Mae Ferristatin II yn Atal Dyblygiad SARS-CoV-2 yn Effeithlon mewn Celloedd Vero

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Haniaethol

Coronafeirws syndrom anadlol acíwt difrifol 2 (SARS-CoV-2) yn parhau i gael effaith sylweddol ar iechyd cyhoeddus byd-eang. Disgrifiwyd mecanweithiau lluosog ar gyfer mynediad cell SARS-CoV-2; fodd bynnag, ychydig o sylw a gafodd rôl derbynnydd transferrin 1 (TfR1) yn haint SARS-CoV-2. Fe wnaethom ddefnyddio ferritin II i gymell diraddio TfR1 ar wyneb celloedd Vero ac i astudio canlyniadau triniaeth o'r fath ar hyfywedd y celloedd ac atgynhyrchu SARS-CoV-2. Fe wnaethom ddangos nad yw ferritin II yn wenwynig ar gyfer celloedd Vero mewn crynodiadau hyd at 400 µM. Yn ôl data microsgopeg confocal, mae dosbarthiad y parth trosglwyddo a rhwymo derbynnydd (RBD) o brotein Spike wedi'i labelu yn cael ei effeithio'n sylweddol gan y rhag-driniaeth 18h gyda 100 µM ferritin II mewn cyfrwng diwylliant. Mae'r defnydd o brotein RBD bron yn cael ei atal yn llwyr gan driniaeth ferritin II, er bod y protein hwn yn dal i fod yn rhwym ar wyneb y gell. Cadarnhawyd y canfyddiadau'n dda gan yr ataliad sylweddol o haint SARS-CoV-2 o gelloedd Vero gan ferritin II gyda gwerthoedd IC50 o 27 µM (ar gyfer firws Wuhan D614G) a 40 µM (ar gyfer firws Delta). Nodwyd gostyngiad sylweddol yn titer heintus yr amrywiad Omicron SARS-CoV-2 mewn crynodiad ferritin II mor isel â 6.25 µM. Rydym yn damcaniaethu bod ferritin II yn rhwystro mynediad cell gwesteiwr TfR{1-SARS-CoV{-2; fodd bynnag, mae angen astudiaethau pellach i egluro mecanweithiau llawn yr ataliad firws hwn, gan gynnwys effaith ferritin II ar dderbynyddion SARS-CoV-2 eraill, megis ACE2, Neuropilin-1, a CD147. Mae atal mynediad firaol trwy dargedu'r derbynnydd ar y celloedd gwesteiwr, yn hytrach na'r protein sy'n dueddol o dreiglad firaol, yn strategaeth therapiwtig COVID-12 addawol.

Geiriau allweddol: SARS-CoV-2;derbynnydd transferrin 1; ferritin II; parth rhwymo derbynyddion (RBD); celloedd Vero

Alexey Sokolov , Irina Isakova-Sivak * , Natalia Grudinina , Daria Mezhenskaya , Elena Litasova , Valeria Kostevich , Ekaterina Stepanova , Alexandra Rak , Ivan Sychev , Olga Kirik a Larisa Rudenko

Sefydliad Meddygaeth Arbrofol, 197376 St Petersburg, Rwsia

1. Rhagymadrodd

Mae pandemig clefyd coronafeirws 2019 (COVID-19) a achosir gan coronafeirws syndrom anadlol acíwt difrifol 2 (SARS-CoV-2) yn parhau i osod baich economaidd-gymdeithasol sylweddol ar boblogaeth y byd. Ystyrir mai ensym trosi angiotensin 2 (ACE2) yw'r prif dderbynnydd cell cynnal y mae SARS-CoV-2 yn ei ddefnyddio i fynd i mewn i gelloedd [1-4]; fodd bynnag, mae nifer o dderbynyddion a chyd-dderbynyddion amgen sy'n gallu hwyluso mynediad celloedd SARS-CoV-2 a haint wedi'u nodi, megis Neuropilin-1, CD147, derbynnydd tyrosine-protein kinase UFO (AXL) ac eraill [5–10]. Ar ben hynny, mae angen dau gam holltiad proteolytig ar gyfer mynediad effeithiol SARS-CoV{-2 i gelloedd ar ôl i dderbynnydd cell gwesteiwr ymgysylltu â phrotein pigyn firaol (S). Mae'r cam cyntaf yn cynnwys hollti ffin S1-S2 gan furin proteas o fewn cell heintiedig, tra bod holltiad safle S20 yn dibynnu ar broteasau celloedd targed, megis TMPRSS2 a cathepsin L, sy'n actifadu proteinau S yn y bilen plasma ac yn y endolysosome, yn y drefn honno (adolygwyd yn [11]).

cistanche ar werthar gyfer ygallu imiwnedd

Ar wahân i'r targedau mynediad celloedd gwesteiwr SARS-CoV-2 sydd wedi'u hastudio'n dda, mae tystiolaeth y gall derbynnydd transferrin 1 (TfR1) fod yn gyd-dderbynnydd amgen ar gyfer mynediad SARS-CoV-2 [12]. Mae TfR1, glycoprotein bilen math II homodimeric 95 kDa, wedi'i fynegi'n helaeth ar bilen plasma'r rhan fwyaf o gelloedd dynol ac mae'n cyfryngu mynediad transferrin (Tf) i gelloedd ar gyfer danfon haearn [13]. Yn wir, mae yna ystod eang o firysau dynol a milheintiol a all oresgyn celloedd lletyol trwy'r rhyngweithio â TfR1 a ffactorau eraill yn y llwybr derbyn haearn, gan gynnwys arenafeirysau'r Byd Newydd, firws diffyg imiwnedd dynol, parvoviruses, firws hepatitis C, alffafeirysau, ac eraill. [14]. Felly, mae targedu llwybr mynediad firaol cyfryngol TfR1- yn cynrychioli strategaeth therapiwtig addawol ar gyfer haint SARS-CoV-2. Nododd astudiaethau sgrinio cynnar ddau gyfansoddyn maint bach (NCI11079 a NCI306711) a gafodd effaith ataliol sylweddol ar y defnydd o haearn Tf-mediated gan gelloedd HeLa. Mae cyfansawdd NCI306711 yn targedu TfR1 trwy ysgogi ei fewnoli a'i ddiraddio ac fe'i enwyd yn "ferritin" oherwydd ei eiddo anarferol o atal trafnidiaeth haearn trwy'r llwybr sy'n dibynnu ar golesterol [15]. Mae moleciwl bach arall, ferritin II (NSC8679), yn gweithredu mewn modd tebyg i ferritin ac yn diraddio TfR1 trwy lwybr rafft lipid sy'n sensitif i nystatin [16]. Yng ngoleuni'r data hyn, fe wnaethom geisio asesu gallu ferritin II i atal dyblygu SARS-CoV-2 mewn celloedd Vero-CCL81 ac archwilio mecanweithiau posibl yr ataliad hwn.

2. Defnyddiau a Dulliau

2.1. Firysau, Proteinau, a Chyfansoddion Cemegol

Mae'r SARS-CoV-2 yn ynysu hCoV-19/St_Petersburg-3524S/2020 (llinach Wuhan D614G), hCoV-19 /Russia/SPE-RII-32759V/2021 (llinach Delta), a hCoV-19/Russia/SPE RII-6086V/2021 (llinach Omicron) gan Sefydliad Ymchwil Smorodintsev Ffliw (Saint Petersburg, Rwsia). Cyflawnwyd yr holl waith gyda firysau heintus yn y labordy bioddiogelwch lefel 3 (BSL-3). Mynegwyd protein ailgyfunol sy'n cyfateb i'r parth rhwymo derbynyddion (RBD) o brotein SARS-CoV-2 S mewn celloedd ewcaryotig gan BIOCAD JSC (St.Petersburg, Rwsia). Cafodd serwm dynol dirlawn haearn TF (Fe2-TF) ei ynysu o serwm gwaed dynol gan gromatograffaeth cyfnewid ïon ar DEAE-Toyopearl, UNOsphere S, a hidlo gel ar Sephadex G-75 Superfine, fel y disgrifiwyd yn flaenorol [17]. Prynwyd Ferristatin II (Ffigur 1) oddi wrth Sigma (C-1144, St. Louis, MO, UDA). Gwanhawyd y cyfansoddyn mewn 150 mM NaCl, byffer Na-ffosffad 10 mM, pH 7.4 (PBS) i'r crynodiad terfynol o 4 mm, a chafodd yr hydoddiant ei hidlo trwy bilen di-haint gyda maint mandwll o 0.22 µm (Sartorius, yr Almaen) .

2.2. SARS-CoV-2 Lluosogi Feirws ac Asesu Cynhwysedd Atal Feirws Ferristatin II

Cafodd firysau eu lluosogi ar gelloedd Vero CCL81 gan ddefnyddio DMEM wedi'i ategu â gwrthfiotig-antimycotig 1 ×, 10 mM HEPES, a 2 y cant FBS (pob un o Capricorn, Ebsdorfergrund, yr Almaen), (DMEM / 2 y cant FBS). Pennwyd titers heintus gan assay Dos Heintiau Diwylliant Meinwe 50 y cant (TCID50), fel y disgrifir yn [18] ac a fynegir yn lgTCID50 / mL.

Ar gyfer gwerthuso gallu niwtraliad firws ferritin, defnyddiwyd assay microniwtraleiddio wedi'i addasu gennym. Y diwrnod cyn yr arbrofion, cafodd celloedd Vero eu hadu mewn {{{0}}blatiau meithrin ffynnon (3 × 104 o gelloedd y ffynnon) mewn DMEM wedi'i ategu gan 1 × gwrthfiotig-antimycotig a 10 y cant FBS. Y diwrnod wedyn, tynnwyd y cyfrwng, a chafodd y celloedd eu heintio â 100 TCID50 o SARS-CoV-2 a baratowyd ar DMEM/2 y cant FBS am 2 h ar 37 ◦C, 5 y cant CO2. Roedd sawl ffynnon heb eu heintio fel rheolaeth negyddol. Yna, tynnwyd yr inocwlwm, a gorchuddiwyd celloedd â 150 µL o wanediadau ferritin II deublyg a baratowyd ar DMEM / 2 y cant FBS, tra bod ffynhonnau rheoli negyddol a chadarnhaol wedi'u gorchuddio â chyfryngau yn unig. Aseswyd pob gwanediad ferritin II yn driphlyg. Deorwyd y platiau am 48 h (ar gyfer firws Wuhan G614D) neu 72 h (ar gyfer firysau Delta ac Omicron) ar 37 ◦C, 5 y cant CO2, hyd nes y gwelwyd effaith cytopathig clir mewn ffynhonnau rheoli cadarnhaol. Mae'r supernatants eu casglu yn ofalus i mewn i 0.2 ml tiwbiau ar gyfer meintioli titer firaol a'r celloedd yn sefydlog gyda fformaldehyd 10 y cant ar 4 ◦C am 24 h.

Trosglwyddwyd y platiau sefydlog i'r labordy BSL ar gyfer gweithdrefn ELISA yn seiliedig ar gelloedd. Roedd hyn yn cynnwys golchi gyda PBST (PBS gyda 0.05 y cant o Tween 20), athreiddedd celloedd gyda 0.1 y cant Triton X-100 ar dymheredd ystafell am 15 munud, blocio gyda llaeth sgim o 3 y cant ar 37 ◦C am 1 h, a golchi dwys gyda PBST. Yna, ychwanegwyd gwrthgorff gwrth-RBD cwningen polyclonaidd wedi'i buro (BIOCAD JSC, Saint Petersburg, Rwsia) ar grynodiad o 1.5 µg/ml am 1 h, ac yna golchi gyda PBST ac ychwanegu gwrth-gwningen gwrth-IgG HRP- eilaidd. gwrthgorff cyfun (BioRad, Hercules, CA, UDA) am 1 awr ar 37 ◦C. Datblygwyd y platiau gan ddefnyddio 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA). Stopiwyd yr adwaith gyda hydoddiant 1M H2SO4, a darllenwyd y canlyniadau ar 450 nm gan ddefnyddio Spectrophotometer Microplate xMark (BioRad, Hercules, CA, UDA). I gyfrifo'r titer IC50, defnyddiwyd dadansoddiad atchweliad aflinol pedwar parametrig, yn seiliedig ar werthoedd OD450 o gelloedd firws-negyddol a firws-positif, fel y disgrifir yn [18].

lle i brynu cistanche

Cyfrifwyd titers SARS-CoV-2 yn y supernatants cell gan RT-PCR amser real meintiol. Cafodd yr RNA ei buro o 100 µL o gyfrwng meithriniad celloedd, yn ogystal ag o SARS-CoV-2 gyda theitrau hysbys ar gyfer cynhyrchu'r cromliniau safonol assay. Cafodd samplau RNA eu puro gyda phecyn echdynnu RNA (Biolabmix, Novosibirsk, Rwsia) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Perfformiwyd yr adwaith RT-PCR mewn dyblygiadau gyda preimiwr blaenyrru 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG{9}} a preimio gwrthdro 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19] gan ddefnyddio un-Tube RT-PCR SYBR pecyn (Evrogen, Moscow, Rwsia) ar System PCR Amser Real Quantstudio 1 (Thermofifisher Scientific, Waltham, MA, UDA), gan ychwanegu 50x Rox fel lliw cyfeirio.

Cyfrifwyd y cylch trothwy (Ct) ar gyfer pob sampl gyda Meddalwedd Dylunio a Dadansoddi QuantStudio v1.5.1, a chynhyrchwyd y gromlin safonol ar bob plât adwaith. Cyfrifwyd titer y firws ym mhob ffynnon gan ddefnyddio gwerthoedd Ct wedi'u normaleiddio i gromliniau safonol a gyfrifwyd ar sail titradiad firws safonol ac a fynegir yn lgTCID50/mL. Er mwyn penderfynu a all ferritin II atal y camau cychwynnol o ymlyniad firaol i'r celloedd, cymysgwyd 100 TCID50 o SARS-CoV-2 â gwanediadau ferritin II, ac ar ôl deori 1h ar 37 ◦C, ychwanegwyd y gymysgedd hon at Vero celloedd, ac yna deoriad 1 awr ychwanegol ar 37 ◦C. Ar ôl amsugno firaol, tynnwyd yr inocwlwm, a gorchuddiwyd y celloedd â 150 µL o gyfryngau FBS ffres DMEM / 2 y cant. Ar ôl 48 h o ddeor ar 37 ◦C, 5 y cant CO2, a CPE gweladwy mewn celloedd rheoli cadarnhaol, gosodwyd platiau ac roeddent yn destun ELISA seiliedig ar gelloedd fel y disgrifir uchod.

2.3. Asesiad o Effaith Sytotocsig Ferristatin II

Aseswyd sytowenwyndra ferritin II ar gyfer celloedd Vero gan y {{{0}}(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,{5}}diphenyltetrazolium bromid ( MTT) assay lleihau [20]. Paratowyd gwanediadau deublyg o ferritin II mewn cyfrwng FBS DMEM/2 y cant gan ddechrau o grynodiad 400 µM a'i ychwanegu at y ffynhonnau o 96-blatiau ffynnon gyda monolayers cell Vero. Ar ôl deori 48h, tynnwyd y cyfryngau a golchwyd y celloedd yn ysgafn gyda PBS cynnes. Ychwanegwyd yr adweithydd MTT 0.5 mg/mL at bob ffynnon mewn cyfaint o 100 µL, a deorwyd y plât ymhellach ar 37 ◦C am 2 h. Yna, tynnwyd yr adweithydd a golchwyd y celloedd â PBS a'u sychu mewn aer, ac yna ychwanegu 100 µL o 96 y cant ethanol i doddi crisialau formazan. Cofnodwyd dwyster y lliw gan ddefnyddio sbectroffotomedr ar donfedd o 535 nm. Defnyddiwyd ffynhonnau'r plât heb eu hadu â chelloedd Vero fel rheolaethau negyddol. Cyfrifwyd yr ataliad 50 y cant o hyfywedd celloedd (CC50) gan ddadansoddiad atchweliad aflinol pedwar parametrig gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prizm.

2.4. Labelu Trosglwyddiad Serwm Dynol a Phrotein RBD Ailgyfunol

Cyflawnwyd yr adwaith labelu ar plws 4 ◦C am 12 h trwy ychwanegu hydoddiant 5 mM o NHS-ester 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) mewn dimethylsulfoxide i 30 µM Fe2-toddiannau TF neu RBD mewn 200 mM NaHCO3, gan gadw'r gymhareb 5-TAMRA: protein=8:1 (mol/mol). Ar ôl tynnu'r llifyn gormodol, amcangyfrifwyd graddfa'r labelu yn ôl cymhareb A541 ac A280, sef 3.5 a 3.2 môl TAMRA fesul môl Fe2-TF ac RBD, yn y drefn honno

2.5.Astudiaeth o Ferristatin II Effaith y Defnydd o TF ac RBD gan Vero Cells

Cafodd celloedd Vero eu meithrin am 18 h yn DMEM/2 y cant FBS heb ferritin Il a chydag ychwanegiad o 100 uM ferritin Il gyda gorchuddion ar gyfer microsgopeg a osodwyd yn flaenorol ar waelod y platiau meithrin. Yna, disodlwyd y cyfrwng am 15 h gyda chyfrwng heb FBS yn cynnwys 1.2 μM Fe2-TF-TAMRA (0.25 mg/mL) neu 1.2 μM RBD-TAMRA (0.1 mg/mL). Ar ôl deori, cafodd y celloedd eu golchi'n ysgafn ddwywaith gyda PBS, eu gosod gyda 4 y cant o baraformaldehyd (w /) yn PBS am 10 munud, eu golchi ddwywaith gyda PBS am 30 munud. Yna, cafodd niwclysau'r celloedd eu staenio â 360nM DAPI am 5 munud, eu golchi â PBS a gorchuddion, a'u gosod ar y sleidiau gan ddefnyddio resin polymerizing ar gyfer microsgopeg fflworoleuedd (DAKO, Glostrup, Denmarc). Cafwyd delweddau gan ddefnyddio microsgop sganio laser confocal Axio Observer.Z1/7 (Carl Zeiss, Jena, yr Almaen), gyda Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 object.A561 nm laser a ddefnyddiwyd i gyffroi fflworoleuedd TAMRA, a { Defnyddiwyd hidlydd {28}} nm i gofnodi fflworoleuedd, defnyddiwyd laser 405 nm i gyffroi DAPI. a defnyddiwyd hidlydd 400-570 nm i gofnodi fflworoleuedd. Cafodd delweddau eu caffael a'u prosesu gan ddefnyddio'r meddalwedd a ddarparwyd gyda'r microsgop.

3. Canlyniadau

Fe wnaethom ddefnyddio dau straen SARS-CoV a oedd yn bell o bell i asesu gallu ferritin II i atal atgynhyrchu firaol yng nghelloedd Vero. Yn y cam cyntaf, fe wnaethom asesu ataliad firaol ym mhresenoldeb cyson y cyfansoddyn yn y cyfrwng diwylliant. Canfu'r broses o ganfod antigen firaol mewn ELISA sy'n seiliedig ar gelloedd mai gwerthoedd IC50 ferritin II oedd 26.5 a 40.4 µM ar gyfer firysau Wuhan D614G a Delta, yn y drefn honno (Ffigur 2A). Cadarnhaodd meintioli'r titers firws yn y cyfryngau diwylliant fod ferritin II yn atal rhyddhau'r firws o'r celloedd heintiedig i'r cyfrwng diwylliant, gan ddechrau o grynodiad 25 µM, a gwerthoedd IC50 a gyfrifwyd o'r gostyngiad mewn titerau TCID50 oedd 24.0 a 25.2 µM ar gyfer firysau Wuhan D614G a Delta, yn y drefn honno. Ar ben hynny, pan ychwanegwyd y cyfansoddyn mewn crynodiad o 100 µM, ni ddigwyddodd unrhyw ddyblygiad firaol yng nghelloedd Vero (Ffigur 2B).

cistanche a tongkat ali

Oherwydd y gwahaniaethau sylweddol ym mhroteinau RBD yr amrywiadau Wuhan D614G a'r amrywiadau Omicron SARS-CoV-2, ni ellid canfod yr olaf mewn ELISA sy'n seiliedig ar gelloedd gan ddefnyddio'r gwrthgorff gwrth-RBD sydd ar gael, gan iddo gael ei godi i RBD y straen SARS-CoV-2 gwreiddiol. Serch hynny, roedd y gostyngiad mewn titerau firaol heintus ym mhresenoldeb ferritin II hyd yn oed yn fwy amlwg yn yr amrywiad Omicron o'i gymharu â'r ddau straen arall SARS-CoV-2: nodwyd gostyngiad o ddeg gwaith yn y titer firaol mewn ferritin II crynodiad mor isel â 6.25 µM, heb unrhyw ddyblygiad firws yn digwydd mewn crynodiadau o 50 µM ac uwch (Ffigur 3). Mae'n bwysig nodi bod yr ataliad hwn o SARS-CoV-2 wedi digwydd dim ond pan oedd ferritin II yn bresennol yn gyson yn y cyfrwng meithrin, ond ni welwyd yr effaith hon pan gafodd y celloedd eu rhag-drin gyda'r cyfansoddyn neu pan oedd firws / ferritin Defnyddiwyd cymysgedd II yn y cam arsugniad ac yna deor heb y sylwedd (data heb ei ddangos).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 ar gyfer straenau Wuhan D614G, Delta, ac Omicron SARS-CoV-2, yn y drefn honno.

Er mwyn archwilio mecanweithiau posibl ataliad SARS-CoV-2 gan ferritin II, astudiwyd effaith y sylwedd ar fynediad firaol gan assay derbyniad RBD dirprwyol. Felly, gwnaethom benderfynu sut y gall crynodiad diwenwyn 100 µM o ferritin II effeithio ar y nifer sy'n derbyn RBD â label tetramethylrhodamine (TAMRA) gan gelloedd Vero. Mae'n hysbys bod TfR1, targed ar gyfer gweithredu ferritin II, yn cyfryngu mynediad Tf; felly, defnyddiwyd y TF â label TAMRA fel rheolaeth gadarnhaol. Nid oedd meithrin celloedd Vero ym mhresenoldeb 100 µM ferritin II am 18 h heb ychwanegu proteinau wedi'u labelu yn cael unrhyw effaith arwyddocaol ar forffoleg y cnewyllyn cell (Ffigur 5, panel uchaf (Ffwg)), gan nodi'n anuniongyrchol absenoldeb necrosis celloedd ac apoptosis. Arweiniodd deori celloedd â TF-TAMRA heb driniaeth ferritin II at groniadau o broteinau wedi'u labelu y tu mewn i'r celloedd, heb effeithio ar y rhanbarth niwclear wedi'i staenio gan DAPI (triad canol chwith o ddelweddau (TF-TAMRA) yn Ffigur 5). Arweiniodd triniaeth celloedd â 100 µM ferritin II at leihad sylweddol mewn cynnwys TF wedi'i labelu (triad canol dde o ddelweddau (TF-TAMRA) yn Ffigur 5). Arweiniodd deori celloedd â RBD-TAMRA heb driniaeth ferritin II, fel yn achos TF wedi'i labelu, at gronni proteinau wedi'u labelu yn y cytoplasm cell, heb effeithio ar y rhanbarth niwclear (triad gwaelod chwith (RBD-TAMRA)) yn Ffigur 5 ). Pan gafodd y celloedd eu trin â 100 µM ferritin II, ailddosbarthwyd y signal TAMRA. Yn lle ymgorffori'r RBD wedi'i labelu yn y celloedd, dosbarthwyd y signal TAMRA yn gyfartal dros wyneb y gell, gyda dim ond cyfran fach o'r label yn ffurfio clystyrau yn gorgyffwrdd yn rhannol â staen DAPI y cnewyllyn, gan nodi lleoliad arwyneb y label TAMRA (gwaelod triad dde (RBD-TAMRA) yn Ffigur 5). Mae'r canlyniadau a ddangosir yn Ffigur 5 yn dangos bod trin celloedd Vero â 100 µM ferritin II yn effeithio ar ymgorffori'r RBD wedi'i labelu yn y celloedd. O ystyried nad oes unrhyw ddata ar gael ar hyn o bryd ar effaith ferritin II ar y derbynnydd ACE2, ni ellir eithrio bod yr effaith a arsylwyd oherwydd rhwymo RBD wedi'i labelu i wyneb y gell, ond mae absenoldeb TfR1 ar y celloedd yn atal y corffori o RBD yn y celloedd sy'n cael eu trin â ferritin II.

4. Trafodaeth

Mae SARS-CoV-2 yn defnyddio mecanweithiau lluosog i oresgyn celloedd gwesteiwr ac achosi haint firaol llwyddiannus, ac mae ystod eang o atalyddion mynediad celloedd gwesteiwr yn cael eu hasesu ar hyn o bryd fel strategaethau therapiwtig COVID[21]. Yn yr astudiaeth gyfredol, rydym yn adrodd ar ganlyniadau rhagarweiniol atal dyblygu SARS-CoV-2 in vitro trwy drin y celloedd targed gan ferritin II, moleciwl maint bach a all ddiraddio derbynnydd transferrin 1 yn ddetholus. Trosglwyddydd dirlawn haearn Mae gan (Fe2-Tf neu holo-Tf) affinedd uchel â'i dderbynyddion, sy'n cael ei fynegi ar arwynebau'r rhan fwyaf o gelloedd dynol ac sy'n cael ei fewnoli mewn cymhleth â holo-Tf gan endocytosis trwy gyfrwng derbynnydd. Mae ffurfio'r cyfadeiladau rhwng haearn a Tf, yn ogystal â rhwng holo-Tf a TfR, yn dibynnu ar pH ac yn darparu rhyddhau haearn o Tf a Tf o TfR yn amgylchedd asidig endosome. Mae ailgylchu'r endosome yn arwain at TfR yn dychwelyd i'r bilen plasma ac yn rhyddhau apo-ffurf o Tf ar gyfer rownd arall o gyflenwad haearn i'r gell. Mae'r defnydd o haearn gan gelloedd mamalaidd yn broses bwysig ar gyfer rheoleiddio twf celloedd canser nad oes ganddynt gyfryngau ffarmacolegol sydd â mecanweithiau gweithredu hysbys. Nododd sgrinio 2000 o gyfansoddion maint bach o lyfrgell Set Amrywiaeth y Sefydliad Canser Cenedlaethol 10 atalydd cludo haearn gyda gwerthoedd IC50 yn amrywio o 5 i 30 µM [22]. Mae Ferristatin II wedi'i ddefnyddio fel atalydd TfR1 mewn astudiaethau o haint celloedd trwy TfR1 gyda'r firws hepatitis C [23,24], firws gastroenteritis trosglwyddadwy [25], a reofirws [26] (Tabl 1). Dylid nodi bod arbrofion ar ddiraddiad TfR1 gyda ferritin II bron bob amser yn cael eu cynnal ym mhresenoldeb parhaol y sylwedd yn y cyfrwng.

Mewn setiad assay tebyg, canfuom fod ferritin II bron yn anwenwynig i gelloedd Vero yn ystod amlygiad 48h i grynodiad o 400 µM. Mae'r crynodiad hwn yn ddigonol ar gyfer diraddio TfR1 yn llwyr ar wyneb celloedd diwylliedig [16]. Ar y naill law, cadarnhawyd yr effaith hon gan y defnydd llai o Fe2-Tf wedi'i labelu gan gelloedd Vero a gafodd ei drin ymlaen llaw gyda 100 µM o ferritin II am 18 h. Yn yr achos hwn, gellir esbonio'r blocio anghyflawn o ran derbyniad Tf wedi'i labelu gan absenoldeb ferritin II ar adeg ychwanegu proteinau wedi'u labelu. Ar y llaw arall, fe wnaeth trin celloedd Vero gan ferritin II newid yn ddramatig y nifer a oedd yn cymryd yr RBD o broteinau Spike. Yn yr astudiaeth ragarweiniol hon, ni wnaethom asesu lefel mynegiant derbynyddion SARS-CoV-2 eraill o dan driniaeth ferritin II ac ni wnaethom ysgogi canlyniad y derbynyddion hysbys hyn i brofi rôl annibynnol TfR wrth gyfryngu SARS -coV-2 mynediad cell, sy'n faes o'n hymchwil pellach.

Serch hynny, gall rhwymiad cymharol unffurf o RBD i wyneb y celloedd sy'n cael eu trin â ferritin II ddangos bod rhai o'r derbynyddion SARS-CoV ar gelloedd Vero yn parhau i fod yn weithredol ac yn rhwymo'r firws, ond yn absenoldeb TfR1, ni all y firws fynd i mewn i'r gell. Mae'r derbynnydd hwn yn fwyaf tebygol o fod yn ACE2 ers Prabhakara et al. dangos cynnydd yn y nifer sy'n manteisio ar RBD wedi'i labelu ynghyd â throsglwyddiad wedi'i labelu gan gelloedd sy'n gorfynegi ACE2, gan awgrymu bod ACE2 yn hyrwyddo derbyniad RBD trwy endocytosis cyfryngol clathrin, sy'n cael ei ecsbloetio gan TfR1 [28]. At hynny, mae tystiolaeth y gall SARS-CoV-2 heintio2-celloedd negyddol ACE gan ddefnyddio llwybrau mynediad amgen [29]; felly, mae dadansoddiad dyfnach o weithredu ferritin II ar wahanol fathau o gelloedd yn ganiataol ar gyfer haint SARS-CoV-2 a fydd yn taflu goleuni ar rôl TfR1 yng nghylch bywyd firws. Er mwyn deall pa mor addawol yw'r sylwedd hwn ar gyfer therapi haint SARS-CoV{-2 yn y dyfodol, mae'n bwysig gwybod sut mae'r cyfansoddyn hwn yn cael ei fetaboli in vivo. Roedd gan lygod mawr a gafodd eu trin â ferritin II lefelau is o TfR1 yn yr afu, a llai o haearn serwm a dirlawnder Tf heb newidiadau yn haearn di-heme yr afu [16].

Ar ben hynny, fe wnaeth ferritin II ysgogi mynegiant hepcidin [16,30]. Mewn astudiaeth arall, aseswyd mynegiant genynnau ar ôl rhoi ferritin II (mewn olew corn) i stumogau llygod mawr Wistar ar ddogn o 146 mg/kg/dydd am 7 diwrnod. Ymhlith genynnau proteinau sy'n rheoleiddio haearn, gwelwyd mynegiant llai o HFE a mynegiant cynyddol o CP, GDF15, a HAMP ar ôl gweinyddu ferritin II [31]. Mae'n debyg mai effaith ferritin II ar y llwybr signalau dibynnol p53- oedd y rhwystr sy'n cyfyngu ar ei ddefnydd yn unig fel atalydd TfR1 ar ddiwylliannau celloedd [31].

Gelwir Ferristatin II hefyd yn ddu uniongyrchol 38, Chlorazol du E, CI 30235, neu CAS 1937- 37-7 ac fe'i defnyddir yn gyffredin fel lliw ar gyfer staenio granulocytes ac onychomycosis [32,33]. Yn bwysig, gwelwyd metabolion bensidin o ddu uniongyrchol 38 sydd â risg bosibl o ganser y bledren mewn samplau wrin o weithwyr mewn uned ar raddfa fach a weithgynhyrchodd y llifyn hwn [34]. Er na ellir defnyddio ferritin II yn uniongyrchol mewn bodau dynol, am y rheswm hwn, mae dadl bod y strategaeth o atal mynediad SARS-CoV-2 i'r gell trwy rwystro TfR1 yn addawol, gan fod y dull hwn yn targedu'r derbynnydd ar y gwesteiwr. celloedd yn hytrach na'r protein firaol sy'n dueddol o dreiglad. Yn ogystal, mae angen astudiaethau pellach i nodi cyfansoddion cemegol sy'n gweithredu fel y moleciwl ferritin II, ond heb ffurfio metabolion â risgiau iechyd posibl.

camweithrediad erectile cistanche

Cyfeiriadau

1 Scialo, F.; Daniele, A.; Amato, F. ; Pastore, L.; Matera, MG; Cazzola, M.; Castaldo, G. ; Bianco, A. ACE2: Prif Dderbynnydd Mynediad Celloedd ar gyfer SARS-CoV-2. Ysgyfaint 2020, 198, 867–877. [CrossRef] [PubMed]

2. Ni, W. ; Yang, X. ; Yang, D.; Bao, J. ; Li, R. ; Xiao, Y.; Hou, C. ; Wang, H.; Liu, J. ; Yang, D.; et al. Rôl ensym trosi angiotensin 2 (ACE2) yn COVID-19. Crit. Gofal 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. Shang, J. ; Ie, G.; Shi, K.; Wan, Y.; Luo, C. ; Aihara, H.; Geng, Q. ; Aurbach, A.; Li, F. Sail strwythurol adnabod derbynyddion gan SARS-CoV-2. Natur 2020, 581, 221–224. [CrossRef] [PubMed]

4. Wan, Y. ; Shang, J. ; Graham, R.; Baric, RS; Cydnabyddiaeth Derbynnydd Li, F. gan y Coronafeirws Newydd o Wuhan: Dadansoddiad yn Seiliedig ar Astudiaethau Strwythurol Degawd Hir o SARS Coronavirus. J. Firol. 2020, 94, e00127-20. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, Q.; Chen, CZ; Swaroop, M.; Xu, M. ; Wang, L.; Lee, J.; Wang, AQ; Pradhan, M.; Hagen, N.; Chen, L. ; et al. Mae sylffad heparan yn cynorthwyo SARS-CoV-2 i mewn i gelloedd a gellir ei dargedu gan gyffuriau cymeradwy in vitro. Cell Discof. 2020, 6, 80. [CrossRef]

6. Wang, K.; Chen, W.; Zhang, Z.; Deng, Y. ; Lian, JQ; Du, P. ; Wei, D. ; Zhang, Y.; Haul, XX; Gong, L. ; et al. Mae CD{1}}protein pigyn yn llwybr newydd ar gyfer haint SARS-CoV-2 i gelloedd lletyol. Trawsgludiad Signal. Targed. Ther. 2020, 5, 283. [CrossRef]

7. Wei, C. ; Wan, L. ; Yan, Q. ; Wang, X. ; Zhang, J.; Yang, X. ; Zhang, Y.; Fan, C. ; Li, D.; Deng, Y. ; et al. Mae derbynnydd sborionydd HDL math 1 yn hwyluso mynediad SARS-CoV-2. Nat. Metab. 2020, 2, 1391–1400. [CrossRef]

8. Daly, JL; Simonetti, B.; Klein, K. ; Chen, KE; Williamson, MK; Anton-Plagaro, C.; Shoemark, DK; Simon-Gracia, L.; Bauer, M.A.; Holland, R.; et al. Mae Neuropilin-1 yn ffactor gwesteiwr ar gyfer haint SARS-CoV-2. Gwyddoniaeth 2020, 370, 861–865. [CrossRef]

9. Wang, S.; Qiu, Z.; Hou, Y.; Deng, X. ; Xu, W. ; Zheng, T. ; Wu, P. ; Xie, S.; Bian, W. ; Zhang, C.; et al. Mae AXL yn ddarpar dderbynnydd ar gyfer SARS-CoV-2 sy'n hyrwyddo heintiad celloedd epithelial pwlmonaidd a bronciol. Cell Res. 2021, 31, 126–140. [CrossRef]

10. Cantuti-Castelvetri, L.; Ojha, R. ; Pedro, LD; Djannatian, M.A.; Franz, J.; Kuivanen, S.; van der Meer, F.; Kallio, K.; Kaya, T.; Anastasia, M.; et al. Mae Neuropilin-1 yn hwyluso mynediad celloedd SARS-CoV-2 a heintiad. Gwyddoniaeth 2020, 370, 856–860. [CrossRef]

11. Jackson, CB; Farzan, M.A.; Chen, B. ; Choe, H. Mecanweithiau mynediad SARS-CoV-2 i gelloedd. Nat. Parch Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef] [PubMed]

12. Tang, X. ; Yang, M.; Duan, Z. ; Liao, Z. ; Liu, L. ; Cheng, R.; Ffang, M. ; Wang, G. ; Liu, H.; Xu, J. ; et al. Mae derbynnydd Transferrin yn dderbynnydd arall ar gyfer mynediad SARS-CoV-2. bioRxiv 2020. [CrossRef]

13. Hentze, MW; Muckenthaler, MU; Andrews, NC Gweithredoedd cydbwyso: rheolaeth foleciwlaidd o fetaboledd haearn mamaliaid. Cell 2004, 117, 285–297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick, M. Croesi'r Giât Haearn: Pam a Sut mae Derbynyddion Transferrin yn Cyfryngu Mynediad Feirysol. Annu. Y Parch Nutr. 2018, 38, 431–458. [CrossRef] [PubMed]

15. Horonchik, L. ; Wessling-Resnick, M. Mae'r atalydd cludo haearn moleciwlaidd bach ferritin/NSC306711 yn hyrwyddo diraddio'r derbynnydd transferrin. Cemeg. Biol. 2008, 15, 647–653. [CrossRef]

16. Byrne, SL; Buckett, PD; Kim, J.; Luo, F.; Sanford, J.; Chen, J.; Enns, C. ; Wessling-Resnick, M. Ferristatin II yn hyrwyddo diraddio derbynnydd transferrin-1 in vitro ac in vivo. PLoS ONE 2013, 8, e70199. [CrossRef]

17. Sokolov, AV; Voynova, IV; Kostevich, VA; Vlasenko, AY; Zakharova, ET; Vasilyev, VB Cymharu'r Rhyngweithio rhwng Ceruloplasmin a Lactoferrin/Trosglwyddo: Rhwymo neu Beidio â Rhwymo. Biocemeg. Biokhimiia 2017, 82, 1073–1078. [CrossRef]