Gweithgarwch imiwn-ysgogol Polysacaridau y gellir eu tynnu o ddŵr o Cistanche Deserticola Fel Cynorthwyydd Planhigion mewn Vitro Ac yn Vivo

Rhagymadrodd

Mae brechlynnau yn bwysig ar gyfer rheoli neu atal clefydau. Mae brechlynnau sydd newydd eu cynhyrchu ac sy'n datblygu ar hyn o bryd yn antigenau ailgyfunol pur iawn gyda mwy o ddiogelwch, ond ni all antigenau wedi'u puro ysgogi ymateb imiwnedd boddhaol o'u cymharu â pharatoadau pathogen gwanedig neu anweithredol. Gyda chymorth cynorthwywyr, gall brechlynnau ysgogi ymatebion imiwn parhaus [1,2]. Mae cynorthwywyr pwerus newydd yn bryderus iawn am y ddau frechlyndatblygiad ac iechyd dynol. Hyd yn hyn, mae cynorthwywyr amrywiol wedi'u nodi a'u hastudio'n helaeth. Mae'r cymhorthion hyn yn rhoi nifer o fanteision i frechlynnau, gan gynnwys lleihau'r swm gofynnol o antigenau, lleihau nifer yr imiwneiddiadau sydd eu hangen ar gyfer ymatebion imiwn arferol, a chymell ymatebion imiwn cyflymach, ehangach a chryfach.3–5]. Er bod llawer o gynorthwywyr cryf wedi'u datblygu, megis lipopolysaccharide (LPS) a chynorthwyydd cyflawn Freund (FCA), nid ydynt yn cael eu cymhwyso'n eang oherwydd eu gwenwyndra. Felly, dim ond ychydig o gynorthwywyr, megis Alum, sydd wedi'u trwyddedu ar gyfer defnydd clinigol [6]. Yn gyffredinol, dylid datblygu cynorthwywyr mwy effeithiol a mwy diogel i hyrwyddo brechlynnau proffylactig a therapiwtig gwell yn erbyn clefydau heintus a diheintus.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA Imiwnedd PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mae diogelwch yn ffactor ystyriaeth bwysig yn natblygiad cynorthwyol. Mae cyfansoddion llysieuol Tsieineaidd yn cynnwys maetholion a chyfansoddion gweithredol pwysig, megis cyfansoddion ffenolig a polysacaridau, a all weithredu fel imiwnogyddion pwerus [7-9]. Yn eu plith, mae polysacaridau o berlysiau Tsieineaidd traddodiadol wedi cael eu harchwilio'n eang oherwydd eu gweithgareddau imiwn-ysgogol a gwenwyndra isel. Er enghraifft, mae inulin yn gynorthwyydd imiwn heb wenwyndra cymhorthion eraill fel FCA. Mae cymhorthydd inulin delta AdvaxTM hefyd wedi gwella imiwnogenigrwydd y brechlyn yn llwyddiannus [10,11]. Mae Astragalus, a elwir hefyd yn Huangqi yn Tsieineaidd a Radix Astragali yn Lladin, wedi'i ddosbarthu'n eang ledled y byd. Polysacarid yw un o'i brif gynhwysion gweithredol sy'n gyfrifol am y gweithgaredd imiwnofodwlaidd. Mae astudiaethau arbrofol wedi dangos bod gan Astragalus polysacarid effeithiau imiwnofodwlaidd cryf in vitro ac in vivo [12, 13]. Roedd polysacaridau barbarum Lycium fel cynorthwyydd brechlyn hefyd yn dangos gwelliannau da ac effeithiau ysgogol [14, 15]. Awgrymodd yr astudiaethau hyn fod polysacaridau llysieuol Tsieineaidd yn ymgeiswyr delfrydol ar gyfer datblygiad cynorthwyol.

Cistanche deserticolaMae YC Ma (CD, "Rou Cong Rong" yn Tsieinëeg) yn berlysieuyn Tsieineaidd traddodiadol gwerthfawr ac yn cael ei ystyried yn gyffredin fel "Ginseng yr anialwch" oherwydd ei effeithiau tonic uwchraddol. Fe'i dosberthir mewn rhanbarthau cras neu led-cras yn Xinjiang. Yn Tsieina, mae ei goesyn cigog sych wedi'i ddefnyddio fel bwyd tonig ers cannoedd o flynyddoedd [16, 17]. Ers blynyddoedd lawer, mae CD wedi'i ferwi wedi'i ddefnyddio fel tonic bwyd i drin nam a achosir gan ormodedd, sy'n awgrymu ei fod yn ddiogel ar gyfer gweinyddiaeth lafar. Mae'r planhigyn hwn yn cael ei ystyried yn eang oherwydd ei swyddogaethau meddyginiaethol eang. Dangosodd astudiaethau ffytocemegol a ffarmacolegol diweddar mai polysacaridau oedd y prif gydrannau sy'n weithredol yn fiolegol a bod ganddynt effeithiau biolegol amrywiol, gan gynnwysgweithgaredd immunomodulatory, effaith gwrthocsidiol, ac effeithiau gwrthlidiol[18–21]. Fodd bynnag, anaml yr adroddwyd am weithgarwch gwella imiwnedd polysacaridau y gellir eu tynnu dŵr o C. deserticola yn Xinjiang.

Mae'n hysbys bod DCs yn gelloedd cyflwyno antigen pwysig (APCs) sy'n darparu'r signalau sydd eu hangen ar gyfer cychwyn ymatebion imiwn a modiwleiddio celloedd cynhenid ​​​​ac addasol. Gall rhai cynorthwyol sy'n gwella'r defnydd o antigenau gan DCs gynyddu moleciwlau cyd-ysgogol neu MHC agwella imiwnedd. Pan fydd DCs yn aeddfedu, cynhyrchir mwy o foleciwlau cyd-ysgogol a cytocinau ac mae DCs yn dangos ffenoteipiau gwahanol [22, 23].

Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom ymelwa i ddechrau a allai WPCD hyrwyddo actifadu DCs trwy lwybr signalau TLR4 in vivo. Gan mai DCs oedd y cysylltiad rhwng ymatebion imiwnedd cynhenid ​​​​ac addasol, fe wnaethom ddamcaniaethu y byddai actifadu DCs a ysgogwyd gan WPCD yn dylanwadu ar ganlyniad imiwnedd addasol. Gwnaethom archwilio'r ymateb imiwn penodol i ovalbumin (OVA) mewn llygod a gafodd eu trin â WPCD, gan gynnwys haenau o is-ddosbarthiad IgG, IgG1, ac IgG2a, amlhau T- a B, a chynhyrchu cytocin. Fe wnaethom ymchwilio i weld a fyddai triniaeth WPCD yn cynyddu gweithgaredd celloedd DCs a Treg yn ddueg y llygod hyn. Profodd ein canfyddiadau weithgaredd imiwnofodwlaidd posibl polysacaridau naturiol o C. deserticola ac ehangodd ei gwmpas cymhwyso.

Defnyddiau a dulliau

Anifeiliaid

Prynwyd C57BL/6, BALB/c, wyth i ddeg wythnos oed, neu lygod benywaidd ICR o Ysbyty Cyntaf Prifysgol Feddygol Xinjiang (Urimuqi, Xinjiang, Tsieina). Cafodd y llygod eu cartrefu o dan amodau heb bathogen yn unol â chanllawiau Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid (ACUC) Prifysgol Xinjiang ar gyfer Iechyd a Lles Anifeiliaid. Roedd y gweithdrefnau arbrofi anifeiliaid wedi'u cymeradwyo gan AUCC Prifysgol Xinjiang.

Echdynnu echdynion dyfrllyd

Mae C. deserticola yn blanhigyn yn nhalaith Xinjiang yn Tsieina. Cafwyd y polysacarid crai trwy echdynnu dŵr a dyddodiad ethanol. Yn gryno, cafodd 100 go C. deserticola sych ei falu'n bowdr ac yna ei hidlo. Cafodd y powdr ei adlifo ag ether petrolewm ar dymheredd yr ystafell dro ar ôl tro ac yna ei adlifo gydag ethanol anhydrus am 1 h i gael gwared ar gynhwysion lliw a lipidau. Echdynnwyd y gweddillion â dŵr berwedig dair gwaith a chafodd y darnau eu cronni gyda'i gilydd, eu centrifugio ar 4000 rpm am 10 munud, a'u hadlif ar 60˚C am 4 h. Ychwanegwyd pedair gwaith cyfaint o 95% ethanol i'r hydoddiant i waddodi polysacaridau crai. Cafodd y polysacaridau crai eu hail-hydoddi mewn dŵr distyll a'u trin ag adweithydd Sevage i gael gwared ar broteinau. Cafodd echdynion eu toddi mewn PBS a'u sterileiddio trwy hidlydd 0.22-μm. Yn olaf, cyfanswm cynnwys siwgr WPCD oedd 59.58%, fel y nodir gan y dadansoddiad ffenol-asid sylffwrig [24].

Cynhyrchu DCs

Cynhyrchwyd BM-DCs yn ôl y dull a ddisgrifiwyd yn flaenorol gydag addasiadau bach [25]. Cafodd DCs mêr esgyrn o C57BL/6 llygod eu fflysio allan gyda RPMI-1640 cyfrwng cyflawn (Gibco) wedi'i ategu â serwm llo ffetws o 10% (Hyclone). Ail-ataliwyd y celloedd a gasglwyd mewn cyfrwng RPMI-1640 gyda 50 μM -mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO) a 20 ng/mL murine GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) a'u deor ar 37˚ C mewn 5% CO2 atmosffer. Disodlwyd hanner y cyfrwng diwylliant gan gyfrwng ffres yn cynnwys GM-CSF bob 1-2 ddiwrnod. Casglwyd celloedd ar Ddiwrnod 6, eu trin â dosau gwahanol o WPCD, a LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) am 24 awr, ac yna eu hasesu gan cytometreg llif.

Canfod aeddfediad DCs ac actifadu celloedd T in vitro

Gwerthuswyd effaith aeddfedu in vitro WPCD ar BM-DCs ar sail canlyniadau dadansoddiadau ffenotypig gan FACs. Ar Ddiwrnod 7, cafodd BM-DCs o C57BL/6 eu hysgogi ym mhresenoldeb GM-CSF ac yna eu trin â chrynodiadau gwahanol o WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0.1, a 0.2 mg/mL) am 12 awr mewn triphlyg. Defnyddiwyd LPS (100 ng/mL) fel rheolaeth gadarnhaol. Ar ôl i BM-DCs gael eu golchi mewn PBS a defnyddiwyd Fc Block (BD Biosciences, CA) i atal rhwymo gwrthgyrff amhenodol, cafodd celloedd eu staenio yn PBS trwy ddefnyddio'r CD40, CD40, CD11c, CD cyfunedig FITC-, PE-, neu APC priodol{ {23}}, gwrthgyrff CD80, a MHC-II (BD) am 20 munud ar 37˚C. Canfuwyd y celloedd lliw gan FACs Calibur (BD). Cynhaliwyd y dadansoddiad data gyda meddalwedd FlowJo (Tree Star).

Yn yr arbrawf aeddfedu DCs in vitro, casglwyd supernatants diwylliant celloedd hefyd i ddadansoddi IL-12 a TNF- trwy ddefnyddio citiau assay cytocine (Boster, Wuhan, China) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mesurwyd yr amsugnedd ar 450 nm gyda darllenydd plât ELISA (Bio-Rad, UDA). Cyfrifwyd meintiau cytocin yn y samplau gyda chromliniau safonol o cytocinau ailgyfunol yn ôl y dull llinol atchweliad.

Er mwyn profi eu gweithgaredd ysgogol allogenig, perfformiwyd yr arbrawf o adwaith lymffocyt cymysg (MLR) yn ôl y dull blaenorol [26] gan assay MTT (Sigma, St Louis, MO). Yn fyr, cafodd BM-DCs o lygod C57BL/6 a ddefnyddiwyd fel celloedd symbylydd eu hadennill ar Ddiwrnod 7 yn RPMI-1640 canolig a GM-CSF a'u trin â chrynodiadau amrywiol o WPCD am 12 h ar 37˚C. Cafodd celloedd eu golchi a'u hail-hongian mewn cyfrwng RPMI-1640 cyn eu platio i mewn i blât y ffynnon. Cafodd celloedd ymatebydd ataliad Singleplenocyte eu hynysu oddi wrth lygod BALB/c. Cymysgwyd BM-DCs â splenocytes yn ôl y cymarebau o 1:5 ac 1:10. Cafodd celloedd eu meithrin ar 37˚C mewn awyrgylch 5% CO2 am dri diwrnod mewn triphlyg. Defnyddiwyd triniaeth LPS fel rheolaeth gadarnhaol. Ychwanegwyd diwylliannau wedyn gydag 20 μL o MTT ar gyfer y 4-h amaethu olaf. Mesurwyd yr amsugnedd ar y donfedd mesur (490 nm) a'r donfedd cyfeirio (650 nm) ar gyfer dadansoddiad amlhau celloedd T. Mesurwyd pob sampl yn erbyn rheolaeth gefndir.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA EICH SYSTEM Imiwnedd PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Triniaeth gan atalydd TLR4 in vitro

Cafodd BM-DCs eu trin ymlaen llaw gyda 5 μM TAK-242 (atalydd TLR4, Medchemexpress Inc. USA) am 1 awr ac yna eu cyd-ddiwyllio â chrynodiadau amrywiol o WPCD (100 a 200 ug/ mL) am 12 h. ym mhresenoldeb neu absenoldeb Golgi Stop yn driphlyg. Yn y rheolaeth gadarnhaol, ychwanegwyd LPS. Canfuwyd celloedd a supernatants gan FACs ar gyfer dadansoddi marcwyr arwyneb CD86 a CD40 a chan ELISA ar gyfer dadansoddi cytocinau TNF-a ac IL{-12, yn y drefn honno.

Protocol imiwneiddio

Prawf gwenwyndra acíwt

Yn y prawf gwenwyndra acíwt geneuol yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd 40 o lygod ICR oedolion iach. Roedd llygod ICR yn cael eu cyflymu (bwyd ond nid dŵr dros nos) cyn eu dosio. Rhoddwyd WPCD ar lafar yn y drefn honno mewn dosau o 0, 50, 500, neu 5000 mg/kg pwysau corff i bob anifail am 7 diwrnod. Roedd llygod wedi'u trin â hallt a llygod wedi'u trin gan alum wedi'u cynnwys yn y grŵp rheoli. Gwelwyd yr anifeiliaid yn ddyddiol am 14 diwrnod yn olynol. Arsylwyd y llygod yn unigol i gofnodi marwolaethau ac arwyddion clinigol. Yn ogystal, mesurwyd pwysau'r corff a'r defnydd o fwyd a dŵr trwy gydol yr arbrawf. Ar Ddiwrnod 14, cyfrifwyd mynegai dueg neu thymws fel (pwysau dueg neu thymws/pwysau corff) × 10.

Canfod gweithgaredd immunomodulatory WPCD in vivo.

Er mwyn ymchwilio i weld a oedd gan WPCD weithgaredd imiwnofodwlaidd, defnyddiwyd ovalbumin (OVA) (Sigma) fel yr antigen enghreifftiol, a gwahanwyd llygod ICR benywaidd ar hap yn 7 grŵp (grŵp rheoli negyddol (0.9% NaCl a WPCD 400 ug). ) a'r rheolaeth gadarnhaol (Alum 200 ug gyda OVA)). Rhoddwyd y llygod yn isgroenol ddwywaith gyda 10 ug OVA yn unig neu WPCD gydag OVA yn ôl y dos o 20, 100, neu 400 ug gydag egwyl o 2-wythnos. Cafwyd samplau gwaed a dueg ar ôl y brechiad atgyfnerthu i ganfod titers IgG, yr is-ddosbarthiadau IgG, amlhau splenocyte a cytocin, marcwyr arwyneb DCs, ac amlder Treg.

Canfod gwrthgyrff sy'n benodol i OVA

Archwiliwyd teitrau ac is-ddosbarthiadau IgG sy'n benodol i OVA gan ELISA yn ôl y dull blaenorol [27]. Cafodd platiau ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) eu gorchuddio dros nos ac yna eu rhwystro. Gwanhawyd samplau serwm yn gyfresol ar gyfer dadansoddi titer IgG neu ganfod IgG1 ac IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Yna deorwyd y platiau gyda PBST yn cynnwys IgG gwrth-lygoden wedi'i gyfuno â HRP, IgG1, ac IgG2a am 1 h ar 37˚C. Datblygwyd yr adwaith lliwimetrig gyda tetramethylbenzidine (TMB) ac yna mesurwyd yr amsugnedd ar 450 nm / 655 nm a'u mynegi fel unedau dwysedd optegol (OD).

Canfod ymlediad splenocyte a cytocin

Pennwyd amlder splenocyte gan y assay MTT. Ar Ddiwrnod 21 ar ôl y brechiad cyntaf, cafwyd un ataliad splenocyte. Cafodd celloedd eu meithrin mewn RPMI-1640 cyfrwng mewn 96-blatiau ffynnon yn ôl y crynodiad o gelloedd 1×106/ffynnon mewn triphlyg. Ysgogwyd y diwylliannau gydag OVA (crynodiad terfynol 10 ug / mL), ConA (crynodiad terfynol 5 ug / mL) (Sigma, St Louis, MO), a LPS (crynodiad terfynol 100 ng / mL) am 48 h ar 37˚C . Cafodd celloedd eu meithrin am 48 h ac ychwanegwyd 20 μL (5 mg / ml) o MTT (Sigma, St Louis, MO) i bob ffynnon a'i ddeor am 4 awr arall. Ar ôl ychwanegu 50 μL o DMSO i bob ffynnon i atal y datblygiad lliw (Sigma), darllenwyd platiau ar 570 nm gan ddarllenydd plât microtiter (BioRad, CA, UDA). Mynegwyd amlder splenocyte fel mynegai symbyliad (SI), sef y gymhareb OD570 nm o ffynnon wedi'i hysgogi i ffynnon heb ei symbylu.

Mesurwyd cynnyrch celloedd IL-4 ac IFN- mewn celloedd T trwy staenio cytocin mewngellol yn unol â phrotocol cyhoeddedig gyda mân addasiadau [27, 28]. Paratowyd ataliad splenocyte sengl ar Ddiwrnod 21 ar ôl y brechiad cyntaf. Ar ôl lysis celloedd gwaed coch, deorwyd y splenocyte (2 × 106 cell / mL) ag OVA (10 ug/mL) ar gyfer ysgogiad 4-h ac ychwanegwyd stop Golgi (BD) ar gyfer deoriad 12 h, PMA fel positif rheolaeth. Roedd celloedd yn cael eu casglu, eu golchi â PBS, eu staenio â CD4-FITC/CD8-FITC, a'u gosod a'u treiddio â phecyn Cytofix/Cytoperm (BD) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Perfformiwyd staenio cytocin mewngellol gyda'r crynodiad priodol o wrthgyrff IL-4-PE neu IFN- -APC ar 4˚C am 20 munud. Canfuwyd celloedd lliw gan FACs. Cynhaliwyd dadansoddiad data yn y FlowJo.

Asesiad o aeddfedu DCs a chelloedd Treg yn y ddueg

Ar gyfer dadansoddi aeddfediad DC o splenocytes mewn llygod, perfformiwyd staenio arwyneb celloedd gyda gwrthgyrff CD11c-PE, CD40-FITC, a CD{3} APC. Ar Ddiwrnod 3 ar ôl y brechiad cyntaf, cafwyd ataliad splenocyte sengl (1 × 106 celloedd / mL) a chafodd celloedd eu staenio ddwywaith. Mesurwyd y dwyster fflwroleuol gan y FACs Calibur a dadansoddwyd y data mesuredig gan FlowJo.

I arsylwi a allai WPCD is-reoleiddio amledd CD4+ CD25+ Foxp3+ celloedd Treg. Paratowyd ataliad splenocyte sengl ar Ddiwrnod 7 ar ôl yr ail frechiad. Cafodd y splenocyte (2×106 cell/mL) ei staenio ar wyneb y gell gyda gwrthgorff CD{7}}APC, ac yna staenio cytocin niwclear gyda'r gwrthgyrff CD priodol{8}FITC a Foxp3-PE gyda phecyn staenio celloedd T rheoleiddiol y llygoden (eBiosciences) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Profwyd amledd celloedd Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ ar FACs. Cynhaliwyd dadansoddiad data yn y FlowJo.

Dadansoddiad ystadegol

Perfformiwyd dadansoddiad un ffordd o brofion amrywiant (ANOVA) (Prawf Cymhariaeth Lluosog Tukey) i ddadansoddi'r gwahaniaethau rhwng grwpiau arbrofol lluosog. Mynegir pob gwerth fel cymedr ±SD. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Canlyniadau Hyrwyddodd WPCD aeddfedrwydd a swyddogaeth BM-DCs in vitro

Mae imiwnedd addasol yn cael ei bennu gan actifadu DCs, gan gynnwys y mathau o moleciwlau cyd-ysgogol a cytocinau [29, 30]. I ddechrau, gwnaethom ymchwilio i weld a allai WPCD hyrwyddo mynegiant moleciwlau cyd-ysgogol. Yn ôl gwahanol ddosau o WPCD, BM-DCs

o C57BL/6 yn cael eu gweinyddu. Dadansoddwyd lefelau mynegiant CD11c, CD86, CD80, CD40, a MHC-II mewn celloedd (Ffig 1). Dangosodd y celloedd â gatiau SSC a FSC nad oedd y driniaeth â dosau gwahanol o WPCD yn newid morffoleg BM-DCs (data heb ei ddangos). Cafodd lefelau mynegiant CD86, CD80, a CD40 eu huwch-reoleiddio'n sylweddol mewn modd dibynnol ar ddos ​​o'i gymharu â'r grŵp heb ei drin a chyrhaeddodd y llwyfandir o dan y dos o 20 ug/mL o WPCD, ond roedd y gwahaniaeth yn ddim yn arwyddocaol o'i gymharu â'r grŵp LPS (Ffig 1A–1C). Cynyddwyd lefel mynegiant MHC-II yn sylweddol i'w werth uchaf o dan y dos o 50 ug/mL (Ffig 1D). Dangosodd canlyniadau dadansoddi marcwyr arwyneb cellog fod DCs a gafodd eu trin â LPS neu WPCD yn dangos lefelau mynegiant sylweddol uwch o CD86, CD80, CD40, a MHC-II ac yn hyrwyddo aeddfedu ffenotypig.

Gallai rhai cynorthwyol gynyddu moleciwlau cyd-symbyliad ar DCs neu ysgogi secretion cytocinau yn uniongyrchol. IL-12 a TNF- yw'r prif sytocinau ar gyfer actifadu ymateb imiwn Th1. Fe wnaethom ddadansoddi cynnyrch cytocin mewn BM-DCs ar driniaeth WPCD. Ar ôl i BM-DCs gael eu trin â chynnwys gwahanol o WPCD am 12 h, casglwyd y supernatant i ganfod cynnwys IL-12 a TNF- gyda phecyn ELISA. Gallai WPCD gynyddu cynhyrchiant IL-12 (Ffig 2A) a TNF- (Ffig 2B) yn ddibynnol ar ddos. Dangosodd y canlyniadau y gallai WPCD ysgogi aeddfedu swyddogaethol DCs.

Mewn ymateb imiwn, mae angen actifadu DCs yn swyddogaethol. Yna, ysgogwyd y lefel uwch o ymlediad celloedd T allogeneig gan DCs cwbl aeddfed. Felly, ymchwiliodd MLR i ymateb swyddogaethol DCs i WPCD. Cafodd gallu allostimulatory DCs a achosir gan WPCD, yn debyg i LPS, ei wella'n ddramatig mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​ar y gymhareb a nodir (Ffig 2C a 2D). Dangosodd y canlyniadau fod WPCD wedi gwella cyflwyniad antigen ac wedi optimeiddio ymateb celloedd T gan MLR in vitro.

Roedd WPCD yn hyrwyddo aeddfedu DCs trwy lwybr TLR4

Gellid casglu o'r canlyniadau uchod bod BM-DCs a weithredwyd gan WPCD yn nodi mynegiadau moleciwl arwyneb DCs tebyg i LPS (ligand TLR4). Felly, fe wnaethom ragdybio bod BM-DCs yn cael eu gweithredu gan WPCD trwy'r llwybr TLR4. Ar ôl i BM-DCs gael eu rhag-drin â TAK-242 (atalydd TLR4) a'u cyd-ddiwyllio â WPCD a LPS am 12 h, mynegiant CD40, CD86, TNF-a, neu IL{{12 Cafodd }} ei ganfod gan FACs neu ELISA. Fel y dangosir yn Ffig 3A a 3B, arweiniodd y driniaeth TAK-242 at fynegiadau sylweddol is-reoledig o CD40 a CD86 a achosir gan LPS neu WPCD, a chynhyrchiad cytocin o IL-12 neu Roedd gostyngiad sylweddol hefyd yn TNF-a (Ffig 3C a 3D). Dangosodd y canlyniadau y gallai WPCD ysgogi aeddfedu DC trwy'r llwybr TLR4.

Gwellodd WPCD imiwnedd doniol a cellog

Er mwyn cymharu, gwnaethom werthuso effeithiau WPCD ar ennyn ymateb imiwn humoral mewn llygod wedi'u himiwneiddio OVA. Cyn y brechiad ac ar Ddiwrnodau 14, 21,

35, a 49 ar ôl y brechiad cyntaf, casglwyd gwaed i ganfod titer IgG a serwm is-ddosbarthiadau IgG gan ELISA. Cynyddodd ymateb gwrthgyrff IgG i OVA gyda'r cynnydd yn y dos o weinyddu WPCD (100 a 400 ug) mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​(Ffig 4). Y crynodiad gorau posibl oedd 100 ug/mL o WPCD a chynyddodd ymatebion IgG ddwywaith o gymharu â'r OVA yn unig ar Ddiwrnodau 21, 35 a 49 (Ffig 4A). Cafwyd cynnydd sylweddol mewn lefelau gwrthgyrff IgG1 ac IgG2a sy'n benodol i OVA o dan 20 a 100 ug o weinyddiaeth WPCD o gymharu â'r grŵp OVA mewn serwm ar Ddiwrnod 35 (Ffig 4B). Yn y cyfamser, dim ond lefelau mynegiant gwrthgyrff IgG ac IgG1 sy'n benodol i OVA a hyrwyddodd yn y llygod wedi'u himiwneiddio. Ni sbardunodd WPCD yn unig wrthgyrff penodol i OVA. Roedd y canlyniadau uchod yn dangos bod WPCD wedi cynhyrchu lefelau gwrthgyrff uwch ac ymatebion Th1/Th2 mwy cytbwys nag Alum.

Mae amlhau splenocyte yn ddangosydd arall o imiwnedd cellog. Mae ConA yn ysgogi celloedd T ac mae LPS yn ysgogi amlhau celloedd B. Ar Ddiwrnod 21 ar ôl y brechiad cyntaf, cafwyd ataliad splenocyte sengl a'i ysgogi yn y drefn honno gydag OVA (10 ug / mL), peptid OVA323-339 (10 ug / mL), ConA (5 ug / mL), a LPS ( 5 ug/mL) am 48 h. Yna mesurwyd amlder celloedd T gan y dull MTT. Gallai WPCD hyrwyddo'n sylweddol OVA-antigen, Con A-mitogen, ac amlhau splenocyte wedi'i ysgogi gan mitogen LPS yn y llygod a imiwneiddiwyd ag OVA a WPCD (Ffig 5) a'r crynodiad gorau posibl o WPCD oedd 100 ug/mL. Roedd y data hyn yn dangos y gallai WPCD fel cynorthwyydd brechlyn mewn llygod sydd wedi'u himiwneiddio OVA ysgogi actifadu celloedd T a chelloedd B yn fwy effeithiol nag Alum.

Cynhyrchodd pob cynorthwyydd WCPD a brofwyd gyda brechlynnau OVA imiwnedd llawn hiwmor a cellog yr un mor gryf (Ffig 4 a 5). Yn seiliedig ar y data hyn, er mwyn gwerthuso dylanwadau WPCD ymhellach ar ymateb celloedd cynorthwyydd T (Th) penodol i OVA, fe wnaethom ddadansoddi mynegiadau cytocin ymhellach mewn celloedd T CD8+ a CD4+ yn ôl cytometreg Llif (Ffig 6) . Ar Ddiwrnod 21 ar ôl y brechiad cyntaf, cafodd un splenocyte o lygod ei ynysu ac yna ei gyd-ddiwyllio â'r OVA (10 ug/ mL). Roedd cynnyrch IL-4 mewn celloedd CD4+ T yn y grŵp a weinyddwyd gyda 100 ug OVA/WPCD yn sylweddol uwch na'r hyn yn y grŵp OVA/Alum a'r grŵp OVA ac yn debyg i'r hyn yn PMA (Ffig 6A). At hynny, cafodd cynnyrch IFN mewn celloedd CD8+ a CD4+ T hefyd ei wella'n sylweddol yn y llygod a weinyddwyd gydag OVA/WPCD (20, 100, a 400 ug) (Ffig 6B a 6C). O gymharu ag Alum adjuvant, dangosodd WPCD allu gwell i ysgogi secretiadau IL-4 ac IFN- o gelloedd T.

Mae aeddfedu DCs wedi'i ysgogi gan WPCD a llai o amlder Treg mewn vivo DCs yn cael eu cydnabod fel yr APCs mwyaf grymus sy'n ymwneud â chychwyn ymatebion imiwn sylfaenol. Felly, ar Ddiwrnod 3 ar ôl y brechiad cyntaf, fe wnaethom hefyd ymchwilio i effeithiau WPCD ar CD40 a CD80 ar DCs yn y ddueg mewn llygod (Ffig 7A a 7B). Cynhyrchodd y llygod yn y grŵp 100-ug OVA/WPCD lefelau sylweddol uwch o CD40 a CD80 ar DCs na'r rhai yn y grŵp OVA/Alum. Dangosodd y data hyn y gallai WPCD ysgogi DCs a chymell aeddfediad DC mewn llygod. Gall celloedd Treg gydbwyso'r goddefgarwch a'r ymatebion imiwn. Er mwyn ymchwilio ymhellach i sut y bu i WPCD fodiwleiddio'r ymateb imiwn, cafodd celloedd Treg yn y ddueg mewn llygod eu staenio â phecyn staenio celloedd T rheoleiddiol y llygoden. Ar Ddiwrnod 21 ar ôl y brechiad cyntaf, gwelwyd llai o amledd o gelloedd CD25+ Foxp3+ Treg yng nghyfanswm celloedd CD4+ T (Ffig 7C). O'i gymharu â'r grwpiau OVA ac OVA/Alum, dangosodd grŵp WPCD amledd Treg yn sylweddol is.

Gwerthusiad diogelwch WPCD mewn llygod

I amcangyfrif gwenwyndra acíwt y geg, fe wnaethom gynnal y prawf gwenwyndra acíwt. Ni ddangosodd y llygod a roddwyd ar lafar â phwysau corff 5000 mg / kg unrhyw ymddygiad annormal na sgîl-effeithiau ac ni chanfuwyd unrhyw farwolaethau yn y prawf gwerthuso gwenwyndra. Ni chofnodwyd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol mewn cynnydd pwysau corff, mynegai Thymus, a mynegai Spleen ymhlith grwpiau amrywiol o lygod a weinyddwyd gyda dosau gwahanol o WPCD ac nid oedd ganddynt unrhyw wahaniaeth arwyddocaol (Tabl 1). Ni welwyd unrhyw farwolaethau ar ôl 14 diwrnod. Felly, roedd gwerth LD50 WPCD yn fwy na 5000 mg fesul kg o bwysau'r corff.

Er mwyn profi a oedd gan WPCD effeithiau negyddol ar dwf y llygod, cyn ac ar ôl brechu isgroenol, pennwyd pwysau'r corff yn y drefn honno ar gyfer pob llygoden (Tabl 2). Yn yr arsylwi dilynol ar y llygod, ni welwyd sgîl-effeithiau nac ymddygiadau annormal. Ar ben hynny, ni ddangosodd pwysau corff y llygod a weinyddwyd gyda WPCD a'r llygod a weinyddwyd â hydoddiant halwynog neu OVA / Alum unrhyw wahaniaeth arwyddocaol. Roedd y canlyniadau arsylwi hyn yn dangos bod gweinyddu WPCD yn ddiogel.

Trafodaeth

Mae cynorthwywyr yn gydrannau allweddol mewn brechlynnau [31]. Oherwydd y datblygiadau mewn genomeg a phroteomeg, mae mwy a mwy o ailgyfuniadau a moleciwlau brechlyn synthetig yn cael eu nodi. Felly, mae angen mwy o gynorthwywyr a fformwleiddiadau. Mae rhai cymhorthion cryf yn gyffredinol yn gysylltiedig â mwy o wenwyndra, er enghraifft, FCA. Felly, mae angen dod o hyd i fformiwleiddiad diogel sy'n cynnwys gwahanol gydrannau synergaidd yn y pen draw yn gyrru'r ymateb imiwn a ddymunir.Nid yw polysacaridau o berlysiau Tsieineaidd yn wenwynigac yn dangos dim sgîl-effeithiau sylweddol [32,28]. Mae angen cynorthwyydd diogel ar gyfer brechlyn penodol.

Mae Cistanche deserticola yn berlysiau tonig pwysig ac mae'n bodoli'n eang mewn tiroedd cras ac anialwch cynnes yng ngogledd-orllewin Tsieina. Mae Cistanche deserticola yn bryderus iawn oherwydd ei fioweithgareddau gan gynnwys effeithiau imiwnofodiwlaidd, gwrthocsidiol, gwrthfacterol ac antitumor [20,21]. Mae rhywfaint o gynnydd wedi'i wneud o ran nodweddu adeileddol a gweithgaredd imiwnolegol Cistanche deserticola, sy'n ymgeisydd da ar gyfer datblygu cymhorthion. Fe wnaethom werthuso'n arbrofol effeithiau cynorthwyol a mecanwaith WPCD in vitro ac in vivo. Roedd rhoi WPCD yn isgroenol yn hybu ymatebion imiwnedd cellog a digrif yn sylweddol trwy gynyddu gwrthgyrff serwm ac ymlediad lymffocytau, gwella mynegiant cytocinau, uwch-reoleiddio aeddfedu DC, a lleihau amledd CD4+ CD{5} } Foxp3+ Celloedd Treg.

Mae DCs yn APCs allweddol ar gyfer preimio celloedd T naïf. Mae actifadu DCs yn bwysig i gynorthwywyr. Defnyddir DCs, yn enwedig DCs sy'n deillio o fêr murine, yn aml i werthuso cymhorthion a brechlynnau. Gall cytometreg llif wahaniaethu rhwng y celloedd sydd wedi'u actifadu ar ôl dal antigen o'r celloedd cyfagos. Mewn dadansoddiad FCM, y radd o agregu ysgogol

celloedd yn ddangosydd anuniongyrchol o werthuso diogelwch immunomodulators [3]. Felly, gall data gweithgaredd cynorthwyol WPCD mewn DCs in vitro ddarparu gwybodaeth werthfawr ar gyfer modelau anifeiliaid. Yn seiliedig ar y model BM-DC, canfuwyd lefelau mynegiant MHC-II, CD86, CD80, a CD40, cynhyrchu cytocin, ac amlhau celloedd T allogenig yn ystod crynodiad gorau posibl WPCD. Cafodd lefelau mynegiant MHC-II, CD86, CD80, a CD40 eu huwchreoleiddio mewn BM-DCs a chynyddwyd cynnyrch TNF-a ac IL-12 mewn modd a oedd yn dibynnu ar ddos. Gwelwyd ymlediad celloedd T allogeneig. Ni newidiwyd morffoleg BM-DCs. Trwy ysgogi actifadu BM-DCs a secretion cytocinau llidiol in vitro, gallai cymhorthydd WPCD gynyddu'n sylweddol faint o antigen a nifer yr APCs ac ysgogi celloedd T i secretu IFN-, sy'n cyfrannu at wella gweithgaredd imiwnofodwlaidd.

Amrywpolysacaridau llysieuol Tsieineaiddyn gallu actifadu'r system imiwnedd ac yn meddu ar alluoedd cynorthwyol rhagorol trwy ysgogi aeddfedu DC gan y llwybr TLR4 [33,28]. Felly, tybiwn fod TLR4 yn cymryd rhan yn y llwybr signalau o aeddfedu DCs a achosir gan WPCD. Yn ôl y disgwyl, arweiniodd triniaethau atalyddion TLR4 at ostyngiad sylweddol mewn TNF-a ac IL-12. Ymhellach, roedd ataliad llwybr TLR4 hefyd yn rhwystro mynegiant CD40 a CD80 ar DCs, gan ddangos bod aeddfedu DCs yn dibynnu ar TLR4. Felly, mae'n amlwg bod TLR4 yn cymryd rhan yn y broses o aeddfedu DCs a achosir gan WPCD.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA Imiwnedd PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mae'r dos gorau posibl o gynorthwyol a ffurfio brechlyn yn cael ei bennu'n empirig mewn llawer o arbrofion. Er mwyn archwilio'r berthynas ymateb dos rhwng antigenau cynorthwyol WPCD ac OVA mewn llygod, fe wnaethom ddewis gwahanol ddosau WPCD yn seiliedig ar ddata a adroddwyd yn flaenorol gan BM-DCs in vitro i weinyddu llygod ICR yn isgroenol ddwywaith. Canfuom fod WPCD wedi cynyddu cynnyrch gwrthgyrff penodol i OVA yn sylweddol ac wedi achosi ymateb imiwn Th1/Th2 cytbwys gyda chynnydd yn lefelau IgG1 ac IgG2a. Yn arbennig, roedd lefel IgG2a yn uwch na'r hyn a gafodd ei drin ag Alum yn y dos gorau posibl. Felly, arweiniodd WPCD at lefelau uwch o wrthgyrff penodol ac effeithiolrwydd uwch gyda'r pigiadau is.

Mae brechlynnau newydd yn gofyn am anwytho ymatebion cellog cryf, sy'n cynnwys gwrthgyrff, celloedd cynorthwyydd T (Th), a lymffocytau T sytotocsig (CTLs). Nod brechlyn therapiwtig yw ysgogi ymatebion celloedd T cryfach. Mae'r cymhorthydd delfrydol yn gwella cryfder y brechlyn ac yn hyrwyddo imiwnedd trwy gyfrwng celloedd heb achosi effeithiau gwenwynig [34]. Ymhlith yr arsylwadau mewn modelau llygod wedi'u himiwneiddio, arweiniodd WPCD at gynnydd mewn lledaeniad splenocyte OVA-benodol ac amhenodol o gymharu ag Alum. Mae rhai cynorthwywyr yn uwch-reoleiddio cytocinau a'r system imiwnedd. Er enghraifft, gall saponins ysgogi ymatebion imiwn trwy gyfrwng celloedd i antigen sydd fel arfer yn achosi gwrthgyrff yn unig. Dewiswyd IL-4 ac IFN- fel y dangosyddion i werthuso'n anuniongyrchol lefelau imiwnedd llygod. Gallai WPCD ysgogi mwy o secretiadau IL-4 ac IFN- nag Alum. Felly, arsylwyd ymatebion celloedd T cynorthwy-ydd cryf a secretiadau cytocin o ganlyniad i frechiad WPCD, sy'n awgrymu y gallai WPCD ysgogi lymffocytau yn fwy effeithlon i gyfrinachu'r cytocin math Th{34a'r cytocin math Th{{{{{{34}math na chytocin na). Alum.

Gall cynorthwywyr sy'n dylanwadu ar gyflwyniad antigen effeithio ar brosesau imiwnedd cymhleth. Gall celloedd Treg fodiwleiddio ymatebion Th1 a Th2 [35]. Gall dos priodol o WPCD hybu aeddfediad DCs mewn llygod trwy gynyddu lefelau mynegiant CD80 a CD40 a chynyddu gallu cyflwyno antigen OVA yn yr ymateb imiwn cynnar. Dangosodd canlyniadau arbrofol actifadu DCs ac amlder Treg fod WPCD wedi achosi aeddfedu DCs ac wedi lleihau amlder Treg yn y ddueg mewn llygod. Profodd y canlyniadau hyn fod WPCD wedi gwella effeithiolrwydd brechlynnau OVA trwy gynyddu targedu celloedd cyflwyno antigen a hyrwyddo actifadu celloedd T-benodol.

Wrth ddatblygu cymhorthion, mae'n anodd ysgogi'r ymateb imiwn priodol yn ddetholus yn erbyn yr haint cyfatebol. Dylai cynorthwyol addas gael sgîl-effeithiau isel a gwenwyndra i fodau dynol neu anifeiliaid. Felly, dylid ystyried diogelwch WPCD, gan gynnwys sgîl-effeithiau uniongyrchol a hirdymor. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom archwilio gwenwyndra acíwt WPCD ac effaith negyddol WPCD ar berfformiad twf llygod am 110 diwrnod. Dangosodd canlyniadau gwenwyndra acíwt WPCD nad oedd gan bwysau'r corff, mynegai thymws, neu fynegai Spleen unrhyw wahaniaeth arwyddocaol. Roedd gwerth LD50 WPCD yn fwy na 5000 mg fesul kg o bwysau'r corff. Trwy gydol yr arsylwi arbrofol dilynol o'r llygod, ni ddarganfuwyd unrhyw sgîl-effeithiau nac ymddygiad annormal mewn llygod. Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod WPCD yn ddiogel.

I gloi, yn yr astudiaeth hon, arddangosodd WPCD, polysacarid crai a echdynnwyd o'r C. deserticola o Xinjiang, rai priodweddau cynorthwyol. Er enghraifft, gwellodd WPCD ymatebion Th1 a Th2 trwy actifadu DCs, cynyddu ymatebion gwrthgyrff, a gwella cynhyrchiant cytocin. Ar ben hynny, fe wnaethom archwilio mecanwaith effeithiolrwydd WPCD trwy ddadansoddi aeddfediad a swyddogaeth DCs trwy lwybr TLR4 in vitro. Yn y llygod a gafodd eu trin â WPCD yn unig, ni welwyd unrhyw sgîl-effaith amlwg. Felly, roedd gan WPCD weithgaredd imiwn-ysgogol uwch mewn ymatebion imiwn cellog a humoral. Mae cymhorthion yn gymysgedd o sawl cyfansoddyn. Gall cymysgedd o nifer o echdynion crai gael mwy o effeithiau buddiol na detholiad un planhigyn. Mae angen archwilio detholiadau WPCD yn systematig, profi eu heffeithiolrwydd a'u diogelwch, ac egluro mecanweithiau eu heffeithiau.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA Imiwnedd PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%