Nodi Bifavone A Dadansoddi Swyddogaethol fel Atalydd Newydd i Brosesau Atherogenig Posibl Vanilloid 4-ddibynnol Derbynnydd Dros Dro
Feb 22, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comi wybod mwy
Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei a Shaik O. Rahaman
Atherosglerosis, clefyd llidiol cynyddol rhydwelïau mawr, yw'r cyfrannwr mwyaf blaenllaw at faich cynyddol marwolaethau ac afiachusrwydd sy'n gysylltiedig â chlefyd cardiofasgwlaidd yn fyd-eang1. Mae digwyddiad cychwyn canolog sy'n arwain at atherosglerosis yn cynnwys cadw gronynnau lipoprotein dwysedd isel wedi'u haddasu (oxLDL) yn y gofodau aortig aortig is-endothelial yn bennaf mewn pwyntiau cangen rhydwelïol2. Yn ystod atherogenesis cynnar, yn dilyn camweithrediad endothelaidd, mae monocytau gwaed sy'n cylchredeg yn trawsfudo i'r ardaloedd intima, ac yn gwahaniaethu i facroffagau meinwe3. Mewn mannau mewnol aortig, mae rhwymo a derbyn oxLDL gan macroffagau gyda chymorth derbynyddion sborionwyr fel SRA a CD36 yn creu dolen athero-lidiol sy'n arwain at ddatblygiad celloedd ewyn llawn lipid, proses hanfodol mewn atherosglerosis2-8. Mae'r Rhaeadrau o'r digwyddiadau llidiol a ysgogwyd gan gelloedd ewyn yn arwain at ffurfio rhediad brasterog cynnar ac yn y pen draw ymddangosiad briwiau atherosglerosis datblygedig a nodweddir gan bresenoldeb cap ffibrog, meinwe galchedig, celloedd imiwnedd, proteinau matrics, a lipidau2-10. Derbynnydd Dros Dro Potensial Vanilloid 4 (TRPV4) o'r is-deulu TRPV, sianel catation polymodal annetholus sy'n athraidd i Ca2 plus, yn cael ei fynegi'n hollbresennol mewn gwahanol fathau o gelloedd gan gynnwys macrophages11-24. Fe'i gelwid yn flaenorol yn osmosensor, a gwyddys bellach bod TRPV4 yn ymateb i ysgogiadau biocemegol a biomecanyddol aml-ffaraidd gan gynnwys gwres, anystwythder matrics, osmolarity, ffactorau twf, pH, a 4 phorbol esters11–24. Adroddir bod TRPV4 yn cyfryngu nifer o swyddogaethau ffisiolegol fel teimlad poen mewn llid a niwropathi18,22,23, gwahaniaethu myofibroblast a mudo 17,25,26, a gwahaniaethu osteoclast yn yr asgwrn27. Mae mwtaniadau TRPV4 wedi'u cysylltu â sawl sianelopathiaeth28–31. Mae astudiaethau diweddar gan ein grŵp ac eraill wedi cynnwys rôl bosibl y sianel hon mewn llu o gyflyrau patholegol fel anafiadau i'r ysgyfaint22,32, ffurfio celloedd ewyn14,16, fbrosis meinwe 17,33, ymateb corff tramor13, a chanser34,35. Yn flaenorol, dangoswyd rôl atheroprotective TRPV4, lle dangoswyd bod swyddogaeth TRPV4 a achosir gan agonydd cemegol mewn celloedd endothelaidd yn gysylltiedig ag actifadu eNOS ac atal adlyniad monocyte i gelloedd endothelaidd36. Mewn cyferbyniad, mae diffygion mewn swyddogaethau TRPV4 wedi'u cysylltu â nifer o ymatebion atheroinfammatory gan gynnwys camweithrediad endothelaidd, llai o gynhyrchu celloedd ewyn macrophage, a chlefydau fasgwlaidd14,16,37-39. Yn ddiweddar, mae ein labordy wedi nodi rôl proatherogenig TRPV4 lle mae'n rheoleiddio ffurfiant celloedd ewyn macrophage a achosir gan oxLDL. Yn fecanyddol, fe wnaethom ddangos bod TRPV4 yn effeithio ar y nifer sy'n derbyn oxLDL mewn macroffagau ond nid yn rhwymo mewn modd annibynnol ar CD14. Mewn astudiaeth arall, fe wnaethom adrodd am waethygiad dibynnol TRPV o ffurfiant celloedd ewyn a achosir gan oxLDL ym mhresenoldeb lipopolysaccharid a chynyddol anystwythder matrics, gan felly ddarparu cysylltiad rhwng mecanosensing a risg o atherosglerosis16. O'u hystyried gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu TRPV4 fel targed deniadol mewn atherosglerosis a chlefydau eraill, gan ysgogi darganfod atalyddion moleciwl bach o TRPV4 y gellir eu trosi'n therapiwteg glinigol effeithiol. Mae'r defnydd o gyfansoddion naturiol mewn therapiwteg wedi dod yn amlwg, yn bennaf oherwydd yr angen am gyfansoddion cost-effeithiol a biogydnaws o'u cymharu â'r cyffuriau synthetig presennol. Cyfansoddion naturiol felflavonoidau, alcaloidau,polyffenolau, a curcuminoidau, yn effeithio ar glefydau cardiofasgwlaidd trwy fecanweithiau amrywiol megis ataliadproinflammatorysignalau, sensiteiddio inswlin, a gwella proffiliau lipid gwaed trwy dargedu llwybrau AMPK, COX1/2, eNOS, a Nrf240-45. Mae astudiaethau diweddar gan grwpiau lluosog wedi nodi dau flavonoid, berberine, ac apigenin, fel modulatyddion posibl gweithgaredd TRPV446,47. Rydym wedi datblygu a defnyddio dull sgrinio lled-trwybwn uchel i nodi antagonyddion posibl TRPV4 o lyfrgell o gyfansoddion naturiol gan ddefnyddio Darllenydd Plât Delweddu Fflworometrig (FLIPR) yn seiliedig ar Ca2 ynghyd â assay mewnlifiad. Yma, rydym yn adrodd ar adnabyddiaeth a dadansoddiad swyddogaethol o Linkedin, flavone, fel atalydd newydd o brosesau atherogenig dibynnol TRPV mewn macroffagau, gan osod sylfaen ar gyfer astudiaethau pellach o'r cyfansoddyn naturiol hwn fel bachyn gwrth-atherosglerotig naturiol. cyfansawdd moleciwl. Adroddwyd bod Linkedin yn arddangos niwro-amddiffynnol,gwrth-garsinogenig, agwrthlidiolrolau48,49. Rydym yn adrodd ar fecanwaith gweithredu Linkedin yn erbyn TRPV4 wrth osod ffurfiant celloedd ewyn macrophage gan ddefnyddio nifer o brofion biocemegol a cellog.
Defnyddiau a dulliau Meithrin anifeiliaid a chelloedd
Fe brynon ni lygod math gwyllt (WT) congenig C57BL/6 gan Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, UDA). Dilynwyd canllawiau Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Prifysgol Maryland ar gyfer pob arbrawf anifeiliaid a chydymffurfiodd yr awduron â chanllawiau ARRIVE. Ar gyfer ynysu macroffagau preswyl murine a achosir gan thioglycolate (MRM), casglwyd lavage peritoneol ar ôl 4 diwrnod o chwistrelliad thioglycolate intraperitoneol, a chynhaliwyd celloedd mewn serwm buchol ffetws 10 y cant (FBS) yn cynnwys DMEM7,14,16. Prynwyd llinell gell macrophage murine (RAW264.7), a ffibroblastau dermol dynol (HDF) gan ATCC (Manassas, VA), ac fe'u diwylliwyd, yn y drefn honno, gyda DMEM neu MEM (Gibco, Waltham, MA). Cynaeafwyd macroffagau sy'n deillio o fêr esgyrn murine (BMDMs) o 6- i 7-lygod wythnos oed, fel y disgrifiwyd yn flaenorol14,50,51. Yn gryno, casglwyd ffemyriaid o lygod WT a TRPV4 KO, a fflysio mêr esgyrn ffemyriaid â chyfryngau DMEM cyflawn gyda 10 y cant FBS. Cafodd y celloedd mêr esgyrn crog eu hidlo trwy hidlydd 70 µm (BD biowyddoniaeth), eu centrifugio, a'u cynnal mewn cyfrwng DMEM wedi'i ategu â M-CSF (25 ng / ml) am 7-8 diwrnod ar 37 gradd i ganiatáu gwahaniaethu i macroffagau.
Adweithyddion
Prynwyd Linkedin a GSK1016790A (GSK101) gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), a chafwyd pecyn assay Calsium 6 FLIPR gan Molecular Device (Sunnyvale, CA). Prynwyd LDL brodorol dynol (VLDL) gan Stemcell Technologies (Vancouver, Canada). Fe wnaethom ddeor LDL gyda 5 µM CuSO4 am 12 h ar 37 gradd i baratoi LDL copr-ocsidiedig (oxLDL)7,14,16. Prynwyd DiI-oxLDL, wedi'i labelu â llifyn fflwroleuol, gan Invitrogen (Carlsbad, CA), a MCSF gan R&D (Minneapolis, MN). Gwrthgyrff ar gyfer dadansoddiad FACS oedd: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4, a TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Roedd gwrthgyrff eilaidd wedi'u cyfuno ag AG yn dod o ymchwil a datblygu (Minneapolis, MN), ac roedd rheolaethau isoteip wedi'u cyfuno ag AG yn dod o BD (Franklin Lake, NJ). Ar gyfer adwaith cadwynol polymeras meintiol (qRT-PCR), defnyddiwyd y pecyn RNeasy o QIAGEN (Redwood City, CA). Prynwyd pob paent preimio gan Bio-Rad (Hercules, CA). Cafwyd cyfryngau diwylliant celloedd, cynhyrchion sy'n gysylltiedig â diwylliant celloedd, ac adweithyddion blot gorllewinol gan Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).
Cistanche ar gyfer gwrth-blinder
Sgrinio trwybwn lled uchel
Cynhaliwyd sgrinio trwybwn lled uchel ar gyfer antagonyddion Trpv4 o lyfrgell o 2000 o gyfansoddion naturiol (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) gan ddefnyddio assay mewnlifiad calsiwm sy'n seiliedig ar ddarllenydd plât delweddu fflworometrig (FLIPR)14,17. Fe wnaethom nodi ginkgetin (GGT), fel antagonist newydd i TRPV4. Perfformiwyd y sgrinio cynradd ac uwchradd gyda RAW264.7, HDF, a BMDMs i asesu gallu Linkedin ac ymgeiswyr eraill i atal TRPV4-ca2 ynghyd â mewnfux14,17. Fel rheolyddion, defnyddiwyd A23187, ionoffor calsiwm, TRPV4 null BMDMs, a GSK219, antagonydd TRPV4 dethol17. Ar ôl y sgrinio eilaidd, fe wnaethom nodi chwe chyfansoddyn yn dangos mwy na thriphlyg o ataliad o fewnlifiad TRPV a chyfryngol Ca2 o gymharu â rheoli cerbydau. Nodwyd Linkedin fel yr atalydd mwyaf grymus o weithgaredd TRPV4. Cafodd BMDMs (5 × 104 o gelloedd/ffynnon) eu hadu i mewn i blatiau du gwaelod wedi'u gorchuddio â cholagen (10 µg/ml) 96-a'u deor ar 37 gradd , 5 y cant CO2. Ar ddiwrnod yr arbrawf, llwythwyd celloedd â llifyn calsiwm 6 yn HBSS, 20 mM HEPES, probenecid 2.5 mM a'u deor am 45 munud ar 37 gradd. Ar ôl deori, ychwanegwyd cyfansoddion llyfrgell at bob ffynnon i grynodiad terfynol o 2 µM. Cafodd platiau eu deor am 45 munud arall ar 37 gradd. Ysgogwyd mewnlifiad Ca2 plus trwy ychwanegu 10 nM o agonist TRPV4 GSK1016790A mewn celloedd wedi'u rhag-drin gan gerbydau neu gyfansawdd a'u cofnodi trwy fesur ΔF/F (Max-Min), fel y disgrifiwyd yn flaenorol17. Dangosir data fel unedau fflworoleuedd cymharol (RFU).
Imiwnoblots
Cafodd macroffagau peritoneol o ganlyniad i thioglycolate eu hadu mewn 10 y cant o FBS yn cynnwys DMEM a'u deor dros nos. Golchwyd celloedd heb eu glynu, ac ychwanegwyd albwmin serwm buchol (BSA) yn cynnwys DMEM o 1 y cant at y plât a'i ddeor am 3 awr cyn triniaeth Linkedin. Er mwyn pennu mynegiant proteinau CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6, a GAPDH, paratowyd lysadau celloedd cyfan o gelloedd a gafodd eu trin dros nos gyda Linkedin (1 a 5 µM) neu gerbyd ym mhresenoldeb neu absenoldeb oxLDL (25 µg/ml ). Er mwyn pennu lefelau mynegiant p-JNK a JNK a sbardunwyd gan LPS, cafodd celloedd eu rhag-drin â Linkedin (5 a 10 µM) am 3 h ac yna eu hysgogi ag E. coli LPS am 30 munud. Paratowyd lysates cell gyfan o gelloedd a gafodd eu golchi ddwywaith (PBS oerfel iâ) gan ddefnyddio byffer RIPA gyda choctel atalydd proteas ychwanegol (Thermo Scientific, MA). Archwiliwyd blotiau â gwrth-TRPV4 cwningen (Alomone Lab, Jerwsalem, Israel), gwrth-lygoden CD36 (Ymchwil a Datblygu, Minneapolis, MN), cwningen gwrth-TLR4, cwningen gwrth-TLR6, cwningen gwrth-JNK, a cwningen gwrth-p- Gwrthgyrff cynradd JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) wedi'i ddilyn gan wrthgyrff eilaidd gwrth-cwningen a gwrth-lygoden HRP-cyfunol (R&D, Minneapolis, MN). Cafodd blotiau eu tynnu a'u hail-chwilio ag IgG gwrth-GAPDH (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) ar gyfer rheoli llwytho.
Ffurfio celloedd ewyn.Cafodd MRM wedi'i ysgogi gan thioglycolate ei hadu ar orchuddion gwydr mewn plât 12 ffynnon gyda DMEM, 10 y cant FBS a'i ddeor ar 37 gradd , 5 y cant CO2 am 2 awr. Ychwanegwyd GGT (1 neu 10 µM) at y celloedd, ac ar ôl 3 h o ddeori, ychwanegwyd oxLDL (50 µg/ml), a deorwyd diwylliannau dros nos ar 37 gradd . Ychwanegwyd LDL brodorol (50 ug/ml) at ffynhonnau'r grŵp rheoli a'i ddeor dros nos. Cafodd celloedd eu gosod mewn paraformaldehyde 4 y cant ac yna staenio Oil Red O i fesur cynhyrchu celloedd ewyn.
Trawsgludiad fector adenovirws.Casglwyd lluniadau Adenovirws i fynegi Ad(RGD) - llygoden TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), a fector gwag adenovirws, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), o Biolabs Vector, Malvern, PA. Fe wnaethon ni ddefnyddio 1 × 108 pfu/ml ar gyfer pob arbrawf. Ar gyfer astudiaethau cynhyrchu celloedd ewyn, deorwyd macroffagau peritoneol llygoden gydag Ade-TRPV4 neu Ade-Vec mewn cyfryngau DMEM am 72 h cyn ychwanegu oxLDL i gynhyrchu celloedd ewyn macrophage.
Rhwymo a derbyn ych-LDL.I asesu rhwymo, cafodd macroffagau peritoneol eu trin â dau ddos (1 neu 10 µM) o Linkedin neu gerbyd am 3 h a'u deor â DiI-oxLDL ar 4 gradd am awr. Ar ôl rhag-driniaeth gyda Linkedin neu gerbyd, deorwyd celloedd â DiI-oxLDL ar 37 gradd am 30 munud i asesu'r nifer a oedd yn cael eu derbyn. Cafodd delweddau eu dal gan ficrosgopeg fflworoleuedd (63x), a defnyddiwyd Delwedd J i feintioli canlyniadau.
Dadansoddiad cytometreg llif.Cafodd macroffagau peritoneol a ysgogwyd gan thioglycolate eu meithrin yn DMEM, 10 y cant FBS am 24 h. Golchwyd celloedd heb eu glynu i ffwrdd, ychwanegwyd cyfrwng di-serwm, a deorwyd celloedd am 2 h ac yna ychwanegu 5 µM GGT neu gerbyd, a pharhawyd i ddeor am 3 h. Cafodd celloedd wedi'u trin eu crafu oddi ar y plât a'u hailddarparu yn PBS, 2 y cant BSA. Deorwyd celloedd â gwrthgyrff cynradd am 45 munud ac yna deoriad 30 munud gyda gwrthgorff eilaidd wedi'i gyfuno ag AG. Defnyddiwyd cytomedr llif FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Canada) i gaffael data. Proseswyd yr holl ddata gan ddefnyddio meddalwedd FlowJo.
qRT-PCR.Cafodd macroffagau a achosir gan thioglycolate eu trin â 5 µM Linkedin neu gerbyd am 3 h; Ychwanegwyd 25 µg/ml o oxLDL at y cerbyd neu gelloedd wedi'u trin â Linkedin, a pharhawyd i ddeori dros nos. Defnyddiwyd RNeasy Micro Kit (#74,004) o QIAGEN i echdynnu cyfanswm RNA, a defnyddiwyd Pecyn Un Cam Gwyrdd Universal SYBR o Bio-Rad i wrthdroi trawsgrifio'r RNA. Defnyddiwyd Beiciwr Thermol Cyffwrdd C1000 (Bio-Rad) i gaffael data. Pennwyd mynegiant genyn fel swm yr mRNA genyn-benodol o'i gymharu â GAPDH mRNA gan ddefnyddio'r dull CT cymharol a ddisgrifir ym mwletin defnyddwyr system Bio-Rad qRT-PCR.
Dadansoddiad ystadegol.Cyflwynir data fel cymedrig ± SEM triphlyg biolegol. Defnyddiwyd meddalwedd GraphPad Prism 7.0, a gwnaed cyfrifiadau gan ddefnyddio prawf-t Student ar gyfer dau grŵp neu ANOVA unffordd ar gyfer grwpiau lluosog.
Cymeradwyaeth foesegol.Cynhaliwyd yr holl arbrofion ar lygod yn unol â chanllawiau'r Pwyllgor Sefydliadol Gofal a Defnydd Anifeiliaid (IACUC) ac fe'u cymeradwywyd gan Bwyllgor Adolygu Parc Prifysgol Maryland-Coleg.
Canlyniadau in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>triphlyg; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">
Ffigur 1. Adnabyddiaeth lled-uchel yn seiliedig ar sgrinio o Linkedin fel atalydd TRPV4 newydd o lyfrgell o gyfansoddion naturiol. (A) Siart llif yn dangos y llif gwaith sy'n arwain at nodi ginkgetin fel atalydd TRPV4 posibl o lyfrgell o 2000 o gyfansoddion naturiol. (B) Recordiad Cynrychiolydd FlexStation 3 yn dangos effaith ataliol 6 chyfansoddyn naturiol ar weithydd TRPV4 (GSK1016790A) a achosir gan Ca2 ynghyd â mewnlifiad mewn calsiwm 6 BMDM wedi'i lwytho â llifyn yn ystod sgrinio eilaidd. Roedd rhag-driniaeth gyda phob un o’r 6 chyfansoddyn yn dangos effeithiau ataliol ar fewnlifiad TRPV{4-dibynnol Ca2 plws o’i gymharu â chelloedd a gafodd eu trin ymlaen llaw gyda cherbyd (rheolaeth negyddol; cerbyd plws GSK1016790A (10 nM)) neu ionoffor calsiwm (A23187, 2 μM). Fe wnaethom ddefnyddio antagonist TRPV4 dethol, GSK2193874 (10 nM), fel rheolydd negyddol. Ailadroddwyd pob arbrawf deirgwaith fesul pedwar. RFU: uned fflworoleuedd cymharol.
Mae ataliad TRPV4 gan GGT yn atal ffurfio celloedd ewyn macrophage a achosir gan oxLDL.Dangosodd ein hastudiaethau blaenorol fod mewnlifiad Ca2 plws TRPV yn ymwneud â ffurfio celloedd ewyn oxLDL 14,16. Felly, gwnaethom werthuso'r posibilrwydd bod ffurfio celloedd ewyn wedi'i atal gan elyniaeth GGT o weithgaredd TRPV4. Deorwyd macroffagau peritoneol murine gwyllt ag oxLDL i gymell ffurfio celloedd ewyn ym mhresenoldeb neu absenoldeb GGT, a'u dadansoddi gan staenio Olew Red O. Yn ôl y disgwyl, canfuom fod y genhedlaeth o gelloedd ewyn wedi cynyddu bum gwaith mewn macroffagau trin oxLDL o'i gymharu â LDL brodorol (Ffig. 2 A, B). Fodd bynnag, roedd triniaeth y macrophages gyda GGT (1 neu 10 µM) cyn ysgogiad ag oxLDL wedi gostwng yn sylweddol ganran y celloedd ewyn (Ffig. 2 A, B). Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu effaith ataliol GGT ar ffurfiant celloedd ewyn macrophage o bosibl yn targedu mewnlifiad Ca2 plus TRPV. Ymhellach, fe wnaethom or-fynegi TRPV4 mewn macroffagau TRPV4 nwl trwy ddefnyddio adenovirws adeiladu ac yna ysgogi ffurfio celloedd ewyn trwy ddefnyddio oxLDL ym mhresenoldeb GGT. Canfuom fod gorfynegiant o TRPV4 yn cynyddu'r ffurfiant celloedd ewyn a gafodd ei rwystro pan wnaethom rag-drin y gell â GGT, sy'n awgrymu bod ataliad rhag ffurfio celloedd ewyn proatherogenig gan GGT yn ddibynnol ar TRPV4 (Ffig. 2 C, D).
Nid yw GGT yn rhwystro lefel mynegiant gwaelodol TRPV4 a derbynyddion llidiol.Mae derbynnydd sborionwr CD36 yn chwarae rhan fawr wrth dderbyn a rhwymo oxLDL, a ffurfio celloedd ewyn, prosesau hanfodol mewn atherosglerosis4-7,54,55. Yn ddiweddar, mae corff cynyddol o dystiolaeth yn awgrymu bod derbynyddion tebyg i dollau yn cymryd rhan mewn atherosglerosis2,4,56. Er mwyn ymchwilio i weld a oedd GGT wedi rhwystro ffurfiant celloedd ewyn trwy effeithio ar fynegiant CD36, TLR4, TLR6, a TRPV4, fe wnaethom gynnal dadansoddiad imiwnoblot ar ddau grynodiad o GGT (1 neu 5 µM). Canfuom lefelau mynegiant tebyg o CD36, TRPV4, TLR6, a TLR4 o gymharu â'r rheolaeth heb ei drin (Ffig. 3A-D). Llif dadansoddiad cytometrig hefyd yn datgelu unrhyw wahaniaeth sylweddol yn y mynegiant arwyneb gell y proteinau gyda neu heb driniaeth GGT ( Ffig. 3 E - H , I - L ). O ystyried y cyfan gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod GGT yn blocio ffurfiant celloedd ewyn macrophage heb atal lefelau sylfaenol mynegiant wyneb TRPV4, CD36, TLR4, a TLR6.
Ffigur 2. Mae atal TRPV4 gan Linkedin yn atal ffurfio celloedd ewyn macrophage a achosir gan oxLDL. (A) Cafodd macroffagau peritoneol murine a achosir gan Thioglycolate eu trin dros nos gyda 50 µg/ml oxLDL, wedi'i ddilyn gan ragdeoriad 3 h gyda cherbyd neu 1 neu 10 µM Linkedin. Cafodd celloedd eu trin â 50 µg/mL brodorol LDL (VLDL) fel rheolaeth. Chwyddiad gwreiddiol: 40x. (B) Dangosir meintioli'r canlyniadau yn (A). n=500 celloedd/cyflwr. Prawf-t y myfyriwr; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>
Derbyniad o oxLDL, ond nid yw'n rhwymo gan macrophages yn cael ei atal gan GGT. Oherwydd y dangoswyd yn flaenorol bod gan TRPV4 rôl yn y nifer sy'n derbyn oxLDL a ffurfiant celloedd ewyn14,16, fe wnaethom werthuso a oedd triniaeth gyda GGT yn achosi amhariad wrth rwymo oxLDL ar yr wyneb macrophage. Cafodd macroffagau peritoneol WT eu trin â GGT cyn deori â DiI-oxLDL ar 4 gradd, ac aseswyd rhwymo. Mae'r canlyniadau'n dangos nad oedd rhwymo oxLDL ar yr wyneb macrophage wedi'i rwystro'n sylweddol gan driniaeth GGT (1 neu 10 µM) o'i gymharu â rheolaeth cerbydau (Ffig. 5A-C). Ar ôl sefydlu nad yw GGT yn atal rhwymo oxLDL, ein nod nesaf oedd pennu a oedd triniaeth GGT yn amharu ar y nifer a oedd yn cael oxLDL mewn macroffagau. Yn ddiddorol, dangosodd ein canlyniadau fod yna ataliad sylweddol yn y nifer sy'n derbyn oxLDL mewn macroffagau mewn celloedd wedi'u trin ymlaen llaw GGT o gymharu â'r grŵp a driniwyd gan gerbydau (Ffig. 6 A, B). O ystyried y cyfan gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod GGT yn rhwystro'r defnydd o oxLDL, ond nid yn rhwymol, mewn macroffagau.
Mae GGT yn blocio mynegiant a achosir gan oxLDL o TRPV4 mewn macroffagau.
Gan fod ein hastudiaethau a gyhoeddwyd yn flaenorol yn dangos bod TRPV4-cafodd Ca2 plus yn chwarae rhan mewn ffurfio celloedd ewyn macrophage wedi'i gyfryngu gan oxLDL14,16, ceisiwyd canfod a oedd GGT yn rhwystro ffurfiant celloedd ewyn trwy atal mynegiant a achosir gan oxLDL o CD36, TLR2, TLR4, TLR6, neu TRPV4. Canfuom fod ysgogiad macroffagau dros nos ag oxLDL wedi arwain at ddadreoleiddio mynegiant proteinau TRPV4 o'i gymharu â LDL, tra bod mynegiant derbynyddion eraill (CD36, TLR2, TLR4, a TLR6) yn aros yn ddigyfnewid (Ffig. 4A-F). Pretreatment o gelloedd gyda GGT cyn symbyliad gyda oxLDL yn ddetholus gostwng lefel y mynegiant o TRPV4 proteinau o'i gymharu â thriniaeth cerbyd (Ffig. 4A-F). Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu effaith ataliol GGT ar fynegiant protein TRPV4, a allai fod yn rhannol gysylltiedig ag atal GGT rhag ffurfio celloedd ewyn.
Ffigur 3. Nid yw triniaeth Linkedin yn newid cyfanswm mynegiant protein neu arwyneb TRPV4, CD36, a TLRs mewn macroffagau. (A–D) Imiwnoblotiau o lysates cell gyfan macrophage yn dilyn triniaeth dros nos gyda 1 neu 5 µM Linkedin neu gerbyd. Mae imiwnoblotiau cynrychioliadol yn dangos mynegiant protein cyfanswm o CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C), a TLR4 (D) mewn celloedd Linkedin-drin a heb eu trin. Perfformiwyd tri atgynhyrchiad biolegol annibynnol a 3 ailadroddiad arbrofol ar gyfer pob set o arbrofion. (E-H) Dadansoddiad cytometrig llif o macroffagau a gafodd eu trin dros nos gyda 5 µM Linkedin neu heb ei drin yn dangos mynegiant arwyneb TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G), a TLR6 (G) mewn celloedd heb eu trin a'u trin â Linkedin. Dadansoddwyd tair atgynhyrchiad biolegol annibynnol a 30,000 o gelloedd fesul cyflwr. (I–I) Dadansoddiad meintiol o ganlyniadau (E–H). Wedi'i ddadansoddi gan brawf-t dau gynffon gyda chyfwng hyder o 99 y cant. Celloedd wedi'u cyfrif fesul arbrawf, 30,000; dau ailadroddiad arbrofol.
Mae GGT yn blocio actifadu JNK2 proatherogenig a llid mewn macroffagau. Mae adroddiadau cyhoeddedig gan ein labordy ac eraill wedi dangos bod actifadu JNK2 yn chwarae rhan hanfodol mewn ffurfio celloedd ewyn ac atherosglerosis7,57. I benderfynu a allai GGT atal actifadu JNK1/2, cafodd macroffagau eu trin â GGT ac yna ysgogiad gyda LPS neu oxLDL. Dangosodd canlyniadau dadansoddiad immunoblot fod triniaeth gyda GGT yn atal yn sylweddol oxLDL- neu ffosfforyleiddiad a achosir gan LPS o JNK1 / 2 o'i gymharu â rheolaeth LDL heb ei drin neu frodorol (Ffig. 7 A - D). Dangoswyd bod actifadu JNK mewn macroffagau yn ysgogi trawsgrifio cyfryngwyr proinflammatory sy'n gysylltiedig ag atherosglerosis58-60. Er mwyn penderfynu a allai GGT rwystro mynegiant y rheolyddion proinflammatory hyn mewn macroffagau, ysgogwyd celloedd a ragdriniwyd gan GGT ag oxLDL, a mesurwyd lefelau mynegiant mRNA o TNF , IL 6, IL12, IL1 , a MCP1 gan ddadansoddiad qRT-PCR. Rydym yn canfod is-reoleiddio sylweddol mewn lefelau mynegiant a achosir gan oxLDL o TNF , IL12 , IL1 , a MCP1 mRNA mewn celloedd GGT-drin o'i gymharu â cerbyd-drin rheolaethau (Ffig. 7E-I). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod GGT yn blocio actifadu JNK2 proatherogenig a mynegiant genynnau llidiol mewn ymateb i ysgogiad oxLDL mewn macroffagau. Trafodaeth Mae'n hysbys bod cyfansoddion naturiol fel flavonoidau a pholyffenolau yn modiwleiddio ymatebion cardiofasgwlaidd trwy fecanweithiau amrywiol, megis atal signalau proinflammatory, sensiteiddio inswlin, statws ocsideiddiol, a gwella proffiliau lipid gwaed40-45. Yma, rydym yn adrodd ar adnabod lled-uchel yn seiliedig ar sgrinio a nodweddu swyddogaethol Linkedin, flavon, fel atalydd newydd o brosesau genig/llidiol Prothero dibynnol TRPV mewn macroffagau. Fe wnaethom ddangos yn benodol fod i) blociau ginkgetin TRPV4- wedi cyfryngu Ca2 plws mewnlifiad i macroffagau, ii) rhwystriad ginkgetin o swyddogaeth TRPV4 wedi gostwng yn sylweddol ffurfiant celloedd ewyn a achosir gan oxLDL trwy atal y defnydd o oxLDL mewn macroffagau, a iii) blociau ginkgetin ffosfforyleiddiad a achosir gan LPS- ac oxLDL o JNK1/2, mynegiant o broteinau TRPV4, a mynegiant genynnau llidiol. Gyda'i gilydd, dangosodd canlyniadau ein hastudiaeth fod ginkgetin yn atal swyddogaeth macrophage proatherogenig/llidiol mewn modd dibynnol ar TRPV. Mae atherosglerosis, clefyd aortig, yn cael ei ysgogi i ddechrau gan lid ac amlyncu macroffagau ag oxLDL, gan achosi ffurfio celloedd ewyn macrophage, sydd wedyn yn symud ymlaen i ffurfio atheroma2-10. Gan fod ffurfio celloedd ewyn yn broses hanfodol mewn atherogenesis, gall deall a thrin ffurfiant celloedd ewyn fod â photensial therapiwtig. Mae'n hysbys bod macroffagau yn mynegi amrywiaeth o sianeli a phympiau ïon treiddio pilen, gan gynnwys TRPV4, Ca2 polymodal mecanosensitif ynghyd â sianel ïon athraidd, sy'n cael ei hactifadu gan ysgogiadau ffisegol a biocemegol11-24. Mae astudiaethau cyhoeddedig gan ein labordy ac eraill wedi nodi rôl TRPV4 mewn llid macrophage a ffurfiant celloedd ewyn a achosir gan oxLDL14-16,26. Gall TRPV4 felly fod yn darged ymarferol ar gyfer gwanhau prosesau proatherogenig.
Ffigur 5. Nid yw Linkedin yn atal rhwymiad DiI-oxLDL i macroffagau. Cafodd Macrophages eu trin ymlaen llaw gyda cherbyd neu Linkedin (1 neu 10 µM) am 3 h ac yna deorwyd gydag oxLDL wedi'i labelu gan DiI (2.5 µg/mL) am 1 h ar 4 gradd . (A) Delweddau microsgopig fflworoleuedd cynrychioliadol (chwyddiad gwreiddiol, 63 ×) o DiI-oxLDL yn rhwymo ar wyneb y bilen macrophage (n=20 celloedd/cyflwr). (B) Canlyniadau arbrawf A yn cael eu dangos fel proffil plot gan ddefnyddio meddalwedd NIH ImageJ. (C) Dadansoddiad meintiol o ganlyniadau o gelloedd/cyflwr A. n{{=20. gwella atherosglerosis trwy leihau MMP-2 a MMP-9 a chynyddu lefelau NO a NOS mewn aortas thorasig llygod mawr52. Yn yr astudiaeth bresennol, fe ddangoson ni fod ginkgetin yn blocio TRPV4-yn achosi mewnlifiad mewn macroffagau Ca2 plus. Yn fecanyddol, gwnaethom ddangos bod ginkgetin yn rhwystro'r nifer sy'n cael oxLDL, ond nid yn rhwymol, mewn macroffagau. Awgrymodd astudiaethau a wnaed in vivo ac in vitro rôl hanfodol CD36 fel y prif dderbynnydd sborionwyr yn y nifer sy'n derbyn oxLDL a ffurfiant celloedd ewyn macrophage2-7. Dangoswyd bod llygod CD36 null sydd heb ApoE neu LDLR yn llai tueddol o ddatblygu briwiau atherosglerotig5,6. Nododd astudiaethau blaenorol o'n grŵp rôl hanfodol i raeadru signalau CD{36-JNK wrth ffurfio celloedd ewyn macrophage7. Mae derbynyddion tebyg i doll TLR2, TLR4, a TLR6 yn gweithredu fel cydderbynyddion trwy ryngweithio â CD36 a dangoswyd eu bod yn ymwneud ag atherogenesis2,56,63. Gwnaethom archwilio'r posibilrwydd bod y diffyg ffurfiant celloedd ewyn a welwyd mewn macroffagau wedi'u trin â Linkedin yn ganlyniad i fynegiant llai o broteinau CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, neu TLR6. Yn ddiddorol, ni wnaeth triniaeth Linkedin leihau mynegiant proteinau CD36, TLR2, TLR4, neu TLR6 yn sylweddol ar lefelau gwaelodol neu o dan amodau a ysgogwyd gan oxLDL. Fodd bynnag, rhwystrodd Linkedin yn benodol y dadreoleiddiad o fynegiant proteinau TRPV4 a achosir gan oxLDL, tra bod ei fynegiant ar lefelau gwaelodol yn aros yr un fath. O ystyried y cyfan gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod ginkgetin yn blocio ffurfiant celloedd ewyn a achosir gan oxLDL trwy fecanwaith sy'n annibynnol ar fynegiant CD36 a TLR, ond yn dibynnu ar TRPV4. Dangosodd astudiaethau blaenorol o'n grŵp ac eraill fod actifadu JNK2 yn ymwneud â ffurfio celloedd ewyn a datblygiad briwiau atherosglerotig7,57. Dywedwyd hefyd bod JNK yn ymwneud â modiwleiddio MMP-9 a MMP-13, sy’n cael eu gorfynegi mewn briwiau atherosglerotig64–68. O ystyried y cyswllt cydnabyddedig o JNK mewn prosesau atherogenig, roeddem am benderfynu a allai ginkgetin atal actifadu JNK. Yn unol ag adroddiadau blaenorol, dangosodd ein canlyniadau hefyd fod ginkgetin yn blocio ffosfforyleiddiad llidiol a achosir gan ysgogiad o JNK2 mewn macroffagau. Mae'r canlyniad hwn yn awgrymu mecanwaith posibl y mae Linkedin yn ei ddefnyddio i rwystro ffurfio celloedd ewyn. Ar ben hynny, canfuom is-reoleiddio sylweddol yn y mynegiant a achosir gan oxLDL o mRNA TNF , IL12, IL1 , a MCP1 mewn celloedd wedi'u trin â ginkgetin o'u cymharu â rheoli cerbydau, gan amlygu rolau gwrthlidiol posibl ginkgetin mewn ymateb i oxLDL. I grynhoi, dangosodd ein canlyniadau fod ginkgetin yn atal swyddogaeth macrophage proatherogenig a llidiol mewn modd dibynnol ar TRPV. Mae'r canfyddiadau hyn felly'n cryfhau'r rhesymeg dros ddefnyddio cyfansoddion naturiol wrth ddatblygu therapiwteg posibl a/neu adweithyddion cemo-ataliol.
Cyfeiriadau
1. Barquera, S. et al. Trosolwg byd-eang o epidemioleg y clefyd cardiofasgwlaidd atherosglerotig. Arch. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te bioleg gellog macroffagau mewn atherosglerosis. Cell 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Llid mewn atherosglerosis. Natur 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Micae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokines, metaboledd lipid macrophage, a chelloedd ewyn: goblygiadau ar gyfer therapi clefyd cardiofasgwlaidd. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Mae tarfu wedi'i dargedu ar y derbynnydd sborionwyr dosbarth B CD36 yn amddiffyn rhag datblygiad briwiau atherosglerotig mewn llygod. J. Clin. Buddsoddi. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Derbynyddion sborionwyr dosbarth AI/II a CD36 yw'r prif dderbynyddion sy'n gyfrifol am y defnydd o lipoprotein dwysedd isel wedi'i addasu sy'n arwain at lwytho lipidau mewn macroffagau. J. Biol. Cemeg. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. Mae angen rhaeadr signalau dibynnol CD ar gyfer ffurfio celloedd ewyn macrophage. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Atherosglerosis - afiechyd llidiol. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te mecanweithiau moleciwlaidd cymhlethdodau thrombotig atherosglerosis. J. Intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Atherosglerosis. Natur 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Gweithrediad cyflym iawn o sianeli ïon TRPV4 gan rymoedd mecanyddol a gymhwysir i integrinau beta1 arwyneb celloedd. Cyfanrif. Biol. (Camb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. a Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ mecanotransduction echelin signalau mewn anystwythder matrics- a thrawsnewid epithelial-mesenchymal a achosir gan TGF 1-. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Mae angen potensial derbynnydd Transient vanilloid 4 ar gyfer ymateb corff tramor a ffurfio celloedd anferth. Yn. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. Mae sianel calsiwm-athraidd TRPV4 yn rheolydd newydd ar gyfer ffurfio celloedd ewyn macrophage ocsidiedig a achosir gan LDL. Radic Rhad. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).
