Mecanweithiau A Thargedau O Fc -Derbynnydd Imiwnedd Cyfryngol I Malaria Sporozoites

Bydd brechlyn amddiffynnol iawn yn hwyluso cyflawni a chynnal dileu malaria yn fawr. Mae deall mecanweithiau imiwnedd wedi'i gyfryngu gan wrthgyrff yn hanfodol ar gyfer datblygu brechlynnau sy'n effeithiol iawn. Yma, rydym yn nodi rolau allweddol mewn imiwnedd humoral ar gyfer rhyngweithiadau Fc -receptor (Fc R) a ffagocytosis opsonic o sporozoites.

Rydym yn nodi rôl sylweddol sylweddol ar gyfer niwtroffiliau wrth gyfryngu clirio ffagosytig o sporozoites mewn gwaed ymylol, tra bod monocytes yn cyfrannu rôl fach. Mae gwrthgyrff hefyd yn hyrwyddo gweithgaredd celloedd lladd naturiol. Yn fecanyddol, mae'n ymddangos bod rhyngweithiadau gwrthgyrff â Fc RIII yn hanfodol, ac mae angen Fc RIIa hefyd ar gyfer y gweithgaredd mwyaf posibl. Mae pob rhanbarth o'r protein circumsporozoite yn dargedau o wrthgyrff swyddogaethol yn erbyn sporozoites, ac mae gan wrthgyrff N-terminal fwy o weithgaredd mewn rhai profion. Mae gwrthgyrff swyddogaethol yn cael eu caffael yn araf ar ôl dod i gysylltiad naturiol â malaria, sy'n bresennol ymhlith rhai oedolion agored, ond yn anghyffredin ymhlith plant. Mae ein canfyddiadau'n datgelu targedau a mecanweithiau imiwnedd y gellid eu hecsbloetio wrth ddylunio brechlynnau i sicrhau'r effeithiolrwydd mwyaf posibl.

Mae malaria yn parhau i fod yn bryder iechyd byd-eang mawr, gyda P. falciparum malaria yn achosi ~219 miliwn o achosion clinigol a 435,000 o farwolaethau bob blwyddyn1. Er gwaethaf ymdrechion rheoli rhyngwladol, mae'r baich malaria wedi aros yn gyson yn ystod y blynyddoedd diwethaf1. Mae angen cryf am frechlyn hynod effeithiol ar gyfer rheoli a dileu malaria, a bwysleisir ymhellach gan adroddiadau cynyddol am ymwrthedd i gyffuriau gwrthfalaria ac ymwrthedd i bryfleiddiad1. Gosododd Sefydliad Iechyd y Byd a phartneriaid ariannu nod i ddatblygu brechlyn sy'n fwy na neu'n hafal i effeithiolrwydd 75 y cant erbyn 20302, sydd wedi bod yn heriol i'w gyflawni3,4. Mae angen gwell dealltwriaeth o'r mecanweithiau sy'n cyfryngu imiwnedd i ddatblygu strategaethau sy'n cynhyrchu ymatebion imiwn amddiffynnol mwy grymus.

Mae gwella imiwnedd mewn bywyd bob dydd yn gofyn inni gynnal arferion byw da. Gall sefydlu a chynnal amserlen ar gyfer mynd i'r gwely a deffro hyrwyddo gweithrediad arferol y rhythm circadian. Osgoi prydau gwyliau sy'n cynnwys llawer o galorïau, ac osgoi bwyta bwydydd asidig neu sbeislyd a all ei gwneud hi'n anodd ei dreulio. Dewiswch ginio ysgafn gyda chynnyrch ffres. Cyfyngu ar y defnydd o ddyfeisiau electronig. Gall golau sgrin ein twyllo i ddeffro sawl gwaith y nos trwy newid cylchoedd cysgu ac ansawdd cwsg. Ceisiwch osgoi ymarfer corff egnïol yn gynnar gyda'r nos. Argymhellir lleiafswm o ddwy awr. Mae ymarfer corff yn ysgogi rhyddhau adrenalin ac yn cynyddu cyfradd curiad y galon, sy'n actifadu ein cwsg. Yn ogystal, gallwn hefyd amlyncu Cistanche deserticola. Gall y polysacaridau a'r verbascoside yn Cistanche deserticola wella imiwnedd. Gall polysacaridau a verbascoside Cistanche deserticola gynyddu gweithgaredd ensymau meinwe'r galon a'r ymennydd, a gwella swyddogaeth ffagosytig celloedd peritoneol ac ymateb amlhau lymffocytau.

Cliciwch pryd i gymryd cistanche

Mae haint malaria yn dechrau o frathiad mosgito Anopheles heintiedig, pan fydd sporozoites yn cael eu brechu yn y dermis5. Yna mae sporozoites yn mudo i bibell waed, yn cylchredeg yn y llif gwaed i'r afu ac yn sefydlu haint mewn hepatocytes. Mae sporozoites yn darged blaenoriaeth ar gyfer brechlynnau malaria oherwydd bydd clirio sborozoites yn atal haint cyn i falaria clinigol ddechrau3. Mae ymchwil mewn modelau anifeiliaid a threialon brechlyn wedi sefydlu mai gwrthgyrff yw'r cyfryngwr allweddol o imiwnedd i sporozoites (adolygir yng nghyf. 3). Fodd bynnag, ni ddeellir yn dda sut mae gwrthgyrff yn gweithredu'n fecanyddol i glirio sporozoites ac atal haint, a thargedau penodol gwrthgyrff swyddogaethol. Mae angen mewnwelediadau newydd i'r cwestiynau hyn i hwyluso datblygiad brechlynnau mwy effeithiol.

Y protein circumsporozoite (CSP) yw'r protein mwyaf helaeth ar wyneb sporozoites6 ac mae'n darged mawr o wrthgyrff dynol6. Mae brechlynnau sy'n seiliedig ar CSP wedi perfformio'n well na antigenau brechlynnau eraill hyd yma, er bod effeithiolrwydd yn parhau i fod yn is-optimaidd3. Mae'r brechlyn malaria mwyaf datblygedig, RTS, S, yn seiliedig ar ffurf cwtogedig o CSP (sy'n cynnwys y rhanbarth ail-adrodd canolog a rhanbarth terfynell C yn unig) a chyflawnodd effeithiolrwydd cymedrol yn erbyn malaria clinigol (29-36 y cant) yng ngham III treial clinigol7. Ystyrir bod rhanbarth ail-ganolog CSP yn darged gwrthgyrff pwysig, ac o ganlyniad, mae pwysigrwydd posibl gwrthgyrff i ranbarthau nad ydynt yn ailadrodd wedi'i danstudio'n fawr8 ond gall fod yn bwysig. Roedd gwrthgyrff i ranbarth C-terminal yn gysylltiedig ag amddiffyniad mewn treialon brechlyn RTS ac S mewn plant9.

O ran mecanweithiau swyddogaethol gwrthgyrff, mae mwyafrif yr astudiaethau cyhoeddedig wedi canolbwyntio ar weithgarwch ataliol uniongyrchol gwrthgyrff i ranbarth ail-adrodd canolog PDC, a all atal symudedd sporozoite a goresgyniad hepatocyte in vitro10-17. Ychydig a wyddys am fecanweithiau pwysig a thargedau imiwnedd eraill.

Mecanwaith imiwnolegol allweddol sy'n cael ei gydnabod fwyfwy mewn imiwnedd yn erbyn pathogenau firaol a bacteriol18-21 yw gallu gwrthgyrff i ryngweithio â derbynyddion Fc (Fc R) ar wahanol fathau o gelloedd sy'n arwain at ffagocytosis opsonic neu sytowenwyndra uniongyrchol. Mae gwrthgyrff i antigenau sporozoite fel arfer yn cael eu dominyddu gan yr is-ddosbarthiadau IgG1 ac IgG313, sydd â photensial cryf i ryngweithio â Fc Rs22. Fodd bynnag, ychydig a wyddys ar hyn o bryd am y mecanweithiau posibl hyn mewn imiwnedd i sporozoites. Mae'r prif fathau o gelloedd phagocytig yn cynnwys monocytes a neutrophils (2-10 y cant a 45-70 y cant o gelloedd gwaed gwyn ymylol, yn y drefn honno).

Yn ogystal â ffagocytosis, gall niwtroffiliau, a chelloedd lladd naturiol (NK) hefyd ladd celloedd trwy sytowenwyndra cellog sy'n ddibynnol ar wrthgyrff (ADCC)23,24, ac mae monocytes a neutrophils hefyd yn cael effeithiau imiwnedd ehangach trwy fynegi marcwyr actifadu, cytocinau, a chemocinau (a adolygir yng nghyf. 25–27).

Mae patrymau mynegiant Fc R yn wahanol rhwng monocytes a neutrophils, sy'n effeithio ar eu swyddogaethau mewn imiwnedd. Gan mai sporozoites yw'r cam cyntaf wrth gychwyn haint malaria, byddai sporozoites fel arfer yn dod ar draws celloedd ffagocytig posibl mewn cyflwr gorffwys, neu homoeostatig, yn hytrach na chyflwr actifedig.

Mae monocytau cyfnod gorffwys yn mynegi Fc RI a Fc RIIa yn bennaf, gydag is-set bach yn mynegi Fc RIIIa28, tra bod niwtroffiliau cyfnod gorffwys yn mynegi Fc RIIa a Fc RIIIb29, a lefelau isel o Fc RIIIa30 (sy'n bwysig yn swyddogaethol). Felly mae gwerthuso rhyngweithiadau penodol rhwng gwrthgyrff a gwahanol Fc Rs yn bwysig ar gyfer deall rolau posibl gwahanol ffagosytau mewn imiwnedd. Gall is-ddosbarth IgG, glycosyliad, a phenodoldeb epitope ill dau effeithio ar ryngweithiadau â gwahanol Fc Rs22.

Gall diffinio mecanweithiau Fc R-mediated sy'n targedu sporozoites ddatgelu mewnwelediadau y gellid eu hecsbloetio i wella effeithiolrwydd amddiffynnol brechlynnau sy'n seiliedig ar sporozoite. Yn yr astudiaeth hon, rydym yn datgelu mecanweithiau a thargedau imiwnedd pwysig yn erbyn sporozoites wedi'u cyfryngu gan Fc Rs penodol ar gelloedd imiwnedd. Rydym yn datblygu technegau i fesur rhyngweithiadau rhwng gwrthgyrff a Fc Rs penodol ac yn nodi priodweddau gwrthgyrff penodol, targedau antigenig, a Fc Rs sy'n bwysig ar gyfer y gweithgaredd swyddogaethol gorau posibl. Ar ben hynny, rydym yn meintioli caffaeliad ymatebion gwrthgyrff swyddogaethol Fc-R-ddibynnol mewn plant ac oedolion sy'n agored i falaria yn naturiol. Mae ein canfyddiadau yn datgelu mecanweithiau imiwnedd pwysig yn erbyn sporozoites ac yn awgrymu strategaethau a thargedau antigenig ar gyfer datblygu brechlyn malaria hynod effeithiol.

Canlyniadau

Mae ffagocytosis opsonic o sporozoites yn cael ei gyfryngu'n bennaf gan neutrophils mewn gwaed ymylol.

Er mwyn ymchwilio i berthnasedd mecanweithiau Fc R-mediated yn erbyn sporozoites, fe wnaethom sefydlu profion ffagocytosis opsonic yn gyntaf gan ddefnyddio'r llinell gell THP -1 heb ei gwahaniaethu (celloedd pro-monocytig), o dan amodau safonol31,32 (Ffig Atodol 1A). Er mwyn gwrthbwyso sporozoites, gwnaethom ddefnyddio gwrthgyrff serwm gan oedolion Kenya sy'n byw mewn rhanbarth â dwysedd trosglwyddo malaria uchel ac sydd ag imiwnedd clinigol sylweddol i falaria a gwrthgyrff i CSP33. Cafodd sporozoites opsonized P. falciparum eu ffagocytosed yn effeithiol gan gelloedd THP-1 mewn modd canolbwyntio-ddibynnol gydag ychydig o ffagocytosis gan ddefnyddio gwrthgyrff gan roddwyr malaria-naïf (trigolion Melbourne) (Ffig Atodol 1B). Roedd ffagocytosis opsonic wedi'i gyfryngu gan sera unigol yn atgynhyrchadwy iawn (r=0.925, P < 0.001; Ffig Atodol 1C).

Er mwyn goresgyn yr heriau o ran cynhyrchu nifer fawr o sporozoites hyfyw ar gyfer profion ffagocytosis opsonic, fe wnaethom sefydlu'r defnydd o gleiniau fflwroleuol wedi'u gorchuddio â PDC hyd llawn, yr antigen mawr a fynegir ar sporozoites, fel mesur dirprwyol o ffagosytosis opsonig o sporozoites. Cafodd gleiniau wedi'u gorchuddio â PDC wedi'u trosi â detholiad o samplau gwrthgorff o wahanol oedolion Kenya eu ffagosyteiddio i bob pwrpas gan gelloedd THP-1, ac roedd ffagocytosis opsonic o gleiniau wedi'u gorchuddio â CSP yn cydberthyn yn gryf â ffagocytosis opsonic o P. falciparum sporozoites (r=0 }}.831, P=0.0015, Ffig Atodol 1d). Felly, roedd gleiniau CSP yn darparu llwyfan effeithlon ar gyfer astudio mecanweithiau a thargedau ffagocytosis opsonic wedi'i gyfryngu gan wrthgyrff.

Yn dilyn hynny, gwnaethom ymchwilio i fathau o gelloedd sy'n cyfryngu ffagocytosis opsonic mewn assay leukocyte cyfan â gwaed ffres, gan ddefnyddio gleiniau CSP i ddechrau wedi'u opsoneiddio â gwrthgorff cwningen polyclonaidd i CSP. Yn ddiddorol, mae cyfradd ffagocytosis (nifer y gleiniau phagocytosed fesul cell) yn llawer uwch gan neutrophils na gan monocytes ( Ffig. 1 A, B ). Oherwydd i ni fesur y gyfradd ffagocytosis, nid yw gweithgaredd uwch neutrophils yn cael ei esbonio'n syml gan eu helaethrwydd uwch o gymharu â monocytau. Cynyddodd ffagocytosis opsonig gyda chrynodiadau gwrthgyrff cynyddol, a gwelwyd gweithgaredd cymharol uwch o neutrophils o gymharu â monocytes ar draws crynodiadau gwrthgyrff ac ystod o gymarebau gleiniau: cell. Cadarnhawyd y gweithgaredd ffagocytosis mwy o neutrophils gan ddefnyddio sporozoites byw wedi'u hynysu'n ffres (fe wnaethom ddefnyddio sporozoites P. bergei transgenic sy'n mynegi P. falciparum CSP, sy'n disodli'r genyn P. berghei CSP mewndarddol12, y cyfeirir ato fel PfCSP-P. berghei). ffagocytosis opsonig o sporozoites opsonized gyda gwrthgyrff o Kenya malaria-rhoddwyr agored i'w gyfryngu yn bennaf gan neutrophils gyda dim ond lefelau isel o ffagocytosis gan monocytes, a neutrophils yn dangos cyfradd ffagocytosis uwch ( Ffig. 1 C ). Rydym hefyd yn perfformio profion i ganiatáu amser estynedig ar gyfer ffagocytosis (hyd at 60 munud), ond rydym yn dal i arsylwi ffagocytosis llawer mwy gan neutrophils o gymharu â monocytes (Atodol Ffig. 2 A).

Dadansoddiad pellach o'r boblogaeth monocyte dangos bod y rhan fwyaf o ffagocytosis oedd gan yr is-set clasurol (CD14high CD16 -; Ffig. 1 D a Atodol Ffig. 2 B-D). I gefnogi ein canfyddiadau, rydym yn dangos ymhellach y gallai puro neutrophils effeithiol phagocytose gwrthgyrff-opsonized P. falciparum sporozoites (Ffig. 1 E). Dihysbyddu gwrthgyrff CSP-benodol, gan cyn-deor gyda PDC ailgyfunol, lleihau ffagosytosis o sporozoites gan 70 y cant o'i gymharu â'r sampl nad yw'n disbyddu (Ffig. 1 F a Atodol Ffig. 3). Defnyddiwyd dull ychwanegol gennym i gael tystiolaeth o bwysigrwydd CSP fel targed o wrthgyrff gweithredol caffaeledig mewn imiwnedd dynol trwy brofi mAb (MGG4) wedi'i ynysu oddi wrth unigolyn sy'n agored i heintiau sporozoite mynych34. Mae'r mAb ysgogwyd ffagocytosis sylweddol o sporozoites, tra bod ychydig o ffagocytosis gyda gwrthgyrff dynol di-imiwn, neu ddefnyddio gwrth-CSP MAb (2A10) a oedd yn treiglo yn y rhanbarth Fc i atal rhyngweithiadau Fc R (Ffig. 1 G).

Diffinio derbynyddion Fc sy'n ymwneud â ffagocytosis opsonic o sporozoites.

Gwnaethom opsonized y P. falciparum sporozoites cyfan a gleiniau CSP gyda gwrthgyrff gan oedolion Kenya a mesur ffagocytosis opsonic gan neutrophils ym mhresenoldeb gwrthgyrff R-blocio Fc penodol. Roedd gan neutrophils ffagocytosis opsonic sylweddol is o'r ddau CSP gleiniau a P. sporozoites falciparum ym mhresenoldeb naill ai Fc RIIa neu Fc RIII atalyddion (Ffig. 2 A, B a Atodol Ffig. 4 A), gan awgrymu bod y ddau derbynyddion yn bwysig.

Yn nodedig, gwarchae Fc RIII oedd y mwyaf effeithiol o ran atal ffagocytosis o sporozoites P. falciparum neu gleiniau CSP, gydag effaith wannach o rwystr Fc RIIa. Ni effeithiwyd ar ffagocytosis opsonic gan neutrophils gan rwystro Fc RI. Roedd titradu'r crynodiad o wrthgyrff blocio yn awgrymu ein bod wedi cyflawni'r effaith fwyaf posibl ar gyfer gwarchae pob Fc R (Ffig Atodol 4B).

Felly, cyfunasom Fc RIIa a Fc RIII gwrthgyrff blocio a chanfuwyd bod hyn yn rhoi mwy o ataliad o ffagocytosis na defnyddio naill ai gwrthgorff blocio, gan awgrymu ymhellach bwysigrwydd y ddau fath Fc R ar gyfer ffagocytosis gorau posibl (Ffig. 2 B). Mae'r canlyniadau hyn yn gyson â mynegiant Fc Rs ar neutrophils gorffwys, sy'n mynegi Fc RIIa a Fc RIIIa / b yn bennaf, ond mae diffyg Fc RI35 (Ffig Atodol 2 C). Gall pwysigrwydd Fc RIII wrth gyfryngu ffagocytosis opsonic o gleiniau PDC a sporozoites esbonio'n rhannol weithgaredd cymharol isel monocytau gan nad yw'r prif is-setiau monocyte yn mynegi fawr ddim Fc RIIIa ar yr wyneb mewn cyflwr anweithredol ac nid ydynt yn mynegi Fc RIIIb35. Defnyddir celloedd THP-1 yn eang fel model o ffagocytosis monocyte a Fc RI36 cyflym iawn, sydd wedi'i rwymo gan IgG monomerig (tra bod Fc RIIa a Fc RIII a fynegir gan neutrophils yn rhwymo i gyfadeiladau imiwn yn unig).

Yn unol â hynny, canfuom fod ffagocytosis opsonic gan gelloedd THP-1 mewn amodau safonol (yn cynnwys 10 y cant FCS yn unig a dim serwm dynol) wedi'i atal yn gryf gan yr atalydd Fc RI gydag ataliad cyfyngedig gan y rhwystrwr Fc RIIa, a dim gyda Fc RIII blocio (Ffig. 2C). Roedd hyn yn awgrymu bod y rhyngweithio rhwng IgG a Fc RI yn arbennig o bwysig ar gyfer celloedd THP-1, canlyniadau cyferbyniol a welwyd gyda neutrophils. Felly, fe wnaethom addasu'r assay THP-1 safonol i'w wneud yn fwy perthnasol yn ffisiolegol trwy gynnwys serwm dynol yn y cyfrwng assay.

Ym mhresenoldeb serwm dynol ychwanegol o 2.5 y cant (fel y'i defnyddiwyd yn y profion leukocyte a neutrophil cyfan), roedd llawer llai o ffagocytosis opsonic (Ffig. 2D), yn ôl pob tebyg oherwydd rhwymo IgG dynol monomerig nad yw'n imiwnedd yn bresennol yn y serwm dynol i Fc RI. Gall y canfyddiadau hyn esbonio ymhellach weithgaredd phagocytig isel monocytau cynradd a welwyd yn y profion leukocyte cyfan ym mhresenoldeb serwm dynol; nid yw IgG buchol (sy'n bresennol yn FCS) yn rhwymo Fc RI37 dynol.

O ystyried pwysigrwydd ymddangosiadol Fc RIII, fe wnaethom fesur ymhellach swyddogaeth gwrthgyrff i PDC ymhlith oedolion Kenya mewn profion ADCC, gan fod rhyngweithiadau Fc RIII yn chwarae rhan allweddol wrth gyfryngu ADCC trwy gelloedd NK. Fe wnaethon ni brofi detholiad o samplau o garfan oedolion Kenya (carfan Kanyawegi) i gynrychioli ymatebwyr uchel, canolradd ac isel (n=31) mewn assay gan ddefnyddio llinell gell gohebydd ADCC sydd ond yn mynegi Fc RIIIa. Roedd gan wrthgyrff a gafwyd yn naturiol ymhlith oedolion Kenya weithgaredd sylweddol, ond nid oedd gwrthgyrff gan roddwyr malaria-naïf Melbourne (Ffig. 2E, F). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gall gwrthgyrff i PDC hefyd hyrwyddo gweithgaredd ADCC trwy ymgysylltu â Fc RIIIa. Yn dilyn hynny, fe wnaethom brofi gweithgaredd celloedd NK cynradd mewn gwaed ffres gan ddefnyddio assay digranulation sefydledig 38. Mae deori celloedd NK gyda gleiniau CSP wedi'u gwrthgyrff gan oedolion Kenya yn arwain at ddirywiad celloedd NK cynradd (Ffig. 2 G, H). Roedd gweithgaredd yn amrywio ar draws samplau a brofwyd, ac yn cydberthyn yn sylweddol â rhwymiad Fc RIII (r=0.538, P=0.002, Ffig. 2H), ond roedd cydberthynas wan ag IgG i CSP (r {{10} }.127, P=0.489, n=31).

Rhwymo Fc RIII a Fc RIIa yn uniongyrchol gan gyfadeiladau gwrthgorff-antigen.

Fe wnaethom ddatblygu profion rhwymo R Fc gan ddefnyddio Fc RIIa a Fc RIII a gafodd eu mynegi a'u puro fel dimers fel y gallant ryngweithio â chymhlygion antigen-gwrthgyrff39. Roedd gan oedolion Kenya nifer uchel o achosion a maint o wrthgyrff i CSP a allai ryngweithio â dimers Fc RIIa a Fc RIII (Ffig. 3A). Yn gyffredinol, ystyriwyd bod 67.3 a 61.5 y cant o samplau (n=104) yn gadarnhaol ar gyfer rhwymo Fc RIIa a Fc RIII. Er bod gan rwymiad y ddau Fc R gydberthynas gref, gadarnhaol rhwng samplau (r=0.71, P< 0.0001, n = 104) (Fig. 3B), some individual samples demonstrated high binding to one FcγR and low binding to the other. Furthermore, the ability of antibodies to CSP to promote direct binding of FcγRIII was significantly correlated with ADCC tested by the ADCC reporter cell line (r = 0.405, P = 0.022, Fig. 2F) and primary NK cells (r = 0.538, P = 0.002, Fig. 2H). FcγRs occur in populations as different alleles40. 

Felly, gwnaethom brofi gwahanol alelau Fc RIIa (R131, H131) a Fc RIII (F158, V158) ar gyfer rhwymiad cyfryngol IgG39. Mae data cyhoeddedig yn dangos bod yr alelau hyn yn gyffredin yn ein poblogaeth astudiaeth41. Roedd gwrthgyrff i PDC yn hyrwyddo rhwymo'r ddau alel Fc RIIa a Fc RIII yn effeithiol. Roedd cydberthynas uchel o rwymo Fc R rhwng y gwahanol alelau; rho=0.8371 am Fc RIIa, a rho=0.78 am Fc RIII (Ffig. 3C, D).

Rhanbarthau o PDC wedi'u targedu gan wrthgyrff swyddogaethol.

Dangosodd ein data cynharach fod PDC yn darged sylweddol o wrthgyrff dynol sy'n hyrwyddo ffagocytosis (Ffig. 1 F, G). Felly, gwnaethom ymchwilio nesaf i wahanol ranbarthau o PDC fel targedau gwrthgyrff swyddogaethol mewn unigolion sy'n agored i falaria gan ddefnyddio tri llun o CSP: (i) peptid synthetig sy'n cynrychioli'r rhanbarth NT (nad yw wedi'i gynnwys yn y brechlyn RTS, S), (ii) ) peptid synthetig sy'n cynrychioli'r rhanbarth ailadroddus (ailadrodd NANP), (iii) protein ailgyfunol sy'n cynrychioli'r rhanbarth CT. Roedd pob llun wedi'i orchuddio ar wahân ar fwclis fflworoleuol (mewn crynodiadau dirlawn) a'i opsonized gyda'r gronfa o sera Kenya. Gwrthgyrff hyrwyddo effeithiol neutrophil phagocytosis o gleiniau gorchuddio â phob llun ( Ffig. 4 A ).

Wedi hynny, fe wnaethom asesu gwrthgyrff a gaffaelwyd yn naturiol i ranbarthau PDC am eu gallu i hyrwyddo ymgysylltiad Fc RIIa a Fc RIII. Roedd gwrthgyrff dynol yn rhwymo pob rhanbarth PDC gyda dwysedd digonol i hyrwyddo rhwymo Fc RIIa a Fc RIII (Ffig. 4 B). Gan fod cyfanswm lefel y rhwymiad IgG yn amrywio ymhlith gwahanol luniadau PDC (Ffig Atodol 5), gwnaethom safoni rhwymiad Fc RIIa a Fc RIII o'i gymharu â lefel adweithedd IgG (a elwir yn Fc R-rwymo effeithlonrwydd). Roedd ein data'n awgrymu bod gan wrthgyrff i'r rhanbarth NT botensial uwch i ymgysylltu â Fc Rs na'r rhanbarthau ailadrodd canolog a CT (roedd gweithgaredd yn sylweddol uwch ar gyfer rhanbarthau NT yn erbyn CT neu NANP, P < 0.001 ar gyfer pob cymhariaeth) .

Gwnaethom werthuso ymhellach arwyddocâd gwahanol ranbarthau fel targedau gwrthgyrff swyddogaethol gan ddefnyddio gwrthgyrff a gynhyrchir yn erbyn rhanbarthau penodol a sporozoites cyfan mewn profion ffagocytosis. Fe wnaethom gadarnhau yn gyntaf y gall gwrthgyrff gwrth-CSP cwningen hyrwyddo ffagocytosis sporozoites. Rhoddodd P. sporozoites falciparum opsonized gyda gwrthgyrff hyn mynegai ffagosytosis uchel (40.5 y cant ) o'i gymharu â rheolaeth ( Ffig. 4 C ). Yn dilyn hynny, rydym yn sefydlu bod mAb hysbys yn erbyn y rhanbarth NANPrepeat canolog o P. falciparum CSP (mAb 2H8, llygoden IgG2a is-ddosbarth)33 hyrwyddo ffagocytosis sylweddol (17.4 y cant, Ffig. 4D) a oedd yn fwy nag a welwyd gyda rheolaeth negyddol mAb 3D11 bod yn targedu PDC P. bergei nad oes ganddo'r epitope NANPrepeat (Ffig. 4D). Mae rhanbarth ailadrodd NANP yn amgodio epitope imiwno-lywydd, tra bod llawer llai yn hysbys am arwyddocâd rhanbarthau NT a CT fel targedau gwrthgyrff.

Er mwyn diffinio ymhellach rôl gwrthgyrff yn y rhanbarthau CT a NT, ac ategu data gan ddefnyddio gwrthgyrff dynol, rydym yn cynhyrchu gwrthgyrff polyclonal cwningen i bob rhanbarth (Atodol Ffig. 6) a defnyddio gwrthgyrff hyn i opsonize PfCSPP trawsgenig. bergei sporozoites ar gyfer ffagocytosis gan neutrophils. Roedd gwrthgyrff polyclonaidd cwningen i'r rhanbarthau CT a NT yn hyrwyddo ffagocytosis PfCSP-P yn effeithiol. bergei sporozoites (Ffig. 4E). Gan fod crynodiad IgG i'r CT a'r NT o sera cwningen wedi'u brechu yn wahanol (Ffig Atodol 6), fe wnaethom asesu effeithlonrwydd ffagocytosis a gwrthgyrff, o'i gymharu â lefelau IgG (a gyfrifir fel gweithgaredd ffagocytosis wedi'i rannu gan adweithedd IgG a bennir gan ELISA). Dangosodd hyn fod gan wrthgyrff i ranbarth N-terminal effeithlonrwydd ffagocytosis sylweddol uwch o'i gymharu â gwrthgyrff CT.

Gan fod gwrthgyrff i'r rhanbarth NT yn hynod effeithiol wrth actifadu Fc Rs a hyrwyddo ffagocytosis opsonic, fe wnaethom berfformio mapio epitope o'r gwrthgyrff polyclonaidd cwningen yn erbyn y rhanbarth NT gan ddefnyddio arae peptid gorgyffwrdd (Ffig. 4F a Ffig Atodol 6D). Roedd arae peptid yn briodol ar gyfer mapio epitope oherwydd rhagwelir y bydd y rhanbarth NT yn anstrwythuredig ac nad yw'n cynnwys unrhyw cysteinau (PlasmoDB, https://plasmodb.org/plasmo/app/record/gene/PF3D7_0304600). Roedd gwrthgyrff yn adweithiol gyda pheptidau yn cwmpasu rhanbarth 21-aa (DDGNNEDNEKLRKPKKKLKQ) sy'n agos at y gyffordd rhwng rhanbarth N-terminal a rhanbarth ailadrodd NANP/NVPD.

Caffael gwrthgyrff sy'n hyrwyddo rhyngweithiadau Fc R a ffagocytosis opsonic trwy amlygiad naturiol.

Fe wnaethom ddadansoddi samplau serwm a gasglwyd o garfan o blant ifanc ac oedolion sy'n agored i falaria sy'n byw yng ngorllewin Kenya mewn rhanbarth â dwyster trosglwyddo malaria uchel (o ranbarth Chulaimbo, Tabl Atodol 1). Yn y lleoliad hwn, mae mwyafrif yr afiachusrwydd a marwolaethau malaria yn digwydd ymhlith plant oed<5 years. 

Mewn cyferbyniad, mae gan oedolion imiwnedd sylweddol, a ddangosir gan ddiffyg datblygiad episodau malaria symptomatig, er y gall parasitemia asymptomatig ddigwydd42. Rydym yn mesur gallu PDC-benodol gwrthgyrff i ryngweithio â Fc RIIa a Fc RIII yn ogystal â hyrwyddo ffagocytosis opsonic o gleiniau PDC gan neutrophils ( Ffig. 5 A - D ). Roedd nifer yr achosion cyffredinol o wrthgyrff gyda phob gweithgaredd swyddogaethol yn ffagocytosis neutrophil ar 16 y cant, (95 y cant CI, 9.19, 26.38 y cant), Fc RIIa rhwymo ar 20 y cant (95 y cant CI, 12.28, 30.84 y cant), a Fc RIII rhwymo 14.7 y cant . (95 y cant CI, 8.19, 24.85 y cant ). Roedd lefel adweithedd IgG i CSP, rhwymo Fc R, a ffagocytosis opsonic gan neutrophils yn isel ymhlith plant ifanc ac yn cynyddu'n sylweddol gydag oedran.

Mewn cyferbyniad, roedd oedolion ag amlygiad gydol oes wedi cael gwrthgyrff swyddogaethol sylweddol uwch o gymharu â phlant. Fe wnaethom hefyd werthuso gwrthgyrff a oedd yn hyrwyddo ffagocytosis merozoites cyfnod gwaed, a oedd â chyffredinrwydd a lefel sylweddol uwch ymhlith plant ifanc o'u cymharu â gwrthgyrff swyddogaethol i CSP (Ffig. 5B, E, F). Mae hyn yn cefnogi'r cysyniad bod imiwnedd naturiol i sporozoites yn cael ei gaffael yn llawer arafach a bod angen llawer mwy o amlygiad i ddatblygu, o'i gymharu ag imiwnedd cam gwaed. Fe wnaethom ymchwilio a yw'r gweithgaredd swyddogaethol uwch ymhlith oedolion yn deillio o'r crynodiad uwch o IgG sy'n benodol i'r CSP yn unig neu hefyd yn adlewyrchu potensial swyddogaethol uwch o wrthgyrff ymhlith oedolion. Dadansoddwyd gweithgarwch swyddogaethol gwrthgyrff o'i gymharu ag adweithedd IgG yn erbyn PDC; i wneud hyn, fe wnaethom eithrio unigolion ag IgG isel iawn i PDC (o dan y canolrif OD o 0.140), a gwnaethom gyfrifo gweithgaredd swyddogaethol o'i gymharu â lefel IgG ar gyfer pob unigolyn.

Yn ddiddorol, dangosodd hyn fod yr effeithlonrwydd ffagocytosis cymharol yn sylweddol uwch mewn oedolion o gymharu â phlant (Ffig. 5G) (prawf Mann-Whitney, P=0.022). Ymhellach, roedd cydberthynas sylweddol rhwng oedran ac effeithlonrwydd rhwymo Fc R (r=0.354, P=0.031 ar gyfer rhwymo Fc RIIa a r=0.572 ar gyfer rhwymo Fc RIII, P < 0.001).

ffagocytosis opsonic gan niwtroffiliau sy'n cydberthyn â rhwymo Fc R ac is-ddosbarthiadau IgG sytoffilig

Estynnwyd ein dadansoddiad i garfan fwy o oedolion imiwn yng ngorllewin Kenya (carfan Kanyawegi, n=104) sydd wedi bod yn agored i falaria gydol oes mewn rhanbarth â dwyster trosglwyddo malaria uchel. Fe wnaethom resymu bod cyfran fawr o'r oedolion hyn yn debygol o fod â gwrthgyrff swyddogaethol i CSP, gan hwyluso dadansoddiad o ffactorau gwrthgyrff a nodweddion penodol sy'n pennu gweithgaredd ffagocytosis opsonic swyddogaethol. Yn wir, dangosodd llawer o samplau ffagocytosis sylweddol a gweithgarwch rhwymo Fc R. Roedd nifer yr achosion o wrthgyrff gyda phob gweithgaredd swyddogaethol yn ffagocytosis neutrophil 47.1 y cant (95 y cant CI, 37.6, 56.9 y cant ), Fc RIIa rhwymo 67.3 y cant , (95 y cant CI, 57.6, 75.8 y cant ) a Fc RIII rhwymo 651.5 y cant (951.5 y cant CI rhwymo ) , 51.7, 70.5 y cant).

Roedd cydberthynas arwyddocaol rhwng ffagocytosis opsonic gan neutrophils a rhwymiad Fc RIIa (r {{0}}.50, P < 0.001) a rhwymo Fc RIII (r= 0.43, P <0.001) (Ffig. 6A). Awgrymodd dadansoddiad atchweliad aml-amrywedd mai Fc RIII oedd y ffactor sylfaenol sy'n gysylltiedig â ffagocytosis neutrophil opsonic (cyfernod atchweliad=10.15, P < 0.001, Tabl 1), tra bod Fc RIIa yn llai pwysig. Yn flaenorol rydym wedi adrodd bod gwrthgyrff i PDC yn y garfan oedolion hon yn bennaf yn IgG1 ac IgG3, gyda lefelau is o IgG2, ac ychydig iawn o IgG433. IgG1 ac IgG3 yw'r prif is-ddosbarthiadau sy'n rhyngweithio â Fc RIIa a Fc RIII i hyrwyddo ffagocytosis, ac mae gan IgG2 weithgaredd gwan. Ymhlith oedolion Kenya, roedd cydberthynas sylweddol gadarnhaol rhwng ffagocytosis neutrophil ag IgG1 (r=0.32, P < 0.001), IgG2 (r=0.26, P=0.007), a mwy yn gryf gydag IgG3 (r=0.50, P < 0.001) (Ffig. 6B, C, Ffig. Atodol 7 a Thabl Atodol 2).

Ni welwyd unrhyw gydberthynas ag IgG4 (r=0.09, P = 0.365), er bod lefelau IgG4 yn isel. Mewn atchweliad aml-amrywedd, roedd IgG3 yn parhau i fod yn gysylltiedig yn sylweddol â ffagocytosis neutrophil, gan awgrymu mai dyma brif gyfryngwr y gweithgaredd hwn (Tabl Atodol 3). Yn ogystal, roedd cydberthynas sylweddol rhwng rhwymo Fc RIIa a Fc RIII â chyfanswm lefelau isddosbarthiadau IgG ac IgG, yn bennaf IgG1 ac IgG3 (Tablau Atodol 2 a 3). Yn gyffredinol, roedd gan samplau a ddosbarthwyd fel rhai â gweithgaredd ffagocytosis uchel (a ddiffinnir fel rhai uwchlaw’r canolrif) lefelau sylweddol uwch o rwymo Fc RIIa a Fc RIII ac IgG3, ac roedd ganddynt lefelau sylweddol uwch o IgG i bob rhanbarth o CSP, o gymharu â samplau â ffagocytosis isel gweithgaredd (Ffig. 6D, E).

Canfuwyd arsylwadau tebyg ymhlith cohort Chulaimbo o blant ac oedolion. Roedd cydberthynas sylweddol rhwng ffagocytosis opsonig â rhwymiad Fc R, ac IgG1 ac IgG3, gyda'r cydberthynas yn gryfach ar gyfer Fc RIII ac IgG3 (Tablau Atodol 4 a 5). Gwnaethom gymhwyso'r profion hyn mewn treial clinigol cam 1/2a o'r brechlyn RTS, S. Dangosodd hyn fod gwrthgyrff sy'n hyrwyddo ffagocytosis opsonic gan neutrophils a rhwymo Fc RIII a Fc RIIa yn uwch ymhlith pynciau gwarchodedig na phynciau nad ydynt yn cael eu hamddiffyn43.

Trafodaeth

Rydym yn darparu canlyniadau sy'n diffinio mecanweithiau a thargedau imiwnedd gwrthgyrff-gyfryngol i sporozoites trwy ryngweithio â Fc Rs penodol a fynegir ar gelloedd imiwnedd. Mae ein canfyddiadau yn cefnogi rôl allweddol i niwtroffiliaid wrth glirio sporozoites mewn gwaed, wedi'i gyfryngu gan ryngweithiadau Fc RIIa a Fc RIII ag IgG1 ac IgG3 gan dargedu'r prif antigen sporozoite, CSP, gyda chyfraniadau ychwanegol gan monocytes (is-set clasurol) a chelloedd NK. Gan ddefnyddio sporozoites cyfan a gleiniau wedi'u gorchuddio ag antigen, gwnaethom sefydlu bod ffagocytosis, mewn gwaed cyfan, yn cael ei wneud yn bennaf gan niwtroffiliau, gan gyferbynnu'r gweithgaredd lefel isel a welwyd â monocytes. Fe wnaethom ddiffinio mecanweithiau allweddol sy'n ymwneud â blocio Fc Rs penodol ar arwynebau celloedd a thrwy ddefnyddio dimers Fc R fel stilwyr i rwymo cyfadeiladau antigen-gwrthgyrff.

Nododd hwn bwysigrwydd Fc RIIa a Fc RIII, ac mae data'n cyfeirio'n benodol at bwysigrwydd Fc RIII. Fe wnaethom ddiffinio targedau gwrthgorff y mecanwaith swyddogaethol hwn gan ddefnyddio gwrthgyrff i wahanol ranbarthau PDC, gwahanol ranbarthau PDC wedi'u gorchuddio â gleiniau, a sporozoites chimerig P. bergei yn mynegi P. falciparum PDC. Fe wnaethom sefydlu bod PDC yn darged mawr o'r gwrthgyrff swyddogaethol hyn a gall gwrthgyrff dargedu pob un o'r tri rhanbarth o'r PDC i ymgysylltu â Fc R a hyrwyddo ffagocytosis.

Yn benodol, roedd gan wrthgyrff i'r rhanbarth YG weithgaredd sylweddol ar draws ystod o wahanol brofion, gan ddarparu arweiniad posibl ar gyfer datblygu brechlynnau gan nad yw'r rhanbarth NT wedi'i gynnwys yn y brechlynnau sy'n seiliedig ar CSP RTS, S (sydd bellach mewn astudiaethau gweithredu), neu R21 (mewn treialon cam 2). Ymhellach, fe wnaethom sefydlu bod gwrthgyrff a gafwyd yn naturiol yn gallu hyrwyddo ffagocytosis opsonic o sporozoites. Roedd caffael gwrthgyrff swyddogaethol yn ddibynnol ar oedran a gwelwyd lefelau uwch o weithgaredd ffagocytosis opsonic a rhwymiad Fc RIIa a Fc RIII gyda samplau gan oedolion yn unig ond nid plant ifanc. Roedd gweithgaredd swyddogaethol yn cydberthyn ag is-ddosbarthiadau IgG1 ac IgG3.

Gall gweithgaredd ffagocytosis uwch neutrophils, ond gweithgaredd lefel isel iawn monocytes, ymwneud â phresenoldeb a defnydd gwahanol Fc Rs; roedd gan neutrophils gyfradd uwch o ffagocytosis, na chafodd ei esbonio'n syml gan y doreth uwch o niwtroffiliau o'i gymharu â monocytes. Yn ddiddorol, roedd blocio naill ai Fc RIIa neu Fc RIIIa/b yn atal gweithgaredd ffagocytosis gan neutrophils, gan awgrymu bod angen y ddau dderbynnydd ar gyfer ffagocytosis, a gefnogwyd gan gyflawni mwy o ataliad gyda blocio gwrthgyrff i Fc RIIa a Fc RIII a ddefnyddir ar y cyd. Nid oedd blocio Fc RI yn effeithio ar ffagocytosis gan neutrophils. Roedd sawl sylw yn awgrymu pwysigrwydd uwch Fc RIII; yn gyffredinol roedd mwy o ataliad o ffagocytosis sporozoite gan rwystr Fc RIII, ac roedd rhwymiad Fc RIII gan wrthgyrff yn cydberthyn yn well â ffagocytosis na Fc RIIa mewn dadansoddiad aml-amrywedd.

Fc RIIIb, sydd wedi'i angori gan GPI, yw'r math Fc RIII mwyaf niferus a fynegir ar niwtroffiliau, ond mae astudiaethau diweddar wedi nodi bod neutrophils hefyd yn mynegi Fc RIIIa30, sydd â pharth trawsbilen a cytoplasmig ar gyfer signalau mewngellol. Ar gyfer ffagocytosis, gall signalau mewngellol ddigwydd trwy Fc RIIIa neu Fc RIIa, gyda rhwymo i Fc RIIIb hefyd yn bwysig, fel y nodir gan ein canfyddiadau. Os yw Fc RIII a Fc RIIa yn gweithredu ar y cyd mewn ffagocytosis, gallai hyn esbonio pam roedd gweithgaredd cyfyngedig Fc RIIa mewn ffagocytosis gan monocytes. Mae celloedd NK yn mynegi Fc RIIIa, a gwnaethom sefydlu y gall gwrthgyrff i CSP hyrwyddo gweithrediad NK trwy ryngweithio â Fc RIIIa. Gall hyn arwain at ladd sporozoites yn ogystal â rhyddhau cytocinau pro-llidiol44.

Fodd bynnag, dim ond 1-5 y cant o leukocytes mewn gwaed yw celloedd NK sy'n awgrymu y byddent yn chwarae rhan lai amlwg mewn imiwnedd yn erbyn sporozoites na neutrophils, sy'n cynnwys 50-70 y cant o leukocytes. Mae sporozoites hefyd yn agored i macroffagau dermol a chelloedd Kupffer yr afu, a allai gynnwys mecanweithiau ychwanegol o glirio Fc R-mediated ac ymchwiliad gwarant mewn astudiaethau yn y dyfodol, ond mae amlder cymharol y celloedd hyn a'u mynegiant o Fc Rs yn wahanol i ffagosytau yn y gwaed. .

Mae astudiaethau presennol ar ffagocytosis opsonic wedi'i gyfryngu gan wrthgyrff mewn malaria wedi defnyddio'r llinell gell THP-1 i raddau helaeth fel model, gan ddefnyddio amodau safonol gyda FCS (ond heb gynnwys serwm dynol). O dan yr amodau hyn, canfuom fod ffagocytosis wedi'i rwystro'n effeithiol gan rwystr Fc RI, ond gwelwyd ychydig iawn o ataliad wrth rwystro Fc RIIa neu Fc RIII. Nododd astudiaeth ddiweddar nad oedd ffagocytosis opsonic gan gelloedd THP-1 yn cydberthyn ag amddiffyniad mewn treial cam I/IIa RTS, S mewn oedolion naïf malaria45. Fe wnaethom ddangos y gall IgG amhenodol mewn serwm dynol hefyd leihau gweithgaredd ffagocytosis celloedd THP-1 oherwydd bod rhyngweithiadau Fc RI yn cael eu rhwystro gan IgG monomerig a gyflwynir mewn plasma dynol, tra nad yw IgG buchol monomerig yn rhwymo Fc RI dynol. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu nad yw celloedd THP-1 yn fodel delfrydol ar gyfer astudio ffagocytosis opsonic yn erbyn sporozoites.

Fe wnaethom sefydlu y gellir targedu pob un o'r tri rhanbarth o Bartneriaethau Diogelwch Cymunedol gan wrthgyrff sy'n ymgysylltu â Fc RIIa a Fc RIII i hyrwyddo ffagocytosis o sporozoites gan neutrophils, a thrwy hynny yn pennu swyddogaethau ar gyfer gwrthgyrff i'r rhanbarthau hyn nad ydynt wedi'u hadrodd o'r blaen. O bwys, roedd gweithgarwch sylweddol o wrthgyrff i'r rhanbarth NT fel y gwelwyd mewn profion ffagocytosis gan ddefnyddio gwrthgyrff dynol gyda gleiniau wedi'u gorchuddio ag antigenau, ffagocytosis o sporozoites gan wrthgyrff cwningen a godwyd i wahanol ranbarthau, a rhwymiad Fc R gan wrthgyrff dynol. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gallai canolbwyntio mwy ar y rhanbarth NT wrth ddylunio brechlyn fod yn werthfawr, yn ogystal â chynnwys y rhanbarthau ailadrodd canolog a CT. Nid yw brechlynnau blaenllaw presennol yn cynnwys y rhanbarth NT3,46. Fe wnaethom fapio epitopau gwrthgyrff i ranbarth 21-aa sy'n agos at y gyffordd rhwng yr YG a'r rhanbarthau ail-adrodd canolog, ond nid yw'n cynnwys yr epitope cyffordd a ddisgrifiwyd yn ddiweddar34 ac sy'n wahanol i epitope Rhanbarth I, sy'n safle ar gyfer Holltiad N-terminal ar adeg goresgyniad hepatocyte47,48.

Mae ein harsylwadau y gall gwrthgyrff a geir trwy ddod i gysylltiad â malaria hyrwyddo ffagosytosis Fc R-mediated gan neutrophils yn cefnogi ymhellach y cysyniad bod hwn yn fecanwaith sy'n digwydd in vivo ymhlith unigolion sy'n datblygu lefelau uchel o imiwnedd. Mewn lleoliad o drosglwyddiad malaria uchel yn Kenya, mae'r gwrthgyrff swyddogaethol hyn yn isel iawn ymhlith plant ifanc sydd fwyaf mewn perygl o haint a malaria difrifol ond sy'n digwydd mewn oedolion. Canfu astudiaethau blaenorol yn y boblogaeth hon fod lefelau uchel o wrthgyrff i CSP ymhlith oedolion yn gysylltiedig â llai o risg o haint ymhlith oedolion49. Mewn cyferbyniad, ni chanfu carfan o blant yn bennaf unrhyw gysylltiad â Mali, lle roedd dwyster trosglwyddo malaria yn is na phoblogaeth ein hastudiaeth50. Yn ddiddorol, roedd y lefelau cymharol o weithgarwch rhwymo gyda phob Fc R yn amrywio'n sylweddol ymhlith unigolion, sy'n debygol o effeithio ar weithgarwch ffagocytosis. Bydd amrywiadau mewn rhwymiad Fc R penodol yn cael eu dylanwadu gan broffiliau is-ddosbarthiad IgG, epitopau a dargedir gan wrthgyrff, a glycosyleiddiad IgG22. Roedd IgG1 ac IgG3 yn bennaf ymhlith is-ddosbarthiadau IgG a gaffaelwyd ac yn cydberthyn â gweithgaredd rhwymo R Fc.

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom addasu'r defnydd o ficrosfferau wedi'u gorchuddio ag antigen i astudio gweithgaredd ffagocytosis opsonic gwrthgyrff i CSP, sef targed imiwnedd allweddol P. falciparum sporozoites. Mantais y dull hwn yw ei fod yn goresgyn yr heriau o gynhyrchu llawer iawn o sporozoites ar gyfer profion imiwnolegol, sy'n anodd ei gyflawni ar gyfer astudiaethau poblogaeth fawr a threialon clinigol. Roedd cydberthynas uchel rhwng lefel y ffagocytosis opsonic a fesurwyd gan ddefnyddio gleiniau wedi'u gorchuddio â CSP a'r hyn a fesurwyd gan ddefnyddio sporozoites cyfan. Roedd y platfform hwn hefyd yn ein galluogi i ddyrannu'r ymatebion gwrthgyrff swyddogaethol i bob rhanbarth o'r PDC. Fe wnaethom hefyd gadarnhau ffagocytosis gan ddefnyddio sporozoites cryopreserved (hyfywedd > 85 y cant 51), a sporozoites wedi'u dyrannu'n ffres.

Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos y gall gwrthgyrff i sporozoites atal symudedd sporozoite, tramwyiad celloedd, a goresgyniad hepatocyte fel mecanweithiau imiwnedd posibl. Fodd bynnag, nid oes tystiolaeth gyson ar hyn o bryd sy'n dangos bod y mecanweithiau hyn yn cyd-fynd ag amddiffyniad rhag haint Plasmodium mewn astudiaethau clinigol3. Mewn modelau imiwneiddio goddefol mewn anifeiliaid, gall lefelau uchel o IgG i PDC amddiffyn rhag haint arbrofol3,4. Fodd bynnag, nid yw lefelau uchel tebyg o amddiffyniad, a gynhelir dros amser, wedi'u cyflawni eto gan wrthgyrff a achosir gan frechlyn mewn treialon clinigol52-56. Mae RTS, S yn achosi lefelau IgG CSP uchel iawn, ond dim ond yn darparu amddiffyniad cymedrol53,56, sy'n awgrymu bod angen strategaethau eraill i gynhyrchu gwrthgyrff sydd â gweithgaredd amddiffynnol swyddogaethol uwch3,4. Mae ein data yn rhoi mewnwelediad i fecanwaith imiwnedd gwrthgyrff nad yw wedi'i astudio'n ddigonol wrth glirio'r ffagocytig o sporozoites ac yn awgrymu y gallai harneisio mecanweithiau Fc Rmediated fod yn strategaeth i gynhyrchu imiwnedd cryfach ar gyfer lefelau uwch o amddiffyniad. Gellid cyflawni hyn trwy strategaethau brechlyn sy'n gwneud y gorau o ymatebion is-ddosbarthiad IgG, lleihau IgM a allai atal rhyngweithiadau Fc R, a gwella targedu epitopau swyddogaethol penodol. Gellid cyflawni'r datblygiadau hyn trwy ddefnyddio cymhorthion brechlyn penodol a dylunio imiwnogen. Gall rhyngweithiadau Fc R ag IgG sydd wedi'u rhwymo i antigenau hefyd gael eu dylanwadu gan ddwysedd epitope a chyfeiriadedd gofodol a lleoliad epitopau57,58. Gallai dulliau bioleg strwythurol fod yn werthfawr i ddeall hyn a llywio’r gwaith o ddylunio brechlynnau. Mae hefyd yn bosibl bod gwahanol ranbarthau o PDC yn cyfryngu imiwnedd trwy wahanol fecanweithiau imiwnedd.

Mae hyn wedi'i ddangos ar gyfer hemagglutinin ffliw, gyda mecanweithiau Fc Rmediated yn bwysig ar gyfer gwrthgyrff i'r rhanbarth coesyn cadw, ond yn llai pwysig ar gyfer gwrthgyrff straen-benodol i'r rhanbarth pen18,21.

Mae angen astudiaethau yn y dyfodol sy'n ymchwilio i sefydlu'r gwrthgyrff swyddogaethol hyn a'u cydberthynas ag amddiffyniad mewn treialon cam II a cham III o RTS, S, a brechlynnau eraill sy'n seiliedig ar CSP. Rydym wedi cynnal astudiaeth gychwynnol yn y treial cam I/IIa o RTS, S56. Sefydlodd hyn fod brechiad RTS, S yn wir yn ysgogi gwrthgyrff i CSP sy'n hyrwyddo rhwymo Fc RIIa a Fc RIII, yn ogystal â ffagocytosis gan neutrophils. Yn bwysig, roedd y gweithgareddau swyddogaethol hyn yn sylweddol uwch ymhlith pynciau a oedd wedi'u hamddiffyn rhag haint malaria o'u cymharu â'r rhai a ddatblygodd haint43. Er bod PDC yn darged o imiwnedd dynol caffaeledig, gan gynnwys gwrthgyrff swyddogaethol, ar hyn o bryd mae dealltwriaeth gyfyngedig o wahaniaethau posibl mewn imiwnedd a gaffaelwyd yn naturiol ac a achosir gan frechlyn yn erbyn sporozoites. Gall ymchwil pellach ar y gwahaniaethau hyn ddatgelu mewnwelediadau pwysig i lywio datblygiad brechlynnau.

I grynhoi, mae ein hastudiaethau wedi diffinio mecanweithiau a thargedau allweddol imiwnedd wedi'i gyfryngu gan Fc R yn erbyn sporozoites mewn gwaed. Mae ein canfyddiadau'n tynnu sylw at rôl fawr i niwtroffiliau yn y gwaith o glirio ffagocytig o sporozoites, rolau pwysig wedi'u diffinio ar gyfer Fc RIIa a Fc RIII, a sefydlu PDC fel targed allweddol ar gyfer y gweithgaredd swyddogaethol hwn. Mae monosytau hefyd yn cyfrannu at ffagocytosis ond mae ganddynt weithgaredd is, a gall gwrthgyrff hefyd hyrwyddo gweithgaredd ADCC celloedd NK trwy ymgysylltiad Fc RIIIa. Mae deall a diffinio mecanweithiau sy'n cyfryngu imiwnedd yn hanfodol i alluogi datblygiad brechlynnau mwy effeithiol. Dylai astudiaethau yn y dyfodol ymchwilio i ba mor effeithiol y mae brechlynnau cyfredol mewn treialon clinigol yn cynhyrchu gwrthgyrff gyda'r gweithgareddau swyddogaethol hyn. Gall harneisio'r wybodaeth hon wrth ddatblygu brechlynnau fod yn strategaeth effeithiol ar gyfer cynhyrchu ymateb imiwn cryf sy'n darparu lefelau uwch o amddiffyniad rhag malaria.

Dulliau

Astudiwch boblogaethau a datganiad moeseg.

Casglwyd plasma o oedolion iach, asymptomatig sy’n agored i falaria ac sy’n byw yn is-ranbarth Kanyawegi yn Sir Kisumu, Kenya (n=104, ystod oedran 18–79; 26.9 y cant o ddynion) ym mis Awst 2007 (carfan Kanyawegi)59; nid oedd gan unrhyw gyfranogwyr symptomau malaria ac mae gan 46.15 y cant parasitemia P. falciparum asymptomatig (a ganfyddir gan ficrosgopeg). Plasma gan blant ifanc iach, asymptomatig ac oedolion sy'n byw yn isranbarth Chulaimbo yn Sir Kisumu, Kenya (n=75, ystod oedran 0.3-5.9 oed i blant, ystod oedran 19.6-69.2 oed i oedolion; 55 y cant benywaidd) oedd a gasglwyd rhwng Chwefror a Mawrth 2007 (carfan Chulaimbo)42; crynhoir manylion y garfan yn Nhabl Atodol 1. Roedd dwyster y trosglwyddiad yn gymharol uchel ar yr adeg y casglwyd gwaed (cyffredinolrwydd parasitemia asymptomatig mewn plant Llai na neu'n hafal i 10 mlynedd oedd 70-80 y cant)60. Casglwyd gwaed oddi wrth oedolion gwrywaidd a benywaidd iach i'w ddefnyddio mewn profion leukocyte, neutrophil, monocyte, a NK cyfan.

Cafwyd cymeradwyaeth moeseg gan Bwyllgor Ymchwil Dynol a Moeseg Ysbyty Alfred (protocol 385-18), y Bwrdd Adolygu Sefydliadol ar gyfer Ymchwilio Dynol yn Ysbytai Prifysgol Cleveland ar gyfer Case Western Reserve University, UDA (protocol 02-04-04) a y Pwyllgor Adolygu Moesegol yn Sefydliad Ymchwil Feddygol Kenya, Kenya (protocol SSC867). Cafwyd caniatâd gwybodus ysgrifenedig gan bawb a gymerodd ran yn yr astudiaeth neu eu rhieni neu warcheidwaid cyfreithiol.

Antigenau.

Roedd yr antigenau a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon i gyd yn seiliedig ar y dilyniant cyfeirio 3D7 o P. falciparum CSP (Gene ID PF3D7_0304600; www.plasmodb.org). Prynwyd y PDC hyd llawn ailgyfunol gan Sanaria (Sanaria, Rockville, UDA).

Mynegwyd y protein yn Pichia pastoris gan ddechrau ar weddillion asid amino 50 ac mae'n cynnwys (NNP) ailddarllediadau 22 a (NVPD)4 ailddarllediadau. Cynhyrchwyd rhanbarth terfynell C PDC (CT) ac ymasiad o ranbarth N-terminal a rhanbarth terfynell C o PDC (N plws C) fel proteinau ailgyfunol gan ddefnyddio celloedd HEK293F (a brynwyd o Invitrogen, Awstralia). Cynhyrchwyd rhanbarth N-terminal CSP (asid amino 19-104, NT) fel peptidau synthetig, a chynhyrchwyd rhanbarth ailadrodd canolog CSP (NNP) hefyd fel peptidau synthetig (NNP × 15) gan LifeTein (LifeTein, NJ, UDA).

Cynhyrchu gwrthgyrff i wahanol broteinau PDC.

yn cael ei berfformio gan gyfleuster gwrthgyrff Sefydliad Walter Eliza Hall; rhoddwyd cymeradwyaeth gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Sefydliad Walter ac Eliza Hall (cyf: 2020.019, 2014.009). Yn gryno, cafodd cwningod (n=2) eu brechu ag un o'r antigenau canlynol: PDC hyd llawn, protein ailgyfunol N plws C, a pheptid NT. Derbyniodd pob cwningen dri dos o antigen (200 µg/dos) wedi'i gyd-weinyddu â chynorthwyydd Freud ar ddiwrnod 0, diwrnod 28, a diwrnod 56. Casglwyd sera cwningen ar ôl y trydydd brechiad ar ddiwrnod 68, a chafodd IgG cwningen ei buro â phrotein A. - dewis cadarnhaol. Mae'r cwningen gwrth-N ynghyd â C IgG eu profi i ddechrau, a dangoswyd i adnabod yn bennaf y C-terminal rhanbarth o PDC, ac nid y rhanbarth N-terminal (Atodol Ffig. 6 A). Cadarnhawyd bod yr IgG gwrth-NT cwningen yn cydnabod rhanbarth N-terminal PDC (Ffig Atodol 6B). Ymatebodd gwrthgyrff NT a CT â PDC hyd llawn (Ffig Atodol 6C). Mynegwyd gwrthgorff monoclonaidd (mAb) MGG434, a gafodd ei ynysu oddi wrth unigolyn ar ôl haint dro ar ôl tro â sporozoites gwanedig, a'i buro fel gwrthgorff IgG1 ailgyfunol mewn celloedd HEK293 gan ddefnyddio dulliau sefydledig. Profwyd yr mAb yn erbyn PDC ailgyfunol i gadarnhau penodoldeb. Mynegwyd gwrth-CSP mAb 2A1061 gyda threigladau LALA yn y rhanbarth Fc62 i atal rhyngweithiadau Fc R fel gwrthgorff rheoli.

Ynysu PBMC, neutrophils, a leukocytes cyfan o waed ymylol.

Cafodd celloedd mononiwclear gwaed ymylol (PBMC) a neutrophils eu hynysu o waed ymylol gan ddefnyddio dulliau a sefydlwyd yn flaenorol63,64. Yn gryno, gwahanwyd gwaed ymylol o roddwyr iach gan ddefnyddio centrifugio graddiant Ficoll. Casglwyd yr haenau Buffy, sy'n cynnwys PBMCs, a'r pelenni RBC sy'n cynnwys neutrophils, ar wahân. Ar gyfer ynysu PBMC, golchwyd celloedd a gasglwyd o haen Buffy bedair gwaith gyda PBS-1 y cant NCS ar 4 gradd . Yn dilyn hynny, cafodd PBMCs eu hailddarparu mewn serwm buchol ffetws RPMI1640-10 y cant (FCS) a'u cadw ar rew. Cyfoethogwyd niwtrophils gan segmentiad dextran o allgyrchiad graddiant pelenni RBC ar ôl Ficoll, ac yna lysis63 hypotonig.

Cafodd leukocytes cyfan eu hynysu o waed cyfan trwy gyfoethogi cychwynnol gyda segmentiad dextran ac yna lysis hypotonig. Addaswyd neutrophils ynysig a leukocytes cyfan i 5 × 105 neutrophils/ml neu 5 × 106 ffagosytau (monocytes a neutrophils)/ml ac yn dilyn hynny ailddarparu yn RPMI1640 ategu gyda 10 y cant FCS a 2.5 y cant gwres-anweithredol serwm dynol a'u cadw ar rew. Cafodd celloedd eu ffenoteipio ar gyfer mynegiant Fc R gan ddefnyddio gwrthgyrff i Fc RI (Clone 10.1 BD Bioscience, 1:50), Fc RIIa (Clone 8.26, BD Bioscience, 1:25), a Fc RIII (Clone 3G8 BD Biowyddoniaeth, 1:50) . Defnyddiwyd gwrthgyrff i CD14 (Clone M5E2, BD Bioscience, 1:20) hefyd i bennu is-setiau monocyte.

Cynnal a chadw celloedd THP-1.

Cadwyd celloedd y llinell gell promonocytig THP{{{0}} (sy'n dod o ATCC) yn RPMI-1640 gyda 0.002 mol/L L-glutamine, 0.01 mol/L HEPES , a 10 y cant o serwm llo ffetws (FCS). Cafodd dwysedd celloedd ei fonitro'n agos a'i gynnal rhwng 1 × 105 ac 1 × 106 cell/ml. Roedd celloedd yn cael eu pasio bob 6 diwrnod neu pan oedd dwysedd celloedd yn agosáu at 1 × 106 o gelloedd/ml.

Diwylliant ac ynysu P. bergei sporozoites.

Cafodd mosgitos Anopheles stephensi eu bwydo ar lygod Webster o'r Swistir a heintiwyd â PDC chimerig yn mynegi llinell barasit P. bergei ANKA12. Cafodd chwarennau poer eu dyrannu 18-22 diwrnod ar ôl y pryd gwaed heintus a'u homogeneiddio mewn PBS. Roedd y sporozoites yn cael eu pasio trwy hidlydd meinwe 70-μm (Falcon) a'u cyfrif gan ddefnyddio hemocytomedr.

Diwylliant ac ynysu P. falciparum merozoites.

Roedd llinell D10 P. falciparum yn cael ei chynnal yn RPMI-HEPES wedi'i hategu â 0.5 y cant Albumax (Life Technologies) a 0.18 y cant NaHCO3. Roedd diwylliannau'n cael eu cynnal o dan 10 y cant parasitemia a'u cydamseru gan driniaeth sorbitol. Cafodd y merozoites eu hynysu gan ddefnyddio dulliau a gyhoeddwyd yn flaenorol 32. Yn gryno, cyfoethogwyd cam schizont yr erythrocytes heintiedig gan buro magnetig a pharhaodd i feithrin mewn cyfrwng a ategwyd â transepoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino) butane (E64, Sigma). -Aldrich) am 8 awr cyn pasio'r sgitsontau aeddfed trwy hidlydd 1.2-μm i ryddhau'r merozoites. Addaswyd y merozoites i 5 × 107/ml ar gyfer assay ffagocytosis opsonic neu 1 × 107/ml ar gyfer y cotio i blât ELISA ar gyfer assay R-rhwymo Fc.

Cyplu cofalent o antigenau â gleiniau latecs fflwroleuol.

Golchwyd gleiniau latecs fflworoleuol wedi'u haddasu amine o 2.0-µm maint (Sigma-Aldrich) ddwywaith gyda 400 µl o PBS a'u centrifugio ar 2000 × g am 3 munud. Ychwanegwyd glutaraldehyde o 8 y cant mewn PBS at y gleiniau a'i ddeor ar rholer dros nos ar 4 gradd. Ar ôl golchi gyda PBS, ychwanegwyd 1 mg/ml o CSP ailgyfunol at y gleiniau a'i ddeor ar fortecs am 6 h. Yn dilyn hynny, cafodd y gleiniau eu centrifugio a'u hailddarparu mewn 200 µl o ethanolamine a'u deor am 30 munud ar fortecs i dorri'r holl grwpiau amin sy'n weddill. Cafodd y gleiniau eu golchi wedyn mewn PBS a'u rhwystro gydag 1 y cant BSA dros nos ar 4 gradd. Cadwyd y gleiniau wedi'u gorchuddio ag antigen mewn baddon dŵr sonigaidd am 20 munud ar 4 gradd i leihau agregu ac yna eu haddasu i 5 × 107 gleiniau/ml. Roedd y gleiniau yn cael eu storio ar 4 gradd ym mhresenoldeb 0.1 y cant SDS a 0.02 y cant NaN3.

Profion ffagocytosis opsonic.

Perfformiwyd profion ffagocytosis opsonig mewn lleoliadau amrywiol at wahanol ddibenion fel y disgrifir isod ac yn Nhabl Atodol 6.

Ar gyfer ffagocytosis opsonic o P. falciparum a P. bergei sporozoites gan ddefnyddio celloedd ynysig, darparwyd sporozoites cryopreserved P. falciparum gan PATHMVI (Samaria, Rockville, UDA) a'u storio mewn nitrogen hylifol, ac fe'u dadmer ar 37 gradd am 40 s fel y disgrifir yn llawlyfr defnyddiwr y gwneuthurwr. Defnyddiwyd sporozoites P. bergei wedi'u dyrannu'n ffres a oedd wedi'u trawsgyfeirio i fynegi'r PfCSP12 hefyd yn yr astudiaeth hon. Defnyddiwyd yr un dull ar gyfer P. falciparum a P. bergei sporozoites yn yr arbrofion. Cafodd y sporozoites eu staenio â 10 µg/ml ethidium bromid am 1 awr ar rew ac yna tri golchiad gyda RPMI-HEPES. Ar gyfer opsonization, cafodd 50,{7}} o sporozoites eu deor ag 1 ul o serwm prawf am 1 awr ar rew, ac yna cyd-deoriad â 5000 o niwtroffiliau ar grynodiad o 5 × 105 o gelloedd/ml yn RPMI-1640 wedi'i ategu gan 10 y cant FCS a 2.5 y cant o serwm dynol anweithredol gan wres gan roddwyr malaria-naïf Melbourne. Ychwanegwyd 1ul ychwanegol o serwm prawf hefyd i gyfrif am y newid cyfaint o ychwanegu neutrophils a chynnal yr un crynodiad gwrthgyrff prawf yn ystod ffagocytosis.

Caniatawyd y cloddiad am 15 munud ar 37 gradd mewn deorydd CO2 5 y cant i ffagocytosis ddigwydd. Cafodd celloedd eu centrifugio ar 4 gradd a'u golchi â PBS oer-1 y cant NCS -0.04 y cant NaN3 (byffer FACS) i atal gweithgaredd ffagocytosis. Mesurwyd lefel y ffagocytosis yn ôl cytometreg llif (FACS CantoII, BD Biosciences) a'i ddadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd FlowJo (fersiwn 10). Cyflwynwyd y data fel mynegai phagocytosis (PI), a ddiffiniwyd fel cyfran y neutrophils (Ffig Atodol 4 A) neu gelloedd THP -1 (Ffig Atodol. 1A) a oedd â sporozoites phagocytosed. Ar gyfer arbrofion ar garfan Kanyawegi a Chulaimbo, safonwyd DP ymhellach fel y mynegai ffagocytosis cymharol (RPI), a ddiffiniwyd fel canran y DP ar gyfer pob sampl o'i gymharu â'r rheolaeth gadarnhaol. Roedd sporozoites heb eu derbyn yn cael eu cynnwys fel rheolaethau negyddol ym mhob asesiad. Roedd profion ffagocytosis niwtrophil safonol yn cynnwys 2.5 y cant o serwm dynol gan roddwyr malaria nad oeddent yn agored i niwed. Perfformiwyd profion ffagocytosis THP -1 safonol gan ddefnyddio dulliau sefydledig sy'n cynnwys 10 y cant FCS.

Ar gyfer ffagocytosis o gleiniau wedi'u gorchuddio ag antigen neu merozoites gan ddefnyddio celloedd ynysig, addaswyd y assay phagocytosis o ddulliau a gyhoeddwyd yn flaenorol gydag addasiadau 32. Yn fyr, cafodd gleiniau latecs fflwroleuol 1 × 106 wedi'u gorchuddio â antigen neu merozoites eu opsonized â samplau serwm am 1 h. Roedd y gleiniau neu'r merozoites yn cael eu golchi deirgwaith gyda RPMI-1640 cyn eu cyd-deor â niwtroffiliaid 1 × 105 ar gyfer ffagosytosis. Caniatawyd i ffagocytosis ddigwydd am 20 munud ar gyfer gleiniau neu 10 munud ar gyfer merozoites ar 37 gradd ac yna golchwyd y celloedd â byffer FACS ar 300 × g a 4 gradd am 4 munud. Gwerthuswyd cyfran y neutrophils sy'n cynnwys gleiniau fflwroleuol neu merozoites gan cytometreg llif (FACS CantoII, BD Biosciences) a'i ddadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd FlowJo (Ffig Atodol 4 A). Mewn rhai profion, defnyddiwyd llinell gell THP-1 gydag amodau safonol sy'n cynnwys 10 y cant FCS; mewn profion eraill, defnyddiwyd serwm dynol ychwanegol o 2.5 y cant gan roddwyr malaria naïf Melbourne er mwyn cymharu.

Ar gyfer ffagocytosis gleiniau wedi'u gorchuddio ag antigen neu P. bergei sporozoites gan ddefnyddio paratoadau leukocyte gwaed cyfan, cafodd y gleiniau wedi'u gorchuddio â PDC eu gwrthbwyso â gwrthgorff polyclonaidd cwningen a godwyd yn erbyn CSP. Perfformiwyd ffagocytosis trwy gyd-gyfrifo'r gleiniau wedi'u gorbynnu â chyfanswm y ffracsiwn leukocyte o waed cyfan sy'n cynnwys 1 × 106 phagocytes (monocytes a neutrophils) am 20 munud ar 37 gradd mewn deorydd CO2 5 y cant. Perfformiwyd yr arbrofion hyn gan ddefnyddio crynodiadau gwrthgyrff amrywiol ar gyfer opsonization neu gymarebau gleiniau-i-ffagosyt amrywiol. Ar gyfer profi ffagocytosis opsonic o sporozoites P. bergei gan baratoadau leukocyte cyfan, opsonized 5 × 105 sporozoites gyda chronfa o malaria-agored i sera oedolion Kenya ar wanhad o 1:100, ac yna cyd-deor gyda leukocytes cyfan yn cynnwys 5 × 104 ffagocytes. Cafodd y celloedd eu hallgyrchu ar 4 gradd am 4 munud i atal y gweithgaredd phagocytic a labelwyd gwahanol ffagosytau (monocytes a neutrophils) â gwrthgyrff cyfun fflworoleuol i'w dadansoddi ymhellach. Cafodd monosytau eu labelu â gwrth-CD14-Alexa647 (MφP9 BD Bioscience, 1:33) a gwrth-CD16- BV421 (3G8 BD Bioscience, 1:20), a labelwyd niwtroffiliau â gwrth-CD66bAPC -H7 (G10F5 BD Biowyddoniaeth, 1:33).

Ar gyfer dadansoddiad FACS, dewiswyd gleiniau ffagocytosed fel poblogaethau PEhigh a FSChigh. Gwahaniaethwyd ymhellach rhwng gleiniau a gafodd eu ffagosytau gan monocytes a neutrophils gan ddefnyddio staen CD14 a CD66b. Mae nifer y gleiniau phagocytosed gan monocytes a neutrophils ei gyfrifo yn seiliedig ar y dwyster fflworoleuedd (Atodol Ffig. 8). Cafodd y rhif hwn ei safoni ymhellach gan ddefnyddio cyfanswm nifer y ffagosytau (monocytes a neutrophils) a'i fynegi fel gleiniau fesul 100 ffagosyt, gan gynrychioli cyfradd ffagocytosis gwahanol fathau o gelloedd.

Ar gyfer atal ffagocytosis opsonic trwy rwystro derbynyddion Fc neu ddisbyddu gwrthgyrff CSP, cafodd gwahanol Fc Rs eu rhwystro gan ddefnyddio gwrthgyrff blocio penodol. Cafodd Fc RI ei rwystro â gwrthgorff blocio 50 µg/ml (mAb 10.1 Merck), cafodd Fc RIIa ei rwystro â gwrthgorff blocio 50 µg/ml (mAb IV.3), cafodd Fc RIII ei rwystro â gwrthgorff blocio 50 µg/ml (mAb 3G8) . Cafodd celloedd THP-1 a niwtroffiliau eu trin â phob rhwystrwr Fc R, yn y drefn honno, ar 4 gradd am 30 munud cyn cyd-deoriad â gleiniau latecs wedi'u gorchuddio â CSP, sydd wedi'u gorsoneiddio â serwm gan oedolion imiwn. Perfformiwyd assay phagocytosis fel y crybwyllwyd uchod. Er mwyn asesu rôl gwrthgyrff i PDC wrth hyrwyddo ffagocytosis wedi'i gyfryngu gan wrthgyrff dynol a gaffaelwyd, cyn-deorwyd cronfa o serwm oedolion Kenya am 30 munud gyda pheptid rhanbarth CSP a NT ailgyfunol ar grynodiad o 20 ug/ml i rwymo CSP-benodol gwrthgyrff, cyn eu defnyddio mewn profion ffagocytosis.

Mesur cyfanswm yr is-ddosbarthiadau IgG ac IgG yn ôl ELISA.

Mesurwyd cyfanswm yr is-ddosbarthiadau IgG ac IgG i broteinau ailgyfunol gan ELISA fel y disgrifiwyd yn flaenorol33. Yn gryno, cafodd PDC ei gorchuddio ar 1 µg/ml ar blatiau microtiter Maxisorp ffynnon (NUNC, Roskilde, Denmarc) a'u deor dros nos ar 4 gradd . Golchwyd platiau gyda PBS yn cynnwys 0.05 y cant Tween20 (PBS-Tween) a'u rhwystro â PBS-1 y cant BSA ar 37 gradd am 2 awr. Gwanhawyd serwm dynol neu IgG cwningen i'r crynodiad a ddymunir a'i ychwanegu at y platiau mewn copïau dyblyg. Ar gyfer canfod IgG yn gyfan gwbl, defnyddiwyd IgG gwrth-ddynol gafr cyfun HRP ar wanediad 1:2500 ac yna swbstrad ABTS ar gyfer datblygu lliw. Stopiwyd yr adwaith gyda 1 y cant SDS, a mesurwyd amsugnedd ar 405 nm. Ar gyfer canfod is-ddosbarthiad IgG, defnyddiwyd mAbs i IgG1 dynol, IgG2, IgG3, ac IgG4 ar wanhau 1:1000, ac yna IgG gwrth-lygoden gafr cyfunedig HRP a ddefnyddiwyd ar wanhau 1:2500. Yn olaf, defnyddiwyd swbstrad 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB, Life Technologies) ar gyfer datblygu lliw, a stopiwyd yr adwaith gyda 1 M H2SO4. Mesurwyd yr amsugnedd ar 450 nm. Defnyddiwyd cronfa o serwm oedolion Kenya ag adweithedd IgG uchel i PDC fel rheolaeth gadarnhaol.

Mapio epitopau gwrthgyrff y rhanbarth NT.

Cafodd arae yn cynnwys 7{15}} peptid mer fiotinylated sy'n cynrychioli dilyniant llinol CSP (straen 3D7/NF54) ei syntheseiddio (Mimotopes, Awstralia). Roedd gan bob peptid bylchwr SGSG byr rhwng y dilyniant peptid CSP a'r tag biotin (a ychwanegwyd i atal symudedd), a gorgyffwrdd 12 aa rhwng peptidau. Cynhaliwyd profion gwrthgyrff gan ddefnyddio dulliau a sefydlwyd yn flaenorol65,66; Ychwanegwyd 50 ul fesul ffynnon o beptidau at blatiau ELISA a oedd wedi'u gorchuddio ymlaen llaw â streptavidin 1 ug/ml (Sigma-Aldrich). Cyflawnwyd a chadarnhawyd dirlawnder rhwymo peptid trwy feintioli safleoedd biotin-rhwymo gweddilliol ar streptavidin gan ddefnyddio biotin-HRP. yna blocio gyda llaeth 10 y cant, a golchi gyda PBS gyda Tween 0.05 y cant . Ychwanegwyd IgG polyclonaidd cwningen a godwyd yn erbyn rhanbarth NT PDC at bob ffynnon mewn crynodiad o 1:500. Canfuwyd lefel rhwymiad IgG cwningen gan IgG gwrth-gwningen gafr cyfun HRP (Millipore, 1:2500) a'i fesur gan ddefnyddio'r swbstrad TMB.

Assay derbynnydd-rwymo Fc.

Addaswyd assay derbynnydd-rwymo Fc o ddulliau a gyhoeddwyd yn flaenorol gyda mân addasiadau39. Yn gryno, cafodd 5{2{0}} ul o CSP ailgyfunol ar grynodiad o 1 ug/ml ei orchuddio ar blatiau Maxisorp™ a'i ddeor dros nos ar 4 gradd , wedi'i ddilyn gan dri golchiad gyda PBS-Tween. Yna cafodd y platiau eu rhwystro gyda 200 ul o 1 y cant BSA-PBS ar 37 gradd am 2 h ac yna tri golchiad gyda PBS-Tween. Gwanhawyd samplau serwm am 1:50 yn PBS-BSA ac ychwanegwyd 50 ul o bob sampl at y platiau yn ddyblyg a'u deor ar dymheredd ystafell am 2 h, ac yna tri golchiad yn PBS-Tween. Ychwanegwyd pum deg microlitr o dimers ectodomain Fc RIIa H131 hydawdd ailgyfunol hydawdd biotin (0.2 ug/ml) neu dimers ectodomain Fc RIII V158 (0.1 ug/ml) at bob ffynnon a'u deor ar 37 gradd am 1 h ac yna tair golchiad gyda PBS -Tween. Ar gyfer rhai profion, defnyddiwyd alel R131 Fc RIIa ac alel F158 Fc RIII yn yr un crynodiad. Dilynwyd hyn gan streptavidin uwchradd gyda chyfuniad HRP (Thermo Fisher Scientific, 1:10,000) yn PBS-BSA ar 37 gradd am 1 h ac yna tri golchiad gyda PBS-Tween.

Yn olaf, ychwanegwyd 50 ul o swbstrad hylif TMB am 20 munud i fesur adweithedd enzymatig. Stopiwyd yr adwaith gyda 50 ul o hydoddiant 1 M H2SO4. Mesurwyd lefel y rhwymo fel dwysedd optegol ar 450 nm. Defnyddiwyd IgG dynol wedi'i gronni o oedolion Kenya sy'n agored i falaria (1:100) ac IgG polyclonaidd cwningen i PDC (1:500) fel rheolaethau cadarnhaol. Defnyddiwyd sera unigol gan oedolion Melbourne naïf (1:50) fel rheolaethau negyddol.

Addaswyd assay derbynnydd-rwymo Fc o ddulliau a gyhoeddwyd yn flaenorol gyda mân addasiadau39. Yn gryno, cafodd 5{2{0}} ul o CSP ailgyfunol ar grynodiad o 1 ug/ml ei orchuddio ar blatiau Maxisorp™ a'i ddeor dros nos ar 4 gradd , wedi'i ddilyn gan dri golchiad gyda PBS-Tween. Yna cafodd y platiau eu rhwystro gyda 200 ul o 1 y cant BSA-PBS ar 37 gradd am 2 h ac yna tri golchiad gyda PBS-Tween. Gwanhawyd samplau serwm am 1:50 yn PBS-BSA ac ychwanegwyd 50 ul o bob sampl at y platiau yn ddyblyg a'u deor ar dymheredd ystafell am 2 h, ac yna tri golchiad yn PBS-Tween. Ychwanegwyd pum deg microlitr o dimers ectodomain Fc RIIa H131 hydawdd ailgyfunol hydawdd biotin (0.2 ug/ml) neu dimers ectodomain Fc RIII V158 (0.1 ug/ml) at bob ffynnon a'u deor ar 37 gradd am 1 h ac yna tair golchiad gyda PBS -Tween. Ar gyfer rhai profion, defnyddiwyd alel R131 Fc RIIa ac alel F158 Fc RIII yn yr un crynodiad. Dilynwyd hyn gan streptavidin uwchradd gyda chyfuniad HRP (Thermo Fisher Scientific, 1:10,000) yn PBS-BSA ar 37 gradd am 1 h ac yna tri golchiad gyda PBS-Tween. Yn olaf, ychwanegwyd 50 ul o swbstrad hylif TMB am 20 munud i fesur adweithedd enzymatig. Stopiwyd yr adwaith gyda 50 ul o hydoddiant 1 M H2SO4. Mesurwyd lefel y rhwymo fel dwysedd optegol ar 450 nm. Defnyddiwyd IgG dynol wedi'i gronni o oedolion Kenya sy'n agored i falaria (1:100) ac IgG polyclonaidd cwningen i PDC (1:500) fel rheolaethau cadarnhaol. Defnyddiwyd sera unigol gan oedolion Melbourne naïf (1:50) fel rheolaethau negyddol.

Assay cytotoxicity cell-mediated sy'n ddibynnol ar wrthgyrff.

Aseswyd gweithgaredd a ysgogwyd gan ADCC o ddetholiad o samplau serwm gan ddefnyddio pecyn Bioassay Reporter ADCC (Promega, Cat. No. G7010) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, gyda'r addasiadau canlynol. Cafodd gleiniau wedi'u gorchuddio â PDC eu gorsoneiddio â serwm dynol ar wanhau 1:50. Roedd 72 o gelloedd adroddwyr wedi'u platio ar 72,000 o gelloedd fesul ffynnon ynghyd â gleiniau fflwroleuol wedi'u gorchuddio â CSP ar gymhareb 10:1. Ar ôl 6 awr o ddeori, ychwanegwyd y swbstrad cemiluminescence a chanfuwyd a mesurwyd goleuedd tua bob 5 munud am 40 munud (CLARIOstar, BMG LabTech). Cofnodwyd data a gyflwynwyd tua 30 munud ar ôl ychwanegu'r swbstrad cemiluminescence.

Cadarnhawyd lefel yr ADCC hefyd mewn celloedd NK cynradd gan ddefnyddio dull a gyhoeddwyd yn flaenorol 38. Yn fyr, cafodd PBMCs sy'n cynnwys celloedd NK eu meithrin yn RPMI1640 wedi'u hategu â 10 y cant FCS a 100 IU/ml o interleukin-2 (IL{{5) }}) dros nos. Cafodd gleiniau wedi'u gorchuddio â PDC eu opsonized â serwm dynol ar wanhau 1:50, yna eu cyd-ddiwyllio â'r PBMCs preimio ym mhresenoldeb gwrth-CD107a-AF647 (H4A3, BD Biowyddoniaeth) am 1 h. Yn dilyn hynny, ychwanegwyd brefeldin A (Sigma-Aldrich) ac atalydd cludo protein (BD Bioscience) at y cyd-ddiwylliant mewn crynodiad o 5 ug/ml a 1/1500, yn y drefn honno, a pharhaodd i ddeor am 3 h. Ar ôl deori, cafodd y celloedd eu centrifugio ar 300 × g am 4 munud ar 4 gradd a'u staenio â gwrth-CD3-APC-H7 (SK7, BD Bioscience, 1:33), gwrth-CD56- PE-Cy7 (B159, BD Biowyddoniaeth, 1:33) a gwrth-CD16-BV421 (3G8, BD Biowyddoniaeth, 1:20). Diffiniwyd celloedd NK fel CD3 -, CD56 ynghyd â lymffocytau a mesurwyd lefel yr ADCC fel canran y celloedd NK â staenio CD107a gan cytometreg llif (LSR Fortessa X-20, BD Bioscience) (Ffig Atodol 9).

Dadansoddi data.

Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio fersiwn Prism 7 (GraphPad Software Inc) a fersiwn STATA 13.1 (StataCorp). Mae prawf ystadegau a gwerthoedd P wedi'u nodi mewn chwedlau ffigur. Gwerthuswyd cydberthnasau rhwng ffagocytosis, rhwymo Fc R, a lefelau IgG gan ddefnyddio cyfernodau cydberthynas Spearman a modelau atchweliad llinol lluosog. Aseswyd y gwahaniaethau mewn lefelau ffagocytosis, rhwymiad Fc R a lefelau IgG ar draws grwpiau oedran a gwahanol amodau gorbersonoli gan ddefnyddio ANOVA un ffordd gyda chymariaethau lluosog.

Er mwyn gwerthuso'r gweithgareddau swyddogaethol gwrthgorff, beth bynnag oedd cyfanswm y titer IgG i CSP, cyfrifwyd effeithlonrwydd rhwymo Fc R a ffagocytosis fel lefel rhwymiad Fc R neu lefel ffagocytosis opsonic o'i gymharu ag adweithedd IgG i CSP. Defnyddiwyd cydberthynas Spearman a phrawf Mann-Whitney i ddadansoddi effeithlonrwydd gweithredol gwrthgyrff ymhlith plant ac oedolion. Defnyddiwyd ANOVA dwy ffordd i gymharu ffagocytosis opsonic gan neutrophils a monocytes yn y profion leukocyte cyfan. Perfformiwyd prawf Kruskal-Wallis a phrawf Mann-Whitney ar gyfer data nad oedd yn cael ei ddosbarthu fel arfer. Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol fel profion dwy ochr. Dosbarthwyd samplau yn bositif ar gyfer gwrthgorff os oedd adweithedd yn fwy na'r cymedr ynghyd â 3 gwyriad safonol o werthoedd y rheolaethau malaria nad ydynt yn agored.

Crynodeb adrodd.

Mae rhagor o wybodaeth am gynllun ymchwil ar gael yn y Crynodeb o Adroddiadau Ymchwil Natur sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon.

Argaeledd data.

Mae data a ddefnyddiwyd i gynhyrchu ffigurau ar gael gan yr awduron ar gais. Mae cronfeydd data a ddadansoddwyd wrth baratoi'r papur hwn ac a gyflwynir mewn ffigurau a thablau ar gael gan yr awdur cyfatebol ar gais rhesymol ac yn amodol ar gytundeb gan y pwyllgorau moeseg perthnasol (ar gyfer data clinigol). Cafwyd dilyniannau P. falciparum o'r gronfa ddata gyhoeddus yn PlasmoDB.org.

Derbyniwyd: 2 Medi 2019; Derbyniwyd: 24 Chwefror 2021.

Cyfeiriadau

1. Sefydliad Iechyd y Byd. Adroddiad Malaria y Byd 2018 (Sefydliad Iechyd y Byd, 2018).

2. Sefydliad Iechyd y Byd, Map ffordd technoleg brechlyn Malaria (Sefydliad Iechyd y Byd, 2018).

3. Beeson, JG et al. Heriau a strategaethau ar gyfer datblygu brechlynnau malaria effeithiol a hirhoedlog. Sci. Cyfieithiad. Med. 11, eaau1458 (2019).

4. Cockburn, IA a Seder, RA Atal malaria: o gysyniadau imiwnolegol i frechlynnau effeithiol a gwrthgyrff amddiffynnol. Nat. Imiwnol. 19, 1199–1211 (2018).

5. Choumet, V. et al. Delweddu porthiant gwaed Anopheles gambiae nad yw'n heintus ac yn heintus mewn llygod naïf ac imiwneiddio poer. PLoS ONE 7, e50464 (2012).

6. Nussenzweig, V. & Nussenzweig, RS Circumsporozoite proteinau o barasitiaid malaria. Cell 42, 401–403 (1985).

7. Partneriaeth, RhCT Effeithiolrwydd a diogelwch RTS, brechlyn malaria S/AS01 gyda neu heb ddos ​​atgyfnerthu mewn babanod a phlant yn Affrica: canlyniadau terfynol cam 3, hap-brawf unigol, rheoledig. Lancet 386, 31–45 (2015).

8. Ymatebion celloedd Dups, JN, Pepper, M. & Cockburn, IA Antibody a B i sporozoites Plasmodium. Blaen. Microbiol. 5, 625 (2014).

9. Dobano, C. et al. Mae crynodiad ac egni gwrthgyrff i epitopau circumsporozoite gwahanol yn cydberthyn ag effeithiolrwydd brechlyn malaria RTS, S/AS01E. Nat. Cymmun.

10, 2174 (2019). 10. Stewart, MJ, Nawrot, RJ, Schulman, S. & Vanderberg, JP Goresgyniad sporozoite Plasmodium bergei yn cael ei rwystro in vitro gan wrthgyrff sy'n ansymudol sporozoite. Heintio. Imiwn. 51, 859–864 (1986).

11. Mishra, S., Nussenzweig, RS & Nussenzweig, V. Mae gwrthgyrff i brotein circumsporozoite Plasmodium (CSP) yn atal gweithgaredd tramwy celloedd sporozoite. J. Immunol. Dulliau 377, 47–52 (2012).

12. Triller, G. et al. Mae amlygiad i barasitiaid naturiol yn achosi gwrthgyrff antimalarial dynol amddiffynnol. Imiwnedd 47, 1197–1209 e1110 (2017).

13. Hoffman, SL et al. Imiwnedd i falaria a gwrthgyrff a gafwyd yn naturiol i brotein circumsporozoite Plasmodium falciparum. N. Saesneg. J. Med. 315, 601–606 (1986).

14. Foquet, L. et al. Mae gwrthgyrff monoclonaidd a achosir gan frechlyn sy'n targedu protein circumsporozoite yn atal haint Plasmodium falciparum. J. Clin. Ymchwilio. 124, 140–144 (2014).

15. Przysiecki, C. et al. Gwrthgyrff niwtraleiddio sporozoite a geir mewn llygod a macacau rhesws wedi'u himiwneiddio â pheptid ailadrodd Plasmodium falciparum wedi'i gyfuno â chymhlethdod protein pilen allanol meningococol. Blaen. Heintiad Cell. Microbiol. 2, 146 (2012).

16. Flores-Garcia, Y. et al. Mae amddiffyniad trwy gyfrwng gwrthgyrff yn erbyn sporozoites plasmodium yn dechrau ar y safle brechu dermol. Bio 9, e02194–02118 (2018).

17. Aliprandini, E. et al. Mae gwrthgyrff gwrth-circumsporozoite sytotocsig yn targedu sporozoites malaria yn y croen gwesteiwr. Nat. Microbiol. 3, 1224–1233 (2018).

18. DiLillo, DJ, Tan, GS, Palese, P. & Ravetch, JV Mae niwtraleiddio gwrthgyrff hemagglutinin sy'n benodol i'r coesyn yn gofyn am ryngweithiadau FcgammaR i'w hamddiffyn rhag firws y ffliw in vivo. Nat. Med. 20, 143–151 (2014).

19. Hessell, AJ et al. Mae derbynnydd Fc ond nid ategu rhwymo yn bwysig wrth amddiffyn gwrthgyrff yn erbyn HIV. Natur 449, 101–104 (2007).

20. Bournazos, S. et al. Mae niwtraleiddio gwrthgyrff gwrth-HIV-1 yn fras yn gofyn am swyddogaethau effeithydd Fc ar gyfer gweithgaredd in vivo. Cell 158, 1243–1253 (2014).

21. Mullarkey, CE et al. Mae niwtraleiddio gwrthgyrff coesyn-benodol hemagglutinin yn fras yn achosi ffagocytosis cryf o gyfadeiladau imiwnedd gan neutrophils mewn modd sy'n dibynnu ar Fc. Bhio 7, e01624–01616 (2016).

22. Irani, V. et al. Priodweddau moleciwlaidd is-ddosbarthiadau IgG dynol a'u goblygiadau ar gyfer dylunio gwrthgyrff monoclonaidd therapiwtig yn erbyn clefydau heintus. Mol. Imiwnol. 67, 171–182 (2015). 23. Cyfog, WM a Borregaard, N. Neutrophils yn y gwaith. Nat. Imiwnol. 15, 602–611 (2014).

24. Kolaczkowska, E. & Kubes, P. Recriwtio neutrophil a gweithrediad mewn iechyd a llid. Nat. Parch Immunol. 13, 159–175 (2013).

25. Gordon, S. Phagocytosis: proses imiwnolegol. Imiwnedd 44, 463–475 (2016).

26. Scapini, P. & Cassatella, MA Rhwydweithio cymdeithasol niwtroffiliau dynol o fewn y system imiwnedd. Gwaed 124, 710–719 (2014).

27. Dale, DC, Boxer, L. & Liles, WC Y ffagosytau: neutrophils a monocytes. Gwaed 112, 935–945 (2008).

28. Ziegler-Heitbrock, L. et al. Enwebiad monocytes a chelloedd dendritig yn y gwaed. Gwaed 116, e74–e80 (2010).

29. Rosales, C. Heterogenedd derbynnydd Fcgamma mewn ymatebion swyddogaethol leukocyte. Blaen. Imiwnol. 8, 280 (2017).

30. Golay, J. et al. Mae neutrophils dynol yn mynegi lefelau isel o FcgammaRIIIA, sy'n chwarae rhan mewn actifadu PMN. Gwaed 133, 1395–1405 (2019).

31. Dur, RW et al. Assay ffagocytosis opsonic ar gyfer Plasmodium falciparum Sporozoites. Clin. Imiwnol Brechlyn. 24, e00445–00416 (2017).

32. Osier, FH et al. Ffagocytosis opsonic o merozoites Plasmodium falciparum: mecanwaith mewn imiwnedd dynol a chydberthynas o amddiffyniad rhag malaria. Med BMC. 12, 108 (2014).

33. Kurtovic, L. et al. Mae gwrthgyrff dynol yn actifadu cyflenwad yn erbyn sporozoites Plasmodium falciparum ac maent yn gysylltiedig ag amddiffyniad rhag malaria mewn plant. Med BMC. 16, 61 (2018).

34. Tan, J. et al. Llinach gwrthgorff cyhoeddus sy'n atal haint malaria yn rymus trwy rwymo'r protein circumsporozoite yn ddeuol. Nat. Med. 24, 401–407 (2018).

35. Kerntke, C., Nimmerjahn, F. & Biburger, M. Mae cryfder (gwyddonol) mewn niferoedd: meintioliad cynhwysfawr o niferoedd derbynyddion gama Fc ar lewcocytau gwaed ymylol dynol a murineaidd. Blaen. Imiwnol. 11, 118 (2020).

36. Fleit, HB a Kobasiuk, CD Mae'r llinell gell dynol tebyg i monocyte THP-1 yn mynegi Fc gamma RI a Fc gamma RII. J. Leukoc. Biol. 49, 556–565 (1991).

37. Ulfman, LH, Leusen, JHW, Savelkoul, HFJ, Warner, JO a van Neerven, RJJ Effeithiau imiwnoglobwlinau buchol ar swyddogaeth imiwn, alergedd, a haint. Blaen. Nutr. 5, 52 (2018).

38. Lichtfuss, GF et al. Mae HIV yn atal digwyddiadau trosglwyddo signal cynnar sy'n cael eu sbarduno gan drawsgysylltu CD16 ar gelloedd NK, sy'n bwysig ar gyfer sytowenwyndra cellog sy'n ddibynnol ar wrthgyrff. J. Leukoc. Biol. 89, 149–158 (2011).

39. Gwinoedd, BD et al. ectodomainau Dimeric FcgammaR fel chwilwyr o swyddogaeth derbynnydd Fc firws gwrth-ffliw IgG. J. Immunol. 197, 1507–1516 (2016).

40. Li, X., Gibson, AW & Kimberly, RP Amryffurfedd ac afiechyd FcR Dynol. Curr. Brig. Microbiol. Imiwnol. 382, 275–302 (2014).

41. Munde, EO et al. Cysylltiad rhwng polymorphisms derbynnydd Fcgamma IIA, IIIA, a IIIB a thueddiad i anemia malaria difrifol mewn plant yng ngorllewin Kenya. BMC Heint. Dis. 17, 289 (2017).

42. Chelimo, K. et al. Gwahaniaethau sy'n gysylltiedig ag oedran mewn cof celloedd T a gaffaelwyd yn naturiol i brotein arwyneb merozoite Plasmodium falciparum 1. PLoS ONE 6, e24852 (2011).

43. Kurtovic, L. et al. Mae gwrthgyrff aml-swyddogaethol yn cael eu hysgogi gan y brechlyn RTS, S malaria ac yn gysylltiedig ag amddiffyniad mewn treialon cam I/IIa. J. Heintio. Dis, jiaa144 (2020). 44. Abel, AC, Yang, C., Thakar, MS a Malarkannan, S. Celloedd lladd naturiol: datblygiad, aeddfedu, a defnydd clinigol. Blaen. Imiwnol. 9, 1869 (2018).

45. Chaudhury, S. et al. Pennir swyddogaeth fiolegol gwrthgyrff a achosir gan yr ymgeisydd brechlyn malaria RTS, S/AS01 gan eu manyldeb manwl. Malar. J. 15, 301 (2016).

46. ​​Collins, KA, Snaith, R., Cottingham, MG, Gilbert, SC & Hill, AVS Gwella imiwnedd amddiffynnol i falaria gyda brechlyn gronynnau hynod imiwnogenig tebyg i firws. Sci. Sylw 7, 46621 (2017).

47. Coppi, A., Pinzon-Ortiz, C., Hutter, C. & Sinnis, P. Mae protein circumsporozoite Plasmodium yn cael ei brosesu'n broteolytaidd yn ystod goresgyniad celloedd. J. Exp. Med. 201, 27–33 (2005).

48. Coppi, A. et al. Mae gan y protein circumsporozoite malaria ddau faes swyddogaethol, pob un â rolau gwahanol wrth i sporozoites deithio o fosgito i westeiwr mamalaidd. J. Exp. Med. 208, 341–356 (2011).

49. John, CC et al. Cydberthynas lefelau uchel o wrthgyrff ag antigenau Plasmodium falciparum cyn-erythrocytig lluosog ac amddiffyniad rhag haint. Yn. J. Trop. Med Hyg. 73, 222–228 (2005).

50. Tran, TM et al. Nid yw astudiaeth carfan hydredol ddwys o blant ac oedolion Malian yn datgelu unrhyw dystiolaeth o imiwnedd caffaeledig i haint Plasmodium falciparum. Clin. Heintio. Dis. 57, 40–47 (2013).

51. Epstein, JE et al. Amddiffyniad rhag malaria Plasmodium falciparum gan frechlyn PfSPZ. JCI Insight 2, e89154 (2017).

52. Sach, BK et al. Amddiffyniad doniol rhag haint Plasmodium falciparum a drosglwyddir gan frathiad mosgito mewn llygod dynol. Brechlynnau NPJ 2, 27 (2017).

53. Stoute, JA et al. Gwerthusiad rhagarweiniol o frechlyn protein circumsporozoite ailgyfunol yn erbyn malaria Plasmodium falciparum. RTS, Grŵp Gwerthuso Brechlyn S Malaria. N. Saesneg. J. Med. 336, 86–91 (1997).

54. Kester, KE et al. Effeithlonrwydd regimensau brechlyn protein circumsporozoite ailgyfunol yn erbyn malaria Plasmodium falciparum arbrofol. J. Heintio. Dis. 183, 640–647 (2001).

55. Kester, KE et al. Cyfnod 2a treial o 0, 1, a 3 mis a 0, 7, a 28-atodlenni imiwneiddio dydd o'r brechlyn malaria RTS, S/AS02 mewn oedolion naïf malaria yn y Walter Reed Sefydliad Ymchwil y Fyddin. Brechlyn 26, 2191–2202 (2008).

56. Kester, KE et al. Treial cam 2a ar hap, dwbl-ddall, o frechlynnau falciparum malaria RTS, S/AS01B a RTS, S/AS02A mewn oedolion naïf malaria: diogelwch, effeithiolrwydd, a chymdeithion amddiffyn imiwnolegol. J. Heintio. Dis. 200, 337–346 (2009).

57. Lux, A., Yu, X., Scanlan, CN & Nimmerjahn, F. Effaith maint cymhleth imiwnedd a glycosyliad ar rwymo IgG i FcgammaRs dynol. J. Immunol. 190, 4315–4323 (2013).

58. Nesspor, TC, Raju, TS, Gên, CN, Vafa, O. & Brezski, RJ Avidity yn rhoi swyddogaeth rhwymo FcgammaR ac effeithydd imiwnedd i imiwnoglobwlin glycosylaidd G1. J. Mol. Cydnabod. 25, 147–154 (2012).

59. Dent, AE et al. Sefydlogrwydd dros dro imiwnedd a gafwyd yn naturiol i Brotein Arwyneb Merozoite-1 mewn oedolion Kenya. Malar. J. 8, 162 (2009).

60. John, CC et al. Gwrthgyrff i antigenau Plasmodium falciparum cyn-erythrocytig a risg o falaria clinigol mewn plant Kenya. J. Heintio. Dis. 197, 519–526 (2008).

61. Zavala, F. et al. Y rhesymeg dros ddatblygu brechlyn synthetig yn erbyn malaria Plasmodium falciparum. Gwyddoniaeth 228, 1436–1440 (1985).

62. Arduin, E. et al. Rhwymiad wedi'i leihau'n fawr i dderbynyddion gama Fc llygoden affinedd uchel ac isel gan L234A/L235A ac N297A Fc treigladau wedi'u peiriannu i mewn i lygoden IgG2a. Mol. Imiwnol. 63, 456–463 (2015).

63. Quinn, MT, DeLeo, FR & Bokoch, GM in Methods Mol Biol, Vol. 412 (gol. Quinn, MT) 13–18 (Springer Science plus Business Media, Springer Efrog Newydd Heidelberg Dordrecht Llundain, 2007).

64. Maueroder, C. et al. Nid yw gallu neutrophils i ffurfio NETs yn cael ei ddylanwadu'n uniongyrchol gan peptid sy'n targedu CMA. Blaen. Imiwnol. 8, 16 (2017).

65. Feng, G. et al. Arweiniodd imiwneiddio dynol ag ymgeisydd brechlyn malaria polymorffig wrthgyrff i epitopau cadw sy'n hyrwyddo gwrthgyrff swyddogaethol i fathau lluosog o barasitiaid. J. Heintio. Dis. 218, 35–43 (2018).

66. Boyle, MJ et al. Mae gwrthgyrff dynol yn trwsio cyflenwadau i atal ymlediad Plasmodium falciparum o erythrocytes ac maent yn gysylltiedig ag amddiffyniad rhag malaria. Imiwnedd 42, 580–590 (2015).

Diolchiadau

Diolchwn i gyfranogwyr yr astudiaeth a staff Sefydliad Ymchwil Feddygol Kenya am samplau o garfan Chulaimbo a charfannau Kanyawegi. Darparwyd P. falciparum sporozoites a mAb 2H8 yn garedig gan Fenter Brechlyn Malaria PATH (MVI). Darparwyd y mAb 3D11 a’r hybridoma yn garedig gan Miguel Prudêncio o’r Instituto de Medicina Molecular. Darparwyd parasitiaid P. bergei yn mynegi P. falciparum PDC gan Chris Janse, Shahid Khan, a Hans Kroeze o Ganolfan Feddygol Prifysgol Leiden. Roedd Paul Ramsland o RMIT, Paul Sanders o Sefydliad Burnet, a Geoffrey Pietersz o Sefydliad Baker Heart a Diabetes yn cefnogi'r broses gydfalent rhwng antigen a gleiniau fflwroleuol.

Diolchwn hefyd i Michelle Wong o Sefydliad Burnet am fod yn fflebotomydd i ni ac Emily Locke am adborth a chyngor defnyddiol. Cefnogwyd yr astudiaeth hon hefyd gan gyfleuster craidd cytometreg Llif AMREP. Cefnogwyd y gwaith hwn gan Gyngor Ymchwil Iechyd a Meddygol Cenedlaethol (NHMRC) Awstralia (Grant Rhaglen ac Uwch Gymrodoriaeth Ymchwil i JG Beeson; Grantiau Prosiect i JGB, GI McFadden, a PM Hogarth; Cymrodoriaeth Datblygu Gyrfa i MJB), PATH-MVI (grant i JGB), Sefydliad CASS (grant i GF), Cymrodoriaeth Llawryfog Cyngor Ymchwil Awstralia i GI McFadden, a Chanolfannau Rhyngwladol NIH ar gyfer Rhagoriaeth mewn Ymchwil Malaria (U19AI129326). Cefnogir Sefydliad Burnet gan yr NHMRC ar gyfer Cynllun Cymorth Seilwaith Sefydliadau Ymchwil Annibynnol a Chymorth Seilwaith Gweithredol Llywodraeth y Wladwriaeth Fictoraidd. Mae JGB, GF, MJB, JAC, SC, a LK yn aelodau o Ganolfan Rhagoriaeth Ymchwil Awstralia NHMRC i Ddileu Malaria.

Cyfraniadau awdur

Arweiniodd JGB, GF, a BDW ddyluniad yr astudiaeth gyda mewnbwn gan PMH, GIM, LK, JAC, ac awduron eraill; Cynhaliodd GF, BDW, LK, PB, DML, SC, VM, ac AC arbrofion a dehongli'r canlyniadau; Cynhaliodd GF, PB, a JAC ddadansoddiad data gyda mewnbwn gan JGB, LK, a MJB; Darparodd neu gynhyrchodd JGB, BDW, PMH, JWK, AED, KC, GIM, AC, VM, DRD, ac RJC adweithyddion, data a/neu adnoddau allweddol; Cyfrannodd GF, JGB, LK, JAC, a DRD at baratoi papur gyda mewnbwn gan yr holl gyd-awduron eraill.

Diddordebau cystadleuol

Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw fuddiannau cystadleuol.

Gwybodaeth adolygiad gan gymheiriaid

Mae Nature Communications yn diolch i Katie Ewer, Photini Sinnis, a’r adolygydd(wyr) dienw arall am eu cyfraniad i’r adolygiad cymheiriaid o’r gwaith hwn. Mae adroddiadau adolygwyr cymheiriaid ar gael.

Nodyn y cyhoeddwr

Mae Springer Nature yn parhau i fod yn niwtral ynghylch hawliadau awdurdodaeth mewn mapiau cyhoeddedig a chysylltiadau sefydliadol.

Mynediad Agored

Mae'r erthygl hon wedi'i thrwyddedu o dan Drwydded Ryngwladol Creative Commons Attribution 4.0, sy'n caniatáu defnyddio, rhannu, addasu, dosbarthu ac atgynhyrchu mewn unrhyw gyfrwng neu fformat, cyn belled â'ch bod yn rhoi credyd priodol i'r awdur(on) gwreiddiol ) a’r ffynhonnell, darparu dolen i’r drwydded Creative Commons, a nodi a wnaed newidiadau. Mae'r delweddau neu ddeunydd trydydd parti arall yn yr erthygl hon wedi'u cynnwys yn nhrwydded Creative Commons yr erthygl oni nodir yn wahanol mewn llinell gredyd i'r deunydd. Os nad yw deunydd wedi'i gynnwys yn nhrwydded Creative Commons yr erthygl ac nad yw rheoliadau statudol yn caniatáu'ch defnydd arfaethedig neu'n fwy na'r defnydd a ganiateir, bydd angen i chi gael caniatâd yn uniongyrchol gan ddeiliad yr hawlfraint. I weld copi o'r drwydded hon, ewch i http://creativecommons.org/ licens/by/4.0/.

 For more information:1950477648nn@gmail.com