Sbardunau Gorfynegiant GRP78 PINC1-Mitophagi Niwro-amddiffynnol Cyfryngol IP3R Rhan 2

2.5. Blot Gorllewinol

Fe wnaethom anestheteiddio llygod mawr yn ddwfn gyda Dolethal (n=4) ar 7 dpi i gael llinyn asgwrn cefn L4-L5 (5- hyd mm) ar gyfer dadansoddiad echdoriad gorllewinol. Rydym yn snap-rhewi y samplau mewn hylifnitrogen.

Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae mwy a mwy o ganlyniadau ymchwil wedi dangos bod perthynas agos rhwng blotio protein a chof. Mae blotio protein yn dechneg ddadansoddol ar gyfer canfod mynegiant protein, a ddefnyddiwyd yn helaeth mewn ymchwil niwrowyddoniaeth.

Mae cysylltiad agos rhwng y niwronau a storio cof. Gall blotio protein ganfod y statws cysylltiad rhwng niwronau a mynegiant proteinau cyn ac ôl-synaptig, gan ddatgelu ymhellach rôl bwysig proteinau wrth ffurfio a storio cof.

Mae astudiaethau wedi canfod bod cysylltiad agos rhwng mynegiant proteinau niwronaidd presynaptig a ffurfio a storio cof. Er enghraifft, yn ystod y broses o ddysgu a chof, mae niwronau'n newid mynegiant proteinau presynaptig, ac mae'r newid hwn yn gysylltiedig â ffurfio a storio atgofion newydd. Yn ogystal, mae rhai astudiaethau hefyd wedi canfod bod newidiadau yn y mynegiant o rai proteinau yn gysylltiedig â chlefydau niwroddirywiol megis clefyd Alzheimer.

Felly, gall blotio protein ddarparu dealltwriaeth fanwl o'r statws cysylltiad rhwng niwronau a'r newidiadau yn y mynegiant o broteinau cysylltiedig, gan ddatgelu mecanwaith moleciwlaidd niwronau. Mae hyn yn arwyddocaol iawn ar gyfer astudio mecanwaith ffurfio cof a chlefydau niwroddirywiol.

Yn fyr, mae'r berthynas rhwng blotio protein a chof yn dangos rôl proteinau yn y cysylltiad rhwng niwronau a storio cof. Mae hyn yn darparu syniadau a chyfarwyddiadau newydd ar gyfer astudio mecanwaith ffurfio cof a chlefydau niwroddirywiol. Gadewch inni hyrwyddo ymchwil niwrowyddoniaeth yn weithredol a chyfrannu at iechyd a hirhoedledd! Gellir gweld bod angen i ni wella cof, a gall Cistanche wella'r cof yn sylweddol oherwydd bod ganddo effeithiau gwrthocsidiol, gwrthlidiol a gwrth-heneiddio, a all helpu i leihau ymatebion ocsideiddiol a llidiol yn yr ymennydd, a thrwy hynny amddiffyn iechyd y nerfol. system. Yn ogystal, gall Cistanche hefyd hyrwyddo twf ac atgyweirio celloedd nerfol, a thrwy hynny wella cysylltedd a swyddogaeth rhwydweithiau niwral. Gall yr effeithiau hyn helpu i wella cof, gallu dysgu a chyflymder meddwl, a gallant hefyd atal camweithrediad gwybyddol a chlefydau niwroddirywiol rhag digwydd.

Cliciwch gwybod ffyrdd i wella gweithrediad yr ymennydd

Cafodd samplau eu storio neu eu prosesu ymhellach trwy homogeneiddio mewn byffer lysis (20 mM HEPES, pH 7.7, swcros 251 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, a choctel ofprotease (Sigma-Aldrich) ac atalyddion ffosffatas (Roche, Basel, y Swistir) ) witha Potter homogenizer ar iâ.

Ar ôl centrifugio lysates ar 800 × g am 20 munud ar 4◦C, rydym yn casglu y supernatant fel y ffracsiwn ôl-niwclear, a phroteinau meintiol gan BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Ar gyfer blotio gorllewinol, fe wnaethom lwytho 30 µg o ffracsiynau ôl-niwclear o segmentau L4-L5 o bob anifail ar geliau polyacrylamid 12% SDS i berfformio gwahaniad trydan-trofforetig o'r proteinau ac yna'i drosglwyddo i bilen PVDF mewn system BioRadcuvette mewn 25 mM Tris, pH 8.4, 192 mM glycin, 20% (v/v) methanol.

Fe wnaethon ni rwystro'r llenni thema gyda 5% BSA mewn PBS a 0.1% Tween-20 am 1 awr ar dymheredd ystafell ac yna deor ar 4 ◦C dros nos gyda gwrthgorff cynradd: llygoden gwrth- -actin ( 1:10000; SigmaAldrich), llygoden gwrth-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), llygoden gwrth-CV (1:1000, Invitrogen), cwningen gwrth-HSP60 (1:500, Gwrthgyrff-ar-lein), llygoden gwrth- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), llygoden gwrth-OPA1 (1:1000, BD Biowyddorau), cwningen gwrth-Parkin (1:500, Abcam, Caergrawnt, DU), llygoden gwrth-PINK1 (1:500, Abcam), cwningen gwrth-NRF2 (1:500, Abcam), gwrth-MNF2(1:500, Abcam), cwningen gwrth-GRP75 (1:500, Abcam).

Ar ôl sawl golchiad, cafodd pilenni eu deori am 2 awr gyda gwrthgorff eilaidd priodol wedi'i gyfuno â marchruddygl Perocsidas (1:5{{200, Vector). Delweddwyd y bilen gan ddefnyddio cymysgedd cemiluminescent o 1:1 (0.5 M luminol, 79.2 mM asid p-coumeric, 1 M Tris-HCl, pH 8.5) a (8.8 M hydrogenperocsid, 1 M Tris-HCl; pH 8.5), a'r tynnwyd delweddau gyda chyfarpar Gene Genom a'u dadansoddi gyda meddalwedd Gene Snap a Gene Tools (Syngene).

2.6. Model In Vitro

Cafodd celloedd NSC34 eu meithrin mewn glwcos uchel canolig Eagle's (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) wedi'i ategu â 10% o serwm buchol ffetws (Sigma-Aldrich), 100 uned/mLpenicillin, a 0.5 X hydoddiant penisilin/streptomycin (Sigma-Aldrich) a'i gynnal mewn deorydd lleithiwyd ar 37 ◦C o dan 5% CO2, yn y bôn fel y disgrifiwyd yn flaenorol [26].

Ar ôl 4 diwrnod o feithriniad celloedd heb newid y cyfrwng, roedd gan gelloedd NSC34 ffenoteip tebyg i wahaniaethol a nodweddir gan bresenoldeb niwritiaid hir. Ar ddiwrnod 4, ychwanegwyd cyffuriau at y celloedd. Paratowyd atebion Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, UDA) ac EFV (Bristol-Myers Squibb, Efrog Newydd, UDA) mewn crynodiad o 10X a'u diddymu yn DMEM.

Ar ôl 24 h, fe aseswyd hyfywedd celloedd trwy ddeor y celloedd â hydoddiant MTT 4 mg/mL am 3 h. Diddymwyd y crisialau formazan ffurf glas yn DMSO, a mesurwyd amsugnedd ar 570 nm gyda darllenydd microplate (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, UDA).

2.7. Nucleofection

Fe wnaethom drawsnewid miliwn o gelloedd gyda 2 µg plasmid ar gyfer mynegiant GFP, GRP78, HAPARK, sh-eGFP llygoden, llygoden sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), llygoden sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio), a /neu llygoden sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) gan ddefnyddio'r Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, y Swistir) a'r pecyn Niwcleofactor V (Lonza) yn dilyn argymhellion y gwneuthurwr.

Ar gyfer dadansoddiad cytometrig statig, fe wnaethon ni hadu'r celloedd mewn {{0}} wedi'u gorchuddio'n dda â phlat gyda cholagen 10%. Ar ôl meithrin, fe wnaethom osod y celloedd â 4% PFA, eu rinsio ddwywaith gyda PBS, a storio neu ychwanegu byffer blocio yn cynnwys PBS 0.3% (v/v) Triton X-100 a 10% o serwm buchol ffetws. Ar ôl 3 diwrnod o ddiwylliant celloedd, ychwanegwyd cyffuriau hydoddi inDMEM.

Ar gyfer yr arbrofion hyn, defnyddiwyd 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich), neu 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). , 1% NP-40, 0.5% sodiwm deoxycholate, 0.1% SDS, coctels proteasand phosphatase) ar gyfer immunoblotting. Perfformiwyd imiwnohistocemeg trwy rinsio'r samplau ddwywaith gyda PBS a'u deor gyda byffer blocio yn cynnwys PBSplus 0.3% (v/v) Triton X-100 a serwm buchol ffetws 10%.

Fe wnaethom ddeor gyda'r gwrthgyrff sylfaenol canlynol: cwningen gwrth-IP3R (1:200, Abcam), llygoden gwrth-HA (1:2000, Abcam), llygoden gwrth-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich), a cwningen gwrth-HSP60 (1:500, Gwrthgyrff-ar-lein). Er mwyn asesu hyfywedd MTT fel y disgrifir uchod, gadawsom y driniaeth am 24 h.

2.8. Mesur Cynhyrchiad Superocsid Mitocondriaidd a ∆ψM

Deorwyd celloedd â 2.5 µM MitoSOX ar gyfer dadansoddiad superoxide neu gyda 2.5 µMTMRM ar gyfer dadansoddiad ∆ψM, y ddau o Probes Moleciwlaidd, ac Invitrogen yn ystod y 30 munud olaf o driniaeth. Canfuwyd fflworoleuedd gyda microsgop Olympus IX81 a'i fesur gan ddefnyddio meddalwedd cytometreg statig.

2.9. Mesur Defnydd Ocsigen yn Electrocemegol

Cafodd celloedd (1 × 106 fesul 1 ml mewn HBSS) eu cynhyrfu mewn siambr nwy-dynn ar 37 ◦C. Cymerwyd mesurau gydag electrod math O2 Clark (Rank Brothers, Caergrawnt, DU) a'u cofnodi gyda data Dup.18 dyfais caffael (WPI) yn syth ar ôl 5-triniaeth gyda cherbyd neu Tun.

2.10. Ffracsiwn Mitocondriaidd a Sytosolig

Cafodd celloedd eu homogeneiddio mewn byffer lysis (10 mM HEPES, pH 7.4, EGTA 1 mM, swcros 250mM, a choctel o broteasau (Sigma-Aldrich) ac atalyddion ffosffatas (Roche)) gyda homogenizer Potter ar rew.

Ar ôl centrifugio lysates ar 2000 × g am 5 munud, cafodd yr uwchnatur ei allgyrchu ar 10,000 × g am 12 munud. Ystyriwyd y ffracsiwn toddadwy (S2) ac mae'n cynnwys proteinau cytosolig a microsomau.

Thepellet (P2) oedd y ffracsiwn mitocondriaidd cyfoethog, a gafodd ei ail-ddarparu mewn byffer RIPA wedi'i addasu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8 }}, 0.5% sodiumdeoxycholate, 0.1% SDS, proteas a choctels ffosffatase) a phenderfynwyd crynodiad protein gan assay BCA. Yna cafodd samplau eu prosesu ar gyfer blot gorllewinol.

2.11. Microsgopeg Electron Trosglwyddo

Fe wnaethon ni foddi segmentau llinyn asgwrn y cefn L{{{0}}L5 (1- sleisys mm) mewn hydoddiant sefydlog o 2% (w/v) PFA a 2.5% (v/v) glutaraldehyde (gradd EM) mewn 0.1 M PBS, pH 7.4 a'u gosod ar lwyfan siglo am 2 h, yna eu gosod mewn 1% (w/v) PFA ac yna eu gosod yn ôl gydag 1% (w/v) osmium tetroxide (TAAB Lab ) yn cynnwys 0.08% (w/v) potasiwm hecsacyanoferrate (Sigma-Aldrich) mewn PBS am 2 awr.

Fe wnaethon ni berfformio pedwar golch gyda dŵr dadionized a dadhydradu dilyniannol mewn aseton. Perfformiwyd yr holl weithdrefnau ar 4 ◦C, a ddisgrifiwyd yn flaenorol [33]. Fe wnaethom fewnosod samplau mewn resin EPON a'u polymeroli ar60 ◦C am 48 h.

Proseswyd samplau i gael darnau lled-denau (1 µm) gyda microtome UCT Leicaultracut, wedi'i staenio â hydoddiant glas toluidine dyfrllyd 1% (w/v), a'i archwilio â microsgop ysgafn i nodi'r ardaloedd corn fentrol wedi'u cyfoethogi â MNs.

Torrwyd adrannau ultrathin (70 nm) â chyllell diemwnt, eu gosod ar gridiau wedi'u gorchuddio, a'u cyferbynnu ag asetad wranyl confensiynol a datrysiadau sitrad plwm Reynolds.

Yn olaf, gwelsom yr adrannau gyda microsgop electron trawsyrru (Jeol 1400) gyda Camera GatanUltrascan ES1000CCD. Fe wnaethom ddewis tair tafell fesul cyflwr, dadansoddi tair MN fesul adran, a mesur arwynebedd y niwclysau o gymharu â chyfanswm arwynebedd y MN gan ddefnyddio offer ImageJ.

2.12. Biowybodeg ac Ystadegau

Defnyddiasom ddadansoddiadau o amrywiant (ANOVA) i gymharu'r gwerthoedd ymhlith gwahanol grwpiau arbrofol ar gyfer data a oedd yn bodloni'r rhagdybiaeth normalrwydd. Dadansoddwyd y gwahaniaethau rhwng grwpiau gan ddefnyddio ANOVA unffordd, ac yna prawf aml-ystod post hoc Tukey, neu gan ddefnyddio prawf-t Student. Gwnaed yr holl ddadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0.05 am arwyddocâd).

3. Canlyniadau

3.1. Testun

3.1.1. Datgelodd Dadansoddiad Proteomig o Orfynegiant GRP78 Mitocondria fel y Prif Darged

Er mwyn nodi'r mecanweithiau moleciwlaidd sy'n arwain at niwro-amddiffyniad wedi'i gyfryngu gan orfynegiant GRP78, fe wnaethom gynnal dadansoddiad proteomig cymharol heb label i nodi gwahaniaethau meintiol ac ansoddol rhwng anifeiliaid a anafwyd gan RA sydd wedi'u heintio ag adenofirysau ar gyfer gorfynegiant GRP78 (Ad-GRP78), y canfuwyd yn flaenorol eu bod yn niwro-amddiffynnol. o MNs, neu beta-galactosidase (Ad-ß-Gal) fel rheolaeth [20].

Saith diwrnod ar ôl anaf (dpi) oedd y pwynt amser a ddewiswyd ar gyfer y dadansoddiad yn ôl astudiaethau blaenorol a gynhaliwyd yn ein labordy [20,25]. Mewn cymhariaeth flaenorol rhwng model o adfywio ar ôl axotomi distal a pwythau nerf sciatig yn erbyn ein model RA dirywiol, gwelsom fod digwyddiadau signalau yn debyg tan 7 dpi, pan ddaeth digwyddiadau dargyfeiriol-ddirywiol i'r amlwg ar ôl RA [20,25].

Arweiniodd y dadansoddiad di-label LC-MS/MS o'r ffracsiynau ôl-niwclear o segmentau llinyn asgwrn y cefn L4-L5 at adnabod 1420 o broteinau, gydag o leiaf dau peptid fesul protein fel yr adroddwyd yn flaenorol ar gyfer samplau ac astudiaethau eraill [25] .

Newidiwyd cyfanswm o 566 a 732 o broteinau neu beptidau yn sylweddol oherwydd gorfynegiant Ad-GRP78 neu Ad-ß-Gal, yn y drefn honno, mewn anifeiliaid a anafwyd gan RA mewn perthynas ag anifeiliaid a anafwyd gan RA nad ydynt wedi'u heintio â firws (p < 0 .05) (Tablau S1 ac S2).

Gwnaethom gymharu'r ddwy restr a chanfod bod 220 wedi'u newid yn unigryw oherwydd Ad-GRP78overexpression (Tabl S3). Roedd anodi swyddogaethol o'r proteinau hyn gan ddefnyddio'r offeryn Cronfa Ddata ar gyfer Anodi, Delweddu a Darganfod Integredig (DAVID) yn ein galluogi i adnabod y swyddogaethau biolegol mwyaf arwyddocaol yn y set ddata (FDR < 0.05) [34,35].

Arweiniodd gorfynegiant GRP78 at wahaniaethau yn lefelau'r proteinau sy'n gysylltiedig â phrosesau, swyddogaeth, a chydrannau mitocondriaidd (Tabl S4A-C, Ffigur S1A-C). Datgelodd termau Ontoleg Genynnau (GO) a dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG o'r data hyn, mewn anifeiliaid sydd wedi'u heintio ag Ad-GRP78, fod gostyngiadau sylweddol yn lefelau llawer o broteinau â swyddogaethau mitocondriaidd, gan gynnwys proteinau o'r wyneb mitocondriaidd allanol a mewnol, proteinau'r cymhleth anadlol, a phroteinau matrics.

Gwnaethom gadarnhau gwahaniaethau mewn lefelau protein a ddatgelwyd yn y rhestr proteomig, megis GRP75, a gafodd ei uwchreoleiddio (p < 0.05), a'r is-uned ofcomplex V (CV ), wedi'i is-reoleiddio (p=0.03) yn y grwpiau GRP78 yn ôl y disgwyl (Ffigur 1A).

Ar draws y rhestr gyfan, y rhai a gafodd eu isreoleiddio fwyaf oedd y 2-protein oxoglutarate/malatecarrier OGC (SCL25A11), MT-ND3 (atalydd tiwmor sy'n cymryd rhan mewn gwennol aspartate thematig ac yn adfywio'r pwll NADH yn y cymhlyg matrics mitocondriaidd i ganiatáu). Swyddogaeth I), is-uned NADH dehydrogenase 3 cymhlyg I, yr asid gammaaminobutyrig aminotransferase ABAT, a'r ubiquinol-cytochrome C reductasesuunit o gymhleth III. Mewn cyferbyniad, ychydig iawn o broteinau a gafodd eu huwchreoleiddio (Ffigur 1B).

Roedd protein unupregulated yn GRP78 yn ôl y disgwyl, a'r proteinau dadreoleiddiedig eraill oedd cludwr asid theamino EAAT2, sydd wedi'i leoli'n bennaf yn y bilen plasma ac weithiau mewn mitocondria mewn synapsau cynhyrfus, a'r hydroxyacyl-CoA dehydrogenase HADHA, sy'n cataleiddio'r tri cham olaf o beta mitocondriaidd. -ocsidiad asidau brasterog cadwyn hir.

Fe wnaethom ymestyn y dadansoddiad i ymchwilio i weld a gafodd proteinau eraill mewn proteinau sy'n gysylltiedig â swyddogaeth mitocondria ormitochondria eu haddasu allan o'r rhestr proteomig er mwyn cadarnhau effaith mitocondria swyddogaethol (Ffigur 1C).

Gwelsom fod yr atroffi optig GTPase GTPase sy'n gysylltiedig â dynamin mitocondriaidd 1 (OPA1), sy'n ymwneud ag ymasiad [36], wedi'i isreoleiddio (p < 0.1); Cyflwynodd LONP1, proteas sy'n dibynnu ar ATP sy'n cyfryngu diraddio dethol polypeptidau wedi'u cam-blygu, duedd i gynyddu, ond ni welwyd unrhyw wahaniaethau yn lefelau ubiquinone NDUFA9, y ffactor trawsgrifio NRF2, sy'n rheoleiddio genynnau sy'n cynnwys elfennau ymateb gwrthocsidiol, neu ddeinamin arall. -gysylltiedig GTPase sy'n ymwneud â thrwyth, fel mitofusin 2 (MFN2) [36].

Dangosir crynodeb cynhwysfawr o'r newidiadau a geir o fewn mitocondria yn y cynllun yn Ffigur 1D.Mae dynameg mitochondrial yn bwysig ar gyfer ymatebion straen gan fod ffiws mitocondriaidd wedi'i ddifrodi ar gyfer cyfnewid deunydd, ac mae ymholltiad mitocondriaidd yn caniatáu gwahanu mitocondria a ddifrodwyd a mitochondria dilynol [37].

O ystyried bod y nifer fawr o broteinau is-reoledig yn lleoleiddio yn y mitocondria ac ni welwyd unrhyw newidiadau amlwg o ran gweithgaredd ymasiad mitocondria trwy ddadansoddi MFN2 a chymhareb ffurfiau L/S OPA1 (Ffigur 1C), fe wnaethom ymchwilio i farcwyr yn ymwneud â mitocondria.

Yn glasurol, mae diraddiad mitocondria sy'n ddibynnol ar awtoffagy yn digwydd ar ôl dadbolaru, ac fel arfer mae'n cael ei sbarduno gan groniad cynyddol y ffosffatas a'r tensinhomolog (PTEN) hyd llawn tybiedig kinase 1 (PINK1) ar y bilen mitocondriaidd allanol.

Yn dilyn hynny, mae'r ligas ubiquitin-protein E3 ubiquitin-protein rhwng y cylch yn cael ei recriwtio i nodi protein pilen allanol mitocondriaidd o hollbresenoldeb mitocondriaby depolar [38-41]. Nid yw brig Ffigur 2A yn dangos unrhyw newidiadau yn lefelau Parkin ond gostyngiad sylweddol mewn PINK1 hyd llawn a gynhyrchwyd gan anaf RA yn y segment llinyn asgwrn cefn ipsilateral L4-L5 mewn perthynas â rheolaeth ar 7 dpi. Mewn cyferbyniad, gostyngodd gorfynegiant GRP78 Parkin ond dyblodd lefelau PINK1 ar ôl RA o'i gymharu â mynegiant rheolaeth protein nad yw'n gysylltiedig -Gal (Ffigur 2A, gwaelod).

Mae uwch-reoleiddio PINK1 hyd llawn yn gyson ag anwythiad mitophagi [42], a gallai gostyngiad Parkin fod yn gysylltiedig â chyflwr datblygedig datgymalu organynnau fel y gwelir gan weddill y proteinau mitochondria.

Rydym yn ymchwilio ymhellach i gyd-leoliad mitocondria a phroteinau sy'n gysylltiedig â themicrotubule 1A/1B cadwyn golau 3 (LC3)-positive puncta, elfen allweddol o'r peiriannau macroautophagy craidd ac yn angenrheidiol ar gyfer y broses mitophagy [43].

Gan ddefnyddio microsgopeg confocal, gwelsom gynnydd sylweddol yn y cydleoli ofmitochondria, wedi'i labelu gan ddefnyddio gwrth-COX IV, gyda LC3-puncta positif ar ôl RA yn unig mewn MNs wedi'u difrodi yn gorfynegi GRP78 ar 7 dpi (Ffigur 2B).

Fe wnaethom gadarnhau bodolaeth mitoffagi mewn MNs afwls dim ond wrth orfynegi GRP78 trwy ddadansoddi samplau gan ddefnyddio microsgopeg electronig trawsyrru.

Gwelsom lawer o wagolau gydag engulfedmitochondria, nodwedd o mitophagi [37], sy'n debyg i mitophagosomau, a nifer o ERcisternae mewn cysylltiad agos â mitocondria o fewn MNs o anifeiliaid Ad-GRP78, ond nid ydym wedi eu canfod yn Ad- -Gal RA-anaf samplau llygod mawr ar 5 dpi (Ffigur 2C).

Ffigur 1. Mae gorfynegiant GRP78 mewn anifeiliaid sydd wedi'u hanafu gan RA yn targedu proteinau mitocondriaidd. (A) Graffiau imiwnoblot a bar yn dangos newidiadau plyg cyfartalog (± SEM) o lefelau protein GRP78, GRP75, a CV mewn segmentau llinyn asgwrn cefn L4-L5 ynGRP78 vs.

-Gal yn gorfynegi llygod mawr sydd wedi'u hanafu gan RA o 7 dpi. Cafodd lefelau eu normaleiddio i werthoedd actin (n=4; * p < 0.05 vs.Ad- -Gal, prawf-t Myfyriwr). (B) Histogram o newidiadau plygiad protein mitocondriaidd a gafwyd trwy ddadansoddiad proteomig o segmentau llinyn asgwrn cefn L{4-L5 o anifeiliaid sydd wedi'u hanafu gan RA sy'n gorfynegi GRP78 o gymharu â'r grŵp Ad{-Gal o 7 dpi. (C)Imiwnoblot a graffiau bar yn dangos newidiadau plyg cyfartalog (± SEM) o NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 wedi'u normaleiddio i actin. (Dim gwahaniaethau arwyddocaol rhwng grwpiau. Prawf t myfyriwr). (D) Mitocondria sgematig gyda phroteinau wedi'u newid trwy orfynegiant GRP78 mewn segmentau llinyn asgwrn y cefn L{4-L5 o anifeiliaid sydd wedi'u hanafu gan RA wedi'u hamlygu mewn melyn (gostyngiad) neu inblue (cynnydd) ar 7dpi.

Ffigur 2. Mae mitoffagi yn cael ei fodiwleiddio in vivo ar ôl RA mewn llygod mawr sy'n gorfynegi GRP78. (A) Immunoblots a graffiau bar cyfatebol ar gyfer dadansoddiad newid plyg PINK1 a PARK o lefelau protein (modd ± SEM) wedi'u normaleiddio i lefelau actin, yn y segmentau llinyn asgwrn cefn L4-L5 o RA-anafiadau vs.

control (top) neu o grwpiau Ad{{{0}}Gal ac Ad-GRP78 (gwaelod) gan 7 dpi. (n=4; * p < 0.05, prawf-t y myfyriwr). (B) I'r chwith, microffotograffau o MNs cynrychioliadol ar y safle ipsilateral gan anifeiliaid a anafwyd RA a gafodd chwistrelliad intrathegol o grwpiau AAVrh10-GFP neu AAVrh10-GRP78 ar 7 dpi. Cafodd samplau eu staenio ar gyfer COX IV (coch) ac LC3 (gwyrdd) a'u gwrth-staenio â fflworoleuolNissl (glas).

Bar graddfa=10 µm a chwyddo digidol mewn mewnosodiadau 10X.

Sylwch mai dim ond yn y grŵp AAVrh10-GRP78 y gwelir cyd-leoli. Ar y dde, graff bar yn dangos y dadansoddiad o % y dotiau cydleoli o COX IV ac LC3. Cyfartaledd ± SEM o gydleoli COX IV a LC3 (n=4; ** p < 0.01, prawf-t y myfyriwr). (C) Delweddau microsgopeg trawsyrru electron cynrychioliadol lle mae mitocondria yn cael eu gwahaniaethu o fewn MNs o linyn y cefn: a, delwedd o cytoplasm MN yn dangos anifail sy'n rheoli mitocondria; b, delwedd o cytoplasm MN o lygoden fawr a anafwyd gan RA o'r grŵp Ad- -gal; c, delwedd o cytoplasm MN o lygoden fawr a anafwyd gan RA o'r grŵp Ad-GRP78 gyda rhai mitocondriaid wedi'u hamlyncu wedi'u dynodi â seren goch; d, dangosir delwedd chwyddo uwch yn (C) gan dynnu sylw at gyswllt largemitochondria ac ER. Nodir bariau graddfa yn y ffigurau.

At ei gilydd, roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai gorfynegiant GRP78 gymell MNs wedi'u datgysylltu â mitophagyin ar ôl RA, a gallai fod yn hyrwyddo niwro-amddiffyniad.

3.1.2. GRP78 Gorfynegiant yn Adfer Swyddogaeth Mitocondriaidd wedi'i Ddifrodi

Yna fe wnaethom ymchwilio ymhellach i effaith gorfynegiant GRP78 ar mitocondriau gan ddefnyddio model in vitro o straen ER gan fod y sarhad hwn yn ymddangos yn gynnar ar ôl anaf RA mewn vivoas a adroddwyd yn flaenorol [20,26], ac mae'n ddull dibynadwy i sgrinio asiantau niwro-amddiffynnol newydd [2,44] ].

Mae'r model hwn yn defnyddio tunicamycin (Tun), sy'n anwythydd straen ER sy'n achosi ffurfio canolraddau N-acetylglucosamine-lipid, a thrwy hynny atal glycosyliad proteinau sydd newydd eu syntheseiddio ac arwain at gamblygu proteinau. Fe wnaethom ni ddefnyddio hynny oherwydd bod llwybr cyfrinachol wedi'i atal hefyd wedi'i adrodd i fod yn allweddol yn y broses niwroddirywiol ar ôl RA [26].

Fe wnaethom wirio yn gyntaf fod cnewyllyn y celloedd tebyg i NSC34motoneuron gyda fector priodol wedi arwain at gynhyrchu GRP78 (Ffigur 3A). Yn y celloedd hyn, roedd mynegiant GRP78 yn gwella goroesiad cyfrwng sy'n cynnwys Tun yn sylweddol (Ffigur 3B).

Er bod triniaeth Tun fel arfer yn achosi GRP78 ei hun, mae'r gorfynegiant mewndarddol hwn yn eithaf hwyr (erbyn 24 h) (Ffigur S2). Roeddem hefyd yn meddwl tybed a allem benderfynu a oes gan orfynegiant GRP78 effeithiau niwro-amddiffynnol mewn model arallin vitro yr adroddasom yn flaenorol ei fod yn atgynhyrchu sawl nodwedd o farwolaeth MN ar ôl anaf RA [26].

Mae'r model hwn yn seiliedig ar ddifrod sytosgerbydol a achosir gan nocodazole, sy'n ymyrryd â pholymereiddio microtiwbwlau. Cynyddodd mynegiant GRP78 hyfywedd celloedd a feithrinwyd ym mhresenoldeb nocodazole hefyd (Ffigur 3B).

Yna, fe wnaethom asesu swyddogaeth mitocondriaidd trwy fesur y genhedlaeth o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) mewn mitocondria gan ddefnyddio MitoSOX, y potensial pilen mitocondriaidd (∆ψm) gan ddefnyddio tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), a'r gyfradd defnydd O2, yn ein celloedd NSC34 sy'n destun straen ER. gyda neu heb orfynegiant GRP78.

Fel rheolaeth gadarnhaol, fe wnaethom ddefnyddio efavirenz (EFV), asiant mitowenwynig sy'n newid y tri pharamedr [45]. Gwelsom fod lefelau MitoSOX yn cynyddu'n raddol ar ôl ychwanegu Tun, gan gyrraedd arwyddocâd ystadegol 24 h a bod cynhyrchu ROS wedi cynyddu'n sylweddol mewn celloedd a driniwyd gan EFV o'r ôl-driniaeth awr gyntaf mewn perthynas â rheolaethau a driniwyd gan gerbydau (Ffigur S3A).

Arweiniodd gorfynegiant o GRP78 at lefelau sylweddol is o mitocondria ROSin mewn perthynas â chelloedd sy'n mynegi GFP ar 24 awr ar ôl triniaeth Tun neu EFV (Ffigur 3C). Cwympwyd y ∆ψm ar ôl 5 a 24 h o driniaeth Tun ac ar ôl 24 h o driniaeth EFV (Ffigur S3B). Sicrhawyd adferiad o'r paramedr hwn trwy or-expressionin GRP78 Tun- neu gelloedd wedi'u trin ag EFV (Ffigur 3D).

Roedd cyfradd y defnydd O2 yn lleihau 80 munud o ddadansoddiad ar ôl ychwanegiad Tun yn y celloedd sy'n mynegi GFP (llethr −0.063,R2=0.98), ond roedd defnydd O2 yn sefydlog mewn GRP78-gelloedd gorfynegi er gwaethaf presenoldeb Tun (llethr −0.221, R2=0.99) (Ffigur 3E, chwith).

Ar ôl 5 h, roedd resbiradaeth yn normal mewn celloedd gorfynegi GRP ac wedi'i beryglu'n ddifrifol yn y celloedd sy'n mynegi GFP (Ffigur 3E, ar y dde). At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod GRP78 yn gwanhau swyddogaeth mitocondriad a achosir gan straen ER neu mitowenwyndra.

For more information:1950477648nn@gmail.com