Mae Gwrthgyrff sy'n ysgogol i Imiwn yn Cael Ysgogi Myeloid Cadarn Ac Imiwnedd Gwrth-tiwmor Gwydn （Rhan 1）

I ddysgu mwy o wybodaeth plz cysylltwchdavid.wan@wecistanche.com

Haniaethol

Gall derbynyddion adnabod patrwm cynhenid, gan gynnwys derbynyddion tebyg i dollau (TLRs), newid y micro-amgylchedd tiwmor a'r imiwnedd gwrth-tiwmor addasol cysefin.Fodd bynnag, nid yw agonyddion TLR wedi cael eu goddef yn dda oherwydd gwenwyndra sy'n gysylltiedig ag actifadu imiwnedd eang yn dilyn gweinyddiaeth systemig.Dylunio therapiwteg sy'n addas ar gyfer cyflwyno systemig agallu ennyn ymateb wedi'i dargedu tiwmor, fe wnaethom ddatblygu dosbarth newydd o gyfuniadau gwrthgyrff sy'n ysgogi imiwn (ISACs) yn cynnwys agonist TLR7/8 wedi'i gyfuno â gwrthgyrff sy'n targedu tiwmor.Roedd ISACs gwrth-HER2 a weinyddir yn systemig yn cael eu goddef yn dda mewn vivo ac yn ysgogi gweithrediad cadarn o gelloedd myeloid mewntwmoraidd, gan arwain at glirio tiwmor a chof imiwnolegol dilynol.Roedd angen gweithgaredd tandem ar gyfer cryfder in vitro ac effeithiolrwydd in vivo wedi'i ysgogi gan ymarferoldeb Fc cyflawn ac agoniaeth TLR i alluogi ffagocytosis ac imiwnedd gwrth-tiwmor trwy gyfrwng celloedd T.Nid oedd cof imiwnolegol wedi'i gyfryngu gan ISAC wedi'i gyfyngu i HER2, gan fod llygod a gafodd eu trin gan yr ISAC wedi'u hamddiffyn rhag ail-ail-ddechrau â thiwmor negyddol HER2-.Mae'r canlyniadau hyn yn rhoi sail resymegol gref ar gyfer datblygiad clinigol ISACs ac yn dangos bod synergedd rhwng signalau Fc R a TLR7/8 yn cyfrannu at fecanwaith imiwnedd gwrth-tiwmor wedi'i gyfryngu gan ISAC.

Cliciwch yma i ddysgu mwy am Cistanche

Rhagymadrodd

Cyn diwedd yr 20fed ganrif, yn gyffredinol roedd gan gleifion canser dri dull triniaeth: echdoriad llawfeddygol, ymbelydredd, a chemotherapi. Ychwanegodd ymddangosiad imiwnotherapi canser bedwaredd ddull pwerus a ehangodd y repertoire oncoleg yn fawr gan ddechrau gyda chymeradwyaeth rituximab ar gyfer lymffoma nad yw'n Hodgkin ac yn ymestyn i fabwysiadu atalyddion pwynt gwirio 1,2 yn eang. Fodd bynnag, mae unrhyw un therapi, gan gynnwys imiwnotherapi, yn gyfyngedig dros dro oni bai ei fod yn ennyn ymatebion biolegol ac imiwnolegol parhaol sy'n goresgyn heterogenedd tiwmor a baich treiglo 3-5. Mae atalyddion pwynt gwirio fel gwrthgyrff gwrth-PD-1 a PD-L1 yn gwella canlyniadau'n ddramatig mewn sawl arwydd, gan gynnwys mewn cleifion â baich treiglo tiwmor uchel neu ansefydlogrwydd microloeren, ac un penderfynydd o dueddiad tiwmor i imiwnotherapi pwynt gwirio yw graddau'r rhagosodiad. -ymdreiddiad cell T presennol. Mae cleifion â thiwmorau "oer" sydd ag ymdreiddiad cell T gwasgaredig yn llai ymatebol i rwystr pwynt gwirio ac mae ganddynt ragolygon gwaeth o'u cymharu â chleifion â thiwmorau "poeth" lle mae celloedd T tiwmor-adweithiol imiwnogyddedig yn bresennol yn y micro-amgylchedd tiwmor (TME) 6,7 . Mae biopsi tiwmor ac imiwn-histocemeg yn nodi bod celloedd proffesiynol cyflwyno antigen (APCs) fel celloedd dendritig (DCs) yn aml yn amlach yn y TME na chelloedd T, er eu bod yn dal yn agored i fecanweithiau gwrthimiwnedd 8,9. O ystyried presenoldeb celloedd myeloid yn y TME a'u rôl yn hyrwyddo actifadu celloedd T, bu ymdrech gynyddol i ddatblygu therapïau sy'n actifadu APCs sy'n gysylltiedig â thiwmor i ennyn imiwnedd celloedd T eang ac ymateb imiwn gwrth-diwmoraidd effeithiol.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 rhoddwr. (d) Adweithiwyd rituximab â SATA trwy weddillion lysin i drosi aminau rhydd yn grwpiau sylffhydryl gwarchodedig cyn dadsetylu â hydrocsylamine ac adwaith dilynol â T785-MCC i gynhyrchu'r rituximab-ISAC. (e) Dadansoddiad LC-MS o'r rituximab-ISAC yn dilyn triniaeth PNGase F. Cyfrifwyd DAR yn seiliedig ar adiad màs cysylltydd-agonist o 606 g/mol. (dd) Deorwyd rituximab neu rituximab-ISAC wedi'i labelu'n fflworoleuol â chelloedd tiwmor CD20 ynghyd â Toledo ar 4 gradd am 2 awr cyn dadansoddi trwy sytometreg llif. Daw'r data o 1 arbrawf gyda samplau triphlyg ac maent yn gynrychioliadol o 2 arbrawf.(gh) Cafodd APCs myeloid dynol newydd eu hynysu eu meithrin gyda rituximab, T785, rituximab, a T785 neu'r rituximab-ISAC ym mhresenoldeb celloedd tiwmor CD20 ynghyd â Toledo wedi'u labelu â CFSE ar gymhareb effeithydd 3:1 i darged. Mae'r crynodiad rituximab yn cael ei ddarlunio ar yr echelin X gyda'r crynodiad o T785 yn y profion hyn yn gyson â'r swm o T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 rhoddwr (cymedr a SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Mae wedi'i ddogfennu'n dda bellach y gall cyflenwi cyfryngau imiwn-ysgogol yn lleol mewn modelau rhag-glinigol ailraglennu APCs preswylydd tiwmor wedi'i atal yn gelloedd actifedig sy'n gallu prosesu a chyflwyno antigenau sy'n gysylltiedig â thiwmor, gan gynnwys neoantigenau, i gelloedd T sydd wedyn yn cyfryngu imiwnedd gwrth-tiwmor 10-13 . Roedd un strategaeth o’r fath a arloeswyd gan Carmi et al yn dangos bod cyflenwad mewntiwmoraidd o wrthgyrff targed tiwmor allogeneig gydag agonist derbynnydd tebyg i Doll (TLR)-3 neu gyda TNF a CD40L APCs cysylltiedig â thiwmor a achubwyd yn swyddogaethol gan arwain at fwy o ddefnydd o antigenau a sefydlu dilynol o imiwnedd gwrth-tiwmor cell T. Arweiniodd y strategaeth gyfuniad hon, a ysgogodd swyddogaeth effeithydd gwrthgorff gyda agonist TLR, at ddileu tiwmorau cynradd a briwiau metastatig ac amddiffynodd y gwesteiwr rhag tiwmor rhag digwydd eto 11,14. Yn yr un modd, mae gwrthgorff gwrth-OX40 agonistaidd mewn cyfuniad ag agonist TLR9, CpG, APCs wedi'u actifadu a chelloedd T o fewn y tiwmor, gan arwain at effeithiolrwydd trawiadol yn erbyn mathau lluosog o tiwmor mewn llygod 13. Mae'r cyfieithiad effeithiol o strategaethau actifadu APC i'r clinig yn cael ei ymchwilio i arwyddion lluosog gyda data clinigol mewn cleifion â melanoma sy'n awgrymu y gall cyflwyno agonyddion TLR9 o fewn tiwmor ar y cyd â gwrthgorff gwrth-PD-1 arwain at grebachu tiwmor ac ymatebion abscopaidd mewn briwiau heb eu chwistrellu 15. Yn yr un modd, nifer o mae grwpiau'n mynd ar drywydd agonistiaid TLR7/8 ar gyfer imiwnotherapi tiwmor gan fod patrwm mynegiant TLR7/8 mewn APCs dynol yn adlewyrchu'n agosach y patrwm mynegiant TLR7 a TLR9 mewn APCs murine16-18. Yn y pen draw, bydd mabwysiadu strategaethau cyflawni mewn-tumoral, os yw'n effeithiol, yn cael ei gyfyngu gan hygyrchedd tiwmor gan fod cyflwyno systemig o agonyddion imiwnedd sy'n targedu APCs wedi'i gyfyngu gan wenwyndra, hanner oes byr, a darpariaeth is-optimaidd i safleoedd targed.Ein nod oedd dylunio cyfuniad gwrthgyrff sy'n ysgogi imiwnedd (ISAC) yn cynnwys gwrthgorff monoclonaidd sy'n targedu tiwmor wedi'i gyfuno â gweithydd imiwn fel dull therapiwtig newydd o gael imiwnedd gwrth-tiwmor gwydn. Arweiniodd gweinyddiaeth systemig yr ISAC at weithrediad APC lleol yn y TME a oedd yn dibynnu ar Fcswyddogaeth effeithydd ac actifadu TLR tra'n osgoi gwenwyndra nodweddiadol sy'n gysylltiedig â chyflwyno systemig o weithyddion TLR. Ar ben hynny, roedd gweinyddu'r cyfuniadau hyn yn systemig i lygod â thiwmor yn galluogi prosesu antigen a chyflwyniad i gelloedd T gan arwain at imiwnedd gwrth-tiwmor parhaus mewn modelau lluosog sy'n gwrthsefyll y gwrthgorff unconjugated sy'n targedu tiwmor.

Canlyniadau

Dylunio a Nodweddu ISAC Er mwyn gallu cyfuno agonist TLR â gwrthgorff, defnyddiwyd offer tocio moleciwlaidd i ddylunio agonydd TLR7/8 newydd (T785) gyda biwtyl-amine a oedd yn bwynt ymlyniad i'r gwrthgorff sy'n hygyrch i doddydd ( Ffigur 1A, Ffigur Atodol 1A–C). Ymgysylltodd T785 â TLR7 dynol gyda EC50 o 0.643 μM a TLR8 dynol gydag EC50 o 1.60 μM mewn llinellau cell HEK293 sy'n cyd-fynegi NF-κB-inducible secreted alcalin phosphatase gohebydd a naill ai TLRFig7 neu TLR 18 ). Cadarnhawyd penodoldeb T785 ar gyfer TLR7/8 gan anallu T785 i gymell gweithgaredd NF-κB mewn celloedd gohebwyr HEK293 sydd heb fynegiant TLR7/8 (Ffigur Atodol 2A). I gadarnhau gweithgaredd agonistaidd mewn celloedd cynradd, ysgogwyd monocytes a DCs wedi'u hynysu'n ffres, a elwir yn APCs myeloid (~ monocytes 96 y cant, 4 y cant DC; Ffigur Atodol 3A), sy'n mynegi TLR7 a TLR8, dros nos gyda 1 μM T785 neu R848, a agonist TLR7/8 sydd wedi'i hen sefydlu a'i nodweddu 19. Roedd T785 a R848 yn ysgogi APCs myeloid i raddau tebyg (Ffigur 1C) 20,21. Cadarnhawyd gweithgaredd T785 hefyd mewn DCs plasmacytoid dynol newydd eu hynysu (pDCs), sy'n mynegi TLR7 ond nid TLR8 (Ffigur Atodol 2B). Er mwyn ymchwilio i effeithiau ISACs mewn diwylliannau in vitro dynol, cynhyrchwyd ISAC gyda rituximab (Ffigur 1D), gwrthgorff monoclonaidd gwrth-CD20 a ddilyswyd yn glinigol a ddefnyddir ar gyfer trin malaeneddau celloedd B, trwy gyfuniad i T785 mewn adwaith aml-gam. gyda chroesgysylltwyr heterobifunctional cydnaws 22. Mesurwyd effeithlonrwydd cydgysylltiad T{{{785-ISAC gan LC-MS yn dilyn deglycosylation gyda PNGase F, gan arwain at gymhareb cyffuriau-i-gwrthgorff (DAR) cyfartalog o 1.71 (Ffigur 1E). Gwnaethom gadarnhau bod yr ISAC wedi cadw rhwymiad tebyg i CD20 yn dilyn arbrofion cytometreg llif gyda'r CD20- yn mynegi llinell gell tiwmor Toledo, llinell gell â nodweddion da sy'n deillio o glaf â lymffoma celloedd mawr gwasgaredig (Ffigur 1F) 23. T 785-Aseswyd rhwymiad ISAC i'r derbynyddion Fc dynol (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) gan Biacore ac roedd yn debyg i rituximab (Tabl Atodol 1).ISACs actifadu APCs myeloid dynol Potensial imiwn-ysgogol y rituximab T{{77} }}Cafodd ISAC ei asesu yn dilyn cyd-ddiwylliant o APCs myeloid dynol newydd eu hynysu gyda CD20 label CFSE ynghyd â chelloedd tiwmor Toledo am 18 awr. Cafodd APCs myeloid a feithrinwyd â rituximab T{785-ISAC newidiadau morffolegol cyflym yn gyson â morffoleg DCs, ond nid oedd morffoleg DC. a welir mewn cyd-ddiwylliannau a ddeorwyd â rituximab, T785 neu gymysgedd hafal o rituximab, a T785 (Ffigur 1G). Parhaodd APCs a ysgogwyd gyda rituximab T785-ISAC yn hyfyw a dendritig o ran morffoleg am hyd at wyth diwrnod tra bod APCs a ysgogwyd gyda'r cymysgedd yn anhyfyw ar y cyfan erbyn diwrnod wyth (Ffigur 1H). Dadansoddiad cytometreg llif aml-liwar ôl 18 awr yn nodi bod APCs wedi'u hysgogi â rituximab T785-ISAC wedi'i isreoleiddio CD14 a CD16 a CD123 wedi'i uwchreoleiddio ar yr un pryd, marciwr arwyneb cell a ddangosir icael ei uwch-reoleiddio ar DCs myeloid actifedig 24. I'r gwrthwyneb, mae APCs wedi'u hysgogi â rituximab,Nid oedd T785 neu'r cymysgedd yn modiwleiddio mynegiant y marcwyr hyn (Ffigur 1I, Ffigur Atodol 4A, strategaeth gatio a ddisgrifir yn Ffigurau Atodol 3BC).

Roedd APCs dynol a ysgogwyd gyda rituximab T785-ISAC hefyd yn uwch-reoleiddio CD moleciwlau symbylol mewn modd dibynnol ar ddos, gyda thueddiadau tebyg wedi'u gweld gydag uwchreoleiddiad CD40 a HLA-DR yn gyson â ffenoteip APCs wedi'u actifadu (Ffigur 1I & Ffigur Atodol 4B). Roedd newidiadau dibynnol ar ddos ​​mewn mynegiant marciwr arwyneb yn gyson p'un a aseswyd hwy fel dwyster fflworoleuedd canolrifol (MFI, Ffigur 1) neu fel y cant o gyfanswm poblogaeth y celloedd sy'n bositif ar gyfer y marciwr priodol (Ffigur Atodol 5). Dangosodd dadansoddiad dilynol o goruwchnatyddion di-gell fod APCs wedi'u hysgogi gan rituximab T785-APC wedi'u hysgogi gan ISAC yn secretu meintiau uwch o TNF ac IL-1 (Ffigur 2J a Ffigur Atodol 4C). Nid oedd potensial imiwn-ysgogol T785-ISACs wedi'i gyfyngu i rituximab, gan fod T785-ISAC a gynhyrchwyd gyda trastuzumab hefyd wedi ysgogi actifadu myeloid gwell (Ffigur Atodol 4D). Aseswyd gallu APCs wedi'u hysgogi gan ISAC i ysgogi cyflwyniad antigen a thraws-brifo celloedd CD8 ynghyd â T gan ddefnyddio model antigen system hirgrwn (OVA) 25,26. Cafodd CD11c splenig a DCs wedi'u hynysu o lygod gwyllt eu meithrin dros nos gyda chyfadeiladau imiwnedd wedi'u ffurfio ag OVA a naill ai'r gwrthgorff gwrth-OVA neu ISAC. Cafodd DCau wedi'u llwytho ag OVA eu meintioli a'u deor â chelloedd OT-I CD8 ynghyd â chelloedd T gyda phenodoldeb TCR ar gyfer y peptid OVA, SIINFEKL, wedi'i gymhlethu â MHC-I. Croes-gyflwyniad gwell wedi'i gyfryngu gan OVA Gwrth-OVA, fel y'i mesurir gan faint o MHC-I, peptid SIINFEKL wedi'i rwymo, a chroes-seimio gwell fel y'i mesurir gan CD8 ynghyd â lluosogiad celloedd T (Ffigurau Atodol 6A a 6B). Mae ISACs yn ennyn TLR chwyddedig a signalau mewngellol sy'n gysylltiedig â Fc R mewn APCs myeloid dynol Mae gweithredu Fc Rs a TLRs yn peri rhaeadru signalau ffosffo-gymhleth, ac mae maint a nodweddion yr ymatebion hyn yn amrywio ymhlith is-setiau celloedd imiwnedd amrywiol 27. Fe wnaethom ymchwilio i'r llwybrau signalau mewngellol i lawr yr afon sy'n ymwneud ag amrywiol mathau o gelloedd o fewn cydddiwylliannau tiwmor PBMC wedi'u hysgogi gyda'r rituximab T785-ISAC o'i gymharu â rheolaethau cymysgedd hafalaidd gan ddefnyddio cytometreg màs (CyTOF) 28. Nodwyd is-grwpiau leukocyte (hy monocytes, celloedd CD4 a T) trwy glystyru SPADE gan ddefnyddio marcwyr llinach gyda chelloedd targed yn cwmpasu celloedd tiwmor CD20 ynghyd â Toledo a chelloedd B iach 29. Digwyddiadau ffosfforyleiddiad sy'n gysylltiedig â signalau TLR (pIRF7) a Fc R (pERK1/2). cynyddwyd 15 munud ar ôl symbyliad gyda'r T785-ISAC mewn monocytes a CDCs, o gymharu â'r cymysgedd cydrannau unigol 30,31. Roedd signalau mewngellol wedi'u cyfyngu i raddau helaeth i gelloedd o darddiad myeloid (monocytes a cDCs) yn ogystal â pDCs, sy'nmae pob un yn mynegi'r Fc Rs a TLR7 a/neu TLR8 angenrheidiol. Mewn monocytes a cDCs, arweiniodd yr ysgogiad a achoswyd gan yr ISAC hefyd at ffosfforyleiddiad sylweddol uwch o MAPKAPK2, p38, CREB, a phrotein ribosomaidd S6 (RPS6), gofyniad ar gyfer cychwyn synthesis protein i lawr yr afon (Ffigur 2A–C a Ffigur Atodol 7A). Dangosodd CD141 plws cDCs a CD1c plws lefelau tebyg o pIRF7 ar draws y ddwy is-setiau CDC, tra bod lefelau RPS6 a pERK1/2 yn tueddu i fod yn uwch mewn CD141 ynghyd â cDCs, sy'n rhagori mewn CD8 ynghyd â phreimio celloedd T a thraws-gyflwyniad antigen, o gymharu â CD1c ynghyd â CDCs (Ffigur Atodol 7B).

Roedd cineteg symbyliad T785-ISAC yn gyson â dynameg signalau disgwyliedig: cyrhaeddodd ffosfforyleiddiad ERK1/2 uchafbwynt ar ôl 5 munud, ac ni chyrhaeddodd ei bartner i lawr yr afon RPS6 ffosfforyleiddiad brig tan y 15-pwynt amser munud (Atodol Ffigur 7C). Mae'r cineteg hon yn cefnogi deinameg ddisgwyliedig wrth i signalau ymledu dros amser, ac mae'n awgrymu bod ymateb signalau parhaus a chwyddedig i ysgogiad ISAC o APCs. O ystyried yr ymateb chwyddedig a welwyd yn dilyn ysgogiad ISAC sy'n gysylltiedig â llwybrau signalau Fc R a TLR, fe wnaethom ddefnyddio'r Amcangyfrif o Wybodaeth Gydfuddiannol wedi'i Ailsamplu Dwysedd amodol (DREMI) ac algorithmau Delweddu Dwysedd Amodol (DREVI) i fesur cryfder perthnasoedd pâr o fewn y llwybrau signalau Fc R a TLR 32. Mae'r algorithmau hyn yn cynhyrchu lleiniau DREVI ar gyfer delweddu, lle mae'r ardal o dan y gromlin (AUC) yn ddangosydd o ddwysedd signal cyffredinol, mae'r pwynt inflection (IP) yn fesur o'r trothwy actifadu, a'r Mae sgôr DREMI yn meintioli dibyniaeth pâr y ddau ffosffoprotein dan sylw. Nododd y dadansoddiad hwn sgoriau DREMI uwch sy'n arwydd o ddibyniaeth uwch pâr rhwng proteinau sy'n gysylltiedig â llwybrau signalau Fc R a TLR yn dilyn ysgogiad T785-ISAC o gymharu â'r rheolaethau cymysgedd hafaliadol (Ffigur 2D). Gwelwyd cyd-ddibyniaeth gref rhwng pERK1/2 a pIRF7 yn unigryw yn dilyn symbyliad gyda T785-ISAC, ond nid cymysgedd, fel y dangosir gan sgôr DREMI uwch, mwy o ddwysedd signal, a throthwy actifadu gostyngol sydd ei angen ar gyfer ffosfforyleiddiad IRF7 (Ffigur 2D ). Roedd y dadansoddiad hwn hefyd yn nodi trothwy actifadu llai sydd ei angen i gychwyn cyfieithu protein (RPS6 phosphorylation) yn dilyn ysgogiad ISAC fel y'i mesurwyd gan sgorau DREMI uwch a IPs is ar gyfer y cyfuniadau pârwise o pERK1/{2-pRPS6 a pIRF7-pRPS6 . At hynny, ymhelaethwyd ar lefel ffosfforyleiddiad RPS6 o ganlyniad i ffosfforyleiddiad ERK1/2 neu IRF7 fel y'i pennwyd gan AUCs pairwise uwch (Ffigur 2D). Mae'r canlyniadau cyfunol hyn nid yn unig yn cadarnhau signalau'r ISAC trwy'r llwybrau Fc R a TLR disgwyliedig ond hefyd, maent hefyd yn cefnogi synergedd rhwng y ddau lwybr sy'n arwain at drothwyon actifadu is a dwyster signal mwy.

Ffigur 3: Mae ISACs angen swyddogaeth effeithydd Fc ac agonist TLR i gyfryngu activation myeloid.Cafodd APCs myeloid dynol ynysig ffres eu meithrin am 18 awr ym mhresenoldeb CD20 ynghyd â chelloedd tiwmor Toledo ar gymhareb effaith 3:1 i darged a (a) 80 nM o'r rituximab-ISAC gyda neu heb 1 μM R406, (b) rituximab-ISACs ar yr isoteip gwrthgorff a nodir, (c) rituximab-ISAC neu rituximab-ISAC deglycosylated (ISAC-deglycosylated). (ac) Dadansoddwyd celloedd yn ôl cytometreg llif ac adroddir data fel dwyster fflworoleuedd canolrifol. (d) Cafodd celloedd gohebydd HEK-Blue-TLR7 neu TLR8 eu meithrin am 18 awr ym mhresenoldeb T785 neu TLRnull cyn asesu gweithgaredd SEAP a achosir gan NF-κB. Mae'r data a ddangosir yno 1 arbrawf ac yn cynrychioli o leiaf 3 arbrawf. (e) Cafodd APCs myeloid dynol newydd eu hynysu eu meithrin am 18 awr ym mhresenoldeb celloedd tiwmor CD20 ynghyd â Toledo a'r rituximab-ISACs a nodir a'u dadansoddi yn ôl cytometreg llif (data a ddangosir fel canolrif).dwyster fflworoleuedd). (ae) Mae'r data a ddangosir yn gynrychioliadol o 1-4 o arbrofion ychwanegol ac yn fwy na neu'n hafal i 3 rhoddwr ar gyfer pob arbrawf (cymedr a SEM). Diffinnir arwyddocâd ystadegol fel *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Mae angen swyddogaeth effeithydd Fc ar ISACs i gyfryngu actifadu APCs myeloid Ymchwiliwyd i gyfraniad gweithgaredd Fc i swyddogaeth ISAC yn dilyn abladiad signalau Fc R i lawr yr afon gyda R406, atalydd kinase moleciwl bach o Syk sy'n atal trawsgludiad signal i lawr yr afon o'r Fc Rs 33,34 sy'n actifadu . Mae ychwanegu R406 wedi'i ddiddymu gan actifadu myeloid wedi'i gyfryngu gan T785-ISAC fel y dangoswyd gan ddiffyg dadreoleiddio'r moleciwl cymhellol CD86 ond ni newidiodd yr ymateb cellog i actifadu TLR7/8 gan T785 (Ffigur 3A & Ffigwr 8 Atodol). Gwelwyd ataliad Syk ag R406 hefyd yn atal signalau mewn monocytau yn dilyn symbyliad T{33ISAC, gydalefelau sylweddol is o MAPKAPK-2 ffosfforyleiddiad, ERK1/2, ac IRF7 a fesurwyd (Ffigur Atodol 7D).O ystyried y data hyn, lluniwyd rituximab T785-ISACs gyda DARs cymaradwy ar bob un o'r pedwar isotypes sy'n digwydd yn naturiol i ddiffinio i ba raddau y mae gweithgaredd T785-ISAC yn amrywio gyda chysylltiadau rhwymo Fc R hysbys 35,36. Ymchwiliwyd hefyd i ISACs rituximab aglycosylated a ffycosylated, gan fod glycosylation yn abladu rhwymiad Fc R tra bod ffycosyliad yn cynyddu'r affinedd rhwymol ar gyfer FCGR3A 37. Mae gallu imiwn-ysgogol y rituximab T785-ISAC yn cydberthyn ag affinedd Fc R yr isoteip gwrthgyrff (Figure). 3B). I'r gwrthwyneb, yr IgG1 (IgG1-AF) ffycosylaidd), wildtype IgG1, ac IgG3 T785-ISACs a ddenodd actifadu myeloid, gyda'r IgG1-AF T785-ISAC yn ysgogi'r uchaf lefelau uwch-reoleiddio CD86 (Ffigur 3B). Arweiniodd deglycosylation y rituximab math gwyllt T785-ISAC gyda PNGase F, sy'n lleihau affinedd rhwymo Fc-Fc R at lai o weithgaredd ysgogol imiwnedd ISAC in vitro, gan gefnogi pwysigrwydd rhanbarth Fc sy'n weithredol yn weithredol (Ffigur 3C).

Mae ISACs angen agoniaeth TLR i gyfryngu actifadu myeloid Ymchwiliwyd i gyfraniad gweithgaredd TLR ar swyddogaeth ISAC yn dilyn abladiad agoniaeth TLR trwy dynnu 2- amino pyridine o T785 y credir ei fod yn ffurfio pont halen gyda gweddillion aspartate critigol yn y rhwymiad pocedi o TLR7 a TLR8 38 (TLRnull, Ffigur 3D). Cyfunwyd y cyfansoddyn TLRnull â rituximab (TLRnull ISAC) a'i asesu ar gyfer potensial actifadu myeloid ym mhresenoldeb CD20 ynghyd â chelloedd tiwmor in vitro. Ni wnaeth yr ISAC TLRnull ysgogi uwch-reoleiddio moleciwl symbylol CD86 na modiwleiddio mynegiant CD14 neu CD123, gan nodi bod angen agoniaeth TLR ar gyfer y ffenoteip actifadu a welwyd gyda T785-ISACs (Ffigur 3E). Ymhellach, ni wnaeth ISAC TLRnull ysgogi ffosfforyleiddiad IRF-7 mewn monocytes, yn gyson â'i anallu i ymgysylltu â TLR7/8 (Ffigur Atodol 7E). Gweithgaredd celloedd B, T, neu NK mewn modelau tiwmor xenograft dynol Aseswyd gallu ISACs i gymell dinistr myeloid- a neutrophil-mediated o diwmorau solet yn absenoldeb gweithgaredd celloedd B, T, ac NK gan ddefnyddio modelau xenograft dynol 39,40. Dewiswyd Trastuzumab, gwrthgorff targedu HER a ddilyswyd yn glinigol, ar gyfer yr ymchwiliad i benderfynu a allai trastuzumab T785-ISAC oresgyn ymwrthedd tiwmor i trastuzumab yn HER2 ynghyd â modelau tiwmorau solet (Ffigur 4 a Ffigur Atodol 9). ) 41,42. Yn gyntaf, cymharwyd gweinyddiaeth systemig trastuzumab T{785-ISAC â chyflwyniad o fewn tiwmor cymysgedd o trastuzumab a T785. Ysgogodd trastuzumab T785-ISAC atchweliad tiwmor a chlirio tra bod cyflwyno cymysgedd hafal o gydrannau wedi rhoi'r budd therapiwtig lleiaf posibl o'i gymharu â trastuzumab yn unig (Ffigur 4A). Cadarnhaodd astudiaethau dilynol yn cymharu ISACs wedi'u targedu tiwmor gyda'u rheolaethau isotype priodol fod angen targedu tiwmoriaid ar gyfer gweithgarwch gwrth-diwmor (Ffigur 4B a Ffigur 10 Atodol). Yn bwysig, roedd gweinyddiaeth systemig o'r ISAC trastuzumab T785- a'i reolaeth isotype yn cael eu goddef yn dda, gydag effaith fach iawn ar bwysau'r corff (Ffigur Atodol 11).Er mwyn penderfynu a yw'r mecanwaith gweithredu sy'n cyfrannu at effeithiolrwydd ISAC in vivo yn debyg i'r hyn a ddisgrifir in vitro, profwyd Fc-incompetent (trastuzumab N297A-ISAC) a trastuzumab TLRnull-ISACs yn yr un model xenograft tiwmor y fron ynyn gyfochrog â math gwyllt trastuzumab T785-ISAC.Er i'r trastuzumab T785-ISAC arwain at atchweliad a chlirio tiwmor, methodd yr ISACs Fc-ancompetent a TLRnull i ennyn gweithgarwch gwrth-tiwmor (Ffigur 4C).Gyda'i gilydd mae'r data hyn yn dangos bod angen targedu tiwmor ac ymgysylltiad Fc R a TLR ar gyfer gweithgarwch gwrth-diwmor ISAC.

Aseswyd cyfraniad gwahaniaethol neutrophils yn erbyn celloedd myeloid eraill wrth gyfryngu effeithiau gwrth-tiwmor gan ddiswyddiadau cell-benodol.Dihysbyddwyd niwtroffiliau gan ddefnyddio gwrthgorff Ly6G, tra disbyddwyd niwtroffiliau ac APCs anaeddfed (monocytau).ei gyflawni gyda gwrthgorff gwrth-Gr1.Dihysbyddwyd celloedd ffagocytig gan ddefnyddio liposomau wedi'u llwytho â chlodronate.Canfuom fod celloedd phagocytic, macrophages yn ôl pob tebyg, yn cyfrannu'n sylweddol at gyfryngu gweithgaredd gwrth-tiwmor yn dilyn triniaeth ISAC (Ffigur 4D).Fodd bynnag, ni chafodd disbyddiad neutrophil gyda gwrth-Ly6G unrhyw effaith ar effeithiolrwydd ISAC.Ni effeithiodd dihysbyddiad Gr1 ar unwaith ar effeithiolrwydd cyfryngol ISAC ond gostyngodd hyd rheolaeth tiwmor (Ffigur 4D).I archwilio gallu T{0}}ISACs i reoli twf tiwmor mewn modelau ag isMynegiant HER2, nesaf buom yn modelu effeithiolrwydd yn y model tiwmor mynegi canolig sy'n gwrthsefyll trastuzumab, HER2-, JIMT-1.Amcangyfrifir bod gan linell gell canser JIMT-1 tua 6.5 x105 copi o arwyneb HER2 ac mae'n mynegi lefel is oHER2 o'i gymharu â llinell gell tiwmor HCC1954 yn ôl cytometreg llif 43.Tra yArafodd trastuzumab T785-ISAC dwf tiwmor yn sylweddol o gymharu â'r isoteip ISAC neu reolaethau trastuzumab, ni welwyd atchweliad na chlirio tiwmor (Ffigur 4E).Tybiwyd gennym y byddai pertuzumab, sy'n clymu epitope HER2 sy'n wahanol i safle rhwymo trastuzumab, yn cynyddu clystyru Fc, ac o ganlyniad yn gwella ADCP ac effeithiolrwydd yr ISAC ym model JIMT-1.Arweiniodd y cyfuniad o'r trastuzumab T785-ISAC â pertuzumab at effeithiolrwydd sylweddol uwch ac atchweliad tiwmor sylweddol (Ffigur 4F).Heb ysgogiad imiwn y trastuzumab T785-ISAC, nid oedd y cyfuniad o pertuzumab â trastuzumab o unrhyw fudd.

Y tro nesaf fe wnaethom ymchwilio i'r digwyddiadau moleciwlaidd a chellog a ysgogwyd gan trastuzumab T785-ISAC sydd yn y pen draw yn arwain at effeithiolrwydd gwrth-tiwmor.Newidiadau mynegiant genynnau cynnar mewn tiwmoraueu mesur gyda phanel proffilio imiwnedd pan-ganser llygoden NanoString, gan ddatgelu dadreoleiddiad sylweddol o 13.7 y cant o'r genynnau o fewn 24 awr o driniaeth gan gynnwys genynnau sy'n gysylltiedig â signalau ac actifadu TLR7 (IRF-7, genynnau cysylltiedig â NF-kB)o gymharu â 0-0.1 y cant yn dilyn trastuzumab neu isoteip T785-triniaeth ISAC (Ffigur 4G) 44.Datgelodd dadansoddiad o lwybrau mynegiant genynnau a aseswyd gan Sgôr Llwybr Dadansoddi Uwch nSolver uwch-reoleiddio sylweddol o lofnodion genynnau allweddol sy'n gysylltiedig ag imiwn (Swyddogaethau Macrophage, Swyddogaethau DC, Prosesu a Chyflwyno Antigen) a oedd ynyn gyson â chanfyddiadau in vitro ac in vivo bod rhyngweithiadau Fc-Fc R yn hanfodol ar gyfer gweithgaredd cyfryngol ISAC (Ffigur 4H a Ffigur Atodol 12).Roedd sgoriau llofnod genynnau sy'n gysylltiedig â chemocinau a cytocinau yn uchel iawn yn dilyn triniaeth trastuzumab T785-ISAC, yn gyson â meintioli protein a berfformiwyd wrth fesur secretion cytocin a chemocin o fewn y tiwmor 24 awr ar ôl ei roi (Ffigur 4Ha Ffigur Atodol 13).Mae'r canfyddiadau hyn, sy'n cyd-fynd â'r data effeithiolrwydd in vitro ac in vivo, yn dangos bod ymateb cadarn wedi'i gyfryngu gan TLR- a Fc R-median yn cael ei ysgogi gan yr ISAC.

Defnyddiwyd cytometreg llif a IHC i asesu a arweiniodd cynnydd mewn actifadu T785-ISAC a mynegiant cemocin yn y pen draw at recriwtio celloedd effeithyddion imiwn.Cafodd ymdreiddiadau imiwnedd myeloid eu proffilio gan sytometreg llif 24 awr a 7 diwrnod ar ôl rhoi dos sengl o trastuzumab T785-ISAC neu trastuzumab a'u cymharu â rheolyddion heb eu trin.Datgelwyd dadansoddiad o diwmorau 24 awr ar ôl y driniaethymdreiddiad CD11b ynghyd â Ly6C plws monocytes a CD11b ynghyd â Ly6G a granulocytes yn y tiwmorau a gafodd eu trin â trastuzumab neu trastuzumab T785-ISAC o gymharu â'r rheolyddion heb eu trin (Ffigur 4I).Saith diwrnod ar ôl y driniaeth, cynyddwyd CD11b a CD11c ynghyd â F4/80 ynghyd â APCs myeloid positif yn sylweddol yn y grŵp trastuzumab T{5}}ISAC a gafodd ei drin o'i gymharu âtrastuzumab neu reolaethau heb eu trin (Ffigur 4I) 45,46.Gall y cynnydd hwn mewn APCs myeloid fodpriodoli i'r cynnydd sylweddol mewn cynhyrchu cemocinau sy'n gysylltiedig â myeloid yn dilyn triniaeth trastuzumab T785-ISAC.Er na fu cynnydd sylweddol yn amlder APCs myeloid ar y pwynt amser 24-awr, gweithredwyd celloedd o'r ffenoteip hwn ar ôl triniaeth trastuzumab T{1}}ISAC, fel y'i mesurwyd gan uwchreoleiddiad CD40 ar wyneb y gell. , o'i gymharu â'r un boblogaeth o trastuzumab neu reolaethau heb eu trin (Ffigur 4I).Mae'r canfyddiad hwn, ynghyd â data NanoString, yn dangos ymhellach allu trastuzumab T{0}ISAC i ymgysylltu ac actifadu celloedd myeloid yn y micro-amgylchedd tiwmor.O ystyried positifrwydd CD11b yr APCs myeloid a welwyd wythnos yn dilyn triniaeth, gall ymdreiddiad cynnar monocytau fod yn rhagflaenwyr i'r boblogaeth APCs myeloid sy'n aeddfedu yn y tiwmorau a drinnir gan ISAC ond nid mewn tiwmorau a drinnir gan trastuzumab.Fodd bynnag, mae'n aros i gael ei benderfynu sut y bu i'r digwyddiadau procsimol pro-llidiol fesur 24 awr yn dilyn ysgogiad ISAC gan NanoString ac MSD ddylanwadu yn y pen draw ar ddigwyddiadau distal megis aeddfedu celloedd myeloid yn y micro-amgylchedd tiwmor trawsnewidiol yn ddiweddarach 6-y pwynt amser dydd. , ac yn y pen draw, dylanwadu ar atchweliad a chlirio tiwmor.
Yn olaf, perfformiwyd IHC i asesu presenoldeb a lleoliad poblogaethau celloedd imiwnedd allweddol yn y tiwmor yn dilyn triniaeth gyda'r trastuzumab T{0}}ISAC o gymharu â'i reolaethau.Yn gyson â cytometreg llif diwrnod 7, F4/80 yn mynegi celloedd i mewncodwyd y tiwmor a'r rhanbarth peritumoral ar ddiwrnod 9 ar ôl un driniaeth â trastuzumab T785-ISAC (Ffigur 4J).At hynny, arweiniodd triniaeth ISAC wedi'i thargedu at gynnydd dramatig mewn CD11c ynghyd â chelloedd yn y rhanbarth peritumoral na welwyd ar ôl triniaeth gwrthgyrff rHER2 neu driniaeth ag isoteip neu isoteip-ISAC (Ffigur 4J).Roedd y drychiad mewn celloedd CD11c plws gan cytometreg llif a IHC hefyd i'w weld mewn data NanoString, lle'r oedd mynegiant mRNA o ITGAX wedi'i godi'n sylweddol ar ddiwrnodau 6 a 9 yn dilyn gweinyddiaeth trastuzumab T785-ISAC (Ffigur Atodol 14).

Ffigur 5: T785-Mae ISACs yn cael effeithiau gwrth-diwmor cadarn ym model tiwmor syngenig MMC. (ah) Mewnblannwyd llygod FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) â llinell gell tiwmor MMC. (a) Cafodd llygod benywaidd eu haposod pan gyrhaeddodd cyfaint y tiwmor tua 500 mm3. Yna cafodd llygod eu trin trwy chwistrelliad mewnperitoneol gyda 5 mg/kg q5d x 2 o wrthgorff gwrth-lygod mawr HER2, llygoden gwrth-lygod mawr HER2 T785-ISAC, neu isotype T785-ISAC (TA99) (n =4-7 llygod y fraich). (b, c) Cafodd llygod gwrywaidd eu haposod pan gyrhaeddodd cyfaint y tiwmor tua 500 mm3 a chafodd ei drin ymlaen llaw gan ddechrau un diwrnod cyn y dyddiad triniaeth gychwynnol gyda liposomau wedi'u llwytho clodronate neu reoli ar gyfer disbyddiad phagocyte (6 chylch, trwy Ddiwrnod 15) neu gwrth -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 diwrnod ar ôl eu triniaeth ddiwethaf eu herio gyda llinell celloedd tiwmor MMC. Roedd llygod naïf tiwmor yn gweithredu fel rheolyddion mewnblannu (n{1}} llygod fesul grŵp). (ad) Data yn cynrychioli o leiaf 2 arbrawf. Cafodd llygod eu lladd yn drugarog unwaith yn diwmoraucyrraedd 2,000 mm3. Dangosir data ar gyfer y grwpiau hynny lle nad oedd unrhyw diwmorau wedi cyrraedd2,000 mm3. (ei) Cafodd carfannau o lygod eu haposod pan gyrhaeddodd cyfeintiau tiwmor tiwmor MMC tua 500 mm3 a'u trin â 5 mg/kg ISAC neu wrthgyrff rheoli wedi'u dosio ar ddiwrnod 0 a diwrnod 5. Proseswyd tiwmorau ar gyfer mesur cytocinau gan MSD , dadansoddiad cytometreg llif, meintioli mRNA NanoString, neu wedi'i osod gan fformalin a pharaffin wedi'i fewnosod ar gyferimmunohistochemistry ar yr amseroedd a ddangosir. (e) Mae plotiau llosgfynydd yn dangos newid plyg log2 mynegiant genynnau mewn tiwmorau rheoli isoteip wedi'u trin yn erbyn NanoString wedi'i fesur gan NanoString ar 24 awr (n=5 llygod fesul grŵp). Dangosir newidiadau gyda gwerth-p wedi'i addasu o < 0.05="" mewn="" coch.="" (f)="" sgoriau="" llofnod="" genynnau="" wedi'u="" mesur="" yn="" ôl="" sgôr="" llwybr="" dadansoddi="" uwch="" nsolver="" ar="" gyfer="" tiwmorau="" wedi'u="" dadansoddi="" 24="" awr="" ar="" ôl="" triniaeth="" (n{7}}="" llygod="" fesul="" grŵp).="" (g,="" h)="" dadansoddiad="" cytometreg="" llif="" o="" gyfansoddiad="" cellog="" tiwmor="" a="" chyflwr="" actifadu="" 24="" awr="" a="" 6="" diwrnod="" ar="" ôl="" dechrau'r="" driniaeth="" (n="4" llygod="" fesul="" grŵp).="" mae'r="" data'n="" cynrychioli="" o="" leiaf="" 2="" arbrawf.="" (dw="">Delweddau cynrychioliadol yn ogystal â meintioli F4/80, CD11c, a CD8 IHC o diwmorau a gynaeafwyd 6 diwrnod ar ôl pob triniaeth a nodir. Mae bariau graddfa yn 50 μm. (ai) Adroddir ar ddata fel cymedr a SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Mae T785-ISACs a dargedir tiwmor yn ennyn atchweliad tiwmor yn y model tiwmor MMC syngeneig
Er mwyn asesu gallu ISACs i gyfryngu effeithiolrwydd gwrth-tiwmor ym mhresenoldeb celloedd B, T, ac NK, defnyddiwyd llinell gell llygod mawr syngeneig HER2 (rHER2) yn mynegi carcinoma mamari llygoden (MMC) a oedd yn deillio o famari digymell. carcinoma mewn rHER2- yn mynegi llygod FVB.Er mwyn lleihau imiwnogenedd traws-rywogaeth sy'n gysylltiedig â mynegiant rHER2 mewn MMC, mae llygod trawsgenig sy'n mynegi llygoden fawr Her2 yn fewndarddol dan reolaetho'r hyrwyddwr MMTV yn cael eu defnyddio fel y gwesteiwr (Ffigur Atodol 15) 47. Gan ddefnyddio presenoldeb system imiwnedd gyfan gwbl, ein nod oedd asesu gallu'r ISAC i frwydro yn erbyn tiwmorau â baich tiwmor mawr o 500 mm3, gan fod tiwmorau mwy yn gyffredinol anos ei drin mewn modelau cyn-glinigol 48. Roedd gweinyddiaeth systemig o'r holl driniaethau, gan gynnwys yr rHER2 T785-ISAC, yn cael ei oddef yn dda, gydag effaith fach iawn ar bwysau'r corff (Ffigur Atodol 16A). Fodd bynnag, dim ond yr rHER2 T785-ISAC oedd yn gallu gwella llygod â thiwmorau mawr, sefydledig (Ffigur 5A). Fel y gwelwyd yn y model xenograft, dangosodd astudiaethau disbyddu celloedd bod gweithgarwch gwrth-tiwmor sylweddol yn cael ei golli pan oedd celloedd phagocytig yn disbyddu â liposomau wedi'u llwytho â chlodronate (Ffigur 5B). Er nad oes disgwyl i'r ISAC weithredu'n uniongyrchol ar gelloedd T, collodd llygod a gafodd driniaeth ymlaen llaw â gwrthgorff sy'n disbyddu CD y gallu i glirio tiwmorau ar ôl dwy weinyddiaeth o rHER2 T785-ISAC (Ffigur 5C). Mae hyn yn awgrymu y gall ISACs wedi'u targedu tiwmor weithredu'n anuniongyrchol trwy gelloedd T, ar ôl cyflwyno antigenau sy'n gysylltiedig â thiwmor. Yn gyson â phresenoldeb cof imiwnolegol, llygodtiwmorau MMC wedi'u halltu yn dilyn triniaeth rHER2 T785-Cafodd ISAC eu diogelu rhag ail-herio tiwmor (Ffigur 5D).

Er mwyn ymchwilio ymhellach i'r mecanwaith sy'n sail i effeithiolrwydd ISAC yn y model syngeneig, gwnaethom ymchwilio nesaf i'r newidiadau cellog, trawsgrifiadol a cytocin ym micro-amgylchedd tiwmor yn dilyn dosio ISAC. Cafodd dwy garfan o lygod â thiwmorau MMC mawr eu trin â rHER2 T785-ISAC neu reolaethau. Cynaeafwyd tiwmorau o'r garfan gyntaf 24 awr ar ôl dosio (Diwrnod 1) pan oedd yr holl diwmorau o faint tebyg (Ffigur Atodol 16B). Rhoddwyd ail ddos ​​i'r garfan arall 5 diwrnod ar ôl y cyntaf, yna'i gynaeafu 24 awr yn ddiweddarach (Diwrnod 6), ac ar yr adeg honno roedd tiwmorau yn yr holl grwpiau triniaeth wedi tyfu'n fesuradwy ac eithrio'r rhai a gafodd eu trin â T785-ISAC (Ffigur Atodol 16B). ). Dadansoddwyd tiwmorau gan IHC, mynegiant mRNA, a secretiad cytocin mewn lysates protein. Yn cefnogi ymhellach ein harsylwadau yn y modelau xenograft bod angen targedu tiwmor ar gyfer gweithgaredd ISAC, dangosodd dadansoddiad mRNA o diwmorau 24 awr ar ôl triniaeth rHER2 T785-ISAC upregulation dramatig o 34.1 y cant o'r genynnau yn imiwnedd pan-ganser llygoden NanoString panel proffilio o'i gymharu â thiwmorau sy'n cael eu trin ag isoteip. Dim ond ychydig o effaith a gafodd yr gwrthgorff gwrth-rHER2 yn unig ar fynegiant genynnau (3.5 y cant o'r genynnau a ddadansoddwyd) ond ni effeithiodd yr isoteip T785-ISAC heb ei dargedu ar fynegiant genynnau (Ffigur 5E). Fel y gwelwyd ym model xenograft HCC1954, cafodd genynnau sy'n gysylltiedig â signalau cyfryngol TLR ac actifadu eu huwchreoleiddio'n sylweddol gan yr rHER2 T785-ISAC sy'n targedu tiwmor, sy'n arwydd o ymateb cadarn wedi'i gyfryngu gan TLR (Ffigur 5E). Datgelodd dadansoddiad llwybr mynegiant genynnau unwaith eto ddadreoleiddio sylweddol o lofnodion genynnau allweddol sy'n gysylltiedig ag imiwn, gan gynnwys llofnodion ar gyfer dadansoddi llwybr mynegiant genynnau, datgelodd uwch-reoleiddio sylweddol o lofnodion genynnau allweddol sy'n gysylltiedig ag imiwn yn dilyn triniaeth rHER2 T{34}}ISAC, gan gynnwys y rhai sy'n gysylltiedig â chemocinau a cytocinau (Ffigur 5F). Perfformiwyd meintioli protein ar yr un tiwmorau ag a ddadansoddwyd gan NanoString, ac yn gyson â chanfyddiadau'r llofnod genynnau, mesurwyd lefelau sylweddol uwch o cytocinau pro-llidiol a chemocinau 24 awr ar ôl triniaeth rHER2 T{785-ISAC (Ffigur Atodol 17). ). Roedd sgoriau llofnodion genynnau hefyd yn sylweddol uwch ar gyfer Prosesu a Chyflwyno Antigen, Swyddogaeth Cell Dendritig, a Swyddogaeth Macrophage, gan gefnogi ymhellach ymateb cyfryngol anFc-Fc R a phagocytosis wedi'i yrru 24 awr ar ôl rHER2 T785-ISACtriniaeth (Ffigur 5F a Ffigur Atodol 18). Yn ogystal â sgorau llofnod genynnau sylweddol uwch sy'n gysylltiedig ag ymateb cadarn wedi'i gyfryngu gan TLR- a Fc R, cynyddwyd sgôr llofnod genynnau ar gyfer Swyddogaethau cell T yn sylweddol hefyd o fewn 24 awr i driniaeth rHER2 T785-ISAC, gan gefnogi ymhellach y canfod bod angen celloedd T ar gyfer effeithiolrwydd cyfryngol ISAC (Ffigur 5F a Ffigur Atodol 18).

Er mwyn nodweddu'r celloedd imiwnedd a allai gyfrannu at y cynnydd cynnar mewn cynhyrchu cytocin a chemocin proinflammatory, dadansoddwyd tiwmorau gan cytometreg llif 24 awr ar ôl y dos cyntaf o rHER2 T785-ISAC neu'r rheolyddion, a 6 diwrnod ar ôl cychwyn y cyffur. triniaeth, 24 awr ar ôl ail ddos. Datgelodd dadansoddiad o diwmorau ar Ddiwrnod 1 ymdreiddiad o CD11b a Ly6C ynghyd â monocytau yn y tiwmorau a gafodd eu trin â rHER2 T785-ISAC, a CD11b ynghyd â Ly6G plws granulocytes yn y tiwmorau a gafodd eu trin â rHER2 mAb neu rHER2 T785-ISAC , ond nid yr isoteip ISAC neu reolaethau gwrthgorff isotype (Ffigur 5G). Cynyddwyd lefelau monocytau hyd yn oed ymhellach mewn tiwmorau a gafodd eu trin gan rHER2 T785-ISAC ar ôl 6 diwrnod. Yn debyg i'r hyn a welsom ym model xenograft HCC1954, codwyd APCs myeloid (CD11b a CD11c ynghyd â F4/80 plws ) yn sylweddol ar ddiwrnod 6 yn dilyn triniaeth rHER2 T785-ISAC o gymharu â'r rheolaethau (Ffigur 5G a Ffigur Atodol 19). ). Ymhellach, canfuwyd bod APCs myeloid yn cael eu actifadu'n benodol yn y grŵp rHER2 T785- a gafodd ei drin gan ISAC ar y ddau bwynt amser, fel y'i mesurwyd gan upregulation CD40 ar wyneb y gell (Ffigur 5H). Yn bwysig, ni fesurwyd cynnydd mewn APCs myeloid tiwmor yn dilyn disbyddiad ffagosyt gan ddefnyddio liposomau wedi'u llwytho â clodronate (Ffigur Atodol 20). Yn olaf, perfformiwyd IHC i asesu presenoldeb a lleoliad poblogaethau celloedd imiwnedd allweddol yn y model MMC yn dilyn triniaeth gyda'r rHER2 T{785-ISAC. Fel y gwelwyd ym model xenograft HCC1954, arweiniodd triniaeth gyda’r rHER2 T785-ISAC at gynnydd dramatig mewn celloedd CD11c plus a F4/80 plus yn y rhanbarth peritumoral na welwyd ar ôl triniaeth gwrthgyrff rHER2 neu driniaeth ag isoteip. neu isoteip T785-ISAC (Ffigur 5I). Yn gyson â mynegiant cynnar cemocinau celloedd T a'r sgôr llofnod genynnau uwch ar gyfer Swyddogaeth Celloedd T, gwelodd IHC ymdreiddiad sylweddol o gelloedd CD8 a mwy o fewn tiwmorau llygod a gafodd eu trin gan rHER2 T{785-ISAC ar ddiwrnod 6, tra Arhosodd staenio CD8 mewn llygod a gafodd eu trin â rheolaethau gwrthgorff neu isoteip gwrth-rHER2 yn isel (Ffigur 5I). Mae cynnydd mewn staenio CD8 ynghyd â IHC, ynghyd â mynegiant genynnau mwy o genynnau sy'n gysylltiedig â swyddogaeth celloedd T a chlirio tiwmor dibynnol CD, yn cefnogi potensial y T785-ISAC i droi tiwmor oer yn boeth.CL785- {58}Mae ISACs yn ennyn atchweliad tiwmor yn HER2-model tiwmor xenograft mynegi canolig Er mwyn dangos bod ISACs yn llwyfan cadarn ar draws llwythi tâl lluosog sy'n ysgogi imiwnedd, rydym wedi datblygu ISAC gan ddefnyddio gweithydd TLR7 adnabyddus, CL264 gyda DAR yn debyg i'r trastuzumab T785-ISAC (Ffigur 6A a Ffigur 21 Atodol). Aseswyd gallu ISACs trastuzumab a gynhyrchwyd gyda CL264 neu T785 i gyfryngu actifadu myeloid o fewn tiwmor ym model xenograft HCC1954 24 awr ar ôl un weinyddiaeth o trastuzumab, trastuzumab CL{72}}ISAC neu trastuzumab T785-ISAC . Arsylwyd gweithrediad myeloid gwell gyda trastuzumab CL264-ISAC fel y dangosir gan fynegiant CD40 cynyddol ar CD11b sy'n ymdreiddio tiwmor ynghyd â CD11c plws F4/80 ynghyd â APCs myeloid o'i gymharu â trastuzumab neu trastuzumab T785-ISAC (Ffigur 6B ).Er mwyn pennu a yw cynhwysedd actifadu myeloid gwell y CL264-ISAC yn trosi i fwy o weithgarwch gwrth-diwmor in vivo, cymharwyd y trastuzumab CL264-ISAC â'rT{0}}ISAC yn y modelau tiwmor HER2High HCC1954 a HER2Med JIMT-1. Er bod y ddauCyfryngodd ISACs trastuzumab atchweliad tiwmor cyflawn ym model HCC1954 HER2High, dangosodd CL264-ISAC fwy o weithgarwch gwrth-diwmor yn y model JIMT{4}} HER2Med gan awgrymu y gallai nerth ISAC a'r gallu i dargedu tiwmorau dwysedd antigen is. bod yn gysylltiedig (Ffigur 6C–D).

Roedd y ddau ISAC yn cael eu goddef yn dda, ond gwelsom golli pwysau corff dros dro o 5-10 y cant mewn anifeiliaid a gafodd eu trin â naill ai'r trastuzumab CL264-ISAC neu rituximab CL264-ISAC, gyda phwysau'r corff yn gwella i neu'n uwch na'r llinell sylfaen gan y trydydd dos (Ffigur Atodol 16A). Mesurwyd secretiad cytocin systemig yn dilyn triniaeth gyda T785-ISAC neu CL264-ISAC. Mesurwyd lefelau isel o TNF yn serwm anifeiliaid bedair awr ar ôl rhoi’r T785-ISAC, tra bod yr isoteip CL264-ISACs wedi’u targedu yn ennyn lefelau uwch o secretion TNF yn systematig (Ffigur Atodol 11) . Mae'n annhebygol bod yr effeithiau hyn rhwng ISACs T785 a CL264 oherwydd effaith uniongyrchol yr ISAC ar dwf celloedd tiwmor, gan nad oedd yr ISAC yn atal amlhau celloedd canser in vitro (Ffigur Atodol 9).

CL264-Mae ISACs yn ennyn cliriad tiwmor a chof imiwnolegol mewn modelau tiwmor syngeneig O ystyried y nerth a'r effeithiolrwydd cynyddol a welwyd gyda'r CL264-ISAC mewn modelau senograft tiwmor dynol gyda dwysedd antigen HER2 amrywiol, fe wnaethom nodweddu gweithgaredd CL nesaf. 264-ISACs mewn modelau tiwmorau syngeneig. Yn debyg i'r T785-ISAC yn y model MMC, arweiniodd y CL264-ISAC at atchweliad tiwmor a chlirio mewn modd dibynnol ar gelloedd T, gan arwain at gof imiwnolegol parhaol (Ffigur Atodol 22A). Er mwyn asesu effeithiolrwydd ISAC mewn model tiwmor syngeneig gyda llai o fynegiant antigen, rydym wedi datblygu llinell gell CT26 sy'n mynegi llygoden fawr HER2 (CT26-rHER2) yn sefydlog. Yn bwysig, nid yw tua 8.5 y cant o'r celloedd CT26 yn mynegi rHER2 ar ôl mewnblannu tiwmor (Ffigur 6E). Dangosodd llygod Wildtype Balb/c a gafodd eu trin â’r rHER2 CL264-ISAC imiwnedd gwrth-tiwmor sylweddol gan fod 75 y cant (6 allan o 8) o’r llygod wedi clirio eu tiwmorau ac wedi aros yn rhydd o diwmor trwy gydol yr arbrawf, ond nid oedd gan yr un o'r llygod a gafodd eu trin â'r gwrthgorff gwrth-rHER2 atchweliad llwyr (Ffigur 6F). Gwelwyd colled pwysau dros dro o tua 10 y cant o bwysau'r corff yn dilyn triniaeth rHER2 CL{264-ISAC, gyda phwysau'r corff yn gwella wyth diwrnod ar ôl cychwyn yr astudiaeth (Ffigur Atodol 22B). Fe wnaethom asesu a oedd rHER2 CL{33}}ISAC yn cyfryngu cof imiwnolegol yn erbyn tiwmor heb fynegiant o'r antigen wedi'i dargedu, rHER2, trwy herio llygod a gafodd eu halltu o diwmorau CT26-rHER2 yn flaenorol gyda llinell gell CT26 rhieni nad oedd yn cynnwys rHER2 mynegiant. Roedd llygod a gafodd eu halltu o diwmorau CT26-rHER2 gydag ISAC rHER2 yn cael eu hamddiffyn yn llawn rhag her gyda llinell gell CT26 y rhieni (Ffigur 6I). Roedd disbyddu celloedd CD4 a CD8 T cyn yr ailherio tiwmor yn dangos bod angen celloedd T i'w hamddiffyn. Yn olaf, gwnaethom brofi a oedd y cof imiwnolegol a ddatblygwyd mewn llygod a gafodd eu halltu o'r blaen gyda'r ISAC yn benodol i antigenau sy'n gysylltiedig â thiwmor y tiwmor cynradd a gafodd ei drin. Yn ystod ail-herio tiwmor CT26 y rhieni, cafodd llygod eu herio ar yr un pryd gyda thiwmor gwahanol, 4T1, wedi'i fewnblannu yn yr ystlys cyfochrog. Mae'r data yn dangos bod datblygiad cof imiwnolegol oeddsy'n benodol i antigenau sy'n gysylltiedig â thiwmor CT26 sy'n wahanol i rHER2, gan na chafodd twf tiwmor tiwmorau 4T1 ei effeithio (Ffigur 6G).