Mae DNA allfeirysol mewn Paratoadau Fector Feirysol sy'n Gysylltiedig ag Adeno yn Ysgogi Ymatebion Imiwnedd Cynhenid ​​sy'n ddibynnol ar TLR9 mewn Celloedd Dendritig Plasmacytoid Dynol

Mae ataliadau fector firaol sy'n gysylltiedig ag adeno (AAV) a gynhyrchir naill ai mewn celloedd HEK sy'n deillio o bobl neu mewn celloedd pryfed Spodoptera frugiperda (Sf9) yn wahanol o ran cydrannau celloedd gwesteiwr gweddilliol yn ogystal ag addasiadau ôl-gyfieithu sy'n benodol i rywogaethau a ddangosir ar y proteinau capsid AAV. . Yma fe wnaethom ddadansoddi effaith y gwahaniaethau hyn ar briodweddau imiwnogenig y fector. Fe wnaethom ysgogi celloedd dendritig plasmacytoid dynol gyda llawer o fectorau HEK a gynhyrchwyd gan gell a Sf9 AAVCMV-eGFP a gynhyrchwyd gan gelloedd yn deillio o wahanol weithgynhyrchwyr. Canfuom fod fectorau AAV8-CMV-eGFP yn ogystal ag AAV2-CMV-eGFP2-fectorau CMV-eGFP wedi ysgogi ymatebion cytocin llidiol sy'n benodol i lawer ond nid yn llwyfan-benodol i gynhyrchu nac yn wneuthurwr-benodol. Gallai'r rhain gael eu lleihau neu eu diddymu trwy rwystro signalau derbynnydd 9 tebyg i dollau neu drwy leihau'n enzymatically DNA yn y lotiau fector gan ddefnyddio DNase. Dangosodd trawsgludiad celloedd HEK llwyddiannus gan lotiau AAV wedi'u trin â DNase a dadansoddiadau DNA nad oedd DNase yn effeithio ar gyfanrwydd y fector ond yn diraddio DNA allfeirysol. Rydym yn dod i'r casgliad y gall paratoadau AAV sy'n deillio o gell HEK- a Sf gynnwys cydrannau DNA all-feirysol imiwnogenig a all sbarduno ymatebion imiwn llidiol sy'n benodol i lawer. Mae hyn yn awgrymu y gallai gwell strategaethau i gael gwared ar amhureddau DNA all-firaol fod yn allweddol i leihau priodweddau imiwnogenig paratoadau fector AAV.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Yn ystod y degawd diwethaf gwelwyd diddordeb aruthrol yn natblygiad strategaethau ailgyfunol newydd yn seiliedig ar firws adeno-gysylltiedig (AAV) ar gyfer ymchwil sylfaenol a chymwysiadau clinigol1–3. Y prif reswm yw'r ffaith bod fectorau AAV wedi bod yn offer hynod amlbwrpas ym maes therapi genynnau o ystyried eu gallu i gyflenwi genynnau therapiwtig yn effeithlon ac yn ddiogel i feinweoedd targed4. Fodd bynnag, mae nifer cynyddol o ymchwilwyr yn adrodd yn annibynnol ar ganfyddiadau sy'n awgrymu ymatebion imiwn lleol a systemig ar ôl cyflwyno AAV mewn astudiaethau cyn-glinigol a chlinigol5-8.

Dangoswyd bod fectorau AAV yn actifadu derbynyddion adnabod patrwm imiwnedd cynhenid ​​​​fel derbynnydd tebyg i doll (TLR)2 a TLR9 gan arwain at ryddhau cytocinau llidiol ac interfferonau math I (IFN)9,10. Mae cydrannau imiwnogenig AAV a allai ysgogi'r ymatebion hyn yn cynnwys proteinau capsid a genom fector9,10. Gallai ymatebion imiwn ar ôl cymhwyso AAV hefyd gael eu sbarduno gan amhureddau yn yr ataliad fector5,11. Mae'r amhureddau hyn wedi'u diffinio fel unrhyw gydran sy'n bresennol yn yr ataliad fector AAV wedi'i buro ac eithrio'r cynnyrch dymunol12 ac maent yn deillio o broses gynhyrchu'r fector. Mae dau o'r prif ddulliau o gynhyrchu fectorau AAV ailgyfunol clinigol yn ymwneud â thrawsnewid DNA plasmid i gelloedd HEK a heintio celloedd pryfed Spodoptera frugiperda (Sf9) â bacoluvirus13. Yn unol â hynny, gallai amhureddau imiwnogenig posibl sydd wedi'u cynnwys mewn ataliadau fector AAV gynnwys endotocsinau, cydrannau cyfrwng meithrin celloedd, adweithyddion a ddefnyddir ar gyfer puro AAV, proteinau a DNA sy'n deillio o gelloedd cynnal, a DNA bacwlofirol gweddilliol neu DNA plasmid5. Ffactorau ychwanegol a allai ddylanwadu ar imiwnogenigrwydd ataliadau fector AAV yw addasiadau ôl-gyfieithu (PTMs) a argraffwyd i'r capsid gan y gwahanol lwyfannau cynhyrchu fector5. Yn bwysig, mae fectorau AAV sy'n deillio o gelloedd HEK a Sf9 yn amrywio'n fawr o ran eu PTMs, eu amhureddau protein celloedd gwesteiwr gweddilliol11, ac o bosibl hefyd yn eu amhureddau DNA (DNA cell HEK vs. DNA cell Sf9 yn ogystal â DNA plasmid gweddilliol vs. DNA bacwlofirol)14. Mae celloedd dendritig Plasmacytoid (pCDs) yn fath o gelloedd imiwnedd cynhenid ​​​​arbenigol sy'n rhyddhau llawer iawn o IFN math I a chytocinau pro-lidiol ar heintiau firaol9,15 ac yn chwarae rhan fawr wrth synhwyro fectorau AAV9. Yn unol â hynny, i ddadansoddi a yw'r gwahaniaethau rhwng fectorau AAV a gynhyrchir gan gell HEK a Sf9-fectorau AAV a gynhyrchir gan gell yn arwain at wahaniaethau yn eu priodweddau imiwnogenig, fe wnaethom ysgogi PDCs dynol gyda llawer gwahanol o'r un fector AAV a gafwyd o'r ddwy system gynhyrchu. a gweithgynhyrchwyr gwahanol. Canfuom fod hanner y lotiau fector a archwiliwyd yn ennyn ymatebion imiwn pro-lidiol penodol i lawer nad oeddent yn gysylltiedig â'r system cynhyrchu fector na'r gwneuthurwr. Cafodd yr ymatebion hyn eu cyfryngu gan signalau TLR9 ac roeddent yn agored i driniaeth y lotiau fector gyda DNA. Awgrymodd trawsgludiad celloedd HEK llwyddiannus gan lotiau fector AAV heb ei drin a DNase a dadansoddiadau DNA o baratoadau AAV nad oedd DNase yn effeithio ar gyfanrwydd gronynnau AAV ond yn hytrach yn targedu DNA all-feirws heb ei amgáu. Gyda'i gilydd, mae hyn yn awgrymu y gall paratoadau fector AAV gynnwys DNA allfeirysol heb ei amgáu a all ddylanwadu ar briodweddau imiwnogenig paratoadau fector AAV mewn pDCs dynol.

Manteision cistanche tubulosa- cryfhau'r system imiwnedd

Canlyniadau

Mae AAV yn ysgogi ymatebion imiwn cynhenid ​​​​lot-benodol mewn pDCs dynol.

Mae astudiaethau wedi dangos bod fectorau AAV sy'n deillio o gelloedd HEK, ac yn deillio o gelloedd Sf9, yn wahanol o ran eu PTMs a'u amhureddau sydd wedi'u cynnwys yn yr ataliadau firaol11. Fe wnaethom ragdybio y gallai'r ffactorau hyn arwain at wahaniaethau yn y priodweddau imiwnogenig rhwng lotiau fector sy'n deillio o gelloedd HEK ac Sf9. I brofi'r ddamcaniaeth hon, dadansoddwyd cyfanswm o wyth lot fector seroteip AAV 8 (AAV8) yn cynnwys yr un dilyniant DNA o hyrwyddwr cytomegalovirws (CMV) a'r un trawsgene union yr un fath ar gyfer y protein fflworoleuedd gwyrdd gwell (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; pum lot sy'n deillio o gell HEK a thair Sf9) a phedair lot AAV2-CMV-eGFP (dwy lot sy'n deillio o gell HEK- a dwy Sf9) gan dri gwneuthurwr gwahanol [gwneuthurwr A; Cyfleuster Craidd Fector Feirysol Prifysgol Iowa (Iowa, UDA), gwneuthurwr B; Virovek (CA, UDA) a gwneuthurwr C; Biowyddorau Vigene (MD, UDA)]. Er mwyn gwneud y mwyaf o debygrwydd ymhlith y lotiau, cynhyrchwyd y saith lot AAV8 gan wneuthurwr A a gwneuthurwr B (Tabl 1) gan ddefnyddio'r un plasmid gwreiddiol. Yn ogystal, perfformiwyd cofrestriad PCR digidol droplet (ddPCR) o genomau fector (vg) y lotiau fector AAV mewn mesuriad ochr yn ochr gan ddefnyddio dau darged gwahanol: un yn y dilyniant CMV a'r llall o fewn y dilyniant eGFP o y fectorau. Defnyddiwyd canlyniadau a gafwyd trwy feintioli'r targed CMV ar gyfer titradiad y lotiau fector AAV yn yr arbrofion canlynol (Tabl 1). Mae pDCs yn synwyryddion firaol arbenigol sy'n cynhyrchu IFNs math I yn aruthrol ar haint firaol15, gan gynnwys fectorau AAV9. Er mwyn ymchwilio i weld a yw fectorau AAV a gynhyrchir gan gelloedd HEK a Sf9-wedi'u cynhyrchu gan gelloedd yn wahanol o ran eu gallu i ennyn ymatebion imiwn cynhenid ​​​​mewn celloedd imiwnocompetent, fe wnaethom ysgogi pDCs dynol gyda'r lotiau fector AAV a restrir uchod. I'r perwyl hwn, cafodd pDCs eu puro o gelloedd mononiwclear gwaed ymylol (PBMCs) rhoddwyr dynol iach unigol trwy ddetholiad negyddol gan ddefnyddio didoli celloedd magnetig actifedig (MACS). Cadarnhaodd dadansoddiad cytometreg llif purdeb y pDCs ynysig o dros 90% (Ffig. S1). Cafodd deg, pDC o roddwr unigol eu hadu a'u hysgogi gyda lotiau fector AAV8 ac AAV2 ar MOI o 1: 1 × 106 vg / cell am 18 h. Mae'r MOI o 1:106 vg/cell a gymhwyswyd i gyfanswm o 12.500 o gelloedd mewn 50 ul/well yn trosi'n titer o 2.5 × 1011 vg/ml. Defnyddiwyd y titer hwn oherwydd ei fod o fewn ystod yr hyn a ddefnyddir mewn astudiaethau therapi genynnau retina mewn bodau dynol (ee 1 × 1012 vg/ ml16 neu 4 × 1011–1.3 × 1012 vg/ml17) ac archesgobion nad ydynt yn ddynol (ee 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6 ). Roedd ysgogiad gyda'r cerbyd yn gweithredu fel rheolaeth. Ni arweiniodd deori gyda lotiau fector AAV8 ac AAV2 at unrhyw fynegiant trawsgen y gellir ei ganfod mewn pDCs. Fodd bynnag, mae pedair o'r wyth lot AAV8 (lotiau A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) a dwy o'r ysgogodd pedair lot AAV2 (lotiau B-Sf9-1, B-Sf9-2) amlhau celloedd adweithiol yn y pDCs a ysgogwyd (Ffig. 1a). Ynghyd â hyn, rhyddhawyd cytocinau pro-llidiol (IP-10, MIP-1, a TNF- ) a math I IFN (IFN- ). I'r gwrthwyneb, ni ysgogwyd amlhau celloedd na rhyddhau cytocin gan yr AAV8 sy'n weddill (llawer A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92}) }) a lotiau AAV2 (lotiau C-HEK-1, C-HEK-2). Cadarnhawyd y canlyniadau hyn mewn tri i bedwar arbrofion annibynnol bob un yn perfformio gyda chelloedd un rhoddwr unigol ( Ffig. 1a - c a Thabl S1 ). Cafodd gwahaniaethau penodol i lot yn y crynodiadau cytocin yn yr arbrofion annibynnol hyn eu dadansoddi'n ystadegol gan ddefnyddio model effaith gymysg llinol a phrawf post hoc Dunnett (Q=2.6) drwy gymharu'r moddau lleiaf sgwâr o'r gwahanol lotiau fector AAV â rheolaeth y cerbyd (Tablau S2 a S3). Roedd hyn yn dangos gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol yn yr ymatebion cytocin rhwng lotiau fector AAV "imiwnogenig" (lotiau AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}}, neu lotiau AAV2 B-Sf9-1, B-Sf9-2 yn y drefn honno) a rheolaeth ond dim gwahaniaethau arwyddocaol rhwng lotiau fector AAV "animiwnogenig" (lotiau AAV8 A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 neu AAV2 lot C-HEK-1, C-HEK-2 yn y drefn honno) a rheolaeth (Tabl S3). Roedd crynodiadau gweddill y cytocinau mesuredig a gynhwyswyd yn yr assay amlblecs naill ai yn is na'r ystod assay (hy, IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN- ) na'r "imiwnogenig" nac ychwaith ysgogodd y lotiau fector nad ydynt yn imiwnogenig unrhyw gynnydd sylweddol yn eu rhyddhau (hy, IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (Ffig. S2), gan awgrymu rhywfaint o benodolrwydd yn yr ymateb cytocin wedi'i gyfryngu gan AAV. Er mwyn ymchwilio i ymatebion cytocin ar bwynt amser cynharach, ysgogwyd pDCs gyda'r lot fector AAV8 "imiwnogenig" A-HEK-1. Gwelsom gynnydd sylweddol yn y crynodiad o TNF- yn y supernatant eisoes ar 2 awr ar ôl ysgogiad PDC. Gallai'r patrwm ymateb hwn gael ei gadarnhau mewn tri arbrawf, pob un yn perfformio gyda chelloedd un rhoddwr unigol ( Ffig. S3 ). Er mwyn ymchwilio i weld a oedd dos uwch o fector AAV8 "nad yw'n imiwnogenig" yn gallu sbarduno ymateb imiwn, fe wnaethom ysgogi PDCs gyda'r MOI mwyaf cymwys yn dechnegol (1: 4.61 × 106 vg). Yn ddiddorol, ni chanfuwyd amlder celloedd adweithiol nac ymatebion cytocin ar ysgogiad gyda'r titer cynyddol hwn (Ffig. S4). Yn groes i'n rhagdybiaeth, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod ymatebion imiwn cynhenid ​​​​i AAV mewn pDCs yn llawer-benodol ac nad oeddent yn gysylltiedig â system gynhyrchu benodol neu ddull gwneuthurwr / puro.

Tabl 1. Llawer gwahanol o fectorau firaol AAV8 ac AAV2 a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon.

Ffigur 1. Sefydlu ymatebion imiwn lot-benodol fector AAV mewn pDCs dynol. Ysgogwyd pDCs dynol gyda gwahanol lawer o AAV8-CMV-eGFP ac AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1 × 106 vg) am 18 h (a) Delweddau maes llachar cynrychioliadol o PDCs wedi'u hysgogi gyda rheoli cerbydau (delwedd uchaf) neu lot fector AAV imiwnogenig (delwedd is). Y bar graddfa yw 100 μm. (b) Rhyddhau cytocine o IP-10, MIP-1 , TNF- , ac IFN- 2 gan pDCau wedi'u hysgogi gan AAV8-. (C) Rhyddhau cytocin gan AAV2-pDCs wedi'u hysgogi. Plotiau cynrychioliadol o un o dri i bedwar arbrawf annibynnol. Gan fod rhai gwerthoedd yn y mesuriadau IFN- 2 (b,c) a TNF- mesuriad (c) wedi disgyn o dan yr ystod assay, ychwanegwyd y cysonyn 1 at yr holl werthoedd IFN- 2 a TNF- a fesurwyd ar gyfer cyflwyniad mewn plot lled-logarithmig. Dangosir canolrifau ac ystodau rhyngchwartel. Yn labeli'r lotiau fector unigol cynrychiolir y tri gwneuthurwr gan y llythrennau A, B, ac C; Mae fectorau sy'n deillio o gell HEK a Sf9-yn cael eu dynodi gan "HEK a "Sf9" ac mae lotiau cyfatebol o'r un gwneuthurwr a'r un system gynhyrchu wedi'u rhifo "1, 2, 3". Cylch: Deillio HEK lot fector; triongl: lot fector yn deillio o Sf9-; du: lot fector gan wneuthurwr A; oren: lot fector gan wneuthurwr B; gwyrdd: lot fector gan wneuthurwr C.

Nid yw'r ymateb imiwn i ysgogiad AAV mewn pDCs yn cael ei ddylanwadu gan wahaniaethau yn y gymhareb capsid / VG.

Mae astudiaethau rhag-glinigol wedi dangos y gall gwahaniaethau yn nifer y gronynnau fector llawn a gwag mewn ataliadau fector AAV ddylanwadu ar ymateb imiwn18. Er mwyn asesu a oedd y gwahaniaethau mewn priodweddau imiwnogenig rhwng y lotiau fector a ddadansoddwyd o ganlyniad i wahaniaethau yn y gymhareb o ronynnau fector llawn a gwag, fe wnaethom bennu titer capsidau fector ym mhob lot AAV yn ôl titradiad AAV ELISA a chyfrifo'r capsid/VG cymhareb. Yn ddiddorol, canfuwyd gwahaniaethau mawr yn y gymhareb capsid/vg rhwng yr holl lotiau AAV (Ffig. 2). Canfuwyd tua dwywaith yn fwy o gapsidau na vg (2:1) mewn lotiau AAV8-CMV-eGFP A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } ac AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; a phedair gwaith yn fwy (4:1) yn lot AAV8 A-Sf9-1. Gwelwyd cymhareb 1:1 yng ngweddill y lotiau. Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol rhwng cymarebau capsid/vg o lotiau fector AAV "imiwnogenig" ac "animiwnogenaidd" yn AAV8 (P=0.27) nac yn AAV2 (P=0.37) lotiau fector (Ffig. 2). Mae hyn yn awgrymu nad oedd y gwahaniaethau rhwng priodweddau imiwnogenig y lotiau fector AAV a ddadansoddwyd ychwaith yn gysylltiedig â gwahaniaethau yn y gymhareb o ronynnau fector llawn a gwag.

budd-daliadau atodiad cistanche-sut i gryfhau system imiwnedd

Cydnabyddiaeth o lotiau fector AAV8 "imiwnogenig" gan TLR9.

Dangoswyd bod adnabyddiaeth imiwn gynhenid ​​​​AAV gan pDCs murine a dynol yn cael ei gyfryngu gan synhwyro DNA TLR99. Yn unol â hynny, gwnaethom werthuso a oedd TLR9 hefyd yn ymwneud â chydnabod ein lotiau fector AAV8 "imiwnogenig". I'r perwyl hwn, cafodd pDCs eu hadu fel y disgrifiwyd a'u meithrin gyda'r antagonist TLR9 H154 (50 µM) ac yna ysgogiad gyda'r lot fector AAV8 "imiwnogenig" A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3, ac A-Sf9-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). Ar ôl 18 h, ni welwyd unrhyw dystiolaeth o amlhau celloedd (Ffig. 3a) a mesurwyd gostyngiad sylweddol yn y rhyddhad IP-10, MIP-1 , TNF- , ac IFN- , (Ffig. 3b). Mae hyn yn dangos bod ymatebion imiwn i lotiau fector AAV8 "imiwnogenig" mewn pDCs dynol yn cael eu cyfryngu gan signalau TLR9.

Ffigur 2. Cymharu cymarebau capsid/vg rhwng gwahanol AAV8-CMV-eGFP ac AAV2-lotiau fector CMV-eGFP. Mae cymarebau capsid/vg te yn deillio o fesuriadau amsugnedd (ELISA) a chanlyniadau ddPCR o (a) wyth lot fector AAV8 a (b) pedair lot fector AAV2. Mae llinellau toredig yn gwahanu “imiwnogenig” oddi wrth lotiau fector AAV “di-imiwnogenig”. Mae barrau'n dynodi modd a gwyriadau safonol o atgynhyrchiadau. Penderfynwyd ar arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr heb ei baru.

Ffigur 3. Mae cydnabyddiaeth o lotiau fector AAV "imiwnogenig" gan pDCs yn dibynnu ar TLR9. Cafodd pDCs dynol eu trin â'r antagonist TLR9 H154 (50 μM) ac yna ysgogiad gyda lotiau fector AAV8 "imiwnogenig" (MOI: 1:1 × 106 vg) am 18 h. (a) Delweddau maes llachar cynrychioliadol o pDCs wedi'u puro wedi'u trin â lotiau fector AAV "imiwnogenig" (delwedd uchaf) neu lotiau fector AAV "imiwnogenig" a H154 (delwedd is). Y bar graddfa yw 100 μm. (b) Rhyddhad cytocin o IP-10, MIP-1 , TNF- , ac IFN- 2 gan pDCs wedi'u hysgogi. Gan fod rhai gwerthoedd yn is na'r amrediad assay yn y mesuriadau IFN- 2, ychwanegwyd y cysonyn 1 at yr holl werthoedd IFN- 2 a fesurwyd i'w cyflwyno mewn plot lled-logarithmig. Dangosir moddion a gwyriadau safonol. Penderfynwyd ar arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio dadansoddiad post hoc ANOVA unffordd a Holm-Sidak. Gwerthoedd P: Llai na neu'n hafal i 0.05: *; Llai na neu'n hafal i 0.01:**; Llai na neu'n hafal i 0.001: ***.

Mae triniaeth DNase yn lleihau ymatebion imiwn o lotiau fector AAV8 ac AAV2 "imiwnogenig".

Er bod fectorau AAV8 "imiwnogenig" wedi ennyn ymateb imiwn dibynnol TLR mewn pDCs, ni ysgogwyd unrhyw ymatebion o'r fath gan y lotiau "animiwnogenig". Mae TLR9 yn cael ei actifadu mewn ymateb i DNA, yn enwedig DNA sy'n cynnwys motiffau CpG anmethylated9. Yn bwysig, cadarnhaodd ein mesuriadau ddPCR fod yr un cydrannau DNA firaol yn bresennol mewn lotiau fector "imiwnogenig" ac "animiwnogenig". Gyda’i gilydd, roedd hyn yn awgrymu y gallai DNA heb ei becynnu/rhydd yn yr ataliad firaol yn hytrach na’r DNA mewnfeirysol fod yn gyfrwng achosol yr ymatebion imiwn a arsylwyd i lotiau fector AAV “imiwnogenig”. Felly, pe bai DNA rhydd gweddilliol yn bresennol yn ataliad firaol y fector AAV8 "imiwnogenig", dylai'r ymateb imiwn cynhenid ​​​​gael ei wanhau gan DNase. I brofi'r ddamcaniaeth hon, cafodd lotiau fector AAV8 ac AAV2 “imiwnogenig” eu trin ymlaen llaw gyda DNase I (100 µg/ml) am 30 munud cyn ysgogiad AAV. Er mwyn eithrio effeithiau amhenodol triniaeth DNase ar y pDCs neu'r gronynnau AAV, yn yr ysgogiadau AAV yn unig, roedd y fectorau yn destun triniaeth DNasemock cyn ysgogiad pDC. Yn y triniaethau ffug hyn heb DNase, cafodd y gronynnau AAV eu deor ar 37 gradd mewn cyfrwng treulio unfath DNase am yr un cyfnod o amser â'r AAVs a driniwyd gan DNase. Cafodd deg, pDC eu hadu a'u hysgogi gyda'r lotiau fector AAV "imiwnogenig" DNase a gafodd ei drin ymlaen llaw neu ei ffug-drin (MOI: 1: 1 × 106 vg). PDCs a ddeorwyd â DNase yn unig neu a gafodd eu trin â ffug gyda cherbyd a wasanaethir fel rheolyddion. Yn ddiddorol, roedd triniaeth DNase o lotiau fector "imiwnogenig" AAV8 ac AAV2 wedi lleihau amlhau celloedd adweithiol (Ffig. 4a) a naill ai wedi'u diddymu'n llwyr (lotiau AAV8 A-HEK-2 ac A-Sf9-1; lotiau AAV2; B-Sf9-1 a B-Sf9-2) neu leihau'n sylweddol (AAV8 lot A-HEK-1 ac A-HEK-3) rhyddhau IP{{40} }, MIP-1 , TNF- ac IFN- ar ôl ysgogiad AAV (Ffig. 4b,c). I gadarnhau bod yr effaith DNase a arsylwyd wedi'i achosi mewn gwirionedd gan dreulio DNA all-firaol ac nid gan effaith y DNase ar gyfanrwydd y fector, gwnaethom ymchwilio i weld a oedd triniaeth DNase o lotiau fector AAV yn effeithio ar allu trawsgludo AAV. Gan na arweiniodd y cymhwysiad AAV at unrhyw drawsgludiad pDC canfyddadwy, defnyddiwyd celloedd HEK ar gyfer y profion hyn gan fod celloedd HEK yn fodel celloedd adnabyddus i ddadansoddi effeithlonrwydd trawsgludo ar drawsgludiad AAV19. Fe wnaethom ysgogi celloedd HEK293T gyda lotiau fector AAV8 ac AAV2 wedi'u trin gan DNase a'u trin â ffug (MOI: 1: 8 × 104 vg) a gwerthuso'r effeithlonrwydd trawsgludo trwy ficrosgopeg fflworoleuedd 3 diwrnod ar ôl cymhwyso fector. Fel y disgrifiwyd, dangosodd fectorau AAV2 nerth trawsgludo uwch o gymharu â fectorau AAV8. Yn bwysig, ar ben hynny, nid oedd rhag-driniaeth gyda DNase wedi lleihau'r effeithlonrwydd trawsgludo yn y lotiau fector sy'n deillio o HEK nac yn lotiau fector AAV8 ac AAV2 sy'n deillio o gell Sf (Ffig. S5a,b). Mae'r canlyniadau hyn yn darparu tystiolaeth bellach bod effaith DNase ar briodweddau imiwnogenig y lotiau fector yn deillio o ddiraddio'r DNA all-feirws. Er bod yr antagonist TLR9 H154 yn ei hanfod wedi diddymu rhyddhau cytocinau pro-lidiol ar gyfer pob un o'r pedair lot AAV8 imiwnogenig (Ffig. 3), gallai rhag-driniaeth DNase hefyd ddileu'r ymateb cytocin pro-llidiol ar gyfer lotiau AAV8 A-HEK{{75} } ac A-Sf9-1, er na wnaeth ei ddileu yn gyfan gwbl ar gyfer lotiau AAV8 A-HEK-1 ac A-HEK-3 (Ffig. 4). Er mwyn profi a allai mwy o amser triniaeth DNase ddiddymu'r ymateb cytocin hwn, gwnaethom ailadrodd arbrofion efelychu pDCs yn dilyn cynnydd deg gwaith yn amser deori DNase yn y lotiau priodol (A-HEK-1 ac A-HEK{{87}). }). Gwelsom, ar ôl triniaeth DNase o'r fectorau am 5 h, fod y crynodiadau cytocin cymedrig yn uwchnatur y celloedd a symbylwyd gan AAV wedi gostwng ymhellach gan nad ydynt bellach yn sylweddol wahanol i reolaeth cerbydau. Gallai'r patrwm ymateb hwn gael ei gadarnhau mewn tri arbrawf, pob un yn perfformio gyda chelloedd un rhoddwr unigol ( Ffig. S6 ). Mae hyn yn awgrymu mai achos canolog yr ymateb imiwn pro-lidiol dibynnol TLR mewn pDCs yn wir yw DNA all-firaol. Er mwyn profi a yw rhyddhau DNA o fewn firaol yn cynyddu gweithgaredd imiwn-ysgogol fectorau AAV, fe wnaethom agor capsidau firaol y lot AAV8 "imiwnogenig" A-HEK-1 yn fwriadol trwy driniaeth wres ar 95 gradd am 10 munud . Yna defnyddiwyd y lot fector wedi'i drin â gwres i ysgogi pDCs. Er nad oedd unrhyw wahaniaethau yn yr ymlediad celloedd adweithiol ar ysgogiad AAV8 lot A-HEK{-1 gyda thriniaeth wres a hebddo, bu cynnydd sylweddol mewn rhyddhau IP-10, MIP-1 , TNF- ac IFN- yn y cyflwr wedi'i drin â gwres, sy'n nodi y gall rhyddhau DNA firaol wedi'i grynhoi i'r ataliad fector gyfrannu at sefydlu ymatebion imiwnedd (Ffig. 5). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos y gall paratoadau fector AAV gynnwys halogion DNA all-feirysol a all sbarduno ymatebion imiwn sy'n benodol i lawer mewn pDCs. Caiff yr ymatebion hyn eu cyfryngu gan signalau TLR9 a gellir eu lleihau/dileu trwy drin y lotiau fector gyda DNA.

Ffigur 4. Mae rhag-driniaeth DNase yn lleihau ymatebion imiwn a achosir gan AAV "imiwnogenig"8-CMV-eGFP ac AAV{4}}lotiau fector CMV-eGFP. Ysgogwyd pDCs dynol gyda lotiau fector AAV8 "imiwnogenig" wedi'u trin gan DNase am 18 h (MOI: 1: 1 × 106 vg). (a) Delweddau ffelt llachar cynrychioliadol o pDCs wedi'u puro wedi'u hysgogi â lotiau fector AAV "imiwnogenig" (delwedd uchaf) a lotiau fector AAV "imiwnogenig" wedi'u trin ymlaen llaw gyda 1{{30}} 0 ug/ ml o DNase I (delwedd is). Y bar graddfa yw 500 μm. (b) Rhyddhau cytocin o IP-10, MIP-1 , TNF- , ac IFN- 2 gan pDCau wedi'u hysgogi gan AAV8-. (c) Rhyddhau cytocinau gan AAV{2-pDCs wedi'u hysgogi. Oherwydd yn y mesuriadau IFN- 2 (b ac c) a mesuriad TNF- (b), disgynnodd rhai gwerthoedd o dan yr ystod assay, ychwanegwyd y cysonyn 1 at yr holl werthoedd IFN{- 2 a fesurwyd ar gyfer cyflwyniad mewn plot lled-logarithmig. Dangosir moddion a gwyriadau safonol. Pennwyd arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio dadansoddiad post hoc ANOVA unffordd a Holm-Sidak. Gwerthoedd P: Llai na neu'n hafal i 0.05: *; Llai na neu'n hafal i 0.01:**; Llai na neu'n hafal i 0.001: ***.

Dadansoddiad archwiliadol o halogion DNA all-firaol mewn paratoadau fector AAV8.

Er mwyn cyflawni'r nodweddiad archwiliadol cyntaf o'r cydrannau DNA all-firaol yn y lotiau fector AAV, mae cynrychiolydd "imiwnogenig" (A-HEK-1) ac "animiwnogenig" (B-HEK-1) Dadansoddwyd lot fector sy'n deillio o gelloedd HEK. Cafodd y lotiau hyn naill ai eu trin gan DNase mewn cyfrwng pDC am 30 munud ar 37 gradd fel y disgrifir uchod, neu cawsant eu trin yn ffug a'u hidlo'n uwch gan ddefnyddio dyfais hidlo toriad 100 kDa, neu cawsant eu trin yn ffug (Ffig. S7a-). g). Datgelodd gwahanu Biodadansoddwr LabChip yn olynol ac asesiad o'r DNA puredig bresenoldeb symiau tebyg o DNA fector (Ffig. S7b–g) mewn samplau wedi'u trin a'u ffug-drin o bob lot gan gadarnhau nad oedd uwch-hidlo na thriniaeth DNase wedi dylanwadu ar y cynnwys DNA tu mewn i'r capsid. Yn ogystal, dangosodd mai dim ond yr "imiwnogenig" (Ffig. S7a-d) ond nid y lot fector "di-imiwnogenig" (Ffig. S7a, e-g) oedd yn cynnwys moleciwlau DNA ychwanegol yn amrywio o ran maint o 100 i 450 bp (Ffig. .S7c,d a h). Yn bwysig, gallai'r rhain moleciwlau DNA ychwanegol yn cael eu canfod yn y sampl ffug-drin a'r sampl ultra-hidlo ond roedd bron yn absennol yn y sampl DNA-drin ( Ffig. S7a - d ). Mae hyn yn dangos bod y moleciwlau DNA hyn yn cynrychioli halogion DNA allfeirysol y gellir eu diraddio gan DNase ond na ellir eu tynnu o'r daliant fector trwy uwch-hidlo. Mae cyllid na ellid canfod yr halogion hyn ond yn y lot fector "imiwnogenig" ond nid yn y lot fector "animiwnogenig" yn profi bod digwyddiad y moleciwlau DNA all-firaol hyn yn benodol i lawer a gallai awgrymu hefyd bod y moleciwlau hyn yn cymell neu'n cyfrannu. i briodweddau immunostimulatory y fector. Er mwyn asesu ffynhonnell bosibl y DNA halogedig yn y dadansoddiadau meintiol (q)PCR o HEK "imiwnogenig" (A-HEK-1) ac "animiwnogenig" (B-HEK-1) Perfformiwyd DNA cell, DNA plasmid, a DNA fector AAV. Templed DNA o bob lot wedi'i drin gan DNase, wedi'i drin yn ffug ac wedi'i hidlo'n iawn a dim ond samplau wedi'u trin yn ffug a ddefnyddiwyd ar gyfer ymhelaethu ar ailadrodd Alu, genom niwclear amlgopi genyn NPIP, a dilyniannau genynnau rRNA 16S mitocondriaidd (mt16S) o darddiad celloedd HEK , ar gyfer ymhelaethu ar amplicon ailadrodd terfynell gwrthdro AAV8 (ITR2; tarddiad DNA plasmid fector a thrawsgen), ac ar gyfer ymhelaethu amplicon ar gyfer y genyn blah (ymwrthedd ampicillin) (Amp; tarddiad DNA plasmid) (Tabl S4). Cymhariaeth o gymarebau gwerthoedd ΔCt amplicon DNA-benodol celloedd HEK yn erbyn yr amplicon ITR2 (hy Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2, a mt16S vs. ITR2) a'r amplicon DNA-benodol plasmid yn erbyn yr amplicon ITR2 (Amp vs. ITR2), yn y drefn honno yn dangos bod y ddwy lot yn cynnwys symiau dibwys o gelloedd niwclear HEK a DNA mitocondriaidd. Mewn cyferbyniad, datgelodd y dadansoddiad swm gweddus o DNA plasmid yn y lot fector "imiwnogenig" ac "animiwnogenig" (tua 1/32fed ac 1/50fed, yn y drefn honno, o ran rhif copi o'i gymharu ag AAV DNA), cyfran sydd ymhell o fewn yr ystod o werthoedd a adroddwyd ar gyfer fectorau AAV eraill12 (Ffig. S7). Serch hynny, nid oedd unrhyw wahaniaethau amlwg yn y gyfran gymharol o fector DNA i plasmid a DNA celloedd HEK rhwng y DNase-drin a ffug-drin neu ultra-hidlo a ffug-drin samplau o'r ddau fector lot ( Ffig. S8 ). Gall hyn awgrymu bod y DNA halogydd heb ei becynnu yn debyg o ran cyfansoddiad dilyniant targed i gyfansoddiad y DNA wedi'i becynnu. Fodd bynnag, cyfyngiad ar y dadansoddiad qPCR yw maint y DNA halogydd (100-450 bp) a fydd yn cynnwys ffracsiwn gweddus o ddarnau gyda dilyniant targed anghyflawn.

Ffigur 5. Mae rhyddhau DNA mewnfeirysol trwy driniaeth wres o fectorau yn gwella ymatebion cytocinau pro-lidiol mewn pDCs. Rhyddhad cytocine o IP-10, MIP-1 , TNF- , ac IFN- 2 gan pDCs 18 h ar ôl ysgogi gyda lot AAV8 A-HEK-1 wedi'i drin â gwres (MOI: 1:1 × 106 vg). Mae llinellau llorweddol yn dynodi modd a gwyriadau safonol. Canfuwyd gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol rhwng ymatebion cytocin a achosir gan fectorau wedi'u trin â gwres a heb eu trin trwy ddefnyddio prawf-t Myfyriwr. Gwerth P: Llai na neu'n hafal i 0.01: **; Llai na neu'n hafal i 0.001: ***.

Trafodaeth

Fectorau AAV yw un o'r arfau mwyaf addawol mewn therapi genynnau. Fodd bynnag, mae casglu tystiolaeth yn herio'r farn bod imiwnogenigrwydd AAV yn ddibwys5. Yng ngoleuni hyn, mae wedi dod yn fwyfwy pwysig deall yn well y mecanweithiau y mae ymatebion imiwn i AAV yn digwydd. Yn yr astudiaeth hon rydym yn dangos bod (1) AAV8 ac AAV2 yn ysgogi ymatebion imiwn cynhenid ​​​​lot-benodol mewn pDCs dynol nad ydynt yn benodol i'r gymhareb capsid / vg na'r llwyfan cynhyrchu na'r dull gwneuthurwr / puro; (2) mae ymatebion imiwnedd cynhenid ​​​​pDCs yn dibynnu ar signalau TLR9 a gellir eu lleihau trwy rag-driniaeth gyda DNase; (3) Nid yw triniaeth DNase yn effeithio ar gyfanrwydd y gronyn fector gan nad yw'n lleihau cyfradd trawsgludo lotiau fector AAV8 ac AAV2 mewn celloedd HEK293T; a (4) Gall lotiau fector AAV gynnwys moleciwlau DNA allfeirysol y gellir eu tynnu trwy drin y lot fector gyda DNA. Mae hyn yn awgrymu y gall paratoadau AAV sy'n deillio o gelloedd HEK a Sf gynnwys amhureddau DNA all-feirws sy'n ysgogi ymateb imiwn cynhenid. Mewn astudiaeth ddiweddar, cynhaliwyd dadansoddiad cymharol gan ddefnyddio fectorau AAV o wahanol rywogaethau celloedd cynnal (celloedd HEK a chelloedd Sf9)11. Canfu'r awduron fod fectorau sy'n deillio o HEK- a Sf yn amrywio o ran eu PTMs a'u amhureddau protein celloedd gwesteiwr gweddilliol ar draws yr holl seroteipiau AAV a chynhyrchwyr a brofwyd ganddynt. At hynny, dadansoddwyd ymateb cytocinau ffibroblastau dynol sylfaenol i drawsgludiad AAV a chanfuwyd y gallai fectorau sy'n deillio o HEK- a Sf fod yn wahanol o ran eu priodweddau imiwnogenig. Yn ein hastudiaeth, gwnaethom hefyd gymharu'r ddwy brif system gynhyrchu hyn gan ddefnyddio llawer o'r un lluniad AAV gan wahanol wneuthurwyr a dau seroteip gwahanol. Fodd bynnag, nid oedd yr ymatebion imiwn a achosir gan fector a welsom yn ein model pDC dynol yn ymwneud yn benodol â system gynhyrchu benodol, gwneuthurwr, neu seroteip, yn lle hynny, roeddent yn llawer-benodol. Mae astudiaethau cyn-glinigol a chlinigol blaenorol o therapi genynnau retina wedi nodi y gall ymatebion imiwn i fectorau AAV, megis llid y llygad neu ymdreiddiad celloedd imiwn, gael eu dylanwadu gan wahaniaethau mewn cymarebau capsid/vg18 neu wahaniaethau dos5. Dangosodd Timmers et al.18 fod cael gwared ar gapsidau AAV gwag o'r ataliad firaol yn lleihau llid ac yn gwella trawsgludiad firaol mewn astudiaeth gyn-glinigol gydag primatiaid nad ydynt yn ddynol. Eto i gyd, dangosodd ein canlyniadau fod cymarebau capsid / vg uwch yn bresennol ymhlith lotiau fector AAV "imiwnogenig" a "heb fod yn imiwnogenig", sy'n golygu nad oedd nifer uwch o gapsidau (capsidau gwag) yn yr ataliad firaol yn gyfrifol am sefydlu yr ymatebion imiwn fector-benodol yn ein model pDC dynol. Ar ben hynny, rydym wedi dangos yn flaenorol bod AAV8 yn ysgogi ymatebion imiwn mewn modd sy'n dibynnu ar ddosau mewn primatiaid nad ydynt yn ddynol6,8. Fodd bynnag, nid oedd cynyddu dos y fectorau AAV "di-imiwnogenig" yn yr astudiaeth hon yn ddigon i sbarduno ymateb imiwn mewn pDCs dynol. Felly, er mwyn deall achos y gwahaniaethau yn eiddo imiwnogenig y fectorau, fe wnaethom ymchwilio i'r mecanwaith sy'n ymwneud â chydnabod y lotiau AAV "imiwnogenig". Mae'r defnydd o fodelau celloedd imiwnocompetent in vitro wedi caniatáu i wyddonwyr astudio rôl llwybrau TLR yn fwy cywir mewn ymatebion imiwnedd cynhenid ​​​​a gynhyrchir gan fectorau AAV9,10. Disgrifiodd Zhu et al.9frst fod pDCs, ond nid DCs confensiynol neu an-pDCs, yn rhyddhau symiau mawr o IFN math I a cytocinau pro-llidiol mewn ymateb i ysgogiad AAV a dangosodd bod llwybr TLR9 yn cael ei gynnwys wrth gydnabod AAV8 ac AAV2 defnyddio pDCs llygoden. Sylwodd yr awduron hefyd fod AAV2 wedi achosi ymatebion imiwn dibynnol TLR mewn PDCs dynol. Yn ein hastudiaeth, gyda'r defnydd o un o'r antagonists TLR9 mwyaf penodol, H1549,21-24, rydym wedi dangos yn anuniongyrchol bod nid yn unig AAV2, ond hefyd fectorau AAV8 yn ysgogi TLR9-ymatebion imiwn cynhenid ​​dibynnol mewn pDCs dynol, ond mewn modd llawer-benodol. Gan fod TLR9 yn dderbynnydd DNA, roedd hyn yn awgrymu bod yr ymatebion imiwn i lotiau fector AAV "imiwnogenig" yn cael eu hysgogi gan gydrannau DNA. Fodd bynnag, er bod ein mesuriadau ddPCR wedi cadarnhau bod yr un cydrannau DNA wedi'u pecynnu yn bresennol mewn lotiau fector "imiwnogenig" a "heb fod yn imiwnogenig", ni sbardunodd y lotiau "animiwnogenig" ymatebion imiwn mewn pDCs. Yn ogystal, roedd triniaeth DNase naill ai'n lleihau neu'n diddymu priodweddau imiwn-ysgogol y fector AAV "imiwnogenig", ond ni leihaodd nerth trawsgludo'r fectorau hyn mewn celloedd HEK, gan awgrymu bod triniaeth DNase o AAV wedi targedu DNA allfeirysol heb ei grynhoi yn y ataliad fector ond nid oedd yn effeithio ar gyfanrwydd y genom fector o fewn y capsid cyfan. Cadarnhawyd hyn ymhellach gan ddadansoddiadau DNA cymharol o lotiau fector “imiwnogenig” a “di-imiwnogenig” cynrychioliadol a driniwyd gan DNase a'u ffug-drin.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche

【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Gyda'i gilydd, mae'r holl arbrofion hyn yn dangos nad oedd yr ymateb imiwn i lotiau fector "imiwnogenig" mewn pDCs wedi'i drefnu gan DNA a gynhwysir yn y gronynnau AAV (hy genom fector neu amhureddau DNA posibl wedi'u pecynnu yn y capsidau AAV) ond gan DNA all-feirysol hygyrch cydrannau a gynhwysir yn yr ataliadau firaol (hy DNA y tu allan neu heb ei amddiffyn gan y capsid firaol). Gwelsom hefyd pan oedd y DNA a gynhwysir yn y capsidau firaol o lot fector "imiwnogenig" yn agored i'r celloedd trwy drin y fector â gwres, roedd cynnydd yn yr ymateb imiwn. Nid yw'n glir a oedd y cynnydd mewn gweithgaredd immunostimulatory ar ôl agor y capsidau o ganlyniad i'r DNA un llinyn y fector neu oherwydd amhureddau posibl wedi'u pecynnu yn y capsidau AAV megis asidau niwclëig cell gwesteiwr gweddilliol, dilyniannau DNA cynorthwyydd gweddilliol, dilyniant asgwrn cefn darnau wedi'u pecynnu ynghyd â'r casét neu breimio cefn o ITRs gan arwain at ddarnau bach o asgwrn cefn wedi'u pecynnu i'r AAV12,25. Mae union fecanwaith y defnydd o DNA allfeirysol gan pDCs yn anhysbys o hyd. Mae ymatebolrwydd pDCs i oligonucleotides CpG yn dangos y gall PDCs adweithio i DNA rhydd26. Mae hyn yn awgrymu y gallai'r ymateb imiwn mewn pDCs gael ei sbarduno gan y defnydd o DNA halogedig rhad ac am ddim sydd wedi'i gynnwys yn yr ataliad fector. Yn ogystal, dangoswyd y gall pDCs gymryd fectorau AAV27 fel arall sy'n awgrymu y gallai DNA rhwymedig capsid gael ei gludo i'r gell pan fydd gronynnau AAV yn cael eu derbyn. Gallai presenoldeb halogiad DNA allfeirysol mewn paratoadau fector AAV naill ai fod yn briodwedd gynhenid ​​i'r lot fector priodol sy'n deillio o broses gynhyrchu a phuro'r fectorau, neu gallai fod oherwydd rhyddhau DNA wedi'i amgáu oherwydd amodau storio amhriodol. . Cafwyd yr holl lotiau fector a archwiliwyd yn yr arbrofion hyn yn ystod yr un cyfnod amser (5 o'r 8 lot fector AAV8 a archwiliwyd, ac roedd dwy ohonynt yn "imiwnogenig" (A-HEK-2; A-HEK-3) ac roedd tri yn "animiwnogenig" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) hyd yn oed yn cael eu cynhyrchu ochr yn ochr yn benodol ar gyfer yr astudiaeth hon), y lotiau o cafodd pob gweithgynhyrchydd ei gludo yn yr un blychau cludo ac, ar ôl eu derbyn, cafodd yr holl lotiau eu storio ochr yn ochr yn yr un drôr o rewgell −80 gradd a ddiogelir gan larwm tymheredd cyn i symiau o'r holl lotiau gael eu dadmer ar yr un pryd a'u rhoi ar y pDCs mewn arbrofion ochr yn ochr. Mae hyn yn awgrymu'n gryf mai'r broses gynhyrchu a phuro AAV, yn hytrach na storio amhriodol, oedd yn gyfrifol am y gwahaniaethau mewn cynnwys DNA all-feirws a phriodweddau imiwn-ysgogol y lotiau hyn. Yn y gorffennol, nid oedd lotiau fector AAV gradd glinigol a gynhyrchwyd ar gyfer therapi genynnau (alipogene tiparvovec, Glybera) bellach wedi'u hawdurdodi oherwydd symiau uchel o amhureddau gan gynnwys DNA celloedd gwesteiwr gweddilliol imiwnogenig o bosibl28. Mae tynnu amhureddau DNA o'r ataliadau firaol fel arfer yn cael ei berfformio yn ystod y broses gynhyrchu. Yma mae triniaeth Benzonase29 neu DNase30 yn cael ei gymhwyso'n rheolaidd er mwyn dileu DNA gweddilliol o'r ataliad firaol terfynol. Mae'r driniaeth hon, yn dibynnu ar y protocol, yn para rhwng 30 munud a 3 h ac yna caiff yr ensym ei anactifadu gan gemegau fel halwynau cesiwm clorid30. Yn ein harbrofion, canfuwyd bod pedair o'r pum lot AAV8 a ddeilliodd o Gyfleuster Craidd Fector Feirol Prifysgol Iowa, a'r ddwy lot fector AAV2 o Virovek yn imiwnogenig mewn pDCs. Fel y disgrifir yn yr adran "Deunyddiau a dulliau", mae proses buro'r lotiau fector o'r ddau wneuthurwr hyn yn cynnwys sawl cam puro, y mae rhai ohonynt yn wahanol iawn i'w gilydd. Felly, mae'r broses buro yn y Cyfleuster Craidd yn Iowa yn cynnwys triniaeth Turbonuclease, wedi'i ddilyn gan ultracentrifugation graddiant iodixanol, cromatograffaeth colofn cyfnewid anion, sterileiddio fflwter, a chyfnewid byffer gan ddefnyddio hidlwyr allgyrchol. Mewn cyferbyniad, mae Virovek yn cymhwyso triniaeth Benzonase, ultracentrifugation yn CsCl ac yna dihalwyno a sterileiddio hidlo. Ar y llaw arall, nid yw proses buro Vigene yn cynnwys triniaeth DNase, ond, fel y'i defnyddir gan Core Facility yn Iowa, mae'n cynnwys uwch-ganrifiad graddiant ïodixanol. Yn syndod, fodd bynnag, nid oedd yr un o'r tair lot fector yn deillio o Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 a 2) wedi ysgogi ymatebion imiwn mewn pDCs, gan awgrymu bod "animiwnogenig “ gellir cynhyrchu lotiau fector hefyd gyda phrosesau cynhyrchu nad ydynt yn cynnwys triniaeth DNA.

budd-daliadau atodiad cistanche-sut i gryfhau system imiwnedd

Yn gyffredinol, mae'r camau puro rhannol debyg a rhannol wahanol a ddefnyddir gan y tri gwneuthurwr yn ei gwneud hi'n anodd cysylltu priodweddau imiwnogenig y fectorau a welwyd yn pDC i un cam yn y broses weithgynhyrchu. Mae treialon clinigol yn defnyddio fectorau gradd arfer gweithgynhyrchu da (GMP) sy'n destun rheolaethau ansawdd llym. Nid oes yr un o'r fectorau o'r tri gweithgynhyrchydd a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn radd arfer labordy da (GLP) ac felly gallant fod o burdeb is na fectorau gradd glinigol. Felly, mae'n bwysig cydnabod y gall fectorau GMP a ddefnyddir mewn treialon clinigol mewn pobl ddangos y gwahaniaethau a welsom yn yr astudiaeth bresennol neu beidio, ac nad yw perthnasedd ein canfyddiadau ar gyfer defnydd clinigol therapïau genynnol yn glir. Fodd bynnag, yn ein profiad ein hunain, gall gwahaniaethau sylweddol sy'n benodol i lawer yn y crynodiad o gydrannau halogedig megis proteinau celloedd cynnal ddigwydd hyd yn oed gyda fectorau gradd GMP, a hyd yn oed mewn fectorau gradd GMP nid oes unrhyw fanylebau cytûn unffurf o ran pa lefelau yw derbyniol5. Gyda'i gilydd, mae gwella'r broses weithgynhyrchu o fectorau AAV yn allweddol i osgoi presenoldeb amhureddau gweddilliol yn yr ataliadau firaol er mwyn lleihau'r potensial ar gyfer ymatebion imiwn anfwriadol. I gloi, rydym wedi dangos y gall amhureddau DNA all-firaol ddylanwadu ar briodweddau imiwnogenaidd fectorau AAV mewn pDCs dynol. Mae angen astudiaethau pellach i ymchwilio i oblygiadau'r canfyddiadau hyn ar gyfer diogelwch therapi genynnau wedi'i gyfryngu gan AAV mewn modelau anifeiliaid neu gleifion dynol.

Cyfeiriadau

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, peirianneg genom DV gan ddefnyddio firws Adeno-gysylltiedig: Cymwysiadau ymchwil sylfaenol a chlinigol. Mol. Ter. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. et al. Dosbarthiad genyn wedi'i gyfryngu gan AAV i organoidau retinol 3D sy'n deillio o fôn-gelloedd lluosog a achosir gan bobl. Int. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. et al. Effeithlonrwydd a diogelwch voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) mewn cleifion â nychdod retinol etifeddol cyfryngol RPE: Hap-brawf, rheoledig, label agored, cam 3. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. Ef, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Esblygu therapiwteg a ddarperir gan AAV tuag at iachâd eithaf. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Ymatebion imiwn i therapi genynnau retina gan ddefnyddio fectorau firaol cysylltiedig adeno - Goblygiadau ar gyfer llwyddiant triniaeth a diogelwch. Prog. Retin. Llygad Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF et al. Gall AAV8 ysgogi ymatebion imiwnedd cynhenid ​​ac addasol yn llygad y primatiaid. Mol. Ter. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF et al. Llai o drawsgludiad retinol a gwell imiwnogenedd wedi'i gyfeirio gan drawsgen gyda chyflwyniad rAAV yn fewnwythiennol yn dilyn fitrectomi ôl mewn cŵn. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. Gwerthusiad hydredol o ffocysau hyper-adlewyrchol yn y retina yn dilyn cyflwyno firws cysylltiedig ag adeno yn is-retinol mewn primatiaid nad ydynt yn ddynol. Cyfieithiad. Vis. Sci. Technol. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-Mae llwybr MyD88 yn hanfodol ar gyfer ymatebion imiwn addasol i fectorau therapi genynnau firws adenoassociated mewn llygod. J. Clin. Ymchwilio. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. et al. Cyfryngu derbynnydd tebyg i doll 2-ymateb imiwn cynhenid ​​​​mewn celloedd afu nonparenchymal dynol tuag at fectorau firaol cysylltiedig adeno. Hepatoleg 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG et al. Mae dulliau'n bwysig: Mae llwyfannau cynhyrchu safonol ar gyfer AAV ailgyfunol yn cynhyrchu fectorau sy'n wahanol yn gemegol ac yn swyddogaethol. Mol. Ter. Dulliau Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF amhureddau sy'n gysylltiedig â chynnyrch mewn fectorau AAV ailgyfunol gradd glinigol: Nodweddu ac asesu risg. Biofeddygaeth 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Gweithgynhyrchu fectorau firaol ailgyfunol sy'n gysylltiedig ag adeno ar gyfer treialon clinigol. Mol. Ter. Dulliau Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Ffarmacoleg cynhyrchu firws ailgyfunol adeno-gysylltiedig. Mol. Ter. Dulliau Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Bioleg celloedd dendritig Plasmacytoid a'i rôl mewn clefydau imiwnedd-gyfryngol. Clin. Cyfieithiad. Imiwnol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD et al. Effeithlonrwydd a diogelwch therapi genynnau retina gan ddefnyddio fector firws sy'n gysylltiedig ag adeno ar gyfer cleifion â choroideremia: Hap-dreial clinigol. JAMA Offthalmol. 137, 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG et al. Canlyniadau 2 flynedd ar ôl therapi genynnol ar gyfer amaurosis cynhenid ​​​​Leber diffygiol RPE a nychdod retinol difrifol sy'n dechrau yn ystod plentyndod cynnar. Offthalmoleg 123, 1606–1620 (2016).

18. Timwyr, AM et al. Ymateb llidiol llygadol i chwistrelliad intravitreal o fector firws sy'n gysylltiedig ag adeno: Cyfraniad cymharol genom a capsid. Hum. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. et al. Mae mutagenesis a gyfeirir at y safle yn gwella effeithlonrwydd trawsgludo fectorau AAV ailgyfunol capsid sy'n deillio o lyfrgell. Mol. Ter. Dulliau Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL et al. Arolwg o effeithlonrwydd trawsgludo ex vivo/in vitro o gelloedd sylfaenol mamalaidd a llinellau cell gyda naw firws naturiol sy'n gysylltiedig ag adeno (AAV1-9) ac un seroteip firws cysylltiedig ag adeno-gysylltiedig. Firol. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. et al. Effaith DNA ataliol ar actifadu imiwnedd a achosir gan CpG. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Zhang, P. et al. Mae antagonydd derbynnydd 9 tebyg i doll yn atal imiwnedd digrif mewn myasthenia gravis awtoimiwn arbrofol. Mol. Imiwnol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK et al. Peirianneg fectorau firaol sy'n gysylltiedig ag adeno i osgoi ymatebion imiwn ac ymfflamychol cynhenid. Sci. Cyfieithiad. Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM Strwythur, mecanwaith a defnydd therapiwtig oligonucleotidau gwrthimiwnedd. Ffarmacol. Res. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA et al. 547. Mae paratoadau AAV yn cynnwys halogiad o ddilyniannau DNA mewn plasmidau cynhyrchu yn union y tu allan i'r ITRs. Mol. Ter. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. et al. Mae TLR9 yn signalau ar ôl trawsleoli o'r ER i DNA CpG yn y lysosom. Nat. Imiwnol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. et al. Mae is-setiau mawr o gelloedd dendritig dynol yn cael eu trawsgludo'n effeithlon gan fectorau firws adeno-gysylltiedig hunan-gyflenwol 1 a 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Adroddiad asesu: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_cy.pdf. Cyrchwyd 03 Mawrth 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Protocol seroteip-annibynnol rhad ar gyfer puro firws adeno-gysylltiedig ailgyfunol brodorol a biobeirianyddol. J. Biol. Dulliau 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW a Samulski, RJ Cynhyrchu a nodweddu fectorau firaol sy'n gysylltiedig ag adeno. Nat. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, T. et al. Cynhyrchu fectorau firws adeno-gysylltiedig ar gyfer cymwysiadau in vitro ac in vivo. Sci. Sylw 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. et al. Mae purdeb fector AAV uchel yn arwain at wella effeithlonrwydd trawsgludo seroteip a meinwe-annibynnol. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).