Dadansoddiad Omics Integreiddiol yn Datod Llwybrau Cysylltiedig â Llid Microfasgwlaidd mewn Biopsïau Alografftau Arennau

edmund.chen@wecistanche.com

Mewn trawsblannu organau solet, mae microRNAs (miRNAs) wedi dod i'r amlwg fel chwaraewyr allweddol wrth reoleiddio swyddogaeth celloedd alografft mewn ymateb i anaf. Er mwyn cael mewnwelediad i rôl miRNAs mewn gwrthodiad wedi'i gyfryngu gan wrthgyrff, ffenoteip gwrthod a ddiffinnir yn histolegol gan lid microfasgwlaidd,aren bu biopsïau alografft yn destun proffilio miRNA ond hefyd proffilio RNA negesydd (mRNA). Gan ddefnyddio proses ddethol aml-gam unigryw sy'n benodol i'r astudiaeth BIOMARGIN (carfan darganfod, N=86; carfan ddethol, N=99; carfan ddilysu, N=298), cafodd chwe miRNA a fynegwyd yn wahaniaethol eu nodi'n gyson: miR-139-5p (i lawr) a miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (i fyny). Roedd lefel eu mynegiant yn cydberthyn yn raddol â dwyster llid microfasgwlaidd. Ymchwiliwyd i benodolrwydd celloedd genynnau targed miRNAs trwy integreiddio eu targedau mRNA in vivo gyda dilyniant RNA ungell o garfan biopsi allografft annibynnol. Roedd mynegiant miR-139-5p sy'n deillio o endothelaidd yn cydberthyn yn negyddol â mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â MHC. I'r gwrthwyneb, roedd gorfynegiant miR sy'n deillio o epithelial wedi'i gysylltu'n gryf â homeostasis electrolyte arennol diraddiedig a llwybrau sy'n gysylltiedig ag imiwnedd wedi'u hatal. Mewn celloedd imiwn, roedd miR-150-5p yn rheoleiddio actifadu NF-kB mewn lymffocytau T tra bod miR-155-5p yn rheoleiddio splicing mRNA mewn celloedd cyflwyno antigen. Gyda’i gilydd, roedd omegau integredig wedi ein galluogi i ddatrys llwybrau newydd sy’n ymwneud â llid microfasgwlaidd ac yn awgrymu bod addasiadau metaboledd mewn celloedd epithelial tiwbaidd yn digwydd o ganlyniad i wrthodiad trwy gyfrwng gwrthgyrff, y tu hwnt i’r adran endothelaidd gyfagos.

Geiriau allweddol:trawsblannu aren, microRNA, aml-omics, llid microfasgwlaidd, gwrthodiad trwy gyfrwng gwrthgyrff

BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR AREN/ARENAU

RHAGARWEINIADYntrawsblannu aren(KT), mae anaf alloimmune fel arfer yn cael ei rannu'n ddau fath o wrthod allograft yn ôl dosbarthiad gofodol ymdreiddiad imiwn a gwybodaeth am bresenoldeb neu absenoldeb gwrthgyrff gwrth-HLA sy'n benodol i roddwr. Mae'r diagnosis yn dibynnu ar y biopsi alografft gyda graddio briwiau histolegol yn ôl dosbarthiad Consensws Rhyngwladol Banff(1). Mae twbwlitis (braf "t") a llid rhyng-rhannol (braf "I") yn nodweddion histolegol dilys o wrthodiad wedi'i gyfryngu gan gelloedd T (TCMR) ac maent yn gysylltiedig â sytowenwyndra uniongyrchol i'r adran tiwbolointerstitial. Mae gwrthodiad trwy gyfrwng gwrthgyrff (ABMR) yn fwyaf aml yn gysylltiedig â chylchrediad gwrthgyrff gwrth-HLA gyda llid yn targedu'r adran microfasgwlaidd. Mae briwiau histolegol ABMR gweithredol yn cynnwys presenoldeb celloedd mononiwclear mewn capilarïau glomerwlaidd ("g"anaf) ac mewn capilarïau peritubwl (briwiau "ptc"), y cyfeirir ato gyda'i gilydd fel "llid microfasgwlaidd" (MVI). Mewn ABMR actif cronig, mae anaf cronig i feinwe fel glomerwlopathi trawsblaniad neu ffibrosis intimol rhydwelïol yn ychwanegu at y briwiau acíwt hyn(1). Gan ddefnyddio'r asiantau gwrthimiwnedd targed-T'-gell-T presennol, ystyrir bod TCMR yn cael effaith prognostig gyfyngedig, tra bod ABMR yn un o brif achosion methiant impiad, sy'n ymwneud â diffyg dulliau therapiwtig effeithol (2).

Er mwyn dod o hyd i therapïau gwell ar gyfer MVI ac ABMR, mae angen gwell dealltwriaeth o'r mecanweithiau biolegol sy'n sail i'r prosesau anafiadau hyn. Mae'n ymddangos bod technolegau omics trwybwn uchel yn addas at y diben gan eu bod yn caniatáu sgrinio miloedd o enynnau, proteinau a metabolion yn union ac ar yr un pryd(3). Holi trawsgrifiad cyfan oarenmae biopsïau alografft wedi dangos newidiadau mynegiant genynnau mRNA dwys yn y celloedd preswyl a anafwyd neu wrth ymdreiddio i boblogaethau celloedd yn ystod ABMR(4). Yn y cyfamser, mae microRNAs (miRNAs) wedi dod i'r amlwg fel chwaraewyr allweddol ym metabolaeth celloedd, trwy reoleiddio RNA negesydd (mRNA) ar y lefel ôl-drawsgrifio. Mewn gwirionedd, chwyldroodd miRNAs ein dealltwriaeth o fireinio prosesau ffisiolegol y corff sy'n ymwneud ag amlhau, apoptosis, gwahaniaethu a datblygiad(5). Nid yw'n syndod bod mynegiant miRNA wedi'i ddadreoleiddio yn arwain at ddatblygiad llawer o batholegau gan gynnwysclefyd arennol(6). Gan fod proffiliau mynegiant miRNA yn wahanol rhwng gwladwriaethau heintiedig ac iach, mae llawer o astudiaethau wedi dadansoddi miRNAs naill ai ar eu pen eu hunain neu ar y cyd â marcwyr mwy traddodiadol, nid yn unig i wneud diagnosis o glefyd a phrognostig dilyniant afiechyd ond hefyd i ddylunio cymwysiadau therapiwtig posibl (7).

Yng nghyd-destun trawsblannu organau solet, gall miRNAs ymwneud â gwrthod trwy eu rôl yn rheoleiddio swyddogaeth celloedd imiwnedd ac mewn ymateb celloedd preswyl alografft i anaf (6,8). Mae sawl astudiaeth wedi ymchwilio i miRNAs allograft fel biofarcwyr a/neu effeithyddion yng ngosodiadau TCMR (8,9), ond nid oes yr un hyd yma wedi canolbwyntio ar MVI ac ABMR.Yn yr astudiaeth hon, ein nod oedd integreiddio gwahanol lefelau omics oarenbiopsïau alografft, i gael mewnwelediad i rôl miRNAs yn y ffenoteip gwrthod niweidiol hwn.

DEUNYDDIAU A DULLIAU Dylunio AstudioMae'r astudiaeth hon yn rhan o'r BIOMARcwyr a ariennir gan FP oArennolRhaglen ymchwil Graft INjuries (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, rhif NCT02832661), dan arweiniad consortiwm ymchwil Ewropeaidd i chwilio am fiofarcwyr briwiau imiwn alografft yntrawsblaniad arenderbynwyr, gyda gwerth diagnostig a/neu prognostig. Mae BIOMARGIN yn astudiaeth amlganolfan, ddarpar, amlgyfnod, a berfformir yn bedwartrawsblaniad arencanolfannau yn Ewrop (Ysbyty Necker, Paris, Ffrainc; Ysbytai Prifysgol, Leuven, Gwlad Belg; Ysgol Feddygol Hannover, Hannover, yr Almaen; ac Ysbyty Athrofaol, Limoges, Ffrainc). Casglwyd samplau yn rhagolygol ar adeg sgrinio a biopsïau dangosiad rhwng Ebrill 2013 a Mehefin 2015 (Ffigur IA). Perfformiwyd yr holl drawsblaniadau gyda chyfatebiaethau negyddol sy'n dibynnu ar sytowenwyndra sy'n dibynnu ar gyflenwad. Yn y pedair canolfan glinigol hyn, perfformiwyd biopsïau protocol yn 3,12, ac weithiau 24 mis ar ôl trawsblannu, yn ôl arfer y ganolfan leol, yn ychwanegol at y biopsïau arwydd. Cymeradwywyd yr astudiaeth gan y bwrdd adolygu sefydliadol ar bob safle, a darparodd yr holl gleifion gydsyniad gwybodus ysgrifenedig.

Carfanau AstudioRhannwyd yr astudiaeth yn dri cham (Ffigur 1A). Yn y cam darganfod rheoli achos cyntaf, defnyddiwyd samplau biopsi N=88 ar gyfer dadansoddiad mynegiant miRNA byd-eang (N=754 miRNAs, ac eithrio miRNAs normaleiddio posibl) . Dewisasom samplau yn seiliedig ar argaeledd a meini prawf histolegol (ac eithrio achosion â diagnosis o glomerwloneffritis neu neffropathi sy'n gysylltiedig â polyomafeirws ac achosion â diagnosis aneglur). Yn seiliedig ar ddarlleniadau biopsi lleol, gwnaed detholiad cyntaf, a gafodd ei fireinio ymhellach trwy ddarllen canolog gan grŵp o batholegwyr, yn annibynnol ar y ganolfan wreiddiol. Defnyddiwyd dadansoddiad ystadegol (gweler detholiad miRNA) i ddewis y rhestr estynedig o miRNAs, a fynegwyd yn fwyaf gwahaniaethol rhwng ffenoteipiau histolegol, a gafodd eu mesur wedyn yn yr ail gam.

Defnyddiwyd cynllun astudiaeth rheoli achos tebyg ar gyfer yr ail gam (dethol), lle cynhaliwyd dadansoddiad mynegiant miRNA wedi'i dargedu (N=143) ar samplau biopsi N=99. Defnyddiwyd yr un biblinell ystadegol i ddewis rhestr hyd yn oed yn fwy cyfyngedig o miRNAs, i'w mesur wedyn yn y 3ydd cam. Yn olaf, yn y drydedd garfan (dilysu), casglwyd yr holl samplau yn rhagolygol ac yn olynol yn unol â'r protocol BIOMARGIN rhwng Mehefin 24, 2014, a Gorffennaf 2, 2015, a chydagarenansawdd biopsi allograft, eu hasesu ar gyfer y 38 miRNAs a ddewiswyd o ganlyniad i'r ail gam dethol. Yn y garfan hon o leoliadau bywyd go iawn, ni wnaethpwyd unrhyw ddetholiad yn seiliedig ar histoleg, demograffeg, amser nac unrhyw ffactor heblaw argaeledd sampl a meini prawf rheoli ansawdd (digonolrwydd biopsi a chynnyrch RNA).

Detholiad miRNADatblygwyd piblinell ystadegol gadarn yn benodol ar gyfer astudiaeth BIOMARGIN yn R(R Core Team(10), fersiwn 1.0.44), fel estyniad o'r pecyn biosignal R(1l). Yn gryno, yn y cyfnod darganfod, fe wnaethom gynnal strategaeth dewis nodweddion gan gynnwys dulliau unnewidyn ac aml-amrywedd. Ar gyfer dewis unnewidyn, defnyddiwyd prawf di-barametrig (prawf Wilcoxon-Mann-Whitney) a phrawf parametrig (prawf-t Myfyrwyr), a charfan Darganfod (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Cafodd sgoriau rhagfynegi pob trawsgrifiad miRNA ym mhob model aml-amrywedd eu hintegreiddio i roi "sgôr aml-newidyn". Trwy gyfuno canlyniadau'r dadansoddiadau unnewidyn ac aml-amrywedd hyn, roeddem yn gallu graddio a dewis is-set o ymgeiswyr miRNA i fod yn rhan o'r rhestr estynedig i'w meintioli yn ystod y cam nesaf.Ar gyfer y dadansoddiad posthoc hwn sy'n canolbwyntio ar lwybrau VMI, cymharwyd mynegiant normaleiddio canolrif pob miRNA rhwng achosion a rheolaethau gan ddefnyddio prawf Wilcoxon ym mhob un o'r tair carfan. Fe wnaethon ni reoli ar gyfer profion lluosog gan ddefnyddio dull cyfradd darganfod ffug Benjamini & Hochberg (FDR).

Asesiad ClinigopatholegolAseswyd y sgoriau briwiau histolegol unigol yn lled-feintiol yn unol â meini prawf Banff 2019(16). Defnyddiwyd y term "llid micro-fasgwlaidd" (MVI) i gyfeirio at unrhyw raddau o gyfuniad o glomerulitis (g) a/neu capillaritis periwbwl (ptc). Roedd pob achos ABMR yn bodloni 2 faen prawf cyntaf dosbarthiad Banf 2015 neu Banff 2017 (hanesyddol tystiolaeth o anaf i feinwe acíwt a thystiolaeth o ryngweithio gwrthgyrff cyfredol/diweddar ag endotheliwm fasgwlaidd), ond nid oedd pob un yn bodloni'r trydydd maen prawf [tystiolaeth serologaidd o wrthgyrff sy'n benodol i roddwr (DSA) a/neu staenio CAd]. Penderfynwyd ar DSAs ar ôl trawsblannu fesul practis canolfan leol, gyda chadarnhad y DSA wedi'i ddiffinio fel gwrthgyrff gwrth-HLA serwm penodol y gellir eu canfod gan roddwyr gyda gwerth dwysedd fflworoleuedd cymedrig (MFI) o 500 ar adeg y biopsi neu unrhyw bryd o'r blaen.

Echdynnu RNA o Samplau Biopsi ar gyfer Proffilio mRNA a miRNACymerwyd creiddiau dwy nodwydd ym mhob unarenbiopsi alografft. Defnyddiwyd un ar gyfer graddio histolegol confensiynol a chafodd o leiaf hanner y llall ei storio ar unwaith mewn Adweithydd Meinwe Allprotect (Qiagen Benelux BV, Venlo, Yr Iseldiroedd). Roedd y tiwbiau Allprotect yn cael eu storio ar 4C (o leiaf 24 awr hyd at uchafswm o 72 awr) , ac yna ei storio ar-20 gradd gradd nes echdynnu RNA. Cyfanswm RNA ei ynysu oddi wrth yarensbesimenau biopsi alografft gan ddefnyddio Pecyn Cyffredinol Allprep DNA/RNA/miRNA (Qiagen Benelux BV) ar offeryn QIAcube (Qiagen Benelux BV). Mesurwyd maint (amsugnedd ar 26{{2{0}} nm) a phurdeb (cymhareb yr amsugnedd yn 230,260, a 280 nm) yr RNA ynysig gan ddefnyddio sbectroffotomedr NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Gwyddonol/Technolegau Bywyd Ewrop BV, Ghent, Gwlad Belg). Gwerthuswyd rhif cyfanrwydd RNA (RIN) gyda Phecyn RNA nano/pico Eukaryote (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Gwlad Belg) ar offeryn Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Nid oedd mynegeion rheoli ansawdd yn sylweddol wahanol rhwng y VMI a'r No. Grwpiau MVI [RIN(cymedr±SD):5.6±1.96vs5.4±1.97,P=0.66; 260/280 cymhareb (cymedr ±SD): 1.87 ± 0.06 yn erbyn 1.87 ± 0.1l,P{{26 }}.40]. Ar gyfer samplau RNA gyda RIN isel (<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

BYDD CISTANCHE YN GWELLA DIALYSIS AREN/ARENOL

Proffilio miRNASpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >Ystyriwyd bod 35 heb eu mynegi. Dangosodd RNU44 ac RNU48 fynegiant cyson ym mhob un o'r samplau cyfernod amrywiad cymedrig (RNU44 ynghyd â RNU48) oedd 3.73 y cant yng Ngherdyn Array A a 3.79 y cant yng Ngherdyn Array B] ac fe'u defnyddiwyd fel genynnau cadw tŷ ar gyfer normaleiddio data ar draws yr holl is-astudiaethau.

mRNA Dadansoddiad TrawsgrifiadolPerfformiwyd dadansoddiad trawsgrifiadol gan ficro-arae fel y disgrifiwyd eisoes(17). Yn gryno, cafodd cyfanswm yr RNA a dynnwyd o'r samplau biopsi ei fwyhau a'i fiotinyleiddio i RNA(cRNA) cyflenwol gan ddefnyddio Pecyn Adweithydd GeneChip 39 IVT PLUS (Affymetrix) a'i groesrywio i Genom Dynol Affymetrix GeneChip U133 Plus 2.0 Araeau( Affymetrix), a oedd yn cynnwys 54,675 o setiau archwilio yn gorchuddio'r genom cyfan. Fe wnaethom ddefnyddio normaleiddio Cyfartaledd Amlsglodion Cryf (RMA). Cymharwyd mynegiant canolrif wedi'i normaleiddio o bob mRNA rhwng achosion a rheolaethau gan ddefnyddio prawf Wilcoxon. Fe wnaethom reoli chwyddiant risg alffa oherwydd profion lluosog trwy gymhwyso dull cyfradd darganfod ffug Benjamini & Hochberg (FDR). Ymdriniwyd â'r data micro-arae yn unol â chanllawiau Isafswm Gwybodaeth am Arbrawf Microarray.

Yn Silico AnalyzesDefnyddiwyd meddalwedd Dehongli Biolegol o Arbrofion Amlomeg (BIOMEX) ar gyfer dadansoddiad gwahaniaethol data trawsgrifomig, gan ddefnyddio anodiad Ensembl ID(18). Defnyddiwyd Dadansoddiad Llwybr Dyfeisgarwch (IPA, Adeiladu: 478438M Fersiwn cynnwys: 44691306, Qiagen) ac OMICSnet(19) i bennu'r setiau o enynnau a reoleiddir gan y miRNAs dethol. Defnyddiwyd OMICSnet i berfformio dadansoddiad Gene Ontology gyda chronfa ddata llwybr Reactome, gan ddefnyddio'r llwybr cyflawn (20). Roedd adeiladu rhwydweithiau genynnau yn gwbl heb oruchwyliaeth ac yn dibynnu ar nifer y rhyngweithiadau moleciwlaidd yr adroddwyd amdanynt rhwng pob genyn unigol â phob genyn arall yn y rhwydwaith. Roedd genynnau sy'n cyflwyno'r nifer uchaf o ryngweithiadau yn cael eu gosod yn awtomatig yng nghanol y rhwydwaith, tra bod y genynnau â nifer is o ryngweithiadau yn cael eu lledaenu i'r cyrion. Ymchwiliwyd i darddiad cellog miRNAs dethol gan ddefnyddio prosiect Fantom5 (21), sy'n darparu dadansoddiad cap o fynegiant genynnau mewn celloedd dynol a meinweoedd. Ar gyfer dadansoddiad mynegiant miRNA, fe wnaethom ystyried y cyfanarencelloedd strwythurol cysylltiedig a'r holl gelloedd hematopoietig sy'n cylchredeg, heb unrhyw ddetholiad pellach.

Dadansoddiad Data Dilyniannu RNA Cell SenglDefnyddiwyd data dilyniannu RNA un-gell dynol (siRNA-seq) o ddau fiopsïau ABMR a phedwar cyfeiriad iach sy'n cyfateb i fiopsïau gwyliadwriaeth trawsblaniadau a gyhoeddwyd yn flaenorol. Lawrlwythwyd y cyfrifon crai neu'r matricsau cysylltiedig yn y drefn honno o'r GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo)(22)aArennauProsiect Meddygaeth Fanwl (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Cafodd matricsau mynegiant genynnau amrwd a gynhyrchwyd fesul sampl eu huno a'u dadansoddi gan ddefnyddio pecyn Seurat V4 (23). Roedd y paramedrau a ddefnyddiwyd i greu a hidlo gwrthrychau Seurat fel a ganlyn: cynnwys celloedd sy'n mynegi rhwng 500 a 10000 o enynnau wedi'u canfod a llai na 25 y cant o drawsgrifiadau mitocondriaidd. Ar ôl hidlo, cafodd yr holl wrthrychau eu hintegreiddio gan ddefnyddio llif gwaith integreiddio SCTTransform ar Seurat (24). Yn gryno, defnyddiwyd 3000 o nodweddion ar gyfer integreiddio gan ddefnyddio swyddogaeth PrepSCTIntegration, a defnyddiwyd y swyddogaeth FindIntegrationAnchors i gyfyngu ar effaith swp. Cynhyrchwyd set ddata Cryno a Thafluniad Manifold Unffurf (UMAP) lawn gan ddefnyddio swyddogaeth DimPlot a'r 16 prif gydran uchaf. Adeiladwyd clystyrau gan ddefnyddio swyddogaethau FindNeighbors a FindClusters gyda datrysiad 0.6. Perfformiwyd adnabyddiaeth clwstwr gan ddefnyddio swyddogaeth FeaturePlot trwy werthuso mynegiant marcwyr penodol ym mhob clwstwr. Cynhyrchwyd lleiniau dot gan ddefnyddio swyddogaethau plotio DotPlot a FeaturePlot, gyda chyfrifiadau wedi'u normaleiddio yn yr assay RNA fel data mewnbwn.

BYDD CISTANCHE YN GWELLA HEINTIAD YR AREN/ARENAU

Dadansoddiad YstadegolDisgrifiwyd nodweddion cleifion a rhoddwyr yn ôl niferoedd, canrannau, ac amlder ar gyfer newidynnau categorïaidd. Gwnaethom adrodd ar newidynnau parhaus gan ddefnyddio modd a gwyriadau safonol (SD) os cânt eu dosbarthu fel arfer, canolrifau ac ystodau rhyngchwartel (IQR) ar gyfer newidynnau â dosbarthiad sgiw. Gwnaethom gymharu eu nodweddion gan ddefnyddio'r Fisher neu'r prawf Wilcoxon pan oedd yn briodol. Defnyddiwyd prawf Kruskal-Wallis i gymharu'r mynegiant miRNA canolrifol yn ôl dwyster MVI, a phrawf Spearman ar gyfer dadansoddi cydberthynas. Fe wnaethom ystyried arwyddocâd ystadegol ar gyfer gwerthoedd P yn llai na 0.05. Defnyddiwyd GraphPad Prism (fersiwn 8; GraphPad Software, San Diego, CA) ac RStudio (fersiwn 4.0.3) ar gyfer dadansoddi ystadegol a chyflwyno data. Defnyddiwyd y pecynnau R canlynol: heatmap3 (map gwres3_1.1.9)ar gyfer dadansoddiadau mapiau gwres, fmsb(fmsb_0.7.0)a phecynnau graddfeydd (graddfeydd_1.1.1) ar gyfer lleiniau radar, ggplot2 (ggplot2_3.3.5)ar gyfer graffiau bar,a complot(corrplot_0.90)ar gyfer dadansoddi matrics cydberthynas.

CANLYNIADAU

Aml-gam Adnabod miRNAs sy'n gysylltiedig â MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Cyflwynodd y 59 o gleifion eraill (MVI-) ddiagnosisau amrywiol yn cynnwys gwrthodiad trwy gyfrwng celloedd T (TCMR, N{=8), ffibrosis rhyng-raniadol ac atroffi tiwbaidd (IFIA, N=20), a biopsïau normal (N=31). }}),ondno MVI.O'r 754 o ymgeiswyr miRNA, mynegwyd 18 miRNAs yn wahaniaethol rhwng grwpiau MVI plus a MVI (Ffigur 1B). Yn y garfan ddethol, cafodd rhestr gyfyngedig o 143 miRNA ei meintoli mewn 99 sampl. Yn y garfan ddethol hon, mynegwyd 14 miRNAs yn wahaniaethol rhwng achosion gyda (N=28) a heb (N=71)ABMR(Ffigur 1C). Yn olaf, yn y garfan drawsdoriadol fwyaf, cafodd 38 miRNA eu meintioli mewn 298 o samplau, a mynegwyd 12 miRNAs yn wahaniaethol rhwng biopsi ABMR(N=29) a dim ABMR(N=269) (Ffigur 1D). ).

Adnabod 6 MiRNA sy'n Gysylltiedig â MVI yn Gyson a Chydberthynas â HistolegNesaf, fe wnaethom groesi'r 3 rhestr o miRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol a nodi 6 miRNA a oedd yn gyson gysylltiedig â MVI neu ABMR ar draws y 3 carfan annibynnol (Ffigur 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR Cafodd -155-5p, miR{7}}p a miR-223-3p eu gorfynegi yn MVI/ABMR, tra gostyngwyd mynegiant miR-139-5p. Mae lleiniau radar (Ffigur 2B) yn dangos ar gyfer pob cam y mynegiant gwahaniaethol rhwng achos a rheolaethau'r 6 miRNAs ac yn cefnogi cadernid y proffiliau miRNA ar draws y tair carfan annibynnol. Nesaf, astudiwyd sut mae'r mynegiant 6 miRNAs yn gysylltiedig â briwiau histolegol unigol ar draws pob un o'r 483 o fiopsïau alografft gyda'i gilydd. Cynyddodd mynegiant y 5 miRNA a reoleiddir i fyny yn raddol gyda dwyster briwiau MVI, tra bod cydberthynas negyddol rhwng mynegiant miR-139-5p (Ffigur 2C).MiR-139-5p/{142-3p/ Roedd 150-5p/155-5p/223-3p nid yn unig yn gysylltiedig iawn â nodweddion cysylltiedig â ABMR (g, ptc, dyddodiad C4d), ond hefyd â briwiau cysylltiedig â TCMR(i, t ) a briwiau IFTA(ct, ci), sy'n awgrymu eu bod yn cymryd rhan mewn prosesau llidiol a chreithio cyffredin nad ydynt yn benodol i ABMR. Fel arall, efallai y bydd rhywfaint o gydberthynas cynhenid ​​yn naturiol yn bodoli rhwng y briwiau, gan arwain at ein hanallu i nodi gwir benodolrwydd ar gyfer un briw. Nid oedd gan MiR-222-3p gydberthynas â briwiau histolegol TCMR neu IFTA (Ffigur 2D).

Integreiddio Aml-Omics: mRNA-miRNA Rhyngchwarae mewn MVNesaf, gwnaethom werthuso'r genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol rhwng achosion MVI plus ac MVI-, yn y set ddarganfod a gyhoeddwyd yn flaenorol (25). O'r 54,675 o chwilwyr, nodwyd cyfanswm o 2755 o enynnau a fynegwyd yn wahaniaethol (DEGs) rhwng yr MVI plus a MVI-

grwpiau, yn cynnwys 1085 o enynnau wedi'u dadreoleiddio a 1670 o enynnau wedi'u huwchreoleiddio (Ffigur 3A). Yr mRNAs a fynegwyd yn fwyaf gwahaniaethol mewn samplau MVI plws oedd CXCL9 a CXCL10, yn unol ag adroddiadau blaenorol (17,26) mai'r genynnau hyn yw'r rhai a or- fynegir fwyaf yn ABMR. Nesaf, defnyddiwyd IPA ac OMICSnet i nodi mewn silico y genynnau targed tybiedig ar gyfer pob miRNA. Rhagwelwyd y byddai cyfanswm o 4504 mRNA yn cael eu targedu gan o leiaf un o'r 6 miRNAs. Yna, fe wnaethom integreiddio'r 4504 o dargedau rhagweledig hyn gyda'r DEGs mewn biopsïau alografft. Nododd dadansoddiad miRNA/mRNA integredig 61 DEG a dargedwyd gan miR-139-5p a gynyddwyd yn sylweddol mewn MVI ynghyd â biopsïau. Nododd hefyd fod 28, 58, 52,43 a 27 DEG wedi gostwng yn sylweddol mewn MVI ynghyd â biopsïau a dargedwyd yn y drefn honno gan miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{). {22}}p,a miR-223-3p (Ffigur 3B).

Tarddiad Cellog y miRNAs MV-CysylltiedigNodweddid tarddiad cellog y chwe miRNA mewn amrywiolarennolisdeipiau cell a hematopoietig gan ddefnyddio atlas miRNA ar gael ar-lein [Cronfa ddata Fantom (27)]. Clystyrau heb oruchwyliaeth yn gwahaniaethuarennolmiRNAs sy'n deillio o gelloedd o miRNAs imiwn sy'n deillio o gelloedd (Ffigur 4A). Datgelodd hefyd un neu ddau fath o gelloedd dominyddol ar gyfer pob miRNA. Roedd yn ymddangos bod MiR{3}}p wedi'i fynegi'n bennaf gan gelloedd endothelaidd glomerwlaidd (EC). Roedd MiR-222-3p, er nad oedd ei fynegiant yn cydberthyn â llid tiwbaidd (briwiau Banff"t", Ffigur 2D), yn ymwneud yn bennaf âarennolcelloedd epithelial. Mynegwyd y pedwar miRNA sy'n weddill yn bennaf mewn celloedd mononiwclear gwaed ymylol (PBMC) neu granulocytes, gyda miR-142-3p wedi'i gyfoethogi mewn celloedd NK a monocytes, miR-150-5p mewn celloedd CD4 plus a CD8 ynghyd â T, miR -155-5p mewn CD19 ynghyd â chelloedd B a macroffagau,andmiR-223-3p mewn niwtroffiliau.

Dilyniannu RNA Cell Sengl Wedi'i Adnabod Pob Cell Arennol ac Ymdreiddio Celloedd Imiwnedd Er mwyn nodweddu rôl bosibl pob miRNA sy'n gysylltiedig â MVI, dadansoddwyd data sc-RNAseq sydd ar gael yn gyhoeddus o ddau.arennolbiopsïau alografft gyda sgoriau ABMR a MVI uchel (g2, ptc3)(22). Cafodd y setiau data hyn eu hintegreiddio â 4 biopsïau cyfeirio iach heb unrhyw MVI. Ar ôl rheoli ansawdd a hidlo, canfuwyd 31545 o gelloedd a datgelodd clystyru heb oruchwyliaeth 12 clwstwr (Ffigur 4B). Fe ddefnyddion ni farcwyr sydd wedi hen ennill eu plwyf(28) i nodi'r holl isdeipiau o gelloedd prif breswyl ac ymdreiddio a'u labelu (Ffigur Atodol S2). Nesaf, fe wnaethom ganolbwyntio ar y poblogaethau celloedd y credwyd bod ein chwe miRNA yn tarddu ohonynt. Yn y nod hwn, fe wnaethom haenu'r celloedd yn 4 clwstwr mawr sy'n cyfateb i'r endotheliwm, epitheliwm, lymffocytau, ac APCs (Ffigur 4C). Yn unol â dadansoddiad blaenorol o'r data hyn (22), ni chanfuwyd niwtroffilig na phoblogaethau celloedd NK yn y setiau data sc-RNASeg.

miR-139-5p Yn rheoli Llwybr Cychwyniad y GE a'r Llwybr Cyflwyno Antigen yn ystod MVIMiR{0}}p oedd yr unig miRNA a is-reoleiddiwyd yn ein hastudiaeth mewn achosion gyda MVI/ABMR (Ffigur 2A) a chanfuwyd ei fod yn tarddu’n bennaf o EC glomerwlaidd (Ffigur 4A). Cadarnhawyd bod chwe deg un o'i enynnau targed yn cael eu huwchreoleiddio mewn micro-arae swmp o achosion MVI plus (Ffigur 3B) ac ymchwiliwyd ymhellach i'w mynegiant ar gydraniad un cell yn y 3 is-glystyrau EC a nodwyd yn flaenorol (Ffigurau 4B, C). Fel y dangosir yn Ffigur 5A, dim ond mewn samplau MVI plws yr oedd yr ECcluster actif i'w ganfod. Yn ogystal, cynyddwyd hanner y 61 o enynnau(N=30) yn gyson mewn sc-RNAseq MVI ynghyd â biopsïau, waeth beth fo'r tri is-glwstwr CE. Ymhlith y rheini, GBP5 oedd y genyn a gynyddodd fwyaf. Nesaf, nododd dadansoddiad ontoleg genynnau gan ddefnyddio'r 30 trawsgrifiad endothelaidd hyn UBE2D1 ac YWHAG fel chwaraewyr canolog yn y rhwydwaith genynnau (Ffigur 5B). Yn fwy penodol, cyfoethogwyd llwybrau cysylltiedig ag imiwnedd a phrosesu antigen wedi'i gyfryngu gan gymhlethdodau histogydnaws mawr (MHC) (Ffigur 5C). Perfformiwyd dadansoddiad ffug-amser i nodweddu newidiadau mynegiant genynnau yn well yn ystod actifadu'r CE, cynyddodd taflwybr cyflwr Ar draws celloedd (Ffigurau 5D, E), UBE2D1, YWHAG, a GBP5 yn barhaus yn ystod actifadu endothelaidd cysylltiedig MVI. Darganfuwyd taflwybrau tebyg iawn ar gyfer genynnau sy'n gysylltiedig â MHC HLA-A, -B a -DRA ond hefyd ar gyfer actifadu endothelaidd bonafide a marcwyr llid fel VCAM1, CXCL9, a CXCL10, sy'n awgrymu bod yr holl enynnau hyn yn cael eu mynegi'n gydredol yn ystod actifadu endothelaidd. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod miR-139-5p yn cael ei leihau yn ystod briwiau MV ac nad yw bellach yn atal llwybr cyflwyno antigen MHC yn y CE wedi'i actifadu.

miR-222-3p Yn amharu ar y ddauArennolLlwybrau Ffisiolegol ac Imiwnedd mewn Celloedd Epithelial Yn ystod MVI Nesaf, fe wnaethom ganolbwyntio ar miR-222-3p, miRNA wedi'i uwchreoleiddio mewn samplau MVI gydag aarennoltarddiad celloedd epithelial a chydberthynas fwy unigryw â briwiau histolegol sy'n gysylltiedig ag ABMR (Ffigurau 2A, D, 4A). Mewn meinwe alografft swmp, cafodd mynegiant 43 o'i enynnau targed ei isreoleiddio (Ffigur 3B), a'i werthuso ymhellach ar unwaith. cydraniad cell yn y gwahanolarennolpoblogaethau epithelial a nodwyd gennym yn flaenorol (Ffigurau 4B, C). Gostyngiad enfawr o 41 o'r 43 (95 y cant) o enynnau hyn ar draws pob un a nodwydarennolmae clystyrau celloedd epithelial yn awgrymu tawelu genynnau

proffil yn VMI (Ffigur 6A). Yn ddiddorol, mae 4 genyn yn ymwneud âarennolllwybrau ffisiolegol (ERBB4, ATPIB1, TIMM50, a KIF3B), ond hefyd genynnau sy'n gysylltiedig ag imiwn (TRAPI a PEBPI) wedi'u nodi fel genynnau canolog yn y rhwydwaith (Ffigur 6B). Datgelodd ontoleg genynnol y43genau gyfoethogi yn llwybrau signalau ErbB ond hefyd mewn llwybrau sy'n gysylltiedig ag imiwn ac ymateb cytocin (Ffigur 6C) a chadarnhawyd mynegiant ERBB4 ymhellach ar draws pob un.arennolcelloedd (Ffigur 6D). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu, yn ystod VMI, lefel uchel o-222-3p mewnarennolmae celloedd epithelial yn gysylltiedig â gormes cryf o enynnau sy'n ymwneud â'r ddauarennolllwybrau homeostasis electrolyte a llwybrau sy'n gysylltiedig ag imiwn yn yr epitheliwm.

miR{0}}p Yn rheoleiddio Ysgogi NF-kB mewn Lymffocytau T Yn ystod MVI Yn yr un modd, fe wnaethom ymchwilio i rôl reoleiddiol miR-150-5p (cynnydd) yn ystod MVI yn y clwstwr celloedd T, lle y'i mynegwyd yn bennaf (Ffigur 4A). Fe wnaethom blotio'r 58 o DEGs sy'n gysylltiedig â MVI sy'n gysylltiedig â MVI a nodwyd mewn samplau biopsi alografft swmp (Ffigur 3B) ac fe wnaethom wynebu mynegiant genynnau yn y clwstwr cell T sc-RNAseq (Ffigur 7A). Roedd cyfran y genynnau a dargedwyd gan miR150-5p ac a danfynegwyd yn benodol mewn celloedd T yn ystod MVI yn rhyfeddol o isel (15/58,25.9 y cant) gan awgrymu nad oedd gostyngiad byd-eang y genynnau hyn mewn vivo yn bennaf oherwydd y Adran lymffocyt T. Serch hynny, o'r rhestr hynod ddethol hon o 15 o enynnau a chan ddefnyddio llwyfan OMICSnet, fe wnaethom adeiladu rhwydwaith genynnau (Ffigur 7B) a chynnal dadansoddiad ontoleg genynnau (Ffigur 7C). Gwelsom fod gorfynegiant miR-150-5p yn gysylltiedig â NF -KB rheoleiddio mewn lymffocytau T yn ystod MVI.

miR{0}}p Yn rheoleiddio mRNA Splicing mewn APCs Yn ystod MV Yn olaf, defnyddiwyd yr un strategaeth yn union ar gyfer y genynnau targed 52miR-155-5p-targed, a danfynegwyd yn ystod MVI (Ffigur 3B). Yn wahanol i miR-150-5p mewn lymffocytau T, gwelsom fod bron i ddau draean o'r miR-155-5p genynnau targed yn gostwng yn gyson yn y clwstwr APC sc-RNAseq (31/52,59.6 y cant , Ffigur 8A). Datgelodd dadansoddiad rhwydwaith genynnau fod AIFMI a CIAO1 yn enynnau canolog (Ffigur 8B). Ar ben hynny, datgelodd ontoleg genynnau gyfoethogiad cryf mewn llwybrau sy'n ymwneud â splicing mRNA (Ffigur 8C).

TRAFODAETHYn ôl ei ddyluniad unigryw, astudiaeth BIOMARGIN yw'r fframwaith nodweddiadol ar gyfer integreiddio data aml-omig. Yn wir, defnyddiwyd piblinellau cadarn iawn mewn carfannau darganfod, dethol a dilysu a oedd yn cwmpasu nifer fawr o gleifion o wahanol ganolfannau trawsblannu. Yn y tair carfan annibynnol, gwnaethom arsylwi a chadarnhau ar yr un pryd y proffil mynegiant rhyfedd o 6 miRNAs yn ystod MVI: gostyngwyd miR-139-5p tra bod miR-142-3p/150-5p/{5} Cynyddwyd }p/{6}}p a miR-223-3p. Yn bwysig, roedd lefel pob un o'r 6 miRNA hyn yn cydberthyn â difrifoldeb MVI, gan awgrymu mecanwaith rheoleiddio dos-ddibynnol. Fe wnaethon ni ddefnyddio llwyfannau silicon nesaf i ymchwilio i bob tarddiad cellog miRNA. Yn drawiadol, arsylwyd dau grŵp gwahanol o miRNAs: y cyntaf yn deillio o ymdreiddio i gelloedd imiwnedd ac ail yn fwy penodol i breswylwyr.arennolcelloedd. Yna, cafodd miRNAs a mRNAs eu mesur yn yr un set ddarganfod o samplau biopsi, gan ganiatáu dadansoddiad integredig o mRNAs / miRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol mewn vivo sy'n gysylltiedig â MVI. Yn olaf, ar ôl disgrifio cymdeithas mRNAs / miRNAs yn y cydraniad swmp-meinwe, cadarnhawyd rhyngweithiad mRNAs / miRNAs yn y datrysiad un gell ar gyfer pedwar o'r 6 miRNAs a nodwyd.

Yn ddiddorol, miR{0}}p oedd yr unig miRNA a oedd yn cydberthyn yn negyddol â briwiau MVI. Mae'n tarddu'n bennaf o'r CE ac adroddwyd ei fod yn rheoleiddio genynnau sy'n gysylltiedig â MHC. Ymhlith ei genynnau targed, roedd UBE2D1 wedi'i uwchreoleiddio'n fawr yn ystod actifadu endothelaidd sy'n gysylltiedig ag MVI. Mae teulu UBE2D yn deulu ensym sy'n cyd-redeg ubiquitin E2 yn y system ubiquitin-proteasome (29, 30) a dangoswyd bod UBeD1 yn gwella ubiquitin March-I, gan arwain at uwch-reoleiddio proteinau dosbarth II MHC(31). Yn ogystal, GBP5 oedd yr EC anweithredol genyn a gynrychiolwyd fwyaf yn ystod MVI, sy'n unol â'n hadroddiadau diweddar sy'n dangos bod GBP5 wedi'i uwchreoleiddio'n fawr mewn biopsïau ABMR(17) ond hefyd mewn samplau gwaed(32). Yn ddiddorol, dangoswyd bod mynegiant GBP5 yn anwythol gan interfferon math II mewn celloedd endothelaidd microfasgwlaidd crothol dynol, ynghyd â CXCL9 a CXCL10(33). Mae rôl gynnar y ddau gemocîn prolidiol hyn mewn prosesau gwrthod acíwt wedi'i ddogfennu'n dda a chynigir eu lefel mewn wrin i fonitro'r risg o wrthod acíwt mewn gwyliadwriaeth arferol o dderbynwyr trawsblaniadau aren (34). Targed miR{23}}p arall yw codau YWHAG.YWHAG ar gyfer y teulu protein o HLA-F ac fe'i disgrifiwyd fel un a fynegwyd yn wahaniaethol yn ystod y broses brofbrotig weithredol mewn neffropathi diabetig (35). Mae rôl bosibl miR-139-5p mewn ffibrosis, llwybr cyffredin terfynol ar ôl llid, hyd yn oed yn fwy perthnasol bod IFTA wedi'i gynnwys yn ddiweddar mewn sgôr cyfansawdd i ragfynegi goroesiad alografft arennau ar ôl ABMR(36). At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu nad yw miR-139-5p bellach yn atal mynegiant antigen MCH ar wyneb Anethum yn ystod MVI ac y byddai'n cymryd rhan yn y broses cemoatyniad a ffibrosis, ond mae'r mecanweithiau hyn yn parhau i gael eu cadarnhau'n arbrofol mynegiant ar yr wyneb endotheliwm yn ystod MVI a cymryd rhan mewn prosesau cemoatyniad a ffibrosis, ond erys y mecanweithiau hyn i'w cadarnhau'n arbrofol.

Yr ailarennol- miRNA deilliedig a nodwyd gennym yw miR-222- 3p, y canfuwyd bod ei fynegiant yn fwy penodol o friwiau MVI: mae'n gysylltiedig â sgorau g a PTC yn ogystal â dyddodiad C4d, ond nid â briwiau i neu t. Fodd bynnag, tarddodd yn bennaf o gelloedd epithelial. Ar ôl integreiddio aml-omig ar gydraniad celloedd, fe wnaethom benderfynu bod miR-222-3p yn atal signalau ErbB yn bennaf sy'n hanfodol ar gyfer swyddogaethau cellog sylfaenol, megis amlhau, mudo, twf a gwahaniaethu (37). Mewn bioleg ddynol, mae angen signalau ErbB ffisiolegol ar gyferarennolhomeostasis electrolyte a chynnal cyfanrwydd yr arennau (38). Nododd ein canlyniadau hefyd ADAM22, NRG1, ZNF91 fel genynnau cysylltiedig â signalau ErbB yn arbennig wedi'u hatgyfnerthu yn yr epitheliwm yn ystod MVI. Cafodd genynnau eraill sy'n hanfodol ar gyfer ffisioleg yr arennau megis ATP1B1 a KIF3B hefyd eu hatal mewn epitheliwm arennol gan miR-222-3p yn ystod MVI. Yn flaenorol, roedd Baker et al. dangos bod ATP1B1 (is-uned b1 o Na plus /K plus -ATPase) yn gyrruarennoladamsugniad tiwbaidd o sodiwm (39). Yn ogystal, mae Aguado-Fraile et al. wedi nodi bod Aelod Teulu Kinesin 3B (KIF3B) yn ymwneud â masnachu mewn celloedd mewn celloedd tiwbyn procsimol llygod mawr. Mae KIF3B yn ymddangos fel cyfryngwr allweddol o ymateb celloedd tiwbyn epithelial procsimol i isgemia/atlifiad gyda'r posibilrwydd o'i gymhwyso mewnarennolrheoli difrod isgemig (40). Gallwn felly ddyfalu bod miR-222-3p yn atal llwybrau ffisiolegol hanfodol yn ystod MVI yn yr epitheliwm. At hynny, mae llwybrau sy'n gysylltiedig ag imiwn hefyd yn cael eu rheoleiddio gan orfynegiant miR{-222-3p: cafodd genynnau pwysig fel TRAP1 a PEBP1 eu rhwystro'n llwyr mewn samplau ag MVI cryf. Yn ddiddorol, dangoswyd bod TRAP1 yn gwellaarennolffibrosis tubulointerstitial mewn llygod â rhwystr wreteral unochrog trwy amddiffynarennolmitocondria cell epithelial tiwbaidd (41). Ar ben hynny, mae PEBP1 yn darparu effeithiau gwrthlidiol trwy atal llwybrau MAPK a NF-kB o dan amodau homeostatig / gwaelodol (42). Ynarennolepithelium , astudiaeth gan Marko et al. dangosodd yn gain bod actifadu NF-kB ôl-isgemig yn gwaethygu anaf tiwbaidd ac yn gwaethygu llid (43). Yn ein dwylo ni, cafodd PEBP1 ei atal yn llwyr gan miR-222-3p, sy'n awgrymu bod y llwybr NF kB yn cael ei ryddhau yn ystod MVI. At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod bioleg epithelial yn cael ei aflonyddu yn ystod MVI aarennolMae celloedd epithelial yn ymateb yn weithredol i anafiadau MVI tra mai anaml yr eir i'r afael â chynnwys y meinwe hon mewn MVI. Gallai'r canfyddiadau moleciwlaidd hyn daflu goleuni newydd ar friwiau anaf tiwbaidd acíwt, maen prawf ABMR sydd wedi'i hen sefydlu ond sydd wedi'i esgeuluso ers amser maith. Ar ben hynny, dangoswyd y gall celloedd epithelial secrete miR-222-3p exosomal a chymell ffenoteip M2 mewn macroffagau (44). Yn y cyfamser, mae Li et al. adroddwyd yn ddiweddar iawn bod macroffagau M2 yn gorfynegi miR-155 ac yn darparu'r miRNA hwn yn y micro-amgylchedd, hefyd trwy secreting exosomes. Mewn trawsblannu aren, cynyddwyd miR-155 o dan amodau amrywiol (IFTA, gwrthodiad acíwt a TCMR) ac mewn hylif corff neu feinwe (45). Yn ddiddorol, gall miR- 155 hyrwyddo pontio epithelial-mesenchymal trwy dargedu RASSF4 mewn celloedd epithelial (46). Mae hyn yn crosstalk seiliedig ar miRNA rhwng macroffagau aarennolcelloedd epithelial yn parhau i gael eu hasesu yntrawsblannu arennauac yn fwy arbennig yng nghyd-destun MVI. Yn unol â'r canfyddiadau hyn, gwelsom fod miR{0}}p wedi'i fynegi'n bennaf gan APCs sy'n cwmpasu monocytau a macroffagau. Yn yr is-set benodol hon, datgelodd ontoleg miR- 155-5p-target-genes ontoleg gyfoethogi mewn llwybrau splicing premRNA. Yn ddiddorol, mae Janssen et al. adrodd bod llid yr ysgyfaint wedi'i achosi gan lwybrau splicing cyn-mRNA mewn macroffagau alfeolaidd. Ar ben hynny, roedd gweithrediad splicing cyn-mRNA yn wahanol mewn macroffagau sy'n byw mewn meinwe o'i gymharu â macroffagau sy'n deillio o monocyte (recriwtio gwaed). Adroddwyd am newidiadau mewn metaboledd craidd mewn macroffagau a recriwtiwyd, gyda mwy o efflux trwy glycolysis a llai o efflux trwy'r cylch asid tricarboxylic (cylch TCA, cylchred Krebs hy) (47). O ran miR-150-5p, canfuom fod ei orfynegiant yn ystod MVI yn gysylltiedig â'r llwybr NF-kB yn y clwstwr lymffocyte sy'n cwmpasu celloedd NKT cynhenid ​​​​a chelloedd T addasol. Yn ddiddorol, mae miR-150-5p yn hanfodol i gynhyrchu celloedd NK aeddfed a swyddogaethol (48) a miR-150-5p nodwyd bod celloedd CD8 plws T diffygiol yn llai sytotocsig (49). Ar ben hynny, gall celloedd CD8 T hefyd secretu miR-150-5p mewn ecsosomau (50) a allai yn ei dro hybu actifadu ffibroblast mewn celloedd epithelial tiwbaidd a dilynol.arennolffibrosis fel yr awgrymwyd gan adroddiadau diweddar (51, 52).

BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN/ARRENAU

Mae gan ein hastudiaeth rai cyfyngiadau. Fe wnaethom ganolbwyntio ein hymchwil ar 6 miRNA, a nodwyd yn gyson ar draws ein dyluniad aml-gam. Fodd bynnag, aethom ymlaen â detholiad miRNA cam-wrth-gam, gyda dim ond ffracsiwn o'r holl miRNAs hysbys wedi'u mesur yn y garfan ddilysu. Roedd y llwybr ystadegol ar gyfer dewis miRNAs yn dibynnu ar ddyluniad cychwynnol BIOMARGIN, a oedd yn addas ar gyfer nodi biomarcwyr diagnostig ar gyfer pwyntiau terfyn lluosog (ABMR, ond hefyd TCMR ac IFTA). Felly, er ei fod wedi cynyddu'n sylweddol yn y carfannau darganfod a dethol (Ffigur 2A), ni chafodd miR-146a ei feintioli yn y garfan ddilysu. Felly, cafodd miR{5}}a ei eithrio mewn gwirionedd o'n proses ddethol, er bod y llenyddiaeth yn awgrymu rôl mewn isgemia/atlifiad mewn trawsblaniadau aren (53) ac mewn rheolaeth trwy gyfrwng Treg ar ymatebion aloimiwn (54). At hynny, ni allwn eithrio y byddai maint sampl mwy pwerus wedi cynhyrchu mwy o miRNAs, megis miR-138 (i lawr) a miR-511 (i fyny) a fynegwyd yn wahaniaethol mewn achosion ABMR o'r garfan ddethol a yn dangos tuedd i'r un cyfeiriad yn y garfan ddarganfod. Ar ben hynny, ni wnaethom gynnal dadansoddiad sc-RNAseq ar ein samplau biopsi ein hunain ond defnyddiwyd set ddata sc-RNAseq sydd ar gael ar-lein. Ar adeg dylunio'r astudiaeth a chasglu samplau biopsi, nid oedd technoleg scRNAseq ar gael eto, ac nid oedd yr angen am samplau wedi'u casglu'n ffres yn caniatáu defnydd ôl-weithredol o samplau wedi'u rhewi neu mewn paraffin. Yn yr un modd, gwnaed proffilio mRNA gan ddefnyddio micro-araeau, y dechnoleg meincnod ar y pryd sydd bellach wedi'i pherfformio'n well gan RNA-seq cenhedlaeth nesaf. Mae defnyddio set ddata sc-RNAseq sydd ar gael ar-lein yn cyfyngu ar ein gallu i adrodd am nodweddion demograffig sylfaenol y cleifion. Gallai'r wybodaeth goll hon godi pryder ynghylch cynrychiolaeth grwpiau poblogaeth. At hynny, ni wnaethom reoli unrhyw agwedd dechnegol ar y dilyniant. Felly ar y cydraniad a ddewiswyd, ni chanfu ein dadansoddiad sc-RNAseq unrhyw glwstwr celloedd neutrophil neu NK yn y samplau hyn. Felly, roedd ein dadansoddiadau i lawr yr afon o miR-142-3p a miR-223-3p wedi'u cyfyngu i adeiladu eu rhwydwaith genynnau targed ac ontoleg (Ffigur Atodol S2) ac nid oeddent yn caniatáu unrhyw archwiliad cydraniad un cell. Fodd bynnag, datgelodd rhwydwaith genynnau ac ontoleg y 27 o enynnau targed miR{-223-3p gyfoethogi cylchred TCA (Ffigur Atodol S2) ynghyd â signalau ERBB. Gallwn felly ddyfalu bod miR-155-5p mewn monocytes a miR-223-3p{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{{-223-3p{{-223-3p{{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{{-223-3p{-223-3p{-223-3p) y neutrophils yn chwarae rhan ym metabolaeth ac ymateb llidiol y celloedd hyn yn ystod MVI. Ar ben hynny, dangoswyd eisoes bod miR-142-3p wedi cynyddu mewn gwrthodiad alografft arennau (9, 55, 56), ond hyd yn hyn nid oedd wedi'i gysylltu'n benodol ag ABMR. Cyfyngiad arall ar ein hastudiaeth yw y gallai newidiadau mynegiant genynnau penodol yn y celloedd ymdreiddio prin gael eu cuddio mewn dadansoddiad mynegiant genynnau swmp. Felly mae angen astudiaethau pellach gan gynnwys mwy o samplau i ganiatáu ymchwiliad priodol i'r holl isdeipiau celloedd prin, hyd yn oed, ond maent wedi'u cyfyngu ar hyn o bryd gan gost gymharol uchel y dechneg.

I gloi, gwnaethom ymchwilio yma i'r llwybrau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig ag MVI, y prif anaf histolegol yn ymwneud ag ABMR. Galluogodd y dull omeg integredig a ddefnyddiwyd ni i ddatrys llwybrau newydd sy’n ymwneud ag MVI ac mae’n awgrymu bod addasiadau i fetaboledd epithelial tiwbaidd yn digwydd o ganlyniad i ABMR, y tu hwnt i’r adran endothelaidd gyfagos. Mae ein hastudiaeth yn dangos potensial mawr aml-omeg i ddatrys mecanweithiau afiechyd ac yn paratoi'r ffordd ar gyfer ymchwiliadau newydd i egluro ymhellach y croes-siarad rhwngarennolis-setiau cell preswyl ac alografft-ymdreiddio.