Mae Celloedd Rhyngosodedig yr Arennau yn Ffagocytig Ac yn Asideiddio Escherichia Coli Uropathogenig Mewnol

edmund.chen@wecistanche.com

Arennaumae celloedd rhyngosodedig yn ymwneud â homeostasis asid-bas trwy fynegiant gwagolar ATPase. Yma rydym yn adrodd ar chwe isdeip o gelloedd rhyng-gysylltiedig dynol, gan gynnwys prif gelloedd rhyngosodedig hybrid a nodwyd o drawsgrifomeg cell sengl. Mae aeddfedu phagosome yn broses fiolegol sy'n cynyddu safle dadansoddi llwybr biolegol ar ôl dod i gysylltiad ag Escherichia coli uropathogenig mewn dau o'r isdeipiau cell rhyngosodedig. Delweddu microsgopeg confocal amser real o murinearennoltiwbiau wedi'u trylifo â phrotein fflwroleuol gwyrdd sy'n mynegi Escherichia coli neu pHrodo Gwyrdd E. coli Mae Bioronynnau yn dangos bod celloedd rhyngosodedig yn mynd ati i facteria ffagocytos ac yna'n asideiddio ffagolysosomau. Yn ogystal, mae celloedd rhyngosodol wedi cynyddu mynegiant gwagolaidd ATPase yn dilyn UTI arbrofol in vivo. Gyda'i gilydd, mae celloedd rhyngosodol yn arddangos ymateb trawsgrifiadol sy'n ffafriol i'rarennauamddiffyn, amlyncu bacteria ac asideiddio'r bacteria mewnol. Mae celloedd rhyngosodedig yn cynrychioli cell epithelial gyda nodweddion ffagosytau proffesiynol fel macroffagau.

Geiriau allweddol:clefyd yr arennau; meinwe'r arennau; celloedd arennau; arennau; arennol

Y tiwbyn casglu arennau yw'r lleoliad terfynol ar gyfer rheoliad asid-bas 1 . Mae'r tiwbyn casglu yn cynnwys prif gelloedd a chelloedd rhyngosodedig (ICs). Mae prif gelloedd (PCs) yn cyfryngu atsugniad halen a dŵr ac fe'u nodweddir gan aquaporin sytoplasmig 2 (AQP2) 2 . Mae ICs yn helpu i gynnal homeostasis asid-sylfaen ac mae ganddynt dri isdeip wedi'u disgrifio, math A (A-IC), math B (B-IC), a nonA-nonB 2,3 . Mae A-ICs yn secretu protonau trwy vacuolar apical H-ATPase (V-ATPase) ac yn atgynhyrchu bicarbonad trwy'r cludwr basilar clorid/bicarbonad (Cl − /HCO 3 ) , cyfnewid anion 1 (AE1/band 3/SLC4A1) 1,4 . Mae B-ICs yn secretu HCO 3 − trwy gludwr apical Cl − /HCO 3, pendrin (SLC26A4), a V-ATPase basochrol cyflym 2,3 . Mae gan IC cnofilod nad ydynt ynA-anB pendrin apical a V-ATPase, ond dim AE1, ac maent wedi'u nodi yn y ddwythell gasglu a'r tiwbyn cysylltu (CNT) 3 . Mae tystiolaeth gynyddol yn cefnogi rôl imiwnedd gynhenid ​​​​ar gyfer ICs ynghyd â'u swyddogaeth draddodiadol o reoleiddio pH. Yn gyntaf, mae'r mwyafrif o ddeg o gleifion nad ydynt yn gysylltiedig â distalarennolAdroddwyd bod asidosis tiwbaidd, cyflwr a nodweddir gan gamweithrediad IC, â hanes o UTI 5 . Yn ail, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), yr organeb ynysig mewn 70 y cant o acíwt pyelo-nephritis mewn gwrywod a 80 y cant mewn benywod, yn ddetholus localizes i'r cytoplasm o ICs 6,7 . Yn drydydd, gwnaethom nodi bod ICs yn mynegi peptidau gwrthficrobaidd (AMPs) fel ribonuclease 7 (RNASE7) 8-11 . Mae gan y CRhA hyn weithgarwch uniongyrchol yn erbyn amrywiaeth o bathogenau, gan gynnwys bacteria, ar y llinell sylfaen a/neu mewn ymateb i haint 8–11 . Yn bedwerydd, rydym ni ac eraill wedi adrodd yn annibynnol bod llygod â datblygiad IC annormal wedi cynyddu tueddiad i heintiau llwybr wrinol (UTIs) a / neu pyelonephritis 12,13 . Yn bumed, mae ICs yn synhwyro ac yn cyfryngu llid 14 . Yn olaf, rydym wedi dangos mynegiant genynnau imiwnedd cynhenid ​​​​mewn ICs murine ynysig 15,16

BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN/ARENOL

Mae deall sut mae ICs yn amddiffyn y llwybr wrinol rhag haint yn bwysig oherwydd deuir ar draws UTI yn aml. Mae dros 50 y cant o fenywod yn profi UTI yn ystod eu hoes, ac mae UTI yn cyfrif am 1-6 y cant o'r holl ymweliadau meddygol 17 . Pan fydd bacteria yn esgyn i'rarennaugan arwain at pyelonephritis, mae cymhlethdodau posibl yn cynnwys gorbwysedd, cronigclefyd yr arennau, ac urosepsis 18,19 . Amcangyfrifir bod 250,{3}} o achosion o pyelonephritis yn digwydd yn flynyddol yn yr Unol Daleithiau 17 . Mae ymwrthedd amlgyffuriau yn dod i'r amlwg fel her hollbwysig o ran trin UTI a heintiau eraill 20 . Felly, gallai'r mecanweithiau y mae ICs yn eu defnyddio i amddiffyn rhag uropathogenau esgynnol fod yn dargedau therapiwtig y gellid eu hecsbloetio i'w datblyguaren- therapi pyelonephritis penodol. Gan fod y rhan fwyaf o astudiaethau IC yn cynnwys modelau anifeiliaid, bydd angen gwell dealltwriaeth o ICs dynol i arwain astudiaethau gwyddoniaeth sylfaenol i ofal clinigol gwell.

Gan fod yarenyn organ gymhleth, gall proffiliau mRNA fod yn anodd eu dehongli. Er enghraifft, mae gan y neffron arbenigedd rhanbarthol gyda segmentau tiwbaidd gwahanol ac isdeipiau celloedd. Mae'rarenyn cynnwys celloedd ymfflamychol endothelaidd, epithelial, rhyngstitaidd a recriwtiedig, pob un â swyddogaethau biolegol penodol a phatrymau mynegiant genynnau. Mae dilyniannu RNA un gell (scRNA-seq) yn fethodoleg sy'n datblygu'n gyflym i nodi a phroffilio gwahanol fathau o gelloedd ar waelodlin neu mewn ymateb i straenwyr 21 . Yma, rydym yn dangos gan ddefnyddio technoleg scRNA-seq bod dynolarenMae ICs yn cynnwys chwe is-set gwahanol sy'n cynnwys tri A-IC, un IC-PC hybrid, un IC nonA-nonB, ac un B-IC. Datgelodd dadansoddiad cyflymder RNA symudiad trawsgrifiadol o gyfrifiaduron personol tuag at is-setiau A-IC ar amlygiad UPEC. Datgelodd Dadansoddiad Llwybr Dyfeisgarwch aeddfedu ffagosom fel y llwybr biolegol allweddol mewn is-set A-IC ar amlygiad UPEC. O fewn y llwybr hwn, V-ATPases yw'r cydrannau allweddol dan sylw. Fe wnaethom ddefnyddio microsgopeg mewnbywydol i ddelweddu'r nifer sy'n derbyn UPEC in vivo gan IC a chadarnhawyd asideiddio UPEC wedi'i fewnoli yn yr ICs hyn. Yn olaf, dangosodd model UTI murine gynnydd mewn mynegiant mRNA V-ATPase (Atp6v1b1). Bydd yr astudiaeth hon yn darparu'r sylfaen i archwilio a thrin V-ATPase yn therapiwtig gan fynegi celloedd epithelial fel ffagosytau bacteriol.

Canlyniadau

Gellir cyfoethogi ICs dynol trwy ddidoli celloedd magnetig-actifedig (MACS) gyda gleiniau magnetig wedi'u gorchuddio â derbynnydd ffactor twf mast / bôn-gelloedd (CD117/c-KIT). Dynolarenmeinwe, yn bennaf o ymylon arferol oarenechdoriadau torfol, wedi'i rannu'n ddarnau 2–4-mm yna'n cael eu trosglwyddo dros nos i'n labordy yn Modified Eagle Medium (DMEM) Dulbecco ar iâ gan y Cooperative Human Tissue Network [https://www.chtn.org]. Gwnaethom werthuso c-KIT fel marciwr arwyneb celloedd i ddidoli ICs dynol oherwydd bod c-KIT wedi'i ddefnyddio'n llwyddiannus at y diben hwn mewn llygod 22 . Mynegiant c-KIT wedi'i leoleiddio i IC dynol yn seiliedig ar y canfyddiad bod c-KIT a'r marciwr IC dynol V-ATPase, is-uned B1 (genyn ATP6V1B1), wedi cyd-labelu'r un celloedd yn y dynolarenadran (Atodol Ffig. 1) 22,23 . Yn dilyn didoli magnetig a oedd yn cynnwys tynnu CD45 ynghyd â chelloedd imiwnedd a chelloedd marw; dangoswyd cyfoethogi ICs tybiedig c-KIT-positif gan fynegiant mRNA ATP6V1B1 a gynyddodd 8-12-plyg mewn c-Kit-positive o'i gymharu â'r celloedd c-KIT-negyddol. Roedd SLC4A1 a SLC26A4 wedi'u cyfoethogi'n amrywiol mewn ICs gan ddangos bod cyfoethogi A-IC a/neu B-IC yn bosibl gan ddefnyddio'r fethodoleg hon (Ffig Atodol 2). Cyflwynir cefndir y meinwe arennau a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl Atodol 1.

Nododd dadansoddiad clwstwr integredig chwe isdeip IC.Cwblhawyd ScRNA-seq ar 1861 datgysylltiedigarencelloedd a gyfoethogwyd ar gyfer ICs fel y disgrifir uchod. Cafwyd yr ICs cyfoethog o ymylon arferol unarenechdoriad torfol. Pasiwyd hidlo rheoli ansawdd (QC) gan 859 o gelloedd a oedd yn agored i UPEC in vitro am 1h a 1002 o gelloedd yn agored i halwynog in vitro am 1h. Nododd dadansoddiad swyddogaeth Seurat 12 clwstwr yn y paratoad cell didoli (Ffig. 1a). Mae'r naw marciwr sydd wedi'u cadw fwyaf ym mhob clwstwr wedi'u cyflwyno mewn Ffigiau Atodol. 3–14. Yn gyffredinol, roedd isdeipiau IC yn cyfrif am 1066 (57 y cant) o'r 1861 o gelloedd. Roedd chwech o'r clystyrau yn cynrychioli isdeipiau IC. Yn benodol, canfuom dri A-IC, un B-IC, un nonA-nonB-IC, ac un is-fath(au) hybrid PC-IC.ArennauEnwebiad celloedd epithelial a argymhellir gan Chen a chydweithwyr, defnyddiwyd gwneuthurwyr cadwraeth yr adroddwyd yn flaenorol eu bod yn farcwyr math o gell neu farcwyr cydwasanaeth a oedd yn gwahaniaethu rhwng un o'r 12 clwstwr ac eraill i aseinio math o gell i bob clwstwr (Tabl Atodol 2 , Ffigur 1b, c, Ffig. 2) 24–28 .

Mae is-deip A-IC a mynegiant protein PC-IC hybrid yn cydberthyn â chanlyniadau scRNA-seq. Fe wnaethom ddilysu canfyddiadau scRNA-seq allweddol, yn benodol bod SLC8A1 (y cyfeirir ato hefyd fel cyfnewidydd Na plus / Ca plus 1 (NCX1)) yn farciwr ar gyfer PC-ICs hybrid a bod aelod o deulu protein sioc gwres A (Hsp70) 1A (HSPA1A) o deulu sioc gwres. ynghyd ag ymateb twf cynnar 1 (EGR1) yn farcwyr sy'n gallu gwahaniaethu isdeipiau A-IC (Ffig. 3). Oherwydd i ni ddefnyddio'r ymylon arferol oarenechdoriadau canser, gwnaethom ddilysu bod ein SLC8A1, HSPA1A, ac EGR1arenroedd patrymau mynegiant yn gyson â'r hyn a welir yn normalarenmeinwe o'r Atlas Protein Dynol ar gael o http://www.proteinatlas.org (Ffig Atodol 15) 29

Casglu proffiliau marciwr isdeip cell dwythell a ddangoswyd yn flaenorol yn murinearencelloedd yn parhau i fod yn gyfan i raddau helaeth mewn dynolarencelloedd. Oherwydd y bydd yn bwysig cyd-destunoli canfyddiadau model murine yn y dyfodol i bathoffisioleg ddynol, fe wnaethom werthuso mynegiant IC dynol o farcwyr celloedd dwythell casglu murine a nodwyd yn flaenorol mewn astudiaethau scRNA-seq a berfformiwyd gan Chen et al. 22 a Ransick et al. 30 . Cyflwynir plot dot o'r canlyniadau yn Ffig. 4. Mae marcwyr math celloedd dwythell casglu murine yn cael eu cadw'n bennaf mewn celloedd dwythell casglu dynol.

Mae is-fath A-IC yn cynyddu yn y ganran gymharol gydag 1 awr o amlygiad UPEC. Roedd canrannau'r celloedd o fewn clystyrau yn gyson rhwng y math o ddatguddiad ac eithrio is-fath A/clwstwr A-IC 0, a gynyddodd o 16.2 i 20.1 y cant, ac is-deip A-IC C/clwstwr 5, a ostyngodd o 9.4 i 6.6 y cant , gyda datguddiadau halwynog vs. UPEC, P =0.03 (Tabl 1).

Mae celloedd PC-IC hybrid yn newid eu cyflymder RNA i ffwrdd o gyfrifiaduron personol a thuag at A-ICs mewn ymateb i 1 awr o amlygiad UPEC. Gellir defnyddio digonedd cymharol cyn-mRNAs heb eu plicio a drawsgrifiwyd yn ddiweddar yn erbyn mRNA aeddfed spliced ​​i gyfrifo'r newid yn helaethrwydd mRNA, a elwir yn gyflymder mRNA 31 . Mae cyflymder mRNA positif mewn astudiaethau un gell yn dangos bod genynnau'n cael eu huwchreoleiddio lle mae cyflymder mRNA negatif yn golygu bod genynnau'n cael eu hisreoli 31 . Mae cyfeiriad cyflymder RNA yn awgrymu bod gan gell taflwybr mynegiant mRNA tuag at fath arall o gell 31,32 . Cyflwynir y cyflymder mRNA mewn ymateb i amlygiad UPEC yn Ffig. 5. O bwysigrwydd, mae PC-ICs hybrid yn newid eu cyflymder RNA i ffwrdd o gyfrifiaduron personol a thuag at ICs mewn ymateb i UPEC. Yn ogystal, mae ICs yn cynnal eu gweithgaredd trawsgrifio, tra bod gweithgaredd trawsgrifio yn dod yn fach iawn mewn eraillarenmathau o gelloedd.

Mae proffil imiwnedd cynhenid ​​yr arennau yn dangos rhai newidiadau mynegiant un-gell cynnar yn dilyn 1 awr o amlygiad UPEC.Mae patrymau mynegiant scRNA-seq o enynnau imiwnedd cynhenid ​​dethol yn dilyn datguddiad UPEC yn erbyn halwynog am 1 awr yn cael eu cyflwyno mewn Ffigys Atodol. 16 ac 17. Mae'r canfyddiadau allweddol yn cynnwys mynegiant uchel o'r adrenomedullin AMP (ADM) yn isdeipiau A-IC A a B, PC-ICs hybrid, a B-ICs. Nid yw cyfrifiaduron personol yn mynegi adrenomedullin ar y llinell sylfaen ond maent wedi cynyddu mynegiant yn sylweddol mewn ymateb i amlygiad UPEC. Mae mynegiant SH sytocine-anwythadwy sy'n cynnwys protein (CISH) a mynegiant rhwystr i awto-integreiddio ffactor 1 (BANF1) yn cael ei ysgogi'n sylweddol mewn ICau nad ydynt ynA-anB yn dilyn datguddiad UPEC. Nodwyd Interleukin 18 (IL18), galectin 3 (LGALS3), beta defensin 1 (DEFB1), a thrawsddygiadur signal CD24 lipocalin 2 / neutrophil lipocalin cysylltiedig â gelatinase (LCN2 / NGAL) yn unig.

mewn PC-ICs hybrid a dim ond ychydig iawn o fynegiant mRNA derbynnydd tebyg i doll oedd yn bresennol. Ni wnaethom nodi mynegiant ribo-niwcleas 7 (RNASE7) ar scRNA-seq. Fe wnaethom werthuso mynegiant mRNA RNASE7 mewn IC cyfun wedi'i ddidoli'n fagnetig a heb fod yn ICarencelloedd. Nodwyd mynegiant mRNA RNASE7 mewn ICs o un allan o bedwararennau(Ffig Atodol. 18).

Mae'r broses fiolegol o aeddfedu phagosome yn gysylltiedig ag ICs sy'n agored i UPEC am 1h.Cafodd y deg llwybr biolegol blaenllaw sy’n gysylltiedig â phob clwstwr eu graddio yn ôl gwerth p fel y’i pennwyd gan Ddadansoddiad Llwybr Dyfeisgarwch. Roedd gan dri chlwstwr casglu a neilltuwyd dwythell A-IC isdeip A/clwstwr 0, is-deip A-IC B/ clwstwr 3, ac is-deip A-IC C/clwstwr 5 brosesau llwybr biolegol gwahaniaethol yn dilyn datguddiad UPEC o gymharu â halwynog (Ffig. .6a–c). Aeddfediad phagosome oedd y ffwythiant safle uchaf mewn celloedd a oedd yn agored i UPEC a halwynog yn is-deip A-IC C/clwstwr 5, wedi'i symud o'r ail i'r safle cyntaf yn is-deip A-IC/clwstwr 0 ac o'r pedwerydd safle i'r trydydd safle uchaf mewn is-deip A-IC B/ clwstwr 3. Nid oedd gan yr un o'r isdeipiau cell dwythell casglu a oedd yn weddill (Ffig Atodol. 19) y deg llwybr cysylltiedig uchaf a oedd yn wahanol yn dilyn datguddiad UPEC o'i gymharu â halwynog. Cyflwynir y proffil mynegiant genynnau a arweiniodd at safle aeddfedu phagosome ar gyfer is-deip A/clwstwr A-IC 0 yn Nhabl Atodol 3.

Mae mynegiant mRNA IC Atp6v1b1 yn cynyddu mewn ymateb ipyelonephritis arbrofol in vivo.Amlygodd y llwybr aeddfedu phagosome Ingenuity V-ATPase fel rhan o ICs (Tabl Atodol 3). Er mwyn penderfynu a yw V-ATPase yn cael ei actifadu ar amlygiad UPEC, gwnaethom ddefnyddio model UTI murine. UPEC un awr ar ôl trawswrethraol yn erbyn brechiad halwynog "Gohebydd IC" llygod, sydd â mynegiant tdTomato (tdT, amrywiad protein fflwroleuol coch) mewn ICs, eu ewthaneiddio a chyfoethogwyd ICs o ddatgysylltiadcelloedd yr arennau. Roedd gan ICs cyfoethog fynegiant mRNA Atp6v1b1 uwch mewn llygod â brechiad UPEC o'i gymharu â rheolaeth halwynog (Ffig. 6d).

Mae ICs yn ffagocytize UPEC in vivo.Fe wnaethom ddatblygu methodoleg i ddarlifo unarentiwbyn gyda UPEC mewn llygoden fyw gyda chyfanaren.Protein fflwroleuol gwyrdd (GFP)-mynegi agregau UPEC microperfused i mewn i lwmen tiwbyn arennau sengl o "gohebydd IC" llygod yn visualized llifo drwy tiwbiau, ddetholus glynu at yr wyneb luminal a chael eu mewnoli gan ICs (Ffig. 7) yn ystod microsgopeg intravital.

Mae ICs yn asideiddio UPEC sy'n cynnwys phagolysosomau in vivo ain vitro.Fe wnaethom hefyd drylifo tiwbiau gyda Biogronynnau E. coli pHrodo Green sydd ond yn fflworoleuol pan fyddant wedi'u asideiddio. Dim ond yn ystod \ microsgopeg intravital mewn ICs y lluniwyd y nifer sy'n derbyn a fflworoleuedd y bioronynnau hyn (Ffig. 8). Dangosodd dadansoddiad segmentu Imaris fod fflworoleuedd gwyrdd wedi cynyddu'n sylweddol dros amser mewn tdT ynghyd â ICs o fewn 2 diwbyn wedi'i ddarlifo â Bioronynnau E. coli pHrodo Green o'i gymharu â tdT rheoli ynghyd â thiwbyn (Ffig. 9a, b). Pan werthuswyd fflworoleuedd ar sail cellog, dangosodd 12/16 (75 y cant) tdT ynghyd â chelloedd gynnydd mewn fflworoleuedd gwyrdd dros amser yn dilyn darlifiad tiwbaidd gyda Bioronynnau E. coli pHrodo Green (Ffig. 9b). Mae'r canlyniadau atchweliad llinol o bob cell wedi'u cyflwyno yn Nhabl Atodol 4. Dilyswyd canfyddiadau delweddu mewn-bywyd in vivo o ffagocytosis ac asideiddio Bioronynnau E. coli PHrodo Green gan IC gan ddefnyddio assay cytometreg llif in vitro. Murinecell arennauataliad o lygod "IC reporter" lle'r oedd ICs (CD45 - tdT plus ) yn mynegi tdT mewndarddol yn agored i pHrodo Green E. coli BioParticles yn erbyn celloedd â chyfryngau yn unig. Cafodd CD45 ynghyd â chelloedd imiwnedd preswyl mewn ataliad celloedd eu gatio fel rheolaeth gadarnhaol a chafodd celloedd CD45 - tdT - (di-ICs) eu porthi fel rheolaeth negyddol. Cymharu cyfryngau yn unig â

Cynyddodd amlygiad bioronynnau, fflworoleuedd gwyrdd sy'n arwydd o gaffael bioronynnau ac asideiddio o {5.7 i 62.8 y cant o gelloedd CD45 a mwy. Mae'r canfyddiad hwn yn dangos y cymeriant bacteriol disgwyliedig gan ffagosytau proffesiynol fel niwtroffiliau. Yn ddiddorol, roedd gan 22.2 y cant o'r ICs ddefnydd o fiogronynnau gwyrdd o'i gymharu â 5.6 y cant o'r rhai nad oeddent yn IC (Ffig Atodol 20), roedd gan reolaeth cyfryngau ddefnydd mewn 0.7 y cant o ICs a 0 y cant o'r rhai nad oeddent yn ICs.

Trafodaeth

Mae'n anodd astudio ICs, yn enwedig mewn bodau dynol, oherwydd eu bod yn cynnwys dim ond 7 y cant ohonyntarencelloedd, yn cynnwys ystod o isdeipiau, ac nid ydynt yn cadw eu ffenoteip mewn meithriniad 33 . Roedd Chen et al. Adroddodd 22 ddadansoddiad un-gell ar murinearencelloedd a Llyn et al. adroddodd piblinell dilyniannu RNA un-niwclews ar ddynolarencelloedd 34,35 . Nododd yr astudiaethau hyn ddau is-fath o A-IC. Yma, rydym wedi datblygu methodoleg i berfformio dilyniannu un-gell ar ICs dynol cyfoethog hyfyw. Fe wnaethom gyfoethogi ar gyfer ICs hyfyw yn hytrach na dilyniannu pob unarencelloedd i ganiatáu mwy o ffocws ar y math hwn o gell. Ein prif ganfyddiadau oedd (a) nodi y gall PCs-IC hybrid newid eu cyfeiriad cyflymder RNA i ffwrdd o gyfrifiaduron personol a thuag at A-ICs mewn ymateb i amlygiad UPEC, (b) bod o leiaf dri is-fath o A-ICs yn bodoli a'u perthynas. gall amleddau symud mewn ymateb i amlygiad UPEC, (c) mae aeddfedu phagosome yn llwybr biolegol blaenllaw mewn isdeipiau A-IC lluosog a gall gynyddu mewn arwyddocâd cymharol gydag amlygiad UPEC, a (d) ffagocytose ICs ac asideiddio UPEC in vivo yn ystod delweddu byw llygod.

Mae ICs yn gwahaniaethu mewn ymateb i asidosis trwy wrthdroi eu polaredd 36,37 . Adroddwyd bod ICs yn deillio o AQP2- yn mynegi celloedd 38 . Yn 2017, nododd Chen a chydweithwyr gelloedd dwbl-bositif a fynegodd Aqp2 ynghyd â Slc4a1 neu Slc26a4 trwy broffilio un-gell murine. Dilyswyd y canfyddiadau hyn gan Park a chydweithwyr y flwyddyn ganlynol 22,35 . Yn 2019, fe wnaethom ddangos trwy imiwn-labelu protein a mRNA fod PC-ICs hybrid yn bodoli 15 . Yn benodol, mynegodd 9 y cant o ICs murine a ddiffinnir gan imiwnolabelu fflwroleuol V-ATPase B1 hefyd Aqp2 mRNA a ddiffinnir gan hybridization fflwroleuol yn y fan a'r lle 15 . Diffiniodd yr astudiaeth bresennol boblogaeth o boblaren-casglu celloedd dwythell sy'n mynegi AQP2, ATP6V1G3, a SLC4A1 yn gyson â PC-ICs hybrid. Ar leiniau TSNE ac UMAP, roedd y celloedd hybrid hyn yn clystyru agosaf at gyfrifiaduron personol, ond roeddent yn wahanol i gyfrifiaduron personol traddodiadol yn seiliedig ar fynegiant marciwr IC. Roedd mynegiant SLC8A1 yn wahanol i'r math hwn o gell. Yn ddiddorol, mae SLC8A1 yn ymwneud yn fawr â thrawsnewid epithelial-i-mesenchymal. Yn benodol, mae absenoldeb SLC8A1 yn trawsnewid ffenoteipiau celloedd epithelial trwy ansefydlogi E-cadherin trwy gyfrwng catenin 39 . Yma, rydym yn dangos bod ICs yn gwahaniaethu mewn ymateb i amlygiad uropathogen. Mae celloedd PC-IC hybrid yn newid eu cyflymder RNA, sef deilliad amser mynegiant mRNA, i ffwrdd o gyfrifiaduron personol a thuag at A-ICs mewn ymateb i UPEC. Mewn llygod, mae Ransick et al. Nododd 30 fynegiad Slc8a1 yn bennaf yn y tiwbyn troellog distal a chelloedd sy'n debyg i gyfrifiaduron personol yn y tiwbyn cysylltu. Ar ein delweddau microcopi confocal yn gwerthusoarenMynegiant SLC8A1, canfuom gelloedd ynysig a fynegodd SLC8A1 mewn tiwbiau positif AQP (ee, casglu dwythellau neu tiwbiau cysylltu). Fe wnaethom hefyd nodi tiwbiau negyddol AQP lle'r oedd y rhan fwyaf o gelloedd yn mynegi SLC8A1, a allai fod yn gyson â'r mynegiant tiwbyn troellog distal uchod Slc8a1 mewn llygod. Mae gan rai isdeipiau A-IC lwybrau biolegol blaenllaw gwahaniaethol yn dilyn datguddiad UPEC ac is-fath A-IC wedi cynyddu mewn amlder cymharol mewn ymateb i UPEC. Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos y gallai is-fath A-IC gynrychioli amrywiad imiwnedd cynhenid. Mae angen ymchwilio i rôl SLC8A1 mewn gwahaniaethu IC mewn astudiaethau yn y dyfodol.

BYDD CISTANCHE YN GWELLA METHIANT YR AREN/ARENAU

Fe wnaethon ni berfformio scRNA-seq ar 1861 dynolarencelloedd yr oedd 1066 ohonynt yn IC. Er mwyn rhoi modelau arbrofol murine yn eu cyd-destun i bathoffisioleg ddynol, bydd yn bwysig cymharu ICs dynol a murine. Cyfoethogodd Chen a chydweithwyr ar gyfer ICs murine gyda c-KIT a pherfformio scRNA-seq 22 . Dosbarthwyd 74 o gelloedd fel cyfrifiaduron personol, 87 fel A-ICs, a 23 o gelloedd fel B-ICs 22 . Roedd Ransick et al. Perfformiodd 30 scRNA-seq ar 688 IC. Nid oeddent yn cyfoethogi ar gyfer IC ond yn hytrach yn rhannu'rareni mewn i'r cortecs, medwla mewnol, a medwla allanol i werthuso gwahaniaethau parthau 30 . Fe wnaethom ddatgan ei bod yn ymddangos bod mynegiant marciwr math celloedd dwythell casglu murine wedi'i gadw'n bennaf mewn celloedd dwythell casglu dynol. Mae'n debygol y bydd angen gwerthusiad un-gell wedi'i dargedu o nifer fwy o IC murine p'un a oes gan lygod isdeipiau A-IC tebyg i bobl.

Fe wnaethom nodi mynegiant scRNA-seq IC o broteinau imiwnedd cynhenid ​​​​fel y cyfryngwr imiwn ac ymfflamychol galectin 3 (LGALS3) a'r ADM yr ydym wedi adrodd yn flaenorol mewn ICs cnofilod 15,40-42 . Fodd bynnag, ychydig iawn o fynegiant oedd gan rai proteinau imiwnedd cynhenid ​​allweddol a adroddwyd yn flaenorol mewn ICs, megis Lipocalin 2 (LCN2 / NGAL), RASE7, a derbynnydd tebyg i doll 4 (TLR4) neu ni chawsant eu gweld mewn ICs dynol ar y lefel un gell yn ein dadansoddiad 6,9. Mae prinder mynegiant LCN2/NGAL a TLR4 mewn ICs yn gyson â'r hyn a adroddwyd mewn ICs murine gan ein grŵp ymchwil ynghyd â Ransick et al. 30arencellexplorer/] 15 . Roedd Chen et al. Adroddodd 22 am rywfaint o fynegiant mRNA TLR4 a NGAL mewn ICs, ond mae sawl un yn plygu llai nag mewn cyfrifiaduron personol. Fe wnaethom werthuso ICs dynol cyfun ar gyfer mynegiant RASE7 a'i nodi mewn ICs o 1 allan o 4arennau(Ffig Atodol 18), sy'n nodi y gall ei fynegiant fod yn ysbeidiol yn dibynnu ar ranbarth, pwynt amser, ac amodau ffisiolegol. Dangoswyd bod mynegiant CISH, sy'n cael ei achosi mewn IC nonB nonB mewn ymateb i UPEC, yn rheoleiddio'r ymateb imiwn cynhenid ​​​​i Mycobacterium tuberculosis yn yr ysgyfaint a'r ddueg 43 . Fe wnaeth ICs ffagocytosed bacteria dros sawl munud, ac roedd ein celloedd ar gyfer scRNA-seq yn agored i UPEC am bwynt amser 1 awr cymharol fyr. Mae angen astudiaethau yn y dyfodol i benderfynu a yw llwybrau IC eraill, megis mynegiant AMP neu reoleiddio marwolaeth celloedd, yn dod yn fwy amlwg mewn pwyntiau amser diweddarach yn dilyn amlygiad UPEC.

Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0.5 μm wrth yr amlen bilen plasma 44 . Mae "ffagosytau proffesiynol", celloedd imiwnedd sy'n deillio o myeloid, gan gynnwys macrophages, neutrophils, ac osteoclasts yn gwahaniaethu microbau goresgynnol o'r microbiota a chelloedd iach, yn amlyncu'r targed i ffagosom, yn cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), yn secretu CRhA, ac yn cyflwyno antigenau i celloedd eraill 45–49 . O bwysigrwydd, mae asideiddio cadarn gan V-ATPase o phagolysosomau gan greu micro-amgylchedd asidig sy'n ddigonol ar gyfer lladd y rhan fwyaf o ficrobau yn nodwedd nodweddiadol o ffagosytau proffesiynol 48,50 . Er enghraifft, mae atal V-ATPase â bafilomycin A1 yn atal gweithgaredd bactericidal macrophage 51 . Mae rhai celloedd epithelial microbau ffagocytos ond yn llai effeithlon o ran lladd bacteriol na ffagosytau proffesiynol ac wedi'u disgrifio fel ffagosytau nad ydynt yn broffesiynol 52 . Mae ICs yn cynrychioli llinach epithelial sydd â phagocytosis a galluoedd cyflwyno antigen (Ffig. 6-9) ynghyd â mynegiant CRhA cadarn a mitocondria hael i gynhyrchu ROS; felly, mae'n ymddangos bod gan ICs botensial lladd bacteriol mwy tebyg i macroffagau na'r ffagosytau nad ydynt yn broffesiynol a grybwyllwyd uchod 8,53-55 . Dangoswyd yn flaenorol bod A-ICs yn gallu cael cyfraddau uchel o endocytosis apical o dextran i fesiglau sytoplasmig 56 . Rydym yn dyfalu bod ffagocytosis IC o UPEC yn estyniad o nodweddion a rennir â macroffagau, gan gynnwys mynegiant V-ATPase, potensial rhydocs, secretion AMP, a galluoedd endocytosis 8,16,49,57,58. Mae angen penderfynu a all ICs malurion cellog a bacteria heblaw UPEC mewn modd tebyg i ffagosytau proffesiynol.

Delweddu cydffocal o un-arentiwbyn wedi'i ddarlifo in vivo â bacteria yn ymhelaethu ar dechnegau in vitro blaenorol fel meithriniad celloedd a darlifiad tiwbyn wedi'i rannu. Yma, fe wnaethom ddatblygu methodoleg i brofi'n uniongyrchol mewn llygod byw a yw ffagocytosis yn swyddogaeth IC. Mae microsgopeg intravital yn caniatáu ar gyfer astudiaeth fanwl o brosesau cellog deinamig o fewn murine gweithredolarennau59 . Mae strategaethau’r gorffennol i ddefnyddio microsgopeg fewnfythol wedi cynnwys chwistrelliad systemig o liwiau neu farcwyr mewnwythiennol i lygod i astudio endocytosis tiwbyn agos,arendeinameg llif y gwaed, a athreiddedd fasgwlaidd neu glomerwlaidd 60 . Pan gyfunir microsgopeg fewnfythol â thechnegau llawfeddygol soffistigedig, gellir astudio adegau cynnar anodd eu gwerthuso o ran prosesau heintus 61 . Yn flaenorol, roedd bacteria'n cael eu microberlifo mewn tiwbiau llygod mawr cyfagos i werthuso llif y gwaed, recriwtio niwtroffil, a rhwystr wrinol 62,63 . Mae mwyafrif helaeth yr UTIau o ganlyniad i bathogenau esgynnol a byddent yn dod ar draws y ddwythell gasglu 64,65 i ddechrau. Felly, rydym yn cynnig bod y ddwythell gasglu yn rhanbarth tiwbaidd hanfodol i werthuso rhyngweithiadau pathogen gwesteiwr. Mae ein system model intravital i bob pwrpas yn ail-greu clasurol

BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR AREN/ARENAU

astudiaeth darlifiad tiwbyn casglu sengl, ond mewn llygoden fyw gyda chyfanaren,cyflenwad gwaed, lymffatig a niwronaidd ynghyd â gallu a gedwir i ryngweithio â chelloedd imiwnedd. Mae gan bathoffisioleg pyelonephritis wahaniaethau rhwng dynion a merched. Er enghraifft, mewn bodau dynol, mae menywod bum gwaith yn fwy tebygol o ddatblygu pyelonephritis acíwt ond mae llygod gwrywaidd wedi cynyddu difrifoldeb pyelonephritis a gyfryngir gan androgen 66,67 . Dangosodd Ransick a chydweithwyr wahaniaethau gwahaniaethol gwrywaidd a benywaidd mewn celloedd tiwbyn procsimol, yn enwedig mewn cludwyr anion organig 30 . Gwerthuswyd ICs gwrywaidd yn ein hastudiaethau dilyniannu un-gell a mewnwelediad. Oherwydd rôl ICs yn amddiffyniad bacteriol yarena chydbwysedd electrolyte, bydd amrywiaeth sy'n gysylltiedig â rhyw mewn swyddogaethau IC, megis ffagocytosis a mynegiant genynnau un-gell, yn feysydd allweddol ar gyfer astudiaethau yn y dyfodol. Mae gan yr astudiaeth hon gyfyngiadau. Roedd yr amlygiad UPEC i ICs dynol yn ein scRNA-seq yn in vitro i senglarena gall fod â gwahaniaethau o'u cymharu â datguddiad UPEC in vivo. Yn ogystal, roedd ein canfyddiadau yn cynrychioli rhanbarth anatomegol y dynolarengall astudiaethau samplu ac astudiaethau yn y dyfodol gyda lleoliadau gwahanol fod wedi rhanbartholi amrywiaeth fel y dangosir gan Ransick et al. 30 . Roedd ICs yn cynnwys 57 y cant o'r celloedd yn ein scRNA-seq, wedi'u cyfoethogi o'r cyfansoddiad IC ~ 7 y cant ynarennauar y llinell sylfaen 33 . Roedd ein sampl yn cynnwys rhai mathau o gelloedd epithelial ac endothelaidd eraill, ond roedd yn negyddol ar gyfer CD45 ynghyd â chelloedd imiwnedd a gafodd eu datrys cyn cyfoethogi ICs (Ffig. 1, Atodol Ffig. 1). Gyda scRNA-seq, gellid nodi a gwerthuso'r IC targed ar wahân. Mae bôn-gelloedd hematopoietig yn mynegi c-KIT, ond nid ydynt yn debygol o gynrychioli'rarenpoblogaethau celloedd myeloid preswyl 68 . Ni wnaethom nodi celloedd c-KIT-mynegi eraill sy'n bresennol mewn bodau dynol iacharennau, megis celloedd stromal/telocytes 69 . Adroddwyd yn flaenorol ar rywfaint o dolen ynysig o Henle a thiwbyn procsimol c-KITarenimmunohistochemistry yn gyson â'n canlyniadau scRNA-seq 70