Haint In Vitro O Gelloedd Arennau Gwartheg Madin-Darby (MDBK) Gyda Sporozoites Eimeria Acervulina: Dadansoddiad Meintiol o Ymlediad Cellog Parasit ac Atgynhyrchu Gan Ddefnyddio Adwaith Cadwyn Polymeras Amser Real (PCR)

edmund.chen@wecistanche.com

Haniaethol

Mae cocsidiosis dofednod yn achosi colledion economaidd sylweddol i'r diwydiant da byw. Parasitiaid Eimeria sy'n gyfrifol am y clefyd hwn. Ar raddfa fyd-eang, mae E. acervulina ac E. tenella ymhlith yr Eimeria spp mwyaf cyffredin. heintio brwyliaid. Defnyddir E. tenella yn gyffredin fel model haint mewn astudiaethau in vivo ac in vitro. Ar y llaw arall, prin fod E. acervulina wedi'i astudio o dan amodau in vitro. Model in vitro sydd wedi'i hen sefydlu ac a ddefnyddir yn helaeth ar gyfer haint E. tenella yw'r buchol Madin Darbyarenllinell gell (MDBK); fodd bynnag, ychydig a wyddys am addasrwydd celloedd MDBK fel celloedd cynnal ar gyfer E. acervulina. Fe wnaethon ni heintio monolayers MDBK gyda dau ddos ​​gwahanol, 5 × 104 a 2 × 105, o sporozoites E. acervulina a diwylliannau gwerthuso ar ôl-haint 24 a 96 h (hpi). Er mwyn cymharu, cynhaliom assay haint union yr un fath gan ddefnyddio E. tenella sporozoites. Er mwyn asesu atgynhyrchu parasitiaid, cafodd nifer y copïau DNA o farciwr SCAR E. acervulina a genyn E. tenella ITS-1 ei feintioli gan ddefnyddio PCR meintiol amser real. Gwelsom fod nifer y copïau E. acervulina wedi cynyddu'n sylweddol ar 24 hpi o gymharu ag E. tenella (t.<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">

Geiriau allweddol:Coccidiosis; Eimeria acervulina; Eimeria tenella; Dofednod; celloedd MDBK; Arennau

BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR AREN/ARENAU

Rhagymadrodd

Mae coccidiosis yn anhwylder economaidd bwysig yn y diwydiant dofednod (Blake et al. 2020). Mae'r clefyd yn cael ei achosi gan barasitiaid apicomplexan o'r genws Eimeria. Mae heintiad yn digwydd trwy lyncu öosystau sborau yn y geg. Unwaith y byddant yn y gwesteiwr, mae'r öosystau yn rhyddhau sporozoites sy'n ymwthio i'r celloedd epithelial berfeddol. Y tu mewn i'r celloedd lletyol, mae sporozoites yn mynd trwy gylchoedd lluosi anrhywiol a rhywiol. Felly mae oocystau'n cael eu cynhyrchu ac o ganlyniad yn cael eu gollwng yn y feces. Gall anifeiliaid heintiedig achosi colli pwysau, dolur rhydd, cynhyrchiant wyau isel, a gall y clefyd fod yn angheuol mewn rhai achosion (López-Osorio et al 2020). Mae saith rhywogaeth o Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, ac E. tenella) yn gyfrifol am coccidiosis adar yn fyd-eang. Mae morffoleg oocystau, patholeg, a difrifoldeb y clefyd yn ffactorau gwahaniaethol cyffredin ymhlith y rhywogaethau hyn. O'r saith Eimeria, E. acervulina, E. tenella, ac E. maxima yw'r rhai mwyaf cyffredin mewn ffermydd brwyliaid (Jordan et al 2018; Moraes et al 2015; Györke et al 2013). O'r 3 rhywogaeth hyn, mae E. tenella yn cael ei ystyried yn bathogenaidd iawn tra bod E. acervulina ac E. maxima yn dangos pathogenedd cymedrol (López-Osorio et al. 2020). Er gwaethaf amrywiadau mewn pathogenedd, pathogenig cymedrol Eimeria spp. megis E. acervulina gallai gynyddu difrifoldeb y clefyd yn ystod cyd-heintio (Hiob et al. 2017). Mae modelau anifeiliaid yn elfen werthfawr mewn ymchwil heintiau. Fodd bynnag, gall astudiaethau in vitro o barasitiaid coccidian gyfrannu at y ddealltwriaeth sylfaenol o'r afiechyd ar lefel cellog (Marugán-Hernández et al. 2020, Bussite et al. 2018, Thabet et al. 2017). Ar ben hynny, gallant fod yn arf defnyddiol sy'n darparu data sylfaenol ar gyfer therapïau yn y dyfodol (Thabet et al. 2017; Khalafalla et al. 2011). Oherwydd ei allu i dyfu mewn llinellau celloedd nad ydynt yn adar (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet et al. 2017), mae E. tenella wedi cael ei ddefnyddio'n helaeth fel organeb enghreifftiol ymchwil in vitro (Marugán-Hernández et al. 2020 ; Thabet et al. 2019, 2017; Khalafalla et al. 2011) a chyfeiriwyd ymdrechion sylweddol at ymchwil E. tenella in vitro ac in vivo, gan gynnwys defnyddio dulliau moleciwlaidd megis PCR meintiol amser real (RT-qPCR) (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet et al. 2019, 2017; Hiob et al. 2017; Raj et al. 2013). Adroddwyd am lai o ymdrechion ar gyfer rhywogaethau Eimeria eraill, gan gynnwys E. acervulina (Naciri-Bontemps 1976; Itagaki et al. 1974; Strout et al. 1965; Hiob et al 2017). Nod yr astudiaeth hon oedd gwerthuso goresgyniad in vitro ac atgynhyrchu sporozoites E. acervulina mewn monolayers celloedd MDBK gan ddefnyddio PCR meintiol amser real.

BYDD CISTANCHE YN GWELLA DIALYSIS AREN/ARENOL

Defnyddiau a dulliau

Darn o öosystau E. acervulina ac E. tenellao E. acervulina ac E. tenella yn cael eu trosglwyddo ar wahân mewn 11-cywion diwrnod oed iach yn unol â dull wedi'i addasu gan Eckert et al. (1995). Casglwyd oocystau wedi'u sbwylio a'u storio mewn hydoddiant deucromad potasiwm 4 y cant ar 4 gradd nes ei ddefnyddio ymhellach.Puro a dihysbyddu oocystauGlanhawyd oocystau o'r ddwy rywogaeth Eimeria o'r hydoddiant deucromad potasiwm 4 y cant. Wedi hynny, cafodd sporozoites eu cyffroi a'u puro yn ôl y dull addasedig a ddisgrifiwyd gan Rentería-Solís et al. (2020).Diwylliant celloeddMadin-Darby bucholarenDefnyddiwyd monolayers (MDBK) (DSMZ, Braunschweig, yr Almaen) fel y model haint. Cafodd celloedd MDBK eu hadu (2 × 105 cell/ffynnon) mewn 24-blatiau ffynnon gyda Chanolig Eryr Addasedig Dulbecco (DMEM) wedi'i ategu â 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS), penisilin 100 IU, streptomycin 100 ug/mL, a 2.5 ug/mL amffotericin a'i ddeor ar 37 gradd mewn awyrgylch o 5 y cant CO2 mewn aer, nes iddynt gyrraedd cydlifiad 80 y cant.Heintio celloedd MDBK ag Eimeria sporozoitesCafodd monohaenau MDBK cydlif eu brechu â sporozoites E. acervulina. Perfformiwyd astudiaethau rhagarweiniol er mwyn dewis dos haint yn seiliedig ar gyfraddau lluosogrwydd gwahanol o haint (MOI) (parasite:cell): {{0}}.25, 0.5, 1.{ {9}}, 1.5, a 5.0 (Taha et al. data heb ei gyhoeddi). Dewiswyd dau ddos ​​​​ar wahân ar gyfer haint: 5 × 104 (MOI: 0.25) neu 2 × 105 sporozoites/ffynnon (MOI: 0.5). Yna cafodd diwylliannau a oedd yn agored i haint eu deor ar 41 gradd mewn cyfrwng DMEM gyda 2 y cant FBS, 100 IU penisilin, 100 ug/mL streptomycin, a 2.5 ug/mL amffotericin. Gweithredwyd dau gyfnod deori gwahanol: 24 h ôl-haint (hpi) a 96 hpi. Cynhaliwyd set union yr un fath o ddosau haint ac amseroedd deori ar gyfer E. tenella sporozoites. Roedd pob arbrawf yn cynnwys un rheolaeth negyddol a oedd yn cynnwys monolayers MDBK heb eu heintio (celloedd heb eu heintio â NC). Perfformiwyd yr holl brofion yn driphlyg. Ar ôl 24 hpi, golchwyd celloedd deirgwaith gyda PBS di-haint (pH 7.2) ac ychwanegwyd cyfrwng newydd at y grŵp 96 hpi tra terfynwyd y diwylliannau 24 hpi. Cafodd monolayers eu trypsineiddio ar ddiwedd pob cyfnod deori (24 hpi neu 96 hpi, yn y drefn honno).

Echdynnu DNA ac adwaith cadwyn polymeras meintiol amser real (RT-qPCR)Echdynnwyd DNA o'r celloedd trypsinized gan ddefnyddio pecyn DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, yr Almaen) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Perfformiwyd RT-qPCR i feintioli copïau o ddilyniant E. acervulina a nodweddir marciwr rhanbarth chwyddedig (SCAR) Ac-R01-1731 ac ar gyfer gofodwr trawsgrifiedig mewnol E. tenella 1 o enyn DNA ribosomaidd (ITS-1) fel cydberthynas o atgynhyrchu parasitiaid. Cynhaliwyd profion RT-qPCR yn unol â'r dulliau a ddisgrifiwyd gan Blake et al. (2008) a Kawahara et al. (2008), yn y drefn honno, gyda rhai addasiadau. Yn gryno, roedd adwaith cyfaint 20 µl yn cynnwys prif gymysgedd 10 µl SYBR Green® (Thermo Scientific, Dreieich, yr Almaen), 500 nM o preimio blaen a gwrthdro (Tabl 1), 2 µl o dempled DNA, a 7 µl dŵr di-niwcleas. Ychwanegwyd rheolydd di-templed (NTC) sy'n cynnwys dŵr heb niwcleas at bob assay. Cafodd adweithiau RT qPCR eu chwyddo mewn triphlyg a'u cynnal ar System Canfod PCR Amser Real Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Feldkirchen, yr Almaen). Roedd amodau RT-qPCR yn 95 gradd am 5 munud ac yna 40 cylch o 95 gradd am 30 s. Perfformiwyd anelio ar 59.8 gradd a 58 gradd am 20 s, ar gyfer E. acervulina ac E. tenella, yn y drefn honno, ac yna un cylch ymestyn o 20 s ar 72 gradd. Cymhwyswyd rhaglen cromlin doddi yn cynnwys ystod tymheredd o 60 i 95 gradd i greu cromlin daduniad. Yn olaf, cynhyrchwyd cromliniau safonol E. acervulina ac E. tenella gan wanhad cyfresol o DNA genomig a gwanhad cyfresol o ddarnau genyn ITS wedi'u clonio (yn ôl Thabet et al. 2015), yn y drefn honno.

Dadansoddiad ystadegol

D'Agostino-Pearson and Shapiro–Wilk normality tests were used to determine the normal distribution of data. A two-way ANOVA test was used for comparison of reproduction considering time points, infection doses, and Eimeria species. Differences were considered statistically significant when p>0.05. Gwnaed yr holl ddadansoddiadau ystadegol mewn meddalwedd GraphPad Prism 9 (San Diego, CA, UDA).

Canlyniadau a thrafodaeth

Llwyddwyd i fwyhau a chanfod copïau genynnau o farciwr SCAR E. acervulina a genyn E. tenella ITS-1 trwy RT-qPCR ym mhob adwaith. Ar ôl cyfnod deori o 24 hpi, roedd nifer y copïau a ganfuwyd ar ôl cymhwyso dos o 5 × 104 sporozoites yn sylweddol uwch (p{5}}.0002) ar gyfer E. acervulina (1.88 × 105±5.56 × 104 ) nag ar gyfer E. tenella (3.60×104±5.37×103 ) (Ffig. 1). Yn yr un modd, cafwyd nifer sylweddol uwch (p=0.0002) o gopïau ar gyfer E. acervulina (4.82×105±8.50×104 ) nag ar gyfer E. tenella (1.27×105±9.32×103 ) 24 hpi ar ôl cais o 2 × 105 sporozoites (Ffig. 1). Mewn cyferbyniad, 96 hpi yn dilyn haint gyda 5 × 104 sporozoites, roedd nifer y copïau yn y diwylliannau heintiedig E. acervulina yn sylweddol (p=0.0044) yn is (6.96 × 103 ± 3.87 × 103 ) o'i gymharu ag E. . tenella (1.24 × 105 ± 1.01 × 105 ). Yn yr un modd, arweiniodd y dos uwch o 2 × 105 sporozoites a ddeorwyd â monolayers am y cyfnod hirach o 96 hpi at niferoedd sylweddol is (p{58}}.0044) o gopïau E. acervulina (3.35 × 104±1.53 × 104 ) yn cymhariaeth ag E. tenella (4.98 × 105 ± 1.28 × 105 ) ( Ffig. 1 ).

Fe wnaethon ni brofi gallu E. acervulina i ymosod ar haenau mono MDBK ac wedyn i luosi dros 24 a 96 hpi. Mae ymdrechion cynharach i werthuso diwylliant E. acervulina wedi'u cynnal gyda chanlyniadau amrywiol. Mae Strout et al. (1965) heintio gwahanol cynradd (embryo cyw iârarena ffibroblastau) a llinellau celloedd parhaol (ffibroblastau llygoden, celloedd HeLa). Mae Strout et al. (1965) bod haint celloedd adnabyddadwy ar 24 hpi ym mhob llinell gell. Yn ddiddorol, ni wnaethant arsylwi twf parasitig dros gyfnodau o fwy na 24 hpi yn unrhyw un o'r modelau celloedd a brofwyd (Strout et al. 1965) sy'n unol â'n harsylwadau o ostyngiad yn nifer y genynnau

copiau 96 hpi. Adroddodd Naciri-Bontemps (1976) dwf E. acervulina mewn cyw iârarencelloedd tan 93 hpi a gwelwyd oocyst yn ffurfio ar ôl brechu merozoites. Fodd bynnag, hyd eithaf ein gwybodaeth, ni chadarnhawyd y canfyddiadau hyn gan gyhoeddiadau diweddarach Dim ond un erthygl sydd wedi'i chyhoeddi ar haenau mono MDBK sydd wedi'u heintio ag E. acervulina sporozoites (Talebi 2001). Yn fyr, datgelodd yr awdur gelloedd MDBK a gafodd eu trin yn flaenorol â chyw iâr hyperimiwn neu antisera cwningen i E. acervulina sporozoites am 24 hpi. Cafodd diwylliannau eu staenio a chafodd sporozoites mewngellol eu cyfrif yn ficrosgopig. Yn anffodus, mae'r astudiaeth yn cyflwyno canrannau o ataliad parasitiaid gan antiserum yn unig (Talebi 2001), ac felly, ni ellir yn hawdd dod i gasgliadau ar effeithiolrwydd haint yn y model hwn. Hyd y gwyddom, ni adroddwyd am unrhyw ymdrechion pellach i ddefnyddio celloedd MDBK fel modelau haint ar gyfer E. acervulina. Yn unol â chanfyddiadau Strout et al. (1965), gwelsom atgynhyrchu parasitiaid brig ar 24 hpi a gostyngiad amlwg a gynrychiolir yn ddiweddarach gan niferoedd copi isel ar 96 hpi. Mae Strout et al. (1965) a Naciri-Bontemps (1976) yn adrodd am ddata ansoddol a ddeilliodd o ddadansoddiad microsgopeg yn unig. Fodd bynnag, mae RT-qPCR yn ddull mwy cywir a sensitif o asesu atgenhedlu parasitiaid. Mewn gwirionedd, mae RT-qPCR yn cael ei ddefnyddio'n gyffredin heddiw ar gyfer gwerthuso meintiol ac mae wedi'i sefydlu'n llwyddiannus i asesu atgynhyrchu coccidia (ee, Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería Solís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Hiob et al. 2017, Thabet et al. 2017, Raj et al. 2013, Khalafalla et al. 2011)

Fodd bynnag, gallai microsgopeg electron ddarparu data gwerthfawr ar gyfer dadansoddi datblygiad mewngellol E. acervulina mewn celloedd MDBK. Felly, dylid ei ystyried ar gyfer ymchwiliadau in vitro pellach i E. acervulina. Yn ddamcaniaethol, byddai llinellau celloedd adar yn well fel model haint in vitro ar gyfer cyw iâr Eimeria gan eu bod yn tarddu o'r gwesteiwr naturiol a gallent ganiatáu mewnwelediad mwy cynrychioliadol i ryngweithio rhwng parasit a gwesteiwr na diwylliannau celloedd sy'n deillio o famaliaid. Fodd bynnag, mae'r rhan fwyaf o'r diwylliannau celloedd cyw iâr sy'n addas ar gyfer ymchwil coccidiosis dofednod yn llinellau cynradd (Bussiere et al. 2018, Strout et al. 1965; Naciri-Bontemps 1976). Mae gan gelloedd cynradd nifer o gyfyngiadau o gymharu â diwylliannau parhaol. Un yw'r angen cyffredinol am feinwe anifeiliaid ffres i ddechrau arbrofion labordy, a all fod yn gysylltiedig â risg o halogiad (Verma et al. 2020). At hynny, i gael celloedd cynradd, mae'n rhaid aberthu anifeiliaid sy'n gwrthdaro ag ystyriaethau moesegol. Yn olaf, gall safoni llinellau celloedd cynradd fod yn gysylltiedig ag anawsterau.

BYDD CISTANCHE YN GWELLA HEINTIAD YR AREN/ARENAU

Felly, mae defnyddio llinellau celloedd anfarwoledig yn arfer cyffredinol yn y rhan fwyaf o grwpiau ymchwil sy'n gweithio ar ddiwylliant coccidia adar in vitro. Yn gyffredinol, dewisir diwylliannau parhaol sy'n deillio o famaliaid gan eu bod ar gael yn hawdd o ffynonellau masnachol a sefydlir offer fel gwrthgyrff, marcwyr, protocolau cyhoeddedig, dilyniannau genomig, ac ati, tra nad yw hyn bob amser yn wir ar gyfer llinellau celloedd cyw iâr a ddefnyddir yn llai cyffredin. . Mae celloedd MDBK yn llinell barhaol sy'n deillio o wartheg a ddefnyddir fel model in vitro ar gyfer amrywiaeth eang o gymwysiadau. Mae celloedd MDBK wedi'u hen sefydlu ar gyfer astudiaethau in vitro ar E. tenella (Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería-Solís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Thabet et al., 2alla et al. al. 2011). Roedd Marugán-Hernández et al. (2020), er enghraifft, wedi cynnal disgrifiad cynhwysfawr o ddatblygiad mewngellol E. tenella mewn celloedd MDBK. Yn yr astudiaeth hon, traciodd yr awduron drwy RT-qPCR a reverse-transcriptase amser real PCR rhaniad cellog a datblygiad cam o straen trawsgenig o E. tenella.

Ein nod oedd meintioli lluosiad E. acervulina mewn celloedd MDBK â thechnoleg PCR. Hyd eithaf ein gwybodaeth gyfredol, nid yw data o'r fath wedi'i gyhoeddi o'r blaen. Ni ystyriwyd dadansoddiad morffolegol yn ein harbrawf. Fodd bynnag, dangoswyd dro ar ôl tro (Marugán-Hernández et al. 2020, Thabet et al. 2017 a Raj et al. 2013) bod y cynnydd mewn niferoedd copïau genynnau mewn gwirionedd yn gysylltiedig â lluosi yn ystod merogony. Mae datblygiad y tu hwnt i'r cyfnod hwn o luosi anrhywiol braidd yn annhebygol o dan yr amodau a roddir yn ein harbrawf. Mewn cymhariaeth ag E. tenella, canfuom fod E. acervulina sporozoites yn goresgyn y gell ac yn lluosi ar gyfradd uwch yn ystod y 24 hpi cyntaf. Fodd bynnag, mae nifer y copïau genynnau yn gostwng yn sylweddol o 96 hpi, gan ddangos dynameg lluosi parasitiaid ar gyfer E. acervulina sy'n amlwg yn wahanol i rai E. tenella. Felly, mae'n ymddangos yn debygol bod y gwahanol rywogaethau Eimeria yn ymddwyn yn wahanol mewn diwylliant in vitro ac y dylid bod yn ofalus wrth ddod i gasgliadau cyffredinol a gafwyd gan E. tenella fel yr unig organeb enghreifftiol sefydledig. Gallai ychwanegu mwy o bwyntiau amser fod yn ddefnyddiol i werthuso deinameg lluosi in vitro yn fanylach. Gellir defnyddio technegau ychwanegol i egluro beth sy'n digwydd yn ystod y cyfnod hwn ac a all cymwysiadau ymarferol ar gyfer therapïau yn y dyfodol ddeillio o'r canlyniadau hyn.

Serch hynny, rydym wedi dangos llwyddiant ymlediad parasitiaid yn y llinell gell hon. Felly, gellid defnyddio celloedd MDBK ymhellach fel modelau haint ar gyfer goresgyniad celloedd sporozoite E. acervulina. Hefyd, argymhellir defnyddio RT-qPCR ac offer sensitif eraill. Yn bwysicach fyth, mae'r llinell gell hon hefyd yn cefnogi haint E. tenella. Gellid trosi hyn yn astudiaethau cymharol rhwng y ddwy rywogaeth Eimeria. Dylid cynnal dadansoddiadau meintiol ac ansoddol manwl pellach i asesu addasrwydd diwylliant MDBK fel matrics in vitro ar gyfer E. acervulina a chyfnodau datblygiad rhywogaethau cyw iâr Eimeria eraill. cymorth; yr ydym hefyd yn ddiolchgar i M. Fritsche, B. Schneidewind, ac R. Schumacher (Institute of Parasitology, University of Leipzig) am eu cymorth rhagorol fel ceidwaid anifeiliaid. Diolch yn fawr hefyd i R. Zhang (Coleg y Gwyddorau Anifeiliaid a Milfeddygol, Prifysgol De-orllewin Minzu) am ei chymorth gwerthfawr yn ystod gwaith labordy. Mae'r awduron hefyd yn dymuno diolch i R. Schmäschke (Sefydliad Parasitoleg, Prifysgol Leipzig) am ei waith gwerthfawr gyda pharatoi trwyddedau anifeiliaid.