Mewn Vitro Ac yn Silico Mewnwelediadau i Atalyddion Tyrosinase
Mar 28, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a
Haniaethol
Mae Tyrosinase yn ensym allweddol sy'n gyfrifol am biosynthesis melanin ac mae'n effeithiol wrth amddiffyn niwed i'r croen a achosir gan ymbelydredd uwchfioled. Fel rhan o ymdrechion parhaus i ddarganfod atalyddion tyrosinase cryf, dyluniwyd a syntheseiddio tri ar ddeg (E)-benzylidene-1-deilliadau indanone (BID1-13) yn systemataidd a phenderfynu ar eu gweithgareddau ataliol yn erbyn tyrosinase. Ymhlith y cyfansoddion a werthuswyd, BID3 oedd yr atalydd mwyaf grymus o tyrosinase madarch (IC50=0.034 mM, gweithgaredd mycophenolate; gweithgaredd IC50=1.39 mM, diphenols). Datgelodd astudiaethau cinetig fod BID3 yn dangos math cymysg o ataliad tyrosinase gyda gwerth Ki o 2.4 mM gan ddefnyddio L-DOPA fel swbstrad. Yn silico dangosodd efelychiadau tocio moleciwlaidd y gall BID3 rwymo i safleoedd catalytig ac allosteric tyrosinase i atal gweithgaredd ensymau a gadarnhaodd astudiaethau arbrofol in vitro rhwng BID3 a tyrosinase. Ar ben hynny, gostyngodd cynnwys melanin a chafodd gweithgaredd tyrosinase cellog ei atal ar ôl triniaeth BID3. Datgelodd yr arsylwadau hyn fod BID3 yn atalydd tyrosinase cryf ac o bosibl y gellid ei ddefnyddio fel asiant gwynnu ar gyfer trin anhwylderau sy'n gysylltiedig â phigmentiad.
Cistanche: croen gwynnu asiant perlysiau
1. Rhagymadrodd
Mae melanin yn cael ei syntheseiddio gan felanocytes yn haen fassal theepidermis yn gyffredinol yn cyfeirio at y teulu o pigmentau a elwir yn gyffredin ar gyfer amddiffyn croen mamalaidd rhag difrod a achosir gan ymbelydredd UV niweidiol trwy ysbwriel radicalau rhydd neu wasgaru golau UV sy'n dod i mewn [1]. Fodd bynnag, mae cenhedlaeth helaeth o felanincan yn achosi hyperbigmentiad gweladwy o'r epidermis, a all fod yn amlwg fel melasma, brychni haul, smotiau oedran, neu lentigau henaint[2].
Mae tyrosinase (EC 1.14.18.1), metalloenzyme sy'n cynnwys copr, yn ensym allweddol sy'n ymwneud â phrosesau melanogenig. Mae Tyrosinase yn cataleiddio'r ddau gam sy'n cyfyngu ar gyfraddau mewn melanogenesis; hydroxylationof tyrosine (gweithgaredd cresolase neu mycophenolate) i gynhyrchu 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ac ocsidiad dilynol L-DOPA (gweithgaredd catecholase neu diphenols) i'r DOPA-quinone cyfatebol. Pan L-tyrosine yw'r swbstrad, y cynnyrch oftyrosinase adwaith catalyzed yw DOPA-quinone, sydd wedyn yn cael ei drawsnewid i melanin [3]. Mae'r camau hyn yn hanfodol ar gyfer amddiffyn y croen rhag difrod UV. Mae Mushroom Agaricus yn cael ei ddefnyddio i'w homoleg sydd ar gael yn fasnachol ac yn uchel gydag ensym mamaliantyrosinase sy'n ei wneud yn addas iawn fel model ar gyfer astudiaethau ar melanogenesis [4]. Mewn pobl, mae melanin yn helpu i amddiffyn croen rhag y difrod a achosir gan UV [5]. Fodd bynnag, mae lefel gormodol melanincan yn achosi anhwylderau dermatolegol amrywiol gan gynnwys hyperpigmentations, melasma, frychni haul, a smotiau oedran [6]. Felly, mae angen atalyddion newtyrosinase sy'n arddangos eiddo tebyg i gyffuriau a chroen i atal pigmentiad croen gormodol.
1-Mae indanone, gyda sgerbwd benzoyl-cyclopentanone, yn cael ei ystyried yn gefndryd anhyblyg o galconau, sy'n ymgorffori'r system ceton annirlawn o galconau sy'n ffurfio cylch cylchol 5 aelod, sy'n gydran sy'n digwydd yn naturiol ac sy'n bresennol mewn amryw o ffynonellau planhigion bwytadwy [7 ]. Mae sawl astudiaeth wedi dangos bod gan gyfansoddion sy'n meddu ar 1-miety indanone bwysigrwydd ffarmacolegol, gan eu bod yn arddangos amrywiol weithgareddau biolegol buddiol, gan gynnwys gwrthlidiol [8-10], gwrthganser [11,12], gwrthocsidydd [13], gwrth-Parkinson's clefyd [14], clefyd gwrth-Alzheimer[15-17], gwrthficrobaidd [18], gwrth-imiwnedd ataliol [19], eiddo a gwrth-tyrosinase [20].
Mae calconau (1,3-dyddiadur-2-rhai cywir-1-rhai) yn getonau aromatig sy'n cynnwys dwy gylch aromatig sy'n gysylltiedig â system garbonyl a,b-annirlawn tri-charbon fel craidd canolog [21, 22]. Mae'r rhain yn gydrannau sy'n digwydd yn naturiol a geir mewn amrywiol blanhigion naturiol bwytadwy ac a ystyrir fel cyfansoddion rhagflaenol ar gyfer llwybr synthetig flavonoidau ac isoflavonoidau megis pyrazolines, pyrimidine, flavanol, flavones, flavanones, isoflavones, aurones, anthocyanidin, dihydroflavanol, a dihydrochalcone [23-hydrochalcone]. Mae'r system carbonyl annirlawn a, b yn hollbwysig i'r math o weithgaredd biolegol, gan fod y systemau hyn yn cael eu dosbarthu mewn llawer o gynhyrchion naturiol fel calconau yn ogystal ag indanone, lle mae'r moleciwlaidd yn gymharol fwy planar, a chyfeirir trosglwyddiad effeithiau electronig yr eilyddion aryl. i'r grŵp carbonyl [7]. Dywedodd llawer o ymchwilwyr blaenorol bod calconau wedi'u hamlygu fel dosbarth newydd o atalydd tyrosinase mewn nifer o gyhoeddiadau [26-29]. Yn ddiweddar, dyluniodd a chyd-weithwyr [30,31] gyfresi o ddeilliadau calconau a'u syntheseiddio ar gyfer eu in vitro gwrth- tyrosinase a gweithgareddau gwrth-melanogenig yn erbyn melanocytes murine.
Yn ôl ein data a adroddwyd yn flaenorol, dangosodd deilliadau gyda sgaffald carbonyl an(E)-b-phenyl-a,b-annirlawn ataliad potenttyrosinase [32-34]. (E)-benzylidene-1-gall indanones fod yn gyfrwng gwrth-melanogenig deniadol gan fod gan y cyfansoddion y sgaffald carbonyl annirlawn (E)-b-phenyl-a,b-yn eu strwythur cemegol. Yn nodedig, Radhakrishnan et al. (2015) [20]cynllunio a syntheseiddio cyfres o ddeilliannau indanonen bensylidene sy'n dwyn ffurfweddiad (Z) a'u gwerthuso'n weithgaredd ffor-tyrosinase. Er bod y deilliadau indanone (Z)-benzylidene-1- hyn wedi cael eu hymchwilio i weithgareddau gwrth-tyrosinase a gwrth-melanogenig o (E)-benzylidene-1-deilliadau indanone eto i'w harchwilio.
Felly, fe wnaethom ddylunio a syntheseiddio tri ar ddeg o gyfansoddion (BID1-13) o'r sgerbwd indanone sy'n dwyn ffurf (E) bensyliden. Ymhlith y cyfansoddion synthetig hyn, dangosodd 2,{5}}dihydroxygroup ar y cylch B o 1-indanone y rhwystr tyrosinasein mwyaf (tua 400-plyg yn fwy effeithiol nag asid kojic, rheolaeth gadarnhaol). At hynny, rydym yn gwerthuso gweithgaredd ataliol tyrosinasein BID3 ymhellach yn ogystal â nodweddu ei rôl reoleiddiol mewn synthesis melanin gan ddefnyddio celloedd melanoma B16F10. Mewn arbrofion estynedig, gwnaethom werthuso potensial gwrth-melanogenig BID3 a cheisio nodi'r cineteg ensymau ac astudiaethau docio moleciwlaidd. Mewn arbrofion olynol, archwiliwyd hefyd botensial tyrosinase cellog BID3 a chynhyrchu melanin mewn celloedd B16F10melanoma a achosir gan MSH a IBMX.
GWRTH-OXIDATION A CROEN WEDI EI DYNNU: DYFYNIAD CISTANCHE
2. Deunyddiau a dulliau
2.1. Adweithyddion
Tyrosinase madarch (EC 1.14.18.1), hormon sy'n ysgogi alffa-melanocyte (a-MSH), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), L-tyrosine, L-3,{{ Prynwyd 11}}dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dimethyl sulfoxide (DMSO), asid kojic, asid ffthalic, ac asid traws-sinamig gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA). Prynwyd cyfrwng Eagle (DMEM) wedi'i addasu gan Dulbecco, serwm buchol ffetws (FBS), streptomycin, ac amffotericin gan WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, De Korea). Prynwyd pob adweithydd arall oddi wrth Sigma-Aldrich.
2.2. Cemeg
2.2.1. Dulliau cyffredinol
Cafwyd yr holl adweithyddion yn fasnachol a'u defnyddio heb eu puro ymhellach. Cynhaliwyd cromatograffaeth haen denau (TLC) a chromatograffaeth golofn ar blatiau 60F245 wedi'u gorchuddio ymlaen llaw Merck ac AS Silica 40-63, 60 Å, yn y drefn honno. Cafwyd data sbectrosgopeg màs cydraniad uchel (AD) ar sbectromedr màs cromatograffaeth hylif (LC) Agilent AccurateMass pedwarplyg amser hedfan (Q-TOF) (Agilent, Santa Clara, CA, UDA) mewn modd positif ESI. Cofnodwyd sbectra cyseiniant magnetig niwclear (NMR) ar sbectromedr Varian Unity INOVA 400 neu sbectromedr Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, UDA) ar gyfer 1H NMR (400 a 500 MHz) ac ar gyfer 13C NMR (100 MHz), yn y drefn honno . Defnyddiwyd DMSO d6, CD3OD, a CDCl3 fel toddyddion NMR ar gyfer samplau NMR. Mesurwyd gwerthoedd newid cysonyn cyplu (J) a chemegol mewn hertz (Hz) a rhannau fesul miliwn (ppm), yn y drefn honno. Mae'r byrfoddau a ddefnyddir wrth ddadansoddi data 1H NMR fel a ganlyn: s (singlet), bs (single eang), d (dwbl), dd (dwbl o ddwbl), t (tripled), TD (tripled o ddwbl), q ( pedwarawd), andm (lluosog).
2.2.2. Gweithdrefn ar gyfer syntheseiddio BID1–13
Trowyd hydoddiant o bensaldehyd (1.1–1.2 Equiv.) a 1-indanone(100 mg, 0.76 mmol) mewn 1 M mewn asid asetig HCl (0.4 mL) ar dymheredd ystafell am 4-48 h. Ar ôl ychwanegu dŵr, cafodd y gwaddodion eu hidlo a'u golchi â dŵr a hecsan: ethylacetate (1: 1), hecsan: dichloromethan (4: 1-1: 1), neu gymysgedd o dichloromethan a methanol, yn dibynnu ar briodweddau'r bensaldehydau sy'n weddill i roi (E)-bensylidene-1-indanones (BID1–13) mewn cynnyrch o 32.8–99.1 y cant . Darperir nodweddu strwythurol (1H a 13C NMR a data màs yr holl AGB) o gyfansoddion syntheseiddio mewn Gwybodaeth Atodol.
2.2.2.1. (E)-2-(4-Hydroxybenzylidene)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one(BID1).
Melyn solet; cynnyrch, 93.4 y cant; amser ymateb, 6 h; fformiwla foleciwlaidd, C16H12O2; mp, 224.7–225.9 C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 10.10 (s, 1H, OH), 7.72 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7.64–7.58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7.43 (s, 1H, finylig H), 7.39 (t,1H, J=7.2 Hz, 6-H), 6.87 (d, 2H, J=8.0 Hz, 30-H, {{46} }}H), 3.99 (s, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO D6) D 193.9, 160.1, 150.4, 138.3,135.1, 134.0, 133.6, 132.2, 128.2, 127.2, 126.7, 124.1, 116.7, 32.6; H) ynghyd â calcd 237.0910, obsd 237.0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-Dihydroxybenzylidene)-2,3-dihydro-1H-inden-1-un (BID2).
Melyn solet; cynnyrch, {{{0}}.6 y cant ; amser ymateb, 5 h; fformiwla lar moleciwlaidd, C16H12O3; mp, 251.2–252.4 C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 9.65 (s, 1H, OH), 9.24 (s, 1H, OH), 7.72 (d, 1H,J=7 .6 Hz, 7-H), 7.66–7.61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7.42 (t, 1H,J {{35 }}.2 Hz, 6-H), 7.35 (s, 1H, finylig H), 7.19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H , J=8.0 Hz, 60-H), 6.83 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 3.98 (s, 2H,CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.8, 150.4, 148.7, 146.3,138.3, 135.1, 134.5, 132.0, 128.2, 127.3, 127.0, . HRMS (ESI plus ) m/z C16H13O3 (M plws H) ynghyd â calcd253.0859, obsd 253.0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihydroxybenzylidene)-2,3-dihydro-1H-inden-1-un (BID3).
Melyn solet; cynnyrch, 5{{20}}.9 y cant ; amser ymateb, 10 h; fformiwla moleciwlaidd, C16H12O3; mp, 198.5–199.9 C (Rhag.); 1H NMR(500 MHz, CD3OD) d 8.17 (s, 1H, finylig H), 7.82 (d, 1H, J=8.0 Hz,60-H), 7.67–7.63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7.45 (t, 1H, J=7.0 Hz, 6-H), 6.45 (d , 1H, J=8.5 Hz, 50-H), 6.39 (s, 1H, 30-H), 4.01 (s, 2H,CH2); 13c NMR (100 MHz, DMSO D6) D 193.9, 161.6, 160.4, 150.3,138.6, 134.8, 131.7, 130.3, 128.7, 128.1, 127.2, 123.9, 114.3,108.6, 32.1, 32.1, 32.1, 1033.1, 1033.1, 103 HRMS (ESI plus ) m/z C16H13O3 (M plws H) ynghyd â calcd253.0859, obsd 253.0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-Hydroxy-3-methoxybenzylidene)-2,3-dihydro-1Hinden-1-one (BID4).
Melyn solet; cynnyrch, 52.0 y cant ; amser ymateb, 4 h; fformiwla foleciwlaidd, C17H14O3; mp, 186.9–187.4 C; 1H NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9.71 (s, 1H, OH), 7.73 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7.67–7.62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7.45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7.43(t, 1H, J=7.2 Hz, 6-H), 7.31 (s, 1H, finylig H), 7.24 (dd, 1H, J=8.0,2.0 Hz, 60-H), 6.87 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 4.05 (s, 2H, CH2 ), 3.84(s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO D6) D 193.9, 150.5,149.7, 148.5, 138.3, 135.2, 134.4, 132.3, 128.2, 127.3, 127.1,125.7, 124.1, 116.6. HRMS (ESI plws ) m/z C17H15O3(M plws H) plws calcd 267.1016, obsd 267.1016.
2.3. Gwerthusiad biolegol
2.3.1. Assay ataliol tyrosinase madarch
Perfformiwyd assay gweithgaredd ataliol Tyrosinase gan ddefnyddio tyrosinase madarch fel y disgrifiwyd yn flaenorol, gyda mân addasiadau[35,36]. Yn gryno, ychwanegwyd 10 mL o grynodiad penodedig o bob cyfansoddyn (0.0005–50 mM) a 20 mL o madarch tyrosinase (1000 uned/mL) mewn byffer ffosffad 50 mM (pH 6.5) at adwaith 170 mL cymysgedd mewn 96-microplate ffynnon (Corning, UDA). Y gymhareb o 1 mM hydoddiant L-tyrosine neu L-DOPA, byffer potasiwm ffosffad 50 mM (pH 6.5), a dŵr distyll oedd 10:10:9. Deorwyd cymysgeddau gweithredu ar 37 C am 30 munud. Ar ôl hynny, cafodd faint o dopacrom a gynhyrchwyd ym mhob ffynnon ei fesur trwy ddadansoddiad sbectrophotometrig ar 492 nm (OD492) gan ddefnyddio darllenydd microplate. Cyfrifwyd y gyfradd atal tyrosinase ( y cant ) fel (1 Abssample / Abscontrol) 100 y cant . Mynegwyd graddau'r ataliad sampl fel y crynodiad sydd ei angen ar gyfer ataliad o 50 y cant (IC50).
2.3.2. Dadansoddiad cinetig ensymau gyda tyrosinase
Er mwyn pennu mecanweithiau cinetig ataliad, defnyddiwyd dau ddull cinetig cyflenwol: Lineweaver-Burk a Dixonplots [37-39]. Gan ddefnyddio lleiniau Lineweaver-Burk (cilocalplots dwbl), penderfynwyd ar y math ataliad o BID3 gan ddefnyddio crynodiadau amrywiol o L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5, ac 1 mM), fel swbstradau, yn absenoldeb a phresenoldeb crynodiadau amrywiol o BID3 (1, 2, a 4 lM). Cafwyd llain Dixon (lleiniau cilyddol sengl) ataliad fortyrosinase ym mhresenoldeb crynodiadau amrywiol o L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5, ac 1 mM ). Y crynodiadau o BID3 oedd 1, 2, a 4 mM. Roedd y gweithdrefnau ensymatig yn cynnwys y dulliau assay tyrosinase a ddisgrifiwyd yn flaenorol. Pennwyd y cysonyn atal (Ki) o ddehongli lleiniau Dixon.
2.3.3. Efelychiadau tocio moleciwlaidd Tyrosinase
Er mwyn pennu strwythur y cymhleth atalydd ensymau ac i sicrhau cywirdeb, ailadroddadwyedd a dibynadwyedd y canlyniadau tocio, fe wnaethom gyflogi meddalwedd AutoDock4.2. Ar gyfer astudiaethau dicio, cafwyd strwythurau crisial targed protein tyrosinase madarch o'r aliniad dilyniant protein (Banc Data Protein (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Perfformiwyd efelychiadau tocio awtomataidd rhwng tyrosinase ac asid kojic, asid ffthalic, asid sinamig, neu BID3 Ar gyfer y weithdrefn docio: trosodd 2D yn strwythurau 3D, taliadau wedi'u cyfrifo, ac ychwanegir atomau hydrogen gan ddefnyddio rhaglen ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41 ] Defnyddiwyd LigandScout 4.1.5 ar gyfer rhagfynegi rhyngweithiadau posibl rhwng ligandau a thyrosinase ac i adnabod ffarmacofforau.
2.3.4. Assay meithriniad celloedd a hyfywedd celloedd
Prynwyd celloedd melanoma B16F10 Murine gan Fanc Llinell Cell Corea (KCLB, Seoul, Korea) a'u meithrin yn DMEM wedi'u hategu â 10 y cant FBS ac 1 y cant streptomycin, ac yna deor ar 37 C, wedi'i lleithio â 5 y cant o CO2 atmosfferig. Perfformiwyd dadansoddiadau hyfywedd celloedd fel y disgrifiwyd yn flaenorol [42]. Yn gryno, fe wnaeth celloedd hadu ar ddwysedd o 1 104 cell/ffynnon mewn 96-plât ffynnon am 24 h. Y diwrnod canlynol, roedd y celloedd yn agored i wahanol grynodiadau o BID3 a'u deor am 24 neu 48 h, yn y drefn honno. Yna, ychwanegwyd hydoddiant EZ-Cytox 10 ml at bob ffynnon a deorwyd y celloedd am 2-4 h. Penderfynwyd ar amsugno gan ddefnyddio ELISA ar donfedd o 450 nm. Perfformiwyd pob assay yn driphlyg.
2.3.5. Assay cynnwys Melanin
Pennwyd cynnwys melanin fel y disgrifiwyd yn flaenorol [43].Cafodd celloedd melanoma B16F10 (2 105 cell/ffynnon) eu hadu mewn 6-blatiau meithriniad ffynnon. Er mwyn pennu effaith ataliol onmelanogenesis BID3, disodlwyd cyfrwng ffres gyda chyfrwng sy'n cynnwys ing BID3 (1, 5, a 10 lM) neu asid kojic (10 mM) fel rheolydd positif am 1 awr, ac yna ei ysgogi gydag a-MSH (5 lM). ) ac IBMX (200 mM) am 48 h. Ar ôl cael eu golchi ddwywaith gyda PBS, cafodd y celloedd eu datgysylltu trwy ddeor yn Trypsin / EDTA, a chafodd y pelenni eu toddi mewn 100 ml o 1 NAOH, ac yna eu deor ar 60 C am 1 llaw wedi'i chymysgu i hydoddi'r melanin. Penderfynwyd ar y cynnwys melanin trwy fesur amsugnedd ar 405 nm trwy ddefnyddio darllenydd theELISA (TECAN, Sunrise, Awstria). Cafodd y cynnwys melanin ei gyfrifo gan ddefnyddio'r hafaliad canlynol: (sampl/rheolaeth) - 100 y cant . Perfformiwyd yr holl benderfyniadau yn driphlyg.
2.3.6. Gweithgaredd tyrosinase cellog
Aseswyd gweithgaredd tyrosinase cellog fel y disgrifiwyd yn flaenorol, gydag addasiadau bach [44,45]. Yn gryno, cafodd 2 1{19}}5/cell eu platio mewn 6-siglenni iach a'u deor dros nos. Roedd y celloedd yn agored i grynodiadau amrywiol o BID3 (1, 5, a 10 mM) asid orkojic (10 mM) am 1 h, ac wedi hynny eu hysgogi gydag a-MSH (5 mM) ac IBMX (200 mM) am 48 h. Ar ôl cael eu rinsio ddwywaith gyda PBS, cafodd y celloedd eu golchi â hydoddiant lysis 100 mL yn cynnwys byffer ffosffad 50 mM (pH 6.5), 0.1 mM ffenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), ac 1 y cant Triton X-100 a'u rhewi ar 80 C am 30 munud. Cafodd lysates eu dadmer a'u centrifugio ar 12,000 rpm am 30 munud ar 4 C. Yna, cyfunwyd uwch-natur (80 mL) â 2 mg/mL L-DOPA (20 mL) mewn 96-plât ffynnon . Ar ôl deori ar 37 C am 30 munud, cafodd y dwysedd optegol ar 492 nm ei fesur gan ddefnyddio darllenydd ELISA (TECAN, Salzburg, Awstria). Penderfynwyd ar y crynodiad protein gan ddefnyddio adweithydd assay protein BCA gan ddefnyddio BCA fel safon (Thermo Scientific, Rockford, IL, UDA).
Budd echdynnu Cistanche: yn atal tyrosinase.
2.3.7. Dadansoddiad ystadegol
Cyflwynir yr holl ddata fel y cymedr ± gwall safonol y cymedr (SEM). Dadansoddwyd y data trwy ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) i bennu gwahaniaethau rhwng triniaethau, ac yna prawf posthoc Bonferroni. Ystyriwyd gwerth p < 0.05="" yn="" ystadegol="">
3. Canlyniadau a thrafodaeth
3.1. Cemeg
Syntheseiddiwyd deilliadau indanones (E)-benzylidene (BID1–13) yn unol â Chynllun cyffredinol 1. Yn yr astudiaeth bresennol hon, cafodd tri ar ddeg (E)-2-benzylidene-1-deilliadau indanone eu syntheseiddio a'u archwiliwyd priodweddau ataliol tyrosinase. Syntheseiddiwyd targed (E)-2-benzylidene-1-deilliadau indanone gan ddefnyddio cyflyrau asidig (1 M HCl mewn asid asetig). deilliadau indanone mewn cynnyrch o 32.8-99.1 y cant . Mae'n ymddangos mai dim ond yr E-isomers o 2-benzylidene-1-indanones a gynhyrchwyd oherwydd y straen A a elwir yn straen 1,{3-aligig. Mae'n debyg bod y straen A (sterichindrance) rhwng y cylch ffenyl a'r grŵp carbonyl yn yr isomer-Z yn fwy na'r un rhwng y cylch ffenyl a'r grŵp methylene yn yr E-isomer. Gwiriwyd strwythurau cyfansoddion synthetig gan 1H a 13C NMR a sbectrometreg màs fel y disgrifir yn yr adran arbrofol (Ffig. S1-S38). Yn benodol, mae symudiad cemegol proton olefinig yn cael ei gysgodi yn yr E-isomer o 2- bensyliden oherwydd effaith anisotropig y grŵp carbonyl ac mae'n ymddangos i lawr y cae (uwchlaw 7 ppm) o'i gymharu â'r isomer Z (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Cynllun 1. Synthesis o (E)-2-benzylidene-1-indanones.
3.2. Priodweddau ataliol Tyrosinase cyfansoddion
Archwiliwyd potensial ataliol tyrosinase (E)-benzylidene-1-deilliadau indanones gan ddefnyddio tyrosinase madarch. Defnyddiwyd y mycophenolate (L-tyrosine) a diphenols (L-DOPA) fel swbstradau ar gyfer yr arbrofion hyn [35]. Perfformiwyd adweithiau ensymau gyda thyrosinase, swbstrad, ac atalyddion prawf. Roedd pob cyfansoddyn a brofwyd yn dangos ataliad crynodiad-ddibynnol. Dangosir gwerthoedd IC50 y (E)-benzylidene-1-deilliadau indanones yn Nhabl 1.
Mewn swbstradau L-tyrosine ac L-DOPA ill dau, roedd BID3 yn arddangos gweithgarwch atal cryf gyda gwerthoedd IC50 o 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM a 1.39 ± 0.00004 mM, yn y drefn honno, o'i gymharu â'r asid kojic rheoli positif, a oedd â gwerthoedd IC50 o 13.77 ± 0.20 mM a 33.14 ± 0.93 mM, yn y drefn honno (Ffig. 1A). Ar ben hynny, dangosodd BID6 weithgaredd cryf tuag at L-tyrosine a L-DOPA gyda gwerthoedd IC50 o 5.00 ± 0.91 mM a 53.11 ± 2.79 mM, yn y drefn honno. Dangosodd BID1 ataliad sylweddol yn erbyn tyrosinase trwy L-tyrosine a L-DOPApathways, gyda gwerthoedd IC50 o 39.74 ± 3.71 mM a 130.0 ± 5.39 mM, yn y drefn honno. Roedd BID4 a BID11 yn dangos gweithgaredd ataliol cymedroltyrosinase. Roedd deilliadau eraill yn anactif. Yn yr un modd, dangosodd BID2 weithgaredd sylweddol tuag at L-tyrosine aL-DOPA, gyda gwerthoedd IC50 o 41.27 ± 3.03 mM a 52.93 ± 2.62 mM. effaith ar y crynodiad o 200 mm [47].
Yn gyson â chanfyddiadau astudiaethau perthynas strwythur-gweithgaredd (SAR), roedd deilliadau sy'n cynnwys (E)-benzylidene-1-ynodyddion indanones ar y cylch ffenyl yn amlwg yn dylanwadu ar ataliad potentialtyrosinase. Mae gan BID3, a ataliodd tyrosinase â'r nerth mwyaf, 2-grŵp hydroxy ym mhresenoldeb 4-grŵp hydroxy ac mae gweithgarwch tyrosinase wedi'i atal yn fawr (BID1 vsBID3). Awgrymodd y canlyniadau hyn y gallai'r grŵp 2,4-dihydroxy (moiety resorcinol) yn y strwythur cylch ffenyl fod yn gyfrifol am ataliad gwell o tyrosinase. Yn ddiddorol, mewn astudiaeth flaenorol ar atalyddion tyrosinase synthetig posibl, fe wnaethom ddangos bod yr amnewid 2,4-dihydroxy yn atal gweithgarwch tyrosinase yn gryf [48,49]. Yn ogystal, roedd ein data SAR hefyd yn nodi bod cyflwyno 3-grŵp hydroxy ym mhresenoldeb 4-hydroxygroup yn effeithio ar ataliad tyrosinase. Dangoswyd y ffenomenau hyn gan y canfyddiad bod 4-methoxy-3-gweithgaredd ataliol hydroxy ffenyl wedi cynyddu yn erbyn tyrosinase, tra bod cyflwyno grŵp dihydroxy 3,4-(catechol moiety) wedi lleihau gweithgarwch ataliol tyrosinase ( BID2 vs BID6) [35]. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod y grŵp methoxy 3-hydroxy-4- hefyd yn gyfrifol am weithgarwch ataliol amtyrosinase. Serch hynny, yn ein hastudiaeth bresennol, dangosodd BID9 a BID11, sy'n cynnwys 2,4-grwpiau dimethoxy ffenyl neu 3,5-dimethoxy phenyl, weithgarwch ataliol cymedrol tyrosinase. Yn seiliedig ar werthoedd IC50 trwy'r llwybr L-tyrosine a L-DOPA, dangosodd BID3 y gweithgaredd ataliol tyrosinase mwyaf grymus felly, fe wnaethom astudio ymhellach y mecanwaith sy'n sail i'r effaith ataliol hon. Dywedodd Radhakrishnan et al. (2015) [20] adroddwyd bod hydroxyl yn amnewid (Z)-benzylidene-1-atalyddion tyrosinase cyfansawdd indanone. Er bod astudiaethau blaenorol wedi dangos bod deilliadau indanone a amnewidiwyd gan hydrocsyl (Z)-benzylidene yn meddu ar weithgarwch gwrth-tyrosinase, hyd eithaf ein gwybodaeth, ni chafwyd unrhyw adroddiadau o ataliad tyrosinase gan (E)-bensylidene{{-1- deilliadau indanone gan ddefnyddio arbrofion yn seiliedig ar gelloedd.
Tabl 1. Potensial ataliol tyrosinase madarch y 2,3-dihydro-1H-inden-1-un (1-indanone) tebyg i sialcon a amnewidiwyd
deilliadau (BID1–13).
Ffig. 1. Ataliad canolbwyntio-ddibynnol ar weithgaredd tyrosinase madarch gan BID3 ac asid kojic (rheolaeth gadarnhaol) (n=3).
3.3. Dadansoddiad cinetig ensymau o ataliad tyrosinase
Gan mai BID3 oedd yr atalydd mwyaf grymus, buom yn astudio ymhellach y mecanwaith sy'n sail i'w effaith ataliol. Mewn ymgais i esbonio'r modd o atal ensymau, cynhaliwyd dadansoddiadau cinetig mewn crynodiadau amrywiol o L-DOPA a chrynodiadau BID3 amrywiol. Lluniwyd lleiniau Dixon a Lineweaver-Burk gan ddefnyddio'r data a gafwyd o'r astudiaethau cinetig er mwyn cadarnhau'r patrwm ataliad a'r cysonion ataliad (Ki) trwy ddehongli lleiniau Dixon (Ffig. 2 A a B). Mae crynodiad L-DOPA wedi'i ddynodi fel a ganlyn: 1, 2, 4 mM. Mae'r groesffordd yn gorwedd ar yr ochr chwith, gan nodi ataliad math cymysg yn erbyn tyrosinase gyda gwerth Ki o 2.4 mM (Ffig. 2 B). Mae'r gwerth Ki yn cynrychioli'r crynodiadau sydd eu hangen i ffurfio cymhleth atalydd ensymau, felly mae atalydd â gwerth Ki is yn nodi mwy o weithgarwch atal tyrosinase.
Mae tocio moleciwlaidd wedi cyfrannu mewnwelediadau pwysig i ddarganfod cyffuriau dros nifer o flynyddoedd. Fodd bynnag, nod gweithdrefnau tocio yw nodi lleoliadau cywir ligandau ym mhoced rhwymo aprotein a rhagfynegi'r affinedd rhwng ligand a phrotein. Mewn geiriau eraill, mae tocio yn disgrifio proses lle mae dau foleciwl yn ffitio gyda'i gilydd mewn gofod tri dimensiwn. Er mwyn pennu a yw BID3 yn rhwymo i safle gweithredol tyrosinase, cynhaliwyd dadansoddiad moleciwlaidd docio i nodi safleoedd rhwymo posibl BID3 yn strwythur grisial tyrosinase madarch (PDB ID: 2Y9X) (Ffig. 3 A). Cyfrifwyd y canlyniadau hyn gan ddefnyddio AutoDock4.2. rhaglen. Y safle rhwymo mwyaf sefydlog oedd bod â'r sgôr isaf [50]. Yn ddiweddar, mae Hassani et al. [47] adroddwyd bod asid cinnamig ac asid ffthalic yn atalyddion tyrosinasein modd cymysg. Felly, defnyddiwyd cymorth, asid cinnamig, ac asid ffthalic i ddilysu canlyniadau tocio [51]. Dangosir modelau tocio moleciwlaidd BID3 ac asid kojic (atalydd math cystadleuol adnabyddus) yn safle catalytig tyrosinase yn Ffig. 3B [52] ]. Cyflwynodd y cymhleth atalydd tyrosinase-BID3 egni rhwymo 6.28 kcal/mol gan gynnwys bondiau dauhydrogen gyda gweddillion tyrosinase ASN260 a MET280, a gwelwyd rhyngweithiadau hydroffobig rhwng gweddillion BID3 a thyrosinase VAL248, PHE264, a VAL283, a oedd yn y rhyngweithiad sefydlogi ymhellach yn y safle sefydlogi. mushroomtyrosinase (Tabl 2, a Ffig. 3E a H). At hynny, mae modelau tocio moleciwlaidd o BID3, asid ffthalic (atalydd alosterig 1), asid acinnamig (atalydd alosterig 2) yn y ddau safle allosteric wedi'u dangos yn Ffig. 3C a 3D. Cymerwyd asid ffthalic ac asid sinamig fel ligandau cyfeirio yn safleoedd allosteric 1 a 2, yn y drefn honno[47,51]. Fel y dangosir yn Ffig. 3F ac I, BID3 ac asid ffthalic arddangos bond hydrogen gyda'r gweddillion TRY140 tyrosinase, a thri gweddillion rhyngweithiadau hydroffobig gyda'r LEU24, PHE147, ac ILE148 tyrosinase ar safle allosteric 1. Rhyngweithiadau cyfatebolligand asid BID3 a cinnamig yn safle allosteric tyrosinase cynnwys bondiau hydrogen rhwng ASP312 aLYS376 o tyrosinase, tra bod THR308 rhyngweithio hydrophobicallyat safle allosteric 2 (Ffig. 3 G a J). Ymhellach, canfuwyd bod rhwymo tyrosinase AGB yn defnyddio egni rhwymol yn y ddau safle allosteric o tyrosinase (4.38 a 5.68 kcal/mol, yn y drefn honno), sy'n dangos affinedd rhwymol uchel gyda'r ddau safle alosterig. Yn seiliedig ar astudiaethau ensymau cinetig, rhoddodd BID3 ataliad math cymysg, cadarnhaodd rhwymedd BID3 gyda'r safle catalytig a dau safle alosterig ei ataliad math cymysg o tyrosinase.
Ffig. 2. Leiniau gwehydd llinell-Burk (A) a Dixon (B) ar gyfer atal tyrosinase madarch gan BID3 gan ddefnyddio L-DOPA fel y swbstrad.
3.4. Gweithgaredd biolegol
Er mwyn manteisio ar effeithiau gwrth-tyrosinase BID3 yn y model meithrin celloedd, fe wnaethom archwilio ei effeithiau sytotocsig ar gelloedd B16F10. Cafodd celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o BID3 (1–20 mM) am 48 h a'u hasesu gan ddefnyddio'r assay EZ-Cytox. Dangosodd y canlyniadau nad oedd gan BID3 unrhyw effaith sytotocsig sylweddol mewn melanomacells B16F10 hyd at 20 mM (Ffig. 4A a B). Felly, perfformiwyd arbrofion dilynol gan ddefnyddio BID3 hyd at 20 mM.
Tabl 2 Safleoedd rhwymo a sgoriau tocio o BID3 mewn tyrosinase madarch (PDB ID: 2Y9X) fel y penderfynwyd gan ddefnyddio rhaglen AutoDock4.2.
Mae melanogenesis yn cael ei reoleiddio gan raeadr enzymatig tyrosinase. Am y rheswm hwn, mae nifer o gyfansoddion gwynnu croen wedi'u datblygu i leihau gweithgaredd tyrosinase. Defnyddiwyd asid Kojic, atalydd tyrosinasein, fel rheolaeth gadarnhaol [53]. Felly, i ymchwilio i effeithiau BID3 ar orbigmentiad a achosir gan ddrychiad cAMP, cafodd celloedd B16F1{0 eu trin ag a-MSH ac IBMX ym mhresenoldeb BID3 (1, 5, a 2{{2{0}} mM) am 48 h, a chynnwys melanin, a gweithgareddau celltyrosinase eu pennu (Ffig. 4 C a D). Achosodd triniaeth gydag a-MSH ac IBMX gynnydd sylweddol (P < 0.001#)="" yn="" y="" cynnwys="" melanin="" (ffig.="" 4c)="" a,="" gweithgaredd="" tyrosinase="" cellog="" (ffig.="" 4d)="" mewn="" celloedd="" b16f10="" o'i="" gymharu="" â'r="" rheolaeth="" heb="" ei="" drin.="" fodd="" bynnag,="" triniaeth="" bid3="" yn="" sylweddol="" (p="">< 0.01**;="" p="">< 0.001***)="" a="" gostyngodd="" cynnwys="" melanin="" yn="" ddibynnol="" ar="" ganolbwyntio="" a="" gweithgaredd="" tyrosinase="" cellog="" o="" gelloedd="" b16f10="" o'i="" gymharu="" â="" chelloedd="" wedi'u="" trin="" â-msh="" oribmx,="" sy'n="" nodi="" y="" gallai'r="" gostyngiad="" mewn="" melanin="" cellog="" fod="" oherwydd="" ataliad="" gweithgaredd="" tyrosinase="" .="" felly,="" mae'r="" canfyddiadau="" hyn="" yn="" dangos="" yn="" glir="" bod="" bid3="" wedi="" cael="" effeithiau="" gwrth-melanogenig="" sy'n="" atal="" gweithgaredd="" tyrosinase="" a="" synthesis="" melanin="" mewn="" celloedd="" b16f10="" heb="" achosi="">
Mae Indanone yn un o strwythurau breintiedig cemeg feddyginiaethol ac yn gyffredinol mae'n gysylltiedig ag amrywiaeth o gyfansoddion ffarmacolegol actif [54]. Mae'r moiety indanone yn bresennol mewn amrywiaeth o gynhyrchion naturiol sy'n weithgar yn ffisiolegol. O ystyried hyn, adroddodd Okpekonet al., [55] fod cyfansoddyn indanone nofel 1-, wedi'i ynysu o wreiddiau Uvaria. Y cyfansoddyn hwn yw'r 1-deilliad indanone cyntaf sydd wedi'i ynysu o blanhigion. Adroddodd Nagle et al., [56] bod indane-aldehyde methylated newydd wedi'i ynysu o marinecyanobacterium fel rheolydd angiogenesis tiwmor. Yn yr un modd, ers pwysigrwydd biolegol craidd indanone, mae ymchwilwyr ers sawl blwyddyn wedi bod yn canolbwyntio ar ddatblygu analogau indanone ffarmacolegol actif fel asiantau therapiwtig. Mae amrywiaeth adeileddol 1-indanones yn awgrymu amrywiaeth o ymatebion biolegol a gellir cymhwyso'r cyfansoddion hyn mewn amaethyddiaeth a meddygaeth. 62], cyffuriau gwrthficrobaidd [63,64], ac asiantau gwrthfeirysol [65,66]. Oherwydd y potensial cymhwysiad eang, roedd 1-indanones yn wrthrychau diddorol ar gyfer ymchwil pellach ac mae'n ddymunol dylunio dosbarthiadau newydd ar gyfer eu synthesis.
cistanche tubolosa: anti-aging
4. Casgliad
Er mwyn nodi atalyddion tyrosinase cryf newydd, rydym wedi dylunio a syntheseiddio tri ar ddeg (E)-benzylidene-1-deilliadau indanone. Ymhlith y cyfansoddion hyn, (E)-2-(2,4-dihydroxy-benzylidene)-1- Gallai {6}},3-dihydro-1H-in-1-un (BID3)) atal gweithgarwch tyrosinase (IC50=0.034 a 1.39 mM, ar gyfer L-tyrosine a L-DOPA, yn y drefn honno), a oedd yn well na chyfeirnod cyfansawdd, asid kojic (IC50=13.77 mM a 33.14 mM, yn y drefn honno). Datgelodd y berthynas strwythur-gweithgaredd fod presenoldeb y grŵp deuhydrocsyl yn safle 2 a 4-sgerbwd indanone (E) (E)-benzylidene wedi gwella'r gweithgaredd yn erbyn tyrosinase. Roedd y modd o ataliad ensymatig yr ensym, a bennwyd gan leiniau Lineweaver-Burk a Dixon, yn nodi bod BID3 yn atalydd math cymysg. Mae astudiaethau tocio moleciwlaidd yn dangos bod rhwymo yn y safle gweithredol ac mewn safleoedd allosteric yn fecanweithiau pwysig tuag at weithgaredd ataliol tyrosinase. Yn seiliedig ar y canlyniadau hyn, roedd yn ymddangos bod BID3 yn atalydd tyrosinase cryf ar gyfer trin anhwylderau croen fel hyperbigmentation.
buddion cistanche anialwch: yn atal ffurfio melanin