Sbectrometreg Màs Tandem Cydraniad Uchel Yn Adnabod Patrwm Ganglioside Penodol mewn Clefyd Arennau Diabetig Cynnar Cleifion Diabetes Mellitus Math 2

Crynodeb:

Ystyried y wybodaeth werthfawr a ddarperir gan glycosphingolipids felmarcwyr moleciwlaidda'r data cyfyngedig sydd ar gael ar gyfer eu canfod a'u nodweddu mewn cleifion sy'n dioddef oMath 2 clefyd yr arennau diabetig(DKD), fe wnaethom ddatblygu a gweithredu dull uwch yn seiliedig ar sbectrometreg màs (MS) cydraniad uchel (AD) ac MS tandem (MS/MS) ar gyfer pennu gangliosidau yn yr wrin oCleifion DKD. Roedd yr astudiaeth hon yn canolbwyntio ar: (i) brofi dichonoldeb HR MS ac MS/MS a pherfformiadau o ran mapio adilyniannu gangliosidau arennol yn DM Math 2cleifion; (ii) penderfynu ar y newidiadau yn ygangliosid wrin o DKDcleifion i mewngwahanol gamau o'r clefyd-normo-, micro-, a macroalbuminuria-mewn assay cymharol gyda rheolaethau iach. Oherwydd y cydraniad uchel a chywirdeb màs, datgelodd y sgrinio cymharol MS fod statws sialylation y cydrannau ganglioside; eu haddasiad gan O-acetyl, CH3COO−, O-fucosyl, ac O-GalNAc; yn ogystal â chyfansoddiad y ceramid mae marcwyr posibl ar gyfer canfod DKD yn gynnar, asesu dilyniant y clefyd, a thriniaeth ddilynol. At hynny, dangosodd ymchwiliad strwythurol gan MS/MS fod GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) a GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) isomerau yn gysylltiedig â macroalbuminuria, yn haeddu ymchwiliad pellach mewn perthynas â'u rôl yn DKD.

Geiriau allweddol: nanoelectrospray; sbectrometreg màs tandem cydraniad uchel; sgrinio; dadansoddiad darnio; clefyd yr arennau diabetig; biofarcwyr ganglioside

1. Rhagymadrodd

Mae diabetes mellitus math 2 (DM) yn parhau i fod yn her therapiwtig gyda chyffredinolrwydd byd-eang cynyddol yn gyson, er gwaethaf datblygiadau gwyddonol yn y maes. Yn gysylltiedig â difrod dinistriol macro-fasgwlaidd a microfasgwlaidd hirdymor, mae DM Math 2 yn arwain at fwy o farwolaethau. Clefyd yr arennau diabetig (DKD) yw achos mwyaf cyffredin clefyd arennol diwedd cyfnod (ESRD) mewn gwledydd datblygedig a gwledydd sy'n datblygu [1,2]. Felly, mae canfod DKD yn gynnar a rheolaeth optimaidd o DM Math 2 yn hanfodol er mwyn lleihau cymhlethdodau, morbidrwydd a marwolaethau. Ar hyn o bryd, mae diagnosis a dilyniant DKD yn dibynnu ar fesur albwminwria a gostyngiad cyson yn y gyfradd hidlo glomerwlaidd (eGFR), y ddau baramedr yn dangos rhagfynegiad cymedrol o statws arennol yn y dyfodol. Mae hanes naturiol DKD yn cynnwys sawl cam clinigol, gan gynnwys y canlynol: gor-hidlo glomerwlaidd cynnar, microalbuminuria neu macroalbuminuria yn digwydd, dirywiad yng nghyfradd hidlo glomerwlaidd, ac ESRD. Fodd bynnag, mae ymchwil diweddar yn ystyried albwminwria yn arwydd o gyflwr sy'n gwaethygu [3].

Yn ystod y degawd diwethaf, dangoswyd diddordeb arbennig yn y cysyniad subtelocentrig, yn ôl y gallai'r tiwbyn procsimol a'r adran tubulointerstitial chwarae rhan hanfodol wrth gychwyn a dilyniant DKD [4-6]. Yn y cyd-destun hwn, mae datblygiad biomarcwyr glycomig prognostig a rhagfynegol yn cael sylw cynyddol ac mae wedi dod yn ffocws i lawer o grwpiau ymchwil dros y blynyddoedd [7-11].

Mae Gangliosides yn cynrychioli dosbarth penodol o glycosphingolipids gyda strwythur cymhleth a nodir ym mhob meinwe a hylifau'r corff ac yn arbennig o helaeth yn y system nerfol ganolog (CNS) [12]. Fel cyfansoddion hanfodol y pilenni dwy haen celloedd niwronaidd, mae gangliosides yn chwarae rhan hanfodol yn natblygiad yr ymennydd, aeddfedu a heneiddio, cyfryngu adlyniad celloedd, actifadu, amlhau, symudedd, a thwf. Mae gangliosidau yn cynnwys ceramid o gyfansoddiad gwahanol mewn perthynas â'r sylfaen sphingoid, gweddillion asid brasterog wedi'u gwreiddio i haen allanol y bilen a chadwyn oligosacarid siaylated sy'n gorchuddio'r bilen ac yn cymryd rhan mewn rhyngweithiadau penodol a hanfodol â moleciwlau eraill yn yr amgylchedd cyfagos. Trwy drosiant arwyneb celloedd arferol, a elwir yn "shedding arwyneb cell", mae gangliosides yn cael eu rhyddhau, i raddau, i'r gofod rhynggellog.

Oherwydd ei bod yn hysbys bod mynegiant, dosbarthiad a strwythur gangliosidau yn fath-benodol o gelloedd a meinwe ac yn amrywio yn ystod datblygiad meinwe, aeddfedu, heneiddio, ac yn bennaf oll, mewn cyflyrau patholegol [12], ystyrir gangliosidau ymhlith y rhai mwyaf gwerthfawr. marcwyr diagnostig a darpar asiantau therapiwtig.

Mae sawl dull sy'n defnyddio darnau biopsi serwm neu arennau wedi'u cymhwyso ar gyfer adnabod gangliosid arennol mewn cleifion DM Math 2, megis imiwneiddio haen denau [7,8], cromatograffaeth haen denau perfformiad uchel (HPTLC) [9], sbectrophotometreg [10] ], a sbectrometreg màs (MS) [11].

Yn wyneb y wybodaeth werthfawr y gellir ei darparu gan gangliosidau fel marcwyr moleciwlaidd meinwe niwronaidd [12] a'r data cyfyngedig sydd ar gael hyd yn hyn wrth ganfod a nodweddu glycosphingolipids yn wrin cleifion DKD, rydym wedi datblygu a gweithredu dull uwch yn seiliedig ar ddulliau. ar nanoelectrospray (nanoESI) cydraniad uchel (HR) MS ar gyfer canfod gangliosidau yn wrin cleifion DM. Arweiniwyd yr opsiwn hwn ar gyfer HR MS gan y manteision a gynigir gan y dull hwn wrth ddadansoddi'r cymysgeddau cymhleth o gangliosidau a dynnwyd o wrin dynol. Pŵer datrys uwch offeryn: (i) yn caniatáu ar gyfer canfod ïonau â gwerthoedd m/z agos, na ellid eu gwahaniaethu fel arall mewn sampl aml-elfen heterogenaidd sy'n cynnwys rhywogaethau o wahanol hyd a phensaernïaeth y gadwyn glycan a chyfansoddiadau annhebyg y ceramid; (ii) yn y bôn yn dileu'r angen am wahanu cymysgedd trwy ddulliau cromatograffig hylifol neu electrofforetig cyn dadansoddi MS; (iii) yn darparu cywirdeb màs uchel, sy'n cynyddu dibynadwyedd adnabod strwythurol yn fawr; ac (iv) nid yn unig yn cynnig gwell cipolwg ar gymhlethdod gangliosidome sy'n gysylltiedig â DM ond hefyd data ar y rhywogaeth sydd â rôl biomarcwr posibl yn seiliedig ar yr hyder uchel mewn penderfyniad màs ar gyfer ïonau moleciwlaidd a darniog.

Mae'r astudiaeth beilot hon, gyda'r nod o nodweddu gangliosidau wrin gyda rolau biomarcwr yn ydiagnosis cynnar o DKD, yn canolbwyntio ar: (a) profi dichonoldeb a pherfformiad AD MS ac MS tandem (MS/MS) trwy ddaduniad egni uchel a achosir gan wrthdrawiadau (HCD) wrth fapio gangliosidau arennol mewn cleifion DM Math 2; (b) pennu'r newidiadau yn y mynegiant o gymysgeddau gangliosidau brodorol o samplau wrin cleifion DM Math 2 mewn assay cymharol gyda rheolaethau iach a nodweddu'r biofarcwyr a ddarganfuwyd. At y diben hwn, gwnaethom optimeiddio llwyfan bio-ddadansoddol modern yn seiliedig ar MS HR nanoESI ar offeryn Orbitrap wedi'i diwnio i'w weithredu yn y modd ïon negyddol wrth sgrinio MS a darnio MS/MS ar gyfer dadansoddiad strwythurol manwl.

2. Canlyniadau a Thrafodaethau

2.1. Sgrinio Cymharol o'r Samplau gan nanoESI HR MS

Cafodd y samplau gangliosid A1, A2, A3, ac C eu trwytho gan nanoESI un ar ôl y llall i MS Orbitrap a'u sgrinio mewn modd ïon negyddol o dan amodau offerynnol union yr un fath. Ym mhob achos, cafwyd y signal cyfanswm cerrynt ïon (TIC) am 2 funud, gan gynhyrchu sbectra o groniad o 100 sgan. Oherwydd sensitifrwydd uchel y dull, hyd yn oed o dan yr amodau amser-cyfyngedig cyflogedig, roedd y sbectra màs a gaffaelwyd yn cynnwys cymhareb signal-i-sŵn uchel a phatrwm ïon moleciwlaidd cyfoethog.

Datgelodd asesiad o'r data mapio a gynhyrchwyd o dan yr un amodau wahaniaethau sylweddol yn y nifer a'r math o gydrannau gangliosid a fynegwyd yn y samplau A1, A3, ac C, ond ni welwyd unrhyw wahaniaethau rhwng y samplau A1 ac A2. Crynhoir y canlyniadau hyn yn Nhabl 1, sy'n rhestru'n gymharol y strwythurau a nodir yn y cymysgeddau brodorol A1, A3, ac C, ynghyd â gwerthoedd m/zexp arbrofol y signalau a ganfuwyd a'r gwerthoedd m/ztheor damcaniaethol sy'n cyfateb i'r strwythurau arfaethedig.

Roedd cywirdeb cydraniad uchel a màs y llwyfan MS cyflogedig yn gwella'r gwahaniaethu a'r adnabyddiaeth yn seiliedig ar fesuriadau màs cywir o ddim llai na 37 o gydrannau wrinol gangliosid a ffycogangliosid yn y tri sampl. Mae'r rhywogaethau a ddarganfuwyd yn perthyn i 15 o wahanol ddosbarthiadau, gan gynnwys addasiadau'r brif gadwyn glycan (Tabl 2), a rhoddwyd y cywirdeb màs cyfartalog ardderchog o 4 ppm iddynt.

Datgelodd gwerthusiad manwl o'r strwythurau yn Nhabl 1, o'r holl samplau, fod y cymysgedd A3, sy'n cyfateb i macroalbuminuria (felly, i gam datblygedig DKD), yn cynnwys y nifer uchaf o gyfansoddion gangliosidau penodol, hy, 19, ac yna sampl C, gyda 12 rhywogaeth wahanol, a sampl A1, gyda 10.

O'i gymharu â'r samplau A1 a C, mae A3 hefyd: (i) yn cwmpasu'r nifer uchaf o rywogaethau gyda'r gadwyn O-glycan hiraf yn perthyn i'r dosbarth G1 a'r amrywiaeth amlycaf o gyfansoddiadau ceramid; (ii) yn cyflwyno'r nifer uchaf o ddosbarthiadau gangliosidau wedi'u mynegi-12 o ddosbarthiadau o gymharu â dim ond 6 yn y sampl A1 a 6 yn y sampl C, yn y drefn honno; (iii) sy'n cynnwys y nifer uchaf o gangliosidau, sy'n arddangos craidd saccharid wedi'i newid gan O-asetyl nad yw'n garbohydrad, yn ogystal ag addasiadau biolegol berthnasol i garbohydrad O-fucosyl ac O-GalNAc; (iv) yw'r unig echdyniad wrinol sy'n cynnwys adeileddau gangliosid a addaswyd gan atodiad O-GalNAc, sef GalNAc-GS1(t18:1/18:0), wedi'i ganfod fel moleciwl deprotonedig a sodiated quadru ply ar m/z 1176.8266 , a GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), fel moleciwl dadprotonedig ddwywaith ar m/z 1310.1271. Fel y gwelir yn Ffigur 1a–c, sy'n dangos cyfran y dosbarthiadau gangliosidau a fynegir yn y tri sampl, ac yn yr histogram cymharol a ddangosir yn Ffigur 2, mae dyfyniad A3 yn dangos statws sialyleiddiad penodol, sy'n cael ei ddominyddu gan polysialocompounds. Ac eithrio'r gangliotetraose monosialaidd GM1(d18:1/16:1) a ganfuwyd fel [M-2H+ ] 2− ar m/z 756.9078 a'r GM3 unsialaidd(d18:0/24: 0) wedi'i ganfod fel moleciwl dadprotonedig dwbl ar m/z 645.3956, mae pob un o'r 17 rhywogaeth arall yn cynnwys mwy nag un gweddillion Neu5Ac yn eu moiety glycan. Ar ben hynny, oherwydd bod dim llai na saith trisialo GT1, pedwar pentasialo GQ1, a hyd yn oed GS1 heptasialylated wedi'u darganfod, yn amlwg, wrth ymyl y nifer estynedig ac amrywiaeth y strwythurau, hyd y creiddiau glycan, a'u haddasiadau ymylol, y sialylation cyffredinol uchel mae cynnwys yn cynrychioli nodwedd arall sy'n benodol i macroalbwminwria.

Tabl 1. Nodwyd rhywogaethau Ganglioside mewn samplau A1, A3, a C gan (-) sgrinio Orbitrap MS nanoESI. d: sylfaen sphingoid dihydroxylated; t: sylfaen sphingoid trihydroxylated.

Mae arsylwad sy'n glinigol berthnasol hefyd yn dod i'r amlwg o'r asesiad cymharol A1 vs C. Tra yn y sampl rheoli, C, y radd sialylation uchaf o'r gangliosidau a ganfuwyd yw pedwar, a nodir trwy ddau gangliotetraose tetrasialyated GQ1 sy'n wahanol yng nghyfansoddiad eu aglycone lipidig, yn sampl A1, y radd sialylation uchaf yw pedwar. Wrth ymyl y gangliosidau di-, tri-, a thetrasialated, mae'r cymysgedd A1 yn cynnwys pentasialo gangliotetraose GP1(d18:1/18:0), a ganfyddir fel [M-4H+ ]4− ion yn m/z 676.5569, a gafodd y cywirdeb màs rhagorol o 2.95 ppm. Mae data o'r fath sy'n ymwneud â statws sialylation y samplau yr ymchwiliwyd iddynt yn dangos bod gradd sialylation gangliosidau arennol yn dilyn y nodwedd C Dilyniant DKDaeffeithiolrwydd triniaeth.

Tabl 2. Golwg ar ffurf tabl o'r dosbarthiadau gangliosidau wrin a nodwyd ynghyd â'u mynegiant gwahaniaethol mewn samplau A1, A3, ac C. Symbolau: x=canfuwyd y dosbarth; -=ni chanfuwyd y dosbarth.

Mae archwiliad manwl o gyfansoddiad aglycone yn datgelu, ac eithrio'r annhebygrwydd amlwg yng nghyfansoddiad y gadwyn glycan, bod y gangliosidau a fynegir yn y tri sampl hefyd yn dangos gwahaniaethau yn strwythur eu ceramidau. Mae'r newidiadau mwyaf amlwg i'r rhan lipid yn gysylltiedig â'r broses lai cyffredin o drihydroxylation sylfaen sphingoid, sy'n digwydd yn y cymysgeddau gangliosid A1 ac A3, a hyd anarferol y cadwyni asid brasterog, sy'n bresennol yn A3 yn unig. Canfuwyd bod pob un o'r samplau A1 ac A3 yn cynnwys dwy rywogaeth gyda gwaelodion sffingoid trihydroxylated y ceramid. Felly, darganfuwyd GT1(t18:0/18:0) a GT1(t18:0/20:0) yn y sampl A1, ond po fwyaf darganfuwyd strwythurau cymhleth trihydroxylated GT1(t18:1/24:3) a Fuc-GT3(t18:1/18:3) yn y sampl A3.

Yn rhyfeddol, mae sampl A3 hefyd yn dangos tystiolaeth o rywogaethau sy'n cynnwys asidau brasterog cadwyn hir iawn (VLCFA). Ystyrir bod VLCFA yn strwythur lipid sy'n digwydd yn anaml sy'n cwmpasu 23 i 27 atom carbon yn y gadwyn asid brasterog. Canfuwyd pedair rhywogaeth VLCFA anarferol o'r fath yn cario 24 atom carbon yn y gadwyn asid brasterog yn y sampl A3: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0), a Fuc-GT1(d18:0/24:0), ac un strwythur ohonynt hefyd yn cynnwys y trihydroxylation sylfaen sphingoid anghyffredin a thri bond dwbl yn y gadwyn asid brasterog, tra bod dau strwythur yn cyflwyno atodiadau i graidd glycan grŵp O-Ac a ffycosyl, yn y drefn honno.

Y nodweddion hyn o'r dognau ceramid yn y samplau A1 ac A3, na chanfuwyd yn y sampl rheoli; y tebygrwydd rhwng A1 ac A2; ac mae'r gwahaniaethau amlwg a ganfuwyd yn yr A3 yn awgrymu, wrth ymyl y cyfansoddiad carbohydrad a'r statws sialylation, bod strwythur y moiety lipid mewn gangliosidau arennol yn arwydd posibl arall o DKD cynnar. Ar ben hynny, mae'n ymddangos bod yr addasiadau yn y cyfansoddiad ceramid yn dibynnu ar gamau albwminwria; mae'n ymddangos bod ceramidau cymhleth, sy'n arddangos trihydroxylation y sylfaen sphingoid a VLCFA yn gysylltiedig â chamau albwminwria datblygedig. O ystyried y daethpwyd ar draws y nifer anghyffredin o dri bond dwbl yn y gadwyn asid brasterog yn y sampl A3 yn unig trwy ddwy rywogaeth wahanol, Fuc-GT3(t18:1/18:3) a GT1(t18:1/24:3), yn ôl pob tebyg, mae mecanwaith ffurfio bond dwbl hefyd yn gysylltiedig â dilyniant DKD.

Mae'r effeithiau negyddol a achosir gan grynhoi lipidau yn yr aren, ar y lefelau glomerwlaidd a thiwbaidd, yn benodol i gelloedd. Ar ben hynny, mae lipotoxicity yn gysylltiedig â gwahanol fathau o lipidau, ymhlith y mae gangliosidau yn arddangos rôl cam canolog [13].

Cynyddwyd cynnwys arennau gangliosidau, ymhlith dosbarthiadau lipid eraill, o fewn podocytes, yn ogystal â chelloedd tiwbyn procsimol, mewn model llygoden DN [14]. Gall tiwbiau agosol fod yn agored i lefelau uchel o lipidau wrinol, gan gynnwys gangliosidau, oherwydd mwy o gynnwys asid brasterog fesul moleciwl albwmin yn gynnar yn DKD [15]. Mae canlyniadau uniongyrchol cronni lipidau o fewn segmentau'r neffron yn gysylltiedig ag addasiadau strwythurol a swyddogaethol, sy'n arwain at nam ar brosesu albwmin yn gynnar yn ystod Math 2 DM.

Mae mwyafrif helaeth yr astudiaethau sy'n canolbwyntio ar nodweddu gangliosid arennol yn dibynnu ar fodelau arbrofol o neffropathi diabetig. Hyd eithaf ein gwybodaeth, dyma'r astudiaeth drosiadol ddynol gyntaf o ymchwil sylfaenol i gymhwysedd clinigol i adrodd ar batrwm gangliosid wrinol penodol mewn cleifion â Math 2 DM. Mae arwyddocâd ymarferol ein hastudiaeth i'w weld yn yr arddangosiad o gysylltiad rhwng gradd sialylation gangliosidau wrinol a strwythur eu ceramidau â DKD cynnar, wedi'i lwyfannu fesul lefel albwminwria.

Gwasanaeth Cefnogol Wecistanche - Yr allforiwr cistanche mwyaf yn Tsieina:

E-bost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950

Siop Am Fwy o Fanylion:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

CAEL DYFYNIAD O'R CISTANCHE ORGANIG NATURIOL GYDA 25% ECHINACOSIDE A 9% ACTEOSIDE AR ​​GYFER Haint YR ARennau