 o gelloedd y ffynnon a'u trin â GCs ar y crynodiad terfynol o 1.75, 17.5, a 175 µg/ml am 48 h, yn y drefn honno. Ar ôl deori, paratowyd y darnau cell gyfan gan ddefnyddio byffer RIPA yn cynnwys PMSF 1 mM. Gwahanwyd proteinau yn y darnau celloedd cyfan gan electrofforesis gel dodecyl sylffad-polyacrylamid 12 y cant ac yna'u trosglwyddo i bilenni difluorid polyvinylidene. Cafodd y bilen ei rhwystro gyda 5 y cant (w/v) o laeth sgim wedi'i hydoddi mewn byffer TBST a'i ddeor â gwrthgyrff cynradd ac eilaidd yn eu tro. Arsylwyd gwrthgyrff rhwym.

Dadansoddiad ystadegol

Mynegwyd y canlyniadau fel modd a gwyriadau safonol, a pherfformiwyd arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio prawf-t Student gyda meddalwedd SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

CANLYNIADAU

Ar ôl 24 h o driniaeth E2, roedd cynnydd amlwg yn nifer y celloedd MCF-7 [Ffigur 1a]. Gallai 10nM o doddiant E2 ysgogi twf y celloedd yn amlwg (123.89 y cant). Fodd bynnag, gyda chynnydd crynodiad E2, gwanhaodd gallu amlhau celloedd. Felly, 10nM oedd y crynodiad gorau posibl o E2 yn yr arbrawf hwn.

Gallai grŵp GCs yn y crynodiadau o 1.75, 17.5, a 175 µg/mg wella amlder y llinellau celloedd MCF-7 gyda modd sy'n dibynnu ar amser a dos a dangosodd wahaniaeth sylweddol gyda grŵp negyddol [Ffigur 1b]. O'i gymharu â grŵp negyddol, dangosodd grŵp E2 amlhau amlwg (120.06 y cant ).

Deorwyd grŵp meddyginiaeth cyfun (CMG) (fulvestrant ag E2 neu GCs) yn y cyfrwng CDT-FBS â chelloedd MCF-4. Ar ôl 72 h o ddeor, gallai CMG arwain at y gogwydd o PR o'i gymharu â'r grŵp meddyginiaeth unigol (IMG) (P < 0.01)="" [ffigur="">

Dangosodd dadansoddiad cytometreg llif y gallai GCs gynyddu'r gwerth DP ychydig, sy'n awgrymu y gallai GCs symud celloedd cyfnod G{{{{{{{}}}}/G1 ymlaen i gamau S a G2/M [Ffigur 2 a Thabl 1] a hybu DNA celloedd synthesis. Roedd y canlyniad yn nodi bod mecanwaith GCs ar MCF-7 yn debyg i un E2. Yn CMG (fulvestrant gyda GCs), roedd gwerth DP cell PI yn dirywio i werth IMG ychydig (P <>

Dangosodd dadansoddiad RT-PCR fod mynegiadau ER ac ER mRNA wedi'u cynyddu o'u cymharu â'r grŵp rheoli (P < 0.01) mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​ar ôl cael ei drin gan grynodiadau gwahanol o GCs am 48 h [Ffigur 3a a b].

Canlyniad blot y gorllewin yn nodi, ar ôl triniaeth gyda chrynodiadau amrywiol o GCs am 48 h, bod cynnwys proteinau ER ac ER yn MCF-7 yn cynyddu gyda'r GCs wedi cynyddu fel modd sy'n dibynnu ar ddos ​​[Ffigur 3c-e]

CASGLIAD

Yn yr ymchwil hwn, cafodd effaith GCs ar amlder a chylchred celloedd MCF-7 ei fesur gan y dull MTT a sytometreg llif, yn y drefn honno. Gallai GCs gynyddu amlder celloedd MCF-7 ar y crynodiad o 1.75, 17.5, a 175 µg/ml ar ôl eu deor am 72 h. Fodd bynnag, mae'r cynnydd yn tueddu i arafu pan ddefnyddiwyd CCs a fulvestrant gyda'i gilydd. Gallai GCs gynyddu gwerth DP celloedd MCF-7, lleihau cell y cyfnod G1, a chynyddu cell y cyfnodau S a G2.

Mae Fulvestrant yn wrthwynebydd ER-benodol, sy'n rhwystro lleoleiddio niwclear ER trwy amharu ar bylu derbynyddion a thrafnidiaeth niwclear sy'n dibynnu ar ynni.[17] Yn yr ymchwil hwn, mae casgliad wedi cadarnhau y gall fulvestrant wanhau'r toreth o GCs ar gelloedd MCF-7, a gallai effeithio ar y trawsnewid cylchred celloedd. Felly, nododd yr astudiaeth hon weithgaredd estrogenig GCs, a hefyd, ER yw targed GCs. Yn yr arbrawf RT-PCR a blot gorllewinol, cynyddodd mRNA a mynegiadau protein o ER ac ER yng nghelloedd MCF-7 gyda chynnydd crynodiad GCs. Felly, gall GCs chwarae rhan mewn gweithgaredd estrogenig yn ôl mRNA wedi'i ddadreoleiddio a phroteinau ER ac ER .