Dadansoddiad O'r Tiwbwl Agosaf A Glomerwlws Yr Arennau
Mar 15, 2022
Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cliciwch yma i gael gwybodaeth am Ran II (Cyflwyniad, deunyddiau, a dulliau) yr erthygl hon.
Proffil Proteomeg Agos-Gell o'r Tiwbwl Agosaf a Glomerwlws yr Arennau Dynol Normal
Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Mehefin Qian2* a Minnie M. Sarwal1* ar gyfer Consortiwm Prosiect Meddygaeth Fanwl yr Arennau (KPMP).
1Is-adran Trawsblannu AmlOrgan, Adran Llawfeddygaeth, Prifysgol California, San Francisco, San Francisco, CA, Unol Daleithiau America
2Labordy Cenedlaethol Pacific Northwest, Is-adran Gwyddorau Biolegol, Richland, WA, Unol Daleithiau
3Labordy Gwyddorau Moleciwlaidd Amgylcheddol, Labordy Cenedlaethol Gogledd-orllewin y Môr Tawel, Richland, WA, Unol Daleithiau
4Adran Patholeg, Prifysgol Michigan, Ann Arbor, MI, Unol Daleithiau
Geiriau allweddol:glomerwlws, sbectrometreg màs, dadansoddiad un cell, proteomeg,aren
Gall asesiadau moleciwlaidd ar lefel un gell gyflymu ymchwil fiolegol trwy ddarparu asesiadau manwl o drefniadaeth cellog a heterogenedd meinwe o ran afiechyd ac iechyd. Y dynolarenmae ganddi gyflyrau amlgellog cymhleth gydag ymarferoldeb amrywiol, a gellir harneisio llawer ohono'n llwyr erbyn hyn gyda datblygiadau technolegol diweddar mewn proteomeg meinwe ar lefel un gell bron. Rydym yn trafod y camau sylfaenol yng nghymhwysiad cyntaf y dull proteomeg hwn sy'n seiliedig ar sbectrometreg màs (MS) ar gyfer dadansoddi is-adrannau o'r dynol normal.aren, fel rhan o Brosiect Meddygaeth Fanwl yr Arennau (KPMP). Gan ddefnyddio ~30-40 o gelloedd arennau micro-ddyranedig wedi'u dal â laser, gwnaethom nodi mwy na 2,500 o broteinau dynol, gyda phenodolrwydd i'rtiwbaidd procsimol(PT; n=25 proteinau) a glomerwlaidd (Glom; n=67 proteinau) rhanbarthau'rarena'u swyddogaethau metabolaidd unigryw. Mae'r astudiaeth beilot hon yn darparu'r map ffordd ar gyfer cymhwyso ein llif gwaith proteomeg bron-un-gell ar gyfer dadansoddi micro-adrannau arennol eraill, ar raddfa fwy, i ddatrys aflonyddwch swyddogaeth isgellog arennol yn yr aren arferol yn ogystal â gwahanol etiolegau. o acíwt a chronigclefyd yr arennau.
gall cistanche wella gweithrediad yr arennau
Rhagymadrodd
Gall datblygiadau diweddar mewn proffilio moleciwlaidd, yn benodol dadansoddiad trawsgrifiadol ar lefel un gell, ddatgelu poblogaethau celloedd prin o fewn meinweoedd clinigol heterogenaidd, sy'n cyfrannu at ein dealltwriaeth o fioleg yr arennau, a'i phrosesau moleciwlaidd (1-7). Mae angen heb ei ddiwallu i ddatblygu dulliau a all ddarparu gwybodaeth fiolegol gynhwysfawr ar y lefelau RNA a DNA a hefyd yn caniatáu ar gyfer dadansoddiad meinwe proteomig un-gell.
Gall technolegau proteomig, yn wahanol i genomeg, ddarparu gwybodaeth swyddogaethol am wladwriaethau cellog a rhwydweithiau rheoleiddio (2). Her dechnolegol ar gyfer proteomeg seiliedig ar sbectrosgopeg màs (MS) yw cyfyngu ar ddeunydd cychwyn. Yn wahanol i drawsgrifomeg, nid yw proteomeg yn caniatáu ar gyfer ymhelaethu moleciwlaidd. Mae'r factoid hwn wedi arwain at ymdrechion sylweddol i wella sensitifrwydd dadansoddol proteomeg sy'n seiliedig ar MS, gan gynnwys miniaturization technoleg ac effeithlonrwydd uwch yn y ffynhonnell ïoneiddiad electrospray (8, 9), fel bod y sensitifrwydd dadansoddol bellach yn ddigonol i ganfod proteinau mewn mamaliaid sengl. celloedd. Er gwaethaf y sensitifrwydd dadansoddol uchel, mae cymwysiadau proteomig i gyfeintiau sampl bach wedi cyflwyno heriau ychwanegol, megis arsugniad amhenodol o broteinau a pheptidau i arwynebau tiwbiau adweithio, cineteg treulio aneffeithlon, yr angen am lanhau, a heriau wrth gyflenwi. Yn ddiweddar, mae ein grŵp wedi adrodd ar y dull proteomeg bron-un-gell (nscProteomics) mewn celloedd HeLa, sy'n darparu technoleg hynod arloesol a sensitif ar gyfer mesuriadau proteome o samplau gyda symiau is-nanogram o brotein o nifer fach o gelloedd (10). Mae angen offer prosesu sampl hynod addas ar gyfer y dull hwn ac mae'n anodd ei drosglwyddo i labordai ymchwil eraill yn ei gyflwr datblygu presennol. Prosesu dynolarenmae meinweoedd trwy'r biblinell hon wedi gofyn am sylw manwl i ddatblygiad protocol er mwyn optimeiddio cadw meinwe a dal celloedd.
Yn yr astudiaeth hon, rydym wedi canolbwyntio ar ddarparu map ffordd ar gyfer mesur llwyddiannus o holi proteomig o wahanol is-adrannau oaren, ar lefel un gell bron, gyda'r canlyniadau canlynol: (i) Asesiad o'r dull optimaidd o gasglu a storio meinwe'r arennau ar gyfer nscProteomics; (ii) Nodi'r safon gyfeirio briodol ar gyfer nscProteomics; (iii) Optimeiddio trwch meinwe'r arennau ar gyfer microdissection dal laser (LCM); (iv) Optimeiddio paramedrau LCM; (v) Disgrifiad o'r dull nscProteomics gan ddefnyddio dull POTS micro cwbl awtomataidd yn seiliedig ar LC-MS (μPOTS; Prosesu mewn Un pot ar gyfer Trace Samples) (11); (vi) Dadansoddeg data ar gyfer nscProteomics.
Er mwyn cyflawni'r tasgau uchod, rydym wedi prosesu 11 dynol unigrywarenbiopsïau a phrotocolau a methodolegau datblygedig i gasglu, prosesu, a holi mynegiant proteomig dynolarensamplau gan μPOTS. O'i gyfuno â LC-MS hynod sensitif, rydym yn arddangos dull μPOTS cwbl awtomataidd sy'n galluogi atgynhyrchu ac yn darparu mesuriadau proteomig meintiol o ~3,000 o broteinau o 10 i 100 o gelloedd arennau micro-ddyrannu (LCM) dal laser, a lefel y cwmpas a gyflawnwyd yn flaenorol ar gyfer miloedd o gelloedd yn unig (12–17). Bydd yr astudiaeth hon yn helpu ar gyfer nodweddu moleciwlaidd heterogenedd cellog meinwe a phatholeg mewn biopsïau arennau gan gleifion ag achosion gwahanol o glefyd acíwt a chronig yr arennau. Mae gan y dechnoleg unigryw hon y potensial i ddatrys heterogenedd proteomig a marcwyr protein unigryw mewn gwahanolarenis-fathau ac is-strwythurau clefydau a fydd yn cyfateb i pathogenesis clefyd, prognosis, a haeniad risg. Crynhoir yr astudiaeth yn Ffigur 1.
Ffigur 1. Mae'r llif gwaith proteomeg ungell agos (nscProteomics) wedi'i optimeiddio ar gyfer prosesu dynolarenmeinweoedd. Mae'r llif gwaith yn cynnwys nodi optimaiddarencasglu a storio meinwe, y rheolaethau ansawdd ar gyfer microdissection dal laser sefydlu dull nscProteomics ar gyfer celloedd yr arennau.
Gweithdrefnau Arbrofol
Dylunio Astudio
Cynrychiolaeth sgematig yr astudiaethau proteomig a gynhaliwyd ar 11 normal dynol unigrywarennaua ddangosir yn Ffigur 2A. Perfformiwyd cyfanswm o 28 rhediad sbectrometreg màs (MS) ar gyfer nscProteomics micro-ddyrannu (LCM) swmp a dal laser ar adrannau glomerwlaidd pâr (Glom) a tiwbaidd troellog procsimol (PT). Meinweoedd o'r ddau gyntafarennauwedi'u cadw fel FFPE ac yn y cyfrwng cyfansawdd tymheredd torri gorau posibl (OCT). Dim ond yn OCT (Ffigur 2A) y proseswyd materion meinweoedd arennau o 9 aren arall.
Ffigur 2. (A) Crynodeb o samplau astudio a phrofion. (B) Y llain QC ar gyfer atgynhyrchu'r broses gan ddefnyddio meinwe OCT. Cafodd gwahaniaethau cyfrif sbectrol rhwng proteinau ar gyfer 2 rediad ar wahân gan ddefnyddio meinwe OCT eu plotio yn erbyn y cyfrif sbectrol protein cyfartalog ar gyfer 1,257 o broteinau. Yn y plot, mae'r llinell las yn darlunio gwahaniaeth cymedrig; mae'r llinellau coch a gwyrdd yn darlunio 2 derfyn DC a 3 SD yn y drefn honno. Mae 97.96 y cant o broteinau o fewn y terfyn atgynhyrchu a gyfrifwyd o 13.52 sy'n dynodi lefel uchel o atgynhyrchedd. Gwelir hefyd fod amrywioldeb rhyng-rediad y broses sy'n cynnwys meinwe OCT yn is na'r broses sy'n cynnwys meinwe FFPE (terfyn atgynhyrchu wedi'i gyfrifo: 24.43). (C) Cymharu dosraniadau cyfrif sbectrol o 374 o broteinau cyffredin yn OCT a FFPE. Mae nifer fwy o broteinau o feinwe OCT yn dangos cyfrif sbectrol uchel tra gwelir goruchafiaeth uwch o gyfrifon sbectrol isel ar gyfer proteinau o feinwe FFPE. (D) Cymharu dosraniadau cyfrif sbectrol o 76 o broteinau unigryw mewn FFPE a 244 o broteinau unigryw yn OCT. Gwelir y mwyafrif uwch o broteinau cyfrif sbectrol isel mewn meinwe OCT. Gall hyn ddangos bod techneg meinwe OCT yn well ar gyfer canfod proteinau toreithiog isel yn y senario presennol. Y cyfernod cydberthynas rhwng proteinau a nodwyd o 2 o feinweoedd wedi'u rhewi OCT oedd 0.96 (P <>
Caffael Sampl Meinwe Arennau
Dynolmeinweoedd yr arennaueu casglu o gyfanswm o 11 nephrectomies rhannol dad-adnabyddedig, a gafwyd gan Brifysgol California San Francisco (UCSF) a Phrifysgol Michigan (UM), gyda IRB cymeradwy, fel rhan o astudiaeth ddichonoldeb technoleg beilot yn y NIH Arennau Meddygaeth Fanwl Prosiect (KPMP). Dim ond ardal iach yarenfel y penderfynwyd gan batholegydd hyfforddedig yn cael ei ddefnyddio at y diben hwn. Cafodd samplau eu gwneud yn ddienw a'r unig gafeat oedd bod y meinweoedd yn cael eu casglu oddi wrth oedolion. Er mwyn asesu'r protocol casglu samplau gorau posibl ar gyfer y dechnoleg, i ddechrau, rhannwyd ~100 mg o feinwe o 2 aren yn gyfartal a naill ai wedi'i baratoi fel darnau meinwe wedi'i fewnosod â pharaffin wedi'i fewnosod (FFPE) fformalin neu wedi'i rewi yn y Cyfansoddyn OCT Meinwe-Plus™ (Fisher Scientific). Torrwyd un adran 5 μm a thair 10 μm o drwch yn olynol o bob bloc OCT gyda cryo-microtome a'u gosod ar sleid bilen terephthalate polyethylen 1.0 (PET) (Zeiss) ar gyfer glomerwlaidd atiwbyn procsimoldyraniad. Roedd y darn 5 μm o drwch wedi'i staenio gan H&E ar gyfer delweddu strwythurau histolegol mawr. Gadawyd y darnau 10 μm o drwch sy'n weddill heb eu staenio. Roedd yr holl sleidiau'n cael eu storio ar −80 gradd nes eu bod wedi'u dyrannu.
Cistanche ar gyfer gwella camweithrediad yr arennau
Asesiad o Effaith Cludo a Phrosesu Meinweoedd ar Allbwn Proteomig
Er mwyn asesu effaith oedi ar y dadansoddiad proteomig o feinwe wedi'i rewi OCT,arentissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 h teithio i ffwrdd, a phrosesu yn yr ail ganolfan, ac i'r gwrthwyneb. Perfformiwyd proteomeg swmp ar ddau 2 unigrywarennau(aren #3, #4), wedi'i gaffael ym Mhrifysgol Michigan, a'i gludo i 2 leoliad gwahanol (Prifysgol Talaith Ohio ac UCSF) ar gyfer dadansoddi MS, gan ddefnyddio'r un protocol a pharamedrau MS ar y ddau safle. Yna cymharwyd canlyniadau'r rhediadau MS rhwng y 2 safle.
Echdynnu Protein a Dyodiad
Cynhaliwyd hyn ar ddulliau paratoi meinwe OCT a FFPE ar gyfer dewis y dull gorau posibl ar gyfer proteomeg meinwe. Rhannwyd meinwe OCT yn adrannau 10 μm o drwch gan ddefnyddio cryomicrotome. I ddewis y swm lleiaf o feinwe sydd ei angen ar gyfer echdynnu protein ar gyfer MS, torrwyd tair cyrl (adran sy'n cael ei rhoi mewn tiwb Eppendorf yn hytrach na'i daenu ar y sleid), a 5 cyrl o feinwe wedi'i rewi, eu dadmer, a'u trosglwyddo i diwbiau microcentrifuge sy'n cynnwys glain dur gwrthstaen 5 mm (Qiagen), sy'n agored i Glustog Lysis Celloedd Mamalaidd (gan gynnwys Ateb Atalydd Niwcleas a Proteas Benzonase®; Qiagen), ac wedi'i homogeneiddio mewn TissueLyser LT (Qiagen) ar 50 r/s am 3 munud. Mesurwyd crynodiad protein (assay Bradford; Thermo Scientific) a'i storio ar −20 gradd nes ei ddefnyddio. Meinwe wedi'i storio ar gyfer<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">
Treuliad Trypsin
Roedd tua 150 ug o gyfanswm y protein (~15 y cant o'r mewnbwn sydd ar gael) yn agored i gyfryngau lleihau (200 mM DTT a 100 mM Tris-HCl) ac adweithyddion alcylating (200 mM iodoacetamide a 100 mM Tris-HCl) ac yna'n cael ei wanhau â dŵr rhydd o RNAse/DNAse i leihau crynodiad Wrea i 0.6 M. Ychwanegwyd pedwar ug o'r mochyn Trypsin (Sigma) a threuliwyd y sampl ar 37 gradd . Mesurwyd crynodiad protein (assay Bradford; ThermoScientific) a defnyddiwyd 10 ug o brotein ar gyfer MS.
MS ar gyfer Swmp Proteomeg i Asesu'r Dull Prosesu Meinweoedd Arennau Gorau
Asidiwyd y cymysgedd peptid tryptig ag asid fformig, ei lanhau â cholofnau C18 Monospin, a'i ddadansoddi ar yr Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). Perfformiwyd MS/MS gan ddefnyddio Datgysylltiad Trap C-Ynni Uwch (HCD). Dadansoddwyd sbectra màs gan ddefnyddio Byonic v2.14.27 (Protein Metrics) gan ganiatáu ar gyfer goddefiannau màs 12 ppm. Caniatawyd addasiadau ôl-gyfieithu amrywiol, gan gynnwys ocsidiad, methylation, carbamylation, a ffosfforyleiddiad. Roedd proteinau'n gyfyngedig i'r rhai a sgoriodd yn well na chyfradd darganfod ffug 1 y cant (FDR). Gwnaethpwyd cymariaethau o helaethrwydd protein a data MS i ddewis y dull gorau ar ei gyferarencasglu meinwe rhwng FFPE ac OCT.
Microdissection Dal Laser
Gosodwyd adrannau trwchus heb eu staenio 5, 10, ac 20 μM wedi'u gosod ar sleidiau PET ar lwyfan system Microdissection Laser MicroBeam Zeiss PALM (Zeiss) i brofi'r trwch torri gorau posibl. glomerwlaidd atiwbyn procsimoldewiswyd rhanbarthau gan ddefnyddio'r offeryn llawrydd a pherfformiwyd dyraniadau ar amcan 10X. Daliwyd adrannau ag arwynebedd ~4,580 μm2 a thrwch 10 uM, a oedd yn cyfrif am ~40 o gelloedd glomerwlaidd yn seiliedig ar y fformiwla a gyhoeddwyd yn flaenorol ar gyfer amcangyfrif celloedd glomerwlaidd mewn oedolyn iacharen(18). Ar gyfer ytiwbaidd procsimolcelloedd, fe wnaethom ddal ~2,900 μm2 otiwbaidd procsimolcelloedd, a oedd yn cyfrif am ~36 o gelloedd. Cafodd adrannau wedi'u torri eu catapulted i mewn i gap gludiog afloyw 200 μL (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) a'i storio ar −80 gradd.
Proteomeg Agos-Ungell-gell (nscProteomeg)
Er mwyn hydoddi proteinau a gasglwyd mewn capiau dal gyda LCM, ychwanegwyd defnyn 10 μL o 0.1 y cant DDM 50 mM Tris pH 8 yn uniongyrchol at y cap. Deorwyd samplau am 30 munud ar 37 gradd mewn thermomixer ThermoTop Eppendorf i leihau anweddiad, ac yna centrifugation ar 2,000 × g am 1 munud i drosglwyddo'r lysate i'r ffiol. Gostyngwyd proteinau gyda 5 mM dithiothreitol a deorwyd ar 37 gradd am 30 munud. Cynhaliwyd alkylation ar 10 mM iodoacetamide gyda deoriad 45 munud yn y tywyllwch ar 25 gradd. Nesaf, ychwanegwyd aliquot o 10 ng o Ls-C ac yna deor 3 h ar 25 gradd . Yna ychwanegwyd cyfanswm o 10 ng o drypsin ac yna treuliad dros nos ar 25 gradd. Cymysgwyd y peptidau wedi'u treulio ag aliquot 15 μL o 18 MΩ dŵr.
Llwyfan LC-MS ar gyfer y Samplau Ultra-Bach
Gwahanwyd samplau peptid (25 μL) gan ddefnyddio colofn 60 cm, gyda diamedr mewnol 50 μm ac allyrrydd integredig (Amcan Newydd). Roedd y colofnau wedi'u pacio'n fewnol gyda chyfryngau BEH Dyfroedd 1.7 μm mewn diamedr. Cynhyrchwyd graddiant 100-munud gan ddefnyddio pwmp nano Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Cyplyswyd y system hon â sbectromedr màs QExactive Plus (Thermo Scientific). Casglwyd sbectra màs o 300 i 1,800 m/z, gan ddefnyddio dull caffael sy'n dibynnu ar ddata o'r 12 uchaf. Casglwyd sbectra MS1 gyda chydraniad màs o 35K ac MS2 gyda 17.5K. Defnyddiwyd uchafswm TG o 100 ms i gynyddu adnabyddiaeth o ïonau digonedd isel.
Echdynnu Data Proteomig
Proseswyd yr holl ffeiliau crai gan ddefnyddio MaxQuant (fersiwn 1.5.3.30) ar gyfer canfod nodwedd, chwilio cronfa ddata a meintioli protein / peptid (19) yn dilyn gosodiadau a ddisgrifiwyd yn flaenorol (10). Chwiliwyd sbectra torfol tandem yng nghronfa ddata ddynol UniProtKB/Swiss-Prot (a lawrlwythwyd ar 29 Rhagfyr 2018 ac yn cynnwys 20,417 o gofnodion a adolygwyd). Mae'r data proteomeg MS ar gyfer nscProteomics wedi'i adneuo i'r ProteomeXchange Consortium trwy ystorfa partner PRIDE (20) gyda'r dynodwr set ddata PXD015058 a 10.6019/PXD015058.
Dadansoddi data
Cafwyd data MS o rediadau a berfformiwyd yn PNNL (nscProteomics) a Phrifysgol Stanford (proteomeg swmp). Ar gyfer proteomeg swmp. Defnyddiwyd y dulliau ystadegol canlynol ar gyfer dewis yr optimaiddarendull casglu meinwe, naill ai wedi'i rewi yn OCT neu wedi'i brosesu fel FFPE, fel yr aseswyd gan broteomeg swmp meinwe feintiol, (i) Cyfrifwyd cynnyrch protein/mg o feinwe mewnbwn cyfatebol; (ii) Profwyd atgynhyrchedd MS ar allbwn MS o adrannau FFPE ac OCT o bob un o'r 2 aren, a baratowyd gan yr un unigolyn gan ddefnyddio'r un protocol, wedi'i ddadansoddi ar yr un offeryn MS gan ddefnyddio protocol gosod, ychydig ddyddiau ar wahân (21). Defnyddiwyd terfyn atgynhyrchu (22) i ddarparu brasamcan o wahaniaethau mesur rhwymedig rhwng rhediadau olynol proses unigol yn ogystal ag amcangyfrif o drachywiredd ar gyfer cymharu prosesau. Cyfrifwyd y cyfernod cydberthynas, a ddarparodd raddau'r cytundeb rhwng rhediadau olynol (gan ddefnyddio'r un feinwe); (iii) Cyfrifwyd helaethrwydd protein a dosbarthiad maint darnau peptid i asesu amrywiadau sy'n deillio o ddiraddiad protein, croesgysylltu oherwydd fformalin, ac ati. Roedd agweddau eraill ar QC, yn cynnwys (iv) asesiad o ddrifft proses dros atgynyrchiadau ac amser trwy ddefnyddio cronfa gyffredinarencyfeirio a (v) cyfrifo tuedd. Dadansoddiad meintiol llym ac adnabod proteinau unigryw a ddefnyddir data yn unig gyda phroteinau â chyfrif sbectrol Yn fwy na neu'n hafal i 5 (23). Defnyddiwyd union brawf Fisher i asesu cyfoethogi proteinau cyffredin ac unigryw a fapiwyd rhwng dwy aren ddynol arferol, (#1 a #2). Yn seiliedig ar y dadansoddiad uchod (gweler y canlyniadau), dewiswyd meinwe wedi'i rewi OCT fel y dull casglu ar gyfer yr holl ddadansoddiadau dilynol.
Cam nesaf ffocws y dadansoddiad data oedd nodi, meintioli, a dilysu setiau protein wedi'u cyfoethogi yn y ~10-100 o gelloedd neu'n benodol iddynt a gafwyd o bob un o'r ddwy a ddewiswyd.arenis-adrannau - rhanbarthau Glom a PT, a gafwyd o'r un petharen, yn ôl swmp a LCM o OCT wedi'i rewimeinwe arennau(n=9; arennau #3–11) ac yn cael ei redeg gan nscProteomics.
Mabwysiadwyd dull hidlo lled-geidwadol cam {{0}} i ymdrin â materion yn ymwneud â data coll/anghyflawn, a defnyddiwyd y prawf G (24) i nodi a oedd y data ar Goll Ar Hap (MAR) neu Ar Goll Ddim ar Hap (MNAR). Cynhaliwyd asesiad dibynadwyedd data ychwanegol trwy ddewis yn llym y proteinau a welwyd yn Mwy na neu'n hafal i 50 y cant o'r holl samplau. Defnyddiwyd prawf-T i nodi ar gyfer proteinau gyfoethogiad sylweddol mewn glomming neu PT a chymhwyswyd cywiro profion lluosog (Benjamini-Hochberg FDR) gyda throthwy arwyddocâd o 0.1. At ddibenion y dadansoddiad, mae'r data dwysedd cymharol MS (log 2 wedi'i drawsnewid) a gafwyd o Glom, PT, a ffracsiynau swmp o unareneu hystyried yn barau. Fe wnaethom nodi proteinau wedi'u cyfoethogi yn Glom (gyda lefelau isel mewn PT / swmp), ac sy'n unigryw i Glom (absennol mewn PT) yn ogystal â phroteinau wedi'u cyfoethogi mewn PT (gyda lefelau isel mewn Glom / swmp) ac yn unigryw i PT (absennol yn Glom) . Dim ond ar ddata heb werthoedd coll ym mhob grŵp y gwnaed dadansoddiad cyfoethogi er mwyn cynyddu hyder. Defnyddiwyd y gydberthynas rhwng gwerthoedd helaethrwydd proteinau cyffredin i asesu graddau'r cytundeb rhwng proteinau is-adran wedi'u cyfoethogi rhwng rhediadau ar wahân o'r un arbrawf. Fe wnaethom hefyd berfformio traws-ddilysiad o broteinau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol ym mhob adran trwy ddosrannu'r cymariaethau hyn o setiau sampl unigryw rhwng 2 rediad gwahanol, Run 1 a Run 2. Cynhaliwyd dilysiad biolegol ar gyfer setiau o broteinau is-adran cyfoethog (Glom a PT) gan cwestiynu a ellid lleoleiddio proteinau wedi'u cyfoethogi gan isadrannau hysbys yn ôl i'w rhanbarthau penodol mewn data cyhoeddus o'r Atlas Protein Dynol (https://www.proteinatlas.org/) (25).
Cistanche ar gyfer symptomau methiant yr arennau
Cymharu/Integreiddio Data Traws-Omics
I asesu cydgordiad mynegiant protein ar lefel RNA, defnyddiwyd data a gynhyrchwyd o ddilyniant RNA un-gell (scRNA Seq) a berfformiwyd ar 10 nephrectomïau brodorol, ac roedd 9 ohonynt yn gorgyffwrdd â'rarennaua ddefnyddir mewn nscProteomics. Ar gyfer hyn, defnyddiwyd platfform 10x Genomeg Chromium gyda chemeg v3 gan ddefnyddio'r dull a optimeiddiwyd yn labordy Sarwal fel Safle Holi Meinwe (TIS) KPMP Consortium (mae llawysgrif yn manylu ar y dull a'r canlyniadau wrthi'n cael ei pharatoi). Ar gyfer y dadansoddiad traws-omeg hwn, defnyddiwyd data trawsgrifio o 45,411arencelloedd wedi'u datrys yn naw prif fath o gelloedd: Podocytes, celloedd mesangial, endotheliwm glomerwlaidd, stroma/interstitium, celloedd imiwn,tiwbyn procsimol, aelod esgynnol trwchus dolen Henle, tiwbyn distal/cysylltu, a dwythell gasglu. Gwnaethpwyd dadansoddiad o ddata un gell gan ddefnyddio fersiwn pecyn Seurat R 2.3.4. Mae dadansoddiad manylach o'r data hwn yn cael ei ddatblygu (26).
Oddi wrth: 'Proteomeg Ger-Single-Gell Proffilio'rTiwbaidd ProcsimolaGlomeruluso'r Dynol NormalArennau' gan Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4 Yang4, Wei-Mehefin Qian2* a Minnie M. Sarwal1* ar gyfer yArennauConsortiwm Prosiect Meddygaeth Fanwl (KPMP).
---erthygl WREIDDIOL YMCHWIL Blaen. Med., 17 Medi 2020 |
