Mae Dyddodiad Serwm Amyloid P Yn Nodwedd Sensitif A Phenodol O Glomerwlopathi tebyg i bilen Gyda Dyddodion IgG Kappa wedi'u Cuddio

Cyswllt: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2, a John M. Arthur2

GEIRIAU ALLWEDDOL:glomerulonephritis; dyddodion wedi'u cuddio; sbectrometreg màs; glomerwlopathi tebyg i bilen; dyddodion subepithelial

Gall cistanche wella gweithrediad yr arennau

Mae glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'i guddio (MGMID) yn batrwm o glomerwloneffritis a ddisgrifiwyd yn ddiweddar gyda histopatholeg unigryw. Nodweddir y patrwm gan isepithelial a/neu mesangialimiwndyddodion sy'n cael eu "cuddio", i imiwnoglobwlin staenio gan immunofluorescence arferol ond cryf staen ar gyfer cadwyn golau IgG a kappa ar ôl treulio proteas. Mae cleifion â'r patrwm hwn o glomerwloneffritis yn fwyaf cyffredin yn ferched ifanc sy'n cyflwyno proteinwria a hanes annelwig o glefyd hunanimiwn fel gwrthgyrff gwrth-niwclear titer isel. Yma buom yn cymharu proffil sbectrometreg màs glomerwli microdissected dal laser o naw biopsïau arennol MGMID ag wyth biopsïau yn dangos patrymau eraill o glomerwlopathi membranous. Y protein a gynyddodd fwyaf yn MGMID oedd serwm amyloid P. Dangosodd imiwnostio serwm amyloid P wedi'i gydleoli ag IgG yn glomeruli MGMID ond nid gyda glomerwlopathi membranous sy'n gysylltiedig â PLA2R. Roedd serwm amyloid P yn bositif yn y glomerwli o bob un o'r 32 biopsïau MGMID ond yn negyddol mewn biopsïau o fathau eraill o glomerwlopathi membranous fel y rhai sy'n gysylltiedig â PLA2R a THSD7A. Roedd pedwar biopsïau â staen amyloid P serwm glomerwlaidd ymhlith y 173 o fiopsïau nad oeddent yn bodloni'r meini prawf ar gyfer MGMID neu amyloidosis. Roedd gan bob un o'r pedwar biopsïau hyn â staen amyloid P serwm positif batrwm pilenaidd o glomerwlopathi gyda dyddodion IgG kappa a oedd ond yn wahanol i MGMID oherwydd y diffyg "masgio". Felly, mae staenio positif o fewn dyddodion glomerwlaidd ar gyfer serwm amyloid yn dynodi ffurf unigryw o glomerulonephritis sy'n debygol o rannu mecanwaith pathoffisiolegol clefyd.

Mae glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'i guddio (MGMID) yn batrwm histopathologaidd o glomerwloneffritis a ddisgrifiwyd yn 2014, sef y disgrifiad cyntaf o'r hyn a elwir yn ddyddodion glomerwlaidd mwgwd.1 Mae histopatholeg nodweddiadol y clefyd hwn yn cynnwys presenoldeb mesangial ac isepithelial dyddodion gyda chyfyngiad IgG kappa. Yn rhyfedd iawn, er bod staenio cydran ategu 3 (C3) yn aml yn amlwg gan imiwnfflworoleuedd arferol ar feinwe wedi'i rewi, mae'r staen Ig yn aml yn cuddio, sy'n golygu ei fod yn dangos staenio negyddol ffug gan imiwnofflworoleuedd arferol ond staenio cadarnhaol pan gaiff ei ailadrodd ar feinwe wedi'i fewnosod â pharaffin ar ôl treulio proteas. Felly, oni bai bod y patholegydd yn cynnal mynegai uchel o amheuaeth ar gyfer yr endid hwn, gellid ei gamddiagnosio fel glomerwlopathi C3. Mae endidau eraill sydd wedi'u disgrifio i ddangos y ffenomen guddio hon mewn dyddodion glomerwlaidd yn cynnwys glomerwloneffritis membranoproliferative gyda dyddodion Ig monotypig wedi'u cuddio a glomerwloneffritis cryoglobwlinemig.2,3

Merched ifanc gan amlaf yw'r cleifion y canfyddir bod MGMID arnynt ar fiopsi<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>Roedd 95 y cant ) yn negyddol ar gyfer Igs monoclonaidd gan electrofforesis protein serwm, ac ni welwyd unrhyw achosion mewn cysylltiad â malaenedd hematologig sylfaenol.4

Tybiwyd y gallai'r canfyddiadau clinigopathologig a rennir ymhlith cleifion MGMID fod yn arwydd o fecanwaith pathoffisiolegol moleciwlaidd cyffredin sy'n gyrru eu clefyd. Ein bwriad wrth adrodd yn gyntaf ar yr endid hwn oedd diffinio carfan i'w dadansoddi ymhellach.1 Disgrifiwn yma bresenoldeb y gydran protein serwm amyloid p (SAP) a geir yn unigryw yn y dyddodion o glomeruli MGMID. Mae imiwneiddio ar gyfer SAP mewn dyddodion glomerwlaidd yn dechneg sensitif a phenodol ar gyfer gwneud diagnosis o MGMID sydd hefyd yn darparu mewnwelediad pathogenig.

Ffigur 1|Mae cydran P-amyloid serwm (SAP) wedi'i gyfoethogi'n sylweddol mewn glomerwli micro-ddyranedig gan gleifion â glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'u cuddio. Defnyddiwyd gwerthoedd meintioli absoliwt normaleiddio seiliedig ar ddwysedd gan MaxQuant (Sefydliad Biocemeg Max Planck, Planegg, yr Almaen) ar gyfer dadansoddiad ystadegol. Mae llinellau toredig yn darlunio toriadau hewristig ar gyfer newid plyg a gwerth P. (a) Mae plot llosgfynydd sy’n cymharu 3 derbynnydd ffosffolipas A2 (PLA2R) – achosion pilenaidd positif ag eraill yn nodi 2 brotein sy’n allgleifion clir yn y cwadrant dde uchaf. (b) Plot llosgfynydd yn cymharu 2 thrombospondin math 1 parth-yn cynnwys 7A (THSD7A) – achosion pilenaidd positif ag eraill yn nodi 2 brotein sy'n allgleifion clir gyda THSD7A yn dangos y newid plyg mwyaf. (c) Mae plot llosgfynydd sy’n cymharu samplau o glomerwlopathi tebyg i bilen â dyddodion IgG kappa wedi’u masgio â phob math arall o gasys pilen yn nodi 6 phrotein sy’n allgleifion clir yn y cwadrant dde uchaf. C6, ategu cydran 6; C7, ategu cydran 7; CFHR1, ategu protein sy'n gysylltiedig â ffactor-H 1; HP1BP3, protein heterochromatin 1 rhwymol protein 3; HPRT1, hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1; IGHG3, Ig gama cyson trwm 3 .

CANLYNIADAU

Sbectrometreg màs glomerwli microdissected laser-dal

Cymharwyd dadansoddiad sbectrometreg torfol o glomerwli micro-ddyrannu â laser o 9 achos o MGMID ag 8 achos o glomerwlopathi pilenni (MG) gan gynnwys 3 achos o dderbynnydd ffosffolipase A2 (PLA2R) - MG positif, 2 achos o thrombospondin math 1 yn cynnwys parth 7A ( THSD7A) – MG positif, a 3 achos o lupus MG. Nodwyd cyfanswm o 1695 o broteinau yn y dadansoddiad hwn. Cynhaliwyd dadansoddiad prawf-egwyddor er mwyn profi a ellid canfod proteinau sy'n gysylltiedig â pathogenesis clefyd MG trwy sbectrometreg màs. Ar gyfer pob math pilenog hysbys, cymharwyd helaethrwydd gwahaniaethol protein yn erbyn y grwpiau sy'n weddill gan ddefnyddio gwerthoedd meintioli absoliwt wedi'u normaleiddio ar sail dwyster (iBAQ). Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio prawf-t Welch, a delweddwyd y canlyniadau ar lain llosgfynydd. Roedd PLA2R gryn dipyn yn fwy niferus mewn achosion o MG sy'n gysylltiedig â PLA2R a dangosodd y newid plyg cryfaf (Ffigur 1a). Dangosodd THSD7A y newidiadau plyg cryfaf yn MG sy'n gysylltiedig â THSD7A, er bod ganddo werth P mwy oherwydd maint sampl isel yn y grŵp hwn (n ¼ 2; Ffigur 1b). Ar y cyfan, dangosodd y dadansoddiad prawf-egwyddor hwn y gall sbectrometreg màs glomerwli micro-ddyrannu â laser nodi proteinau sy'n arwyddocaol i bathogenesis afiechyd mewn glomerwlopathi membranous.

Nesaf, ceisiasom nodi proteinau a allai fod yn gysylltiedig â phathogenesis MGMID gan ddefnyddio'r dull hwn. Roedd cyfanswm o 6 pro teins gryn dipyn yn fwy niferus yn y samplau MGMID o gymharu â'r grwpiau eraill (Tabl 1). Y protein gyda'r newid plyg mwyaf oedd SAP (Ffigur 1c). Roedd y proteinau sy'n weddill yn cynnwys IgG Kappa, 3 protein ategu, a'r protein heterochromatin 1-rhwymo protein 3 (HP1BP3). Ystyriwyd mai SAP oedd yr ymgeisydd gorau gan iddo gael ei ganfod ym mhob sampl MGMID a dangosodd y gwahaniaeth mwyaf mewn digonedd o gymharu â samplau nad ydynt yn MGMID. Dangosir yr holl Igs a adnabyddir gan sbectrometreg màs mewn glomerwli microdissected sy'n dal laser o achosion o glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa yn Nhabl Atodol S1. Dangosir cyfrifiadau sbectrol trwy samplu'r holl broteinau a ddangosodd doriad $1 log2 cynyddol mewn samplau MGMID a gwerth P #0.1 yn Nhabl Atodol S2.

Cistancheyn gallu gwellaarenswyddogaeth

Staenio SAP mewn achosion o glomerwlopathi tebyg i bilen

Dangosodd gwrthgorff cwningen polyclonaidd yn erbyn y protein SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) staenio cadarnhaol cryf ar hyd y pilenni islawr glomerwlaidd o achosion gyda MGMID a oedd yn colocalized ag IgG trwy ddadansoddiad confocal. Ni ddangosodd SAP gydleoli ag IgG yn y glomeruli o MG sy'n gysylltiedig â PLA2R (Ffigur 2). Profwyd gwrthgorff cwningen polyclonaidd yn erbyn HP1BP3 mewn 4 biopsïau gyda MGMID a dangosodd staenio negyddol yn y dyddodion glomerwlaidd ym mhob un o'r 4 achos.

Perfformiwyd staenio SAP ar gyfanswm o 211arenbiopsïaugyda glomerulonephritis (Tabl 2). Roedd cyfanswm o 36 o achosion gyda dyddodion math imiwn wedi'u staenio'n bositif ar gyfer SAP. Roedd pob un o'r achosion a oedd wedi'u staenio'n bositif yn rhannu rhai nodweddion histopathologig gan gynnwys presenoldeb dyddodion mesangial ac isepithelial gyda chyfyngiad IgG kappa a dim newidiadau endocapilari neu bilen-ymledol gan ficrosgopeg golau. Roedd SAP yn negyddol ym mhob achos, gyda dyddodion cudd nad oeddent yn MGMID, gan gynnwys 3 achos o glomerwloneffritis cryoglobwlinemig a 3 achos o glomerwloneffritis membranoproliferative wedi'i guddio. Roedd hefyd yn negyddol ym mhob un o’r 19 achos o glomerulonephritis ymledol gyda dyddodion Ig monoclonaidd (PGNMID), gan gynnwys achosion gydag IgG1 kappa (4 achos), IgG2 lambda (1 achos), IgG 3 kappa (8 achos), ac IgG3 lambda (6 achos). ). Roedd pob un o'r 30 achos o glomerwlopathi membranous polyclonal (PLA2R, THSD7A, lupws, a segmentol) yn negyddol ar gyfer SAP. Astudiwyd ffurfiau ychwanegol o glomerulonephritis hefyd ac roeddent yn negyddol. Ymhlith y glomerwloneffritis sy'n gysylltiedig â haint, roedd 7 positif ar gyfer staenio IgG a 6 â thystiolaeth o ddyddodion twmpathau isepithelial. Yn ôl y disgwyl, dangosodd pob un o'r 6 achos o amyloidosis staenio cadarnhaol mewn dyddodion amyloid. Fodd bynnag, roedd patrwm y dyddodiad smwdlyd yn gwbl groes i'r staenio gronynnog a oedd yn bresennol mewn achosion o MGMID. Dangosir ffotomicrograffau cynrychioliadol o glomeruli ar staen SAP o amrywiaeth o wahanol glefydau arennol yn Ffigur Atodol S1.

Roedd pob un o'r 32 achos a ddynodwyd yn flaenorol fel MGMID yn gadarnhaol ar gyfer SAP. Yn ogystal, roedd staenio cadarnhaol ar gyfer SAP yn y glomeruli o 4 o 25 achos o glomerwlopathi membranous gyda dyddodiad IgG monotypic nad oedd yn cuddio yn ôl y drefn arferol.

immunofluorescence, gan gynnwys 4 o 13 achos gydag IgG1 kappa, 0 o 2 achos gydag IgG1 lambda, 0 o 5 achos gydag IgG2 kappa, 0 o 4 achos gydag IgG3 kappa, a {{ 12}} o 1 achos gyda IgG4 kappa. Yn gyffredinol, roedd 32 o 36 (89 y cant) o glomerwlopathi SAP-positif wedi'u cuddio ac yn ffitio i mewn i'r categori MGMID, tra bod y 4 arall o 36 (11 y cant) heb eu cuddio a'u diagnosio fel MG gyda dyddodion IgG1 kappa. Roedd gan gleifion â glomerwlopathi membranous monotypic nad oedd yn cuddio ond a oedd yn bositif ar gyfer SAP oedran cymedrig o 33 mlynedd, gyda chymhareb benywaidd-i-wryw o 4:{0. Roedd gan achosion gyda glomerwlopathi membranous monotypic nad oedd yn cuddio ond a oedd yn negyddol ar gyfer SAP oedran cymedrig o 59.3 mlynedd gyda chymhareb benywaidd-i-wryw o 15:4.

Tabl 1|Cynyddodd proteinau yn sylweddol mewn glomerwli cleifion âglomerwlopathi tebyg i bilengyda dyddodion IgG kappa wedi'u cuddio, fel y dangosir gan sbectrometreg màs

Adweithedd serwm i SAP

Profwyd sera o 22 o gleifion â MGMID, 12 â glomerwlopathi membranous PLA2R-positif, a 6 rheolydd arferol ar gyfer adweithedd IgG i SAP gan assay imiwnosorbent cysylltiedig ag ensymau (ELISA). Er bod rhywfaint o amrywiaeth yn bodoli ymhlith cleifion ym mhob grŵp, nid oedd unrhyw wahaniaeth sylweddol mewn adweithedd IgG tuag at SAP rhwng y grwpiau (Ffigur Atodol S2).

Ffigur 2|Cydleoli IgG a serwm amyloid P-elfen (SAP). (a–c) Mae arbrofion imiwnfflworoleuedd a gynhaliwyd ar sampl biopsi arennol o glaf a gafodd ddiagnosis o glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'i guddio yn dangos staenio pilen islawr glomerwlaidd gronynnog ar gyfer (a) SAP a (b) IgG. (c) Mae SAP ac IgG wedi'u cydleoli'n gryf yn y dyddodion pilen islawr glomerwlaidd. (d–f) Mae arbrofion imiwnofflworoleuedd a gynhaliwyd ar sampl biopsi arennol o glaf â 3 ffosffolipas A2 yn dangos glomerwlopathi pilenog derbynnydd-positif (d) staenio pilen islawr glomerwlaidd negyddol ar gyfer SAP a (e) staenio pilen islawr glomerwlaidd gronynnog positif ar gyfer IgG. (f) Mae diffyg colocalization yn y claf hwn gyda 3 ffosffolipas A2 glomerwlopathi membranous sy'n gysylltiedig â derbynnydd. I wneud y gorau o'r ddelwedd hon, gweler y fersiwn ar-lein o'r erthygl hon yn Nhabl 2|Canlyniadau staenio cydran serwm amyloid p (SAP) mewn biopsïau arennol

AA, amyloid A; AL, cadwyn golau amyloid; C3, ategu cydran 3; GBM, bilen islawr glomerwlaidd; MG, glomerwlopathi membranous; MGMID, glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'u cuddio; MPGN, membranoproliferative; glomerulonephritis; PGMNID, glomerulonephritis ymledol gyda dyddodion monoclonaidd IgG kappa; PLA2R, derbynnydd ffosffolipase A2; THSD7A, math 1 thrombospondin sy'n cynnwys 7A.

TRAFODAETH

Mae MGMID yn batrwm unigryw o glomerwlopathi a ddisgrifiwyd yn ddiweddar a nodweddir gan ddyddodion subepithelial a mesangial sy'n staenio ar gyfer IgG kappa gan baraffin IF (Ffigur 3). Mae cleifion â'r patrwm hwn o glomerwlopathi yn tueddu i fod yn fenywod ifanc (oedran<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

Mae SAP yn brotein pentameric 25-kDa o fewn y teulu pentraxin sy'n cael ei amgodio gan y genyn APCS ac mae'n doreithiog mewn serwm ac fel cydran o bilen islawr glomerwlaidd.5 Er bod union swyddogaeth SAP yn aneglur, mae'n hysbys i ryngweithio mewn plasma ag amrywiaeth eang o broteinau, gan gynnwys cydrannau cyflenwad, apolipoproteinau, a rheolyddion ceulo a phroteolysis.6 Mae'n ffurfio rhyngweithiadau sefydlog sy'n ddibynnol ar galsiwm gyda'i ligandau, gan gynnwys proteinau, lipoproteinau, a DNA, gan eu hamddiffyn rhag diraddio. Mae SAP yn gweithredu fel moleciwl hydawdd adnabod patrwm sy'n ymwneud â'r ymateb imiwn cynhenid, gan gydnabod amrywiaeth o batrymau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â phathogenau a difrod, gan gynnwys cydrannau microbaidd a malurion celloedd apoptotig.7 Rhyngweithiad SAP â moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â phathogenau neu ddifrod. mae patrymau'n hyrwyddo clirio gweddillion celloedd apoptotig trwy eu rhwymo'n uniongyrchol i ategu cydran 1q (C1q) ac actifadu'r llwybr cyflenwad clasurol. Er gwaethaf actifadu cyflenwad, mae'n hysbys bod SAP yn rhoi imiwn-reoleiddio, sy'n lleihau niwtroffiligllido fewn meinweoedd trwy lai o adlyniad endothelaidd,8 llai o weithrediad elastase,9 a llai o gartrefu i feinweoedd.10 Gwyddys hefyd mai SAP yw'r prif brotein rhwymol ar gyfer DNA a chromatin yn y plasma.11

Mewn afiechyd, mae SAP yn fwyaf adnabyddus am fod yn rhan o ddyddodion amyloidosis. Er nad yw wedi'i astudio cystal, mae tystiolaeth hefyd y gallai chwarae rhan mewn modelau dynol ac anifeiliaid o glefyd hunanimiwn. Mae gwrthgyrff SAP wedi'u nodi mewn cleifion âhunanimiwnafiechydon, a dangoswyd bod llai o fynegiant SAP yn hyrwyddoawtoimiwneddmewn modelau murine. Mae gwrthgyrff yn erbyn SAP wedi'u nodi mewn 44 y cant o gleifion â lupus erythematosus systemig, gyda theitrau gwrthgyrff yn cydberthyn â gweithgaredd afiechyd.12 Canfuwyd bod diffyg SAP yn arwain at ddatblygiad hunanimiwnedd digymell mewn llygod C57BL/6 sy'n dueddol o gael imiwnedd, ac mewn llygod nad ydynt yn hunanimiwn. llygod 129/Sv tueddol o'u croesi â llygod C57BL/ 6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13 ond nid yn y straen 129/Sv yn unig, sy'n awgrymu y gallai fod angen tueddiad genetig gwaelodol ar gyfer diffyg SAP i achosi awtoimiwnedd.14 Y mae llygod yn dangos bod gwrthgyrff gwrth-niwclear yn cael eu cynhyrchu, DNA gwrth-sownd sengl, gwrthgyrff DNA gwrth-ddwbl, a ffactorau gwynegol. Maent yn datblygu ymledolimiwnglomerwloneffritis cyfryngol cymhleth, yn amlach mewn merched.13 Mewn model murine o neffritis lwpws lle mae glomerwloneffritis yn cael ei achosi gan chwistrelliad o hunan-DNA wedi'i actifadu mewn serwm, roedd therapi genynnau SAP gan fector plasmid yn lleihau cynhyrchu gwrthgyrff DNA gwrth-ddwbl-sownd , dyddodiad cymhleth imiwnedd, a llid yr arennau, ac atal dyfodiad neffritis lupws.15

Ffigur 3|Darganfyddiadau biopsi arennol mewn glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'u cuddio. Mae ffotomicrograffau o'r biopsi a ddangosir yn Ffigur 2 i'w gweld yma. (a) Mae pigau segmentol yn bresennol ar hyd y pilenni islawr glomerwlaidd, gan Jones staen arian metheamine (chwyddiad gwreiddiol × 400). (b) Mae microsgopeg electron yn datgelu dyddodion isepitheliaidd sy'n bresennol ar hyd y bilen islawr glomerwlaidd (chwyddiad gwreiddiol × 12,000). (c) Mae glomeruli yn staenio negatif ar gyfer IgG gan imiwnfflworoleuedd arferol ar feinwe ffres (imiwnofflworoleuedd uniongyrchol; chwyddhad gwreiddiol × 400). (ch) Mae glomeruli o'r un achos yn staenio'n bositif ar feinwe wedi'i fewnosod â pharaffin ar ôl treulio proteas (imiwnofflworoleuedd uniongyrchol; chwyddhad gwreiddiol × 400). (d) Mae glomeruli yn dangos staenio ar gyfer kappa ac (dd) nid lambda ar y meinwe paraffin wedi'i fewnosod wedi'i dreulio'n proteas (imiwnofflworoleuedd uniongyrchol; chwyddhad gwreiddiol × 400). I wneud y gorau o'r ddelwedd hon, gweler y fersiwn ar-lein o'r erthygl hon yn www.aren-rhyngwladol.org.

Er gwaethaf y cyfyngiad cadwyn ysgafn a welir ar fiopsi, nid oes tystiolaeth ar hyn o bryd bod yr endid hwn yn gysylltiedig ag anhwylderau lymffoproliferol gwaelodol neu Igs monoclonaidd sy'n cylchredeg.4 Felly, ni ddylid ystyried bod MGMID o fewn sbectrwm gammopathi monoclonaidd o arwyddocâd arennol ar hyn o bryd. amser. Mae rôl hunanwrthgyrff SAP hefyd yn ansicr. Yn wahanol i fathau eraill o glomerwlopathi membranous gyda phrotein sy'n bresennol yn benodol yn y dyddodion imiwnedd, megis clefyd sy'n gysylltiedig â PLA2R,16 nid yw'n ymddangos bod MGMID yn cael ei yrru gan awto-wrthgyrff a gyfeiriwyd yn erbyn SAP, gan inni fethu â chanfod adweithedd gwrthgyrff serwm yn erbyn SAP mewn cleifion MGMID . Esboniad arall yw bod IgG kappa yn bresennol o ganlyniad i ryngweithio arferol rhwng y 2 brotein hyn yn hytrach na rhyngweithiad antigen-gwrthgorff hunanimiwn, gan y gwyddys bod y gadwyn Ig kappa yn rhan o ryngweithiad arferol serwm SAP.6 Felly, er ei fod yn ddefnyddiol ar gyfer diagnosteg meinwe'r endid hwn, nid yw profi am wrthgyrff SAP yn y serwm yn gwasanaethu fel diagnostig anfewnwthiol ar hyn o bryd, ac mae gyrrwr sylfaenol y clefyd hwn yn parhau i fod yn ddirgelwch.

Mae canlyniadau clinigol mewn MGMID yn amrywiol iawn, yn amrywio o ryddhad digymell i ddilyniant i gam olafarenclefydgyda thrawsblaniad yn digwydd eto. Mae dadansoddiad ôl-weithredol wedi methu â dangos unrhyw gysylltiad rhwng y driniaeth a ddefnyddiwyd a'r canlyniad clinigol.4 Mae'n bosibl y bydd goblygiadau i therapi yn gysylltiedig â darganfod rhan SAP yn y clefyd hwn. Mae triniaethau sy'n targedu SAP yn uniongyrchol wedi dangos addewid cynnar wrth drin amyloidosis.17,18 Yn ogystal, mae'r canlyniadau sbectrometreg màs yn nodi y gallai therapïau sy'n targedu'r rhaeadru cyflenwad fod yn ddefnyddiol wrth drin y math hwn o glomerulonephritis, o ystyried bod y rhan fwyaf o'r proteinau a gynyddwyd mewn MGMID mae glomerwli yn gysylltiedig â chyflenwad. Mae angen astudiaethau ychwanegol i nodi biofarcwyr gweithgaredd ar gyfer y clefyd hwn, yn ogystal â therapïau.

Mae'r rheswm dros guddio dyddodion imiwnedd mewn biopsïau MGMID ar imiwnfflworoleuedd arferol yn parhau i fod yn ddirgelwch. Mae presenoldeb SAP yn y dyddodion yn codi esboniadau newydd posibl ar gyfer y ffenomen hon mewn achosion o MGMID. Er enghraifft, mae'n hysbys bod rhyngweithiadau'r protein SAP yn ddibynnol iawn ar Ca2þ,6 ac mae llawer o'r cyfryngau trafnidiaeth a'r byfferau a ddefnyddir i brosesu meinwe biopsi arennol ar gyfer imiwnfflworoleuedd yn amddifad o Ca2þ. Gallai'r diffyg Ca2þ in vitro hwn arwain at darfu ar ddyddodion imiwnedd fel nad ydynt bellach ar gael i'w canfod trwy imiwnfflworoleuedd ar y meinwe wedi'i rewi. Fodd bynnag, byddai'r dyddodion cymhleth imiwnedd yn parhau i fod ar gael i'w canfod yn y meinwe sefydlog fformalin, o ganlyniad i'r bondiau cemegol cofalent a achosir gan fformalin rhwng proteinau mewn meinwe.

Rydym yn disgrifio yma, am y tro cyntaf, bresenoldeb unigryw SAP yn y dyddodion glomerwlaidd o MGMID. Yn ogystal, rydym yn dangos bod staenio oarenbiopsïauar gyfer SAP yn nodi achosion â nodweddion clinigopathologig tebyg i'r rhai yn MGMID, heb eu cuddio, trwy imiwnfflworoleuedd arferol. O ystyried y canlyniadau hyn, credwn fod staenio cadarnhaol o fewn dyddodion glomerwlaidd ar gyfer SAP yn nodi ffurf unigryw o glomerwloneffritis sy'n rhannu mecanwaith pathoffisiolegol cyffredin o glefyd. Hyd nes y disgrifiad diweddar o MGMID, roedd yr achosion hyn yn cael eu diagnosio i nifer o gategorïau gwahanol yn amrywio o glomerwlopathi C3 i glomerwloneffritis sy'n gysylltiedig â haint i glomerwlopathi membranous annodweddiadol.1 Mae esblygiad cyflym y meini prawf diagnostig a'n dealltwriaeth o'r math hwn o glomerwloneffritis yn amlygu pŵer màs sbectrometreg i ddarparu mewnwelediad pathoffisiolegol i glomerwloneffritis cyfryngol imiwn.

DULLIAU

Technegau prosesu biopsi arennol

Defnyddiwyd technegau prosesu biopsi arennol safonol, gan gynnwys golau, immunoflorescence, a microsgopeg electron.19,20 Roedd pob sampl microsgopeg ysgafn wedi'i staenio â hematocsilin ac eosin, arian methenamine Jones, trichrome Masson, ac adweithydd cyfnodol asid-Schiff. Torrwyd pob adran imiwnfflworoleuedd uniongyrchol ar 4 mm a'i adweithio â gwrthgyrff gwrth-ddynol cwningen polyclonaidd wedi'u tagio â flfluorescein i gadwyni IgG, IgA, IgM, C3, C1q, ffibrinogen, a k-, a golau-l (Dako, Carpenteria, CA). am 1 awr, a'i rinsio; rhoddwyd slip gorchuddio gan ddefnyddio cyfrwng mowntio dyfrllyd. Cafodd achosion dethol eu staenio ar gyfer gwrthgyrff gwrth-ddynol llygoden polyclonaidd wedi'u tagio â flfluorescein i IgG1, IgG2, IgG3, ac IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Perfformiwyd immunofluorescence paraffin ar ôl treuliad proteas fel y disgrifiwyd yn flaenorol.2,3 Dewiswyd cyfanswm o 9 biopsïau MGMID ac 8 biopsïau rheoli cymhariaeth â glomerwlopathi membranous o fathau eraill ar gyfer dadansoddiad sbectrometreg màs. Cymeradwywyd protocol yr astudiaeth gan Fwrdd Adolygu Sefydliadol Solutions ac roedd yn cydymffurfio ag egwyddorion Datganiad Helsinki.

Gall Cistanchetonifyaren

Sbectrometreg màs glomerwli microdissected laser-dal

Torrwyd meinwe biopsi arennol o feinwe paraffin wedi'i fewnosod â fformalin ar drwch o 10 mm ar sleidiau ffrâm bilen PET Leica (Leica, Wetzlar, yr Almaen). Yna cafodd y sleidiau hyn eu staenio â hematocsilin. Cafodd y glomeruli eu micro-rannu'n diwbiau microcentrifuge gan ddefnyddio microsgop Leica DM60{{20}}0B. Cafodd y glomeruli microdissected eu gorchuddio mewn 2 y cant o sodiwm dodecyl sylffad a 0.1M dithiothreitol ar 99 gradd am 1 awr a'u prosesu trwy baratoi sampl gyda chymorth hidlo (FASP).21 Trosglwyddwyd y lysate eglur i grynodyddion Vivacon 500 (MWCO o 30 kDa; Sartorius , Göttingen, yr Almaen). Tynnwyd sodiwm dodecyl sylffad trwy olchiadau dro ar ôl tro gyda wrea 8 M mewn tris 0.1 M (hydroxymethyl)-aminomethane/Cl, pH 8.5; yna cafodd y samplau eu alcylu gyda 0.05 M iodoacetamide. Tynnwyd iodoacetamid gan 3 golchiad gyda 8 M wrea / 0.1 M tris (hydroxymethyl) - aminomethane / Cl, pH 8.5, ac yna 3 golchiad gyda 0.05 M bicarbonad amoniwm. Cafodd proteinau eu treulio â trypsin (gradd ddilyniannol, Promega, Madison, SyM) ar gymhareb 40:1 w/w ar 37 gradd am 16 awr. Casglwyd peptidau trwy allgyrchu a'u dihalwyno ar awgrymiadau cam C (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Dadansoddwyd peptidau wedi'u treulio gan sbectrometreg màs NanoLC-tandem gan ddefnyddio sbectromedr màs Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Llwythwyd y peptidau ar golofn trap cam cefn (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) yn cynnwys 2.5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) resin hybrid arwyneb wedi'i wefru ynghyd â 150 mm X 0.0Colofn ddadansoddol 75 mm yn cynnwys yr un resin cam cefn ag a ddefnyddir yn y trap. Yna defnyddiwyd system cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad nanoAcquity (Waters Corp.) i gynhyrchu graddiant 60-munud o 98:2 i 60:40 byffer A: B cymhareb (byffer A ¼ 0.1 y cant asid fformig , 0.5 y cant acetonitrile; byffer B ¼ 0.1 y cant asid fformig, 99.9 y cant acetonitrile).

Cafodd peptidau eu hanwybyddu o'r golofn gyda blaen chwistrellu integredig (Picofrit, New Objective) a'u hïoneiddio gan chwistrelliad electro (2.0 kV) ac yna dadansoddiad sbectrometreg màs tandem gan ddefnyddio daduniad ynni uwch a achosir gan wrthdrawiad (HCD). Perfformiwyd sganiau arolwg o ragsylweddion peptid ar gydraniad 240K (ar 400 m/z) gyda tharged cyfrif ïon 5 × 10⁵. Perfformiwyd sbectrometreg màs tandem trwy ynysu ar 1.6 Th gyda'r pedwarpôl, darniad HCD gydag egni gwrthdrawiad normaleiddio o 30, a dadansoddiad sbectrometreg màs sgan cyflym yn y trap ïon. Chwiliwyd y data sbectrometreg màs tandem a gafwyd yn erbyn cronfa ddata ddynol ddiweddaraf Uniprot sy'n cynnwys y cofnodion Swiss Prot a TREMBLE gan ddefnyddio

MaxQuant (Sefydliad Biocemeg Max Planck, Planegg, yr Almaen). Cyflawnwyd delweddu data gan ddefnyddio Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Gosodwyd y gyfradd darganfod ffug ar 1 y cant ar gyfer y gemau peptid-i-sbectrwm. Defnyddiwyd gwerthoedd iBAQ wedi'u normaleiddio o MaxQuant ar gyfer meintioli. Cafodd dosbarthiadau iBAQ ar gyfer pob sampl eu haddasu'n ganolrif i reoli gwahaniaethau mewn llwytho. Tynnwyd gwerthoedd iBAQ hafal i sero o'r set ddata. Ar gyfer profion damcaniaeth ystadegol, cynhaliwyd 2-prawf-t sampl Welch ar gyfer pob protein gan ddefnyddio gwerthoedd iBAQ normaleiddio ar gyfer y 2 grŵp. Os canfuwyd protein mewn un grŵp yn unig, cynhaliwyd 1-prawf-t sampl Welch, gan ddefnyddio'r gwerth iBAQ lleiaf a ganfuwyd fel y rhagdybiaeth nwl.

SAP staenio

Cafodd adrannau wedi'u mewnosod â pharaffin wedi'u gosod â fformalin, wedi'u torri ar 3 mm, eu dad-baraffinio, a pherfformiwyd adalw antigen ar 99 gradd. Ymatebwyd i'r adrannau â gwrthgorff polyclonaidd polyclonaidd gwrth-SAP cwningen (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) wedi'i ddilyn gan gafr gwrth-cwningen eilaidd coch Rhodamine X-conjugated a arsugnwyd cyfnod solet i sicrhau cyn lleied â phosibl o groes-adwaith â dynol. IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Cafodd pob achos ei redeg gyda rheolaethau cadarnhaol a negyddol. Gwerthuswyd y staen gan ficrosgopeg immunofluorescence safonol. Barnwyd ei bod yn gadarnhaol os oedd staen dolen capilari gronynnog positif yn y glomerwli, ac yn negyddol os nad oedd dolen capilari

staenio yn y glomeruli. Archwiliwyd cydleoli IgG a SAP yn y pilenni islawr glomerwlaidd gan ficrosgopeg confocal gan ddefnyddio microsgop sganio laser confocal Zeiss LSM 880 (Zeiss Microsgopeg, Jena, yr Almaen). Ar gyfer y dadansoddiad hwn, adweithiwyd IgG gwrth-ddynol cwningen polyclonal (flfluorescein isothiocyanate-conjugated) (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) gyda'r meinwe adalw gwres yn dilyn y staenio ar gyfer SAP fel y disgrifir uchod. Perfformiwyd rheolaethau negyddol i sicrhau penodoldeb gwrthgyrff trwy hepgor gwrthgyrff sylfaenol. Profwyd pedwar achos o MGMID am bresenoldeb HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) trwy staenio immunoperoxidase.

Profi am wrthgyrff serwm i SAP

Cafodd protein SAP (R&D Systems, Minneapolis, MN; {{0}SAB-050) ei wanhau i 3 ng/ml mewn byffer carbonad-bicarbonad (pH 9.6) a'i orchuddio ar {{ 6}}yn dda plât Immulon H2 (Thermo Gwyddonol) dros nos ar 4 gradd . Golchwyd platiau x3 gan ddefnyddio 200 ml o glustog golchi (helir byffer 1 × ffosffad a 0.05 y cant tween) a'u blocio am 2 awr gyda byffer blocio (helir byffer 1 × ffosffad, 0.05 y cant). tween, gelatin pysgod 1 y cant). Yna golchwyd platiau × 3 gyda 200 ml o glustog golchi. Ychwanegwyd ugain microlitr o serwm gwanedig (1:100 mewn byffer golchi) fesul ffynnon a'i ddeor am 2 awr ar dymheredd ystafell. Golchwyd platiau × 7 gyda 200 ml o glustog golchi a ddilynwyd gan ychwanegu'r gwrthgorff canfod, gwrth-Dynol IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Golchwyd platiau × 7 gyda 200 ml o glustog golchi. Nesaf, cymysgwyd swbstrad 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine peroxidase, a swbstrad peroxidase Sol B ar gymhareb 1: 1, ac ychwanegwyd 100 ml at y plât. Stopiwyd yr adwaith trwy ychwanegu 100 ml o 2M H2SO4, wedi'i adael ar y fainc am 20 munud cyn darllen ar 450 nm. Er mwyn rheoli er mwyn sicrhau bod y protein SAP wedi'i rwymo i'r plât, fe wnaethom ddefnyddio gwrth-SAP cwningen (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) mewn gwanhad cyfresol ac yna IgG-HRP gwrth-gwningen (Jackson ImmunoResearch Laboratories). ; 111-035-144). Roedd y rheolaeth yn dangos cydberthynas dda rhwng gwanhau gwrthgorff a'r amsugnedd, gyda gwerth R-sgwâr cymedrig o 0.95.

Cistanche ar gyfer gwellaarenswyddogaeth

DATGUDDIAD

Ni ddatganodd yr holl awduron unrhyw fuddiannau cystadleuol.

ATODOL

Ffeil Atodol DEUNYDD (PDF)

Ffigur S1. Delweddau cynrychioliadol o staen glomerwlaidd SAP o amrywiaeth o glefydau arennol.

Ffigur S2. Astudiaethau seroreactivity gwrth-SAP trwy assay imiwn-imiwnedd sy'n gysylltiedig ag ensymau.

Tabl S1. Pob Igs a adnabyddir gan sbectrometreg màs mewn glomerwli micro-ddyrannu â laser o achosion o glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa.

Tabl S2. Dangosodd cyfrifiadau sbectrol trwy samplu'r holl broteinau fod $1 log2 yn fwy niferus mewn samplau MGMID a gwerth P # 0.1.

CYFEIRIADAU

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et al. Glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'u cuddio.ArennauInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Immunofluorescence paraffin yn y labordy patholeg arennol: mwy na thechneg achub. Mod Pathol. 2015; 28:854 –860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, et al. Glomerulonephritis bilen-proliferative gyda dyddodion imiwnoglobwlin monotypic wedi'u cuddio. Arennau Int. 2015;88:867-873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, et al. Nodweddion clinigopathologig glomerwlopathi tebyg i bilen gyda dyddodion IgG kappa wedi'u cuddio. Cynrychiolydd Mewnol Arennau 2016; 1: 299-305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. Strwythur cydran amyloid P serwm dynol pentameric. Natur. 1994; 367:338-345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AC, et al. Serwm amyloid P cydran (SAP) yn rhyngweithio mewn plasma dynol sy'n cynnwys lefelau calsiwm ffisiolegol. Biocemeg. 2017; 56:896-902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, et al. Adnabod patrymau gan bentracsinau. Adv Exp Med Biol. 2009; 653:98-116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, et al. Y pentracsinau PTX3 a SAP mewn imiwnedd cynhenid, rheoleiddio llid ac ailfodelu meinwe. J Hepatol. 2016; 64: 1416-1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Cydran amyloid P dynol: atalydd elastase. Scand J Immunol. 1984; 20: 219-226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Serwm amyloid P: rheolydd systemig o'r ymateb imiwn cynhenid. J Leukoc Biol. 2014; 96:739-743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Moleciwlau amddiffynnol - protein C-adweithiol (CRP), serwm amyloid P (SAP), pentraxin3 (PTX3), lectin rhwymo mannose (MBL), ac apolipoprotein A1 (Apo A1), a'u hunanwrthgyrff: mynychder ac arwyddocâd clinigol mewn hunanimiwnedd. J Clin Immunol. 2005; 25: 582-591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. Mae gwrthgyrff cydran P amyloid gwrth-serwm mewn cleifion â lupus erythematosus systemig yn cydberthyn â gweithgaredd afiechyd. Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1698-1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et al. Mae cydran serwm amyloid P yn rheoli diraddiad cromatin ac yn atal hunanimiwnedd gwrth-niwclear. Nat Med. 1999; 5: 694-697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et al. Autoimunity a glomerulonephritis mewn llygod gyda dileu wedi'i dargedu o'r serwm amyloid genyn cydran P: SAP diffyg neu gyfuniad straen? Imiwnoleg. 2004; 112: 255-264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B, et al. Roedd lleddfu neffritis lupws gan therapi genynnau elfen P serwm amyloid gyda mecanweithiau gwahanol yn amrywio o wahanol gamau o'r clefyd. PloS Un. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et al. Derbynnydd ffosffolipase M-math A2 fel antigen targed mewn neffropathi membranous idiopathig. N Engl J Med. 2009; 361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et al. Clirio amyloid yn therapiwtig gan wrthgyrff i gydran serwm amyloid P. N Engl J Med. 2015; 373: 1106-1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, et al. Ailadrodd dosau o wrthgyrff i serwm amyloid P cydran dyddodion amyloid clir mewn cleifion ag amyloidosis systemig. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Canllawiau ymarfer ar gyfer y biopsi arennol. Mod Pathol. 2004; 17: 1555-1563.

20. Walker PD. Y biopsi arennol. Arch Pathol Lab Med. 2009; 133: 181-188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Dull paratoi sampl cyffredinol ar gyfer dadansoddi proteome. Dulliau Nat. 2009;6:359–362.