Mae Metformin yn Lliniaru Nam Niwrowybyddol wrth Heneiddio Trwy Ysgogi Llwybr OfAMPK/ BDNF/PI3K RHAN 1

Mae arafu nam niwrowybyddol sy'n gysylltiedig ag oedran wedi bod yn her. Gwnaethom werthuso effeithiau therapiwtig metformin mewn heneiddio a achosir gan d-galactose. Yn ogystal, buom yn astudio'r mecanweithiau moleciwlaidd posibl a allai fod yn gyfrifol am effeithiau gwrth-heneiddio metformin. Rhannwyd tri deg o lygod mawr gwrywaidd yn gyfartal yn grŵp rheoli 1, a dderbyniodd hydoddiant halwynog, grŵp 2-d-galactose (D-gal), a dderbyniodd d-galactos (100 mg / kg / dydd) trwy lavage gastrig am wyth wythnos, a grŵp wedi'i drin â 3-d-galactos ynghyd â Metformin (D-gal a Met), a gafodd d-galactos ynghyd â metformin (200 mg/kg/dydd) drwy lavage gastrig am wyth wythnos. Cynhaliwyd asesiad niwrowybyddol. Perfformiwyd mesuriad o straen llidiol, ocsideiddiol, a biomarcwyr BDNF. Aseswyd mynegiant genynnau AMPK a PI3K. Cafodd meinweoedd hippocampal eu dyrannu ar gyfer astudiaethau histopatholegol ac imiwn-histocemegol. Arweiniodd D-gal at namau niwrowybyddol, dyrchafiad biomarcwyr ymfflamychol, newidiwyd marcwyr straen ocsideiddiol, gostyngodd BDNF, a gostyngodd mynegiant synaptoffiseg a Bcl2 gyda mynegiant cynyddol o Caspase-3, a dad-reoleiddio genynnau AMPK a PI3K. Roedd newidiadau niwroddirywiol yn bresennol yn yr hippocampus. Adferodd Metformin newidiadau niwroddirywiol a achoswyd gan D-gal yn sylweddol. Daethom i'r casgliad y gallai metformin liniaru diffyg niwrowybyddol a achosir gan oedran trwy leddfu niwro-lid, gwanhau straen ocsideiddiol, lleihau apoptosis, yn ogystal â hyrwyddo plastigrwydd synaptig. Gellid cyfryngu'r mecanweithiau hyn trwy actifadu'r llwybr AMPK/BDNF/PI3K.

Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu chwilota cryf o radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH a gallant ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol, atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhad ac am ddim thymin.

Cliciwch ar Cistanche yn Wrdw am WRTH HENEIDDIO

【Am ragor o wybodaeth: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Byrfoddau

D-gal d-galactos

ROS Rhywogaethau ocsigen adweithiol

IL-1 Interleukin-1

IL-1 Interleukin-1

IL-6 Interleukin-6

IL-10 Interleukin-10

TNF- Ffactor necrosis tiwmor

BDNF Ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd

kinase protein wedi'i actifadu gan AMP AMPK

PI3K/Akt Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B

RT-PCR Adwaith cadwyn polymeras transcriptase Reverse

EPM Elevated ynghyd â drysfa

TL Trosglwyddo cudd

MDA Malondialdehyde

SOD Superoxide dismutase

MPTP Mandwll trosiannol athreiddedd Mitochondrial

H&E Haematocsilin ac eosin

iNOS synthase nitrig ocsid anwythol

NF-κB Ffactor niwclear-κB

CTLl Potentiation hirdymor

Mae colli swyddogaeth ffisiolegol yn gyson, ystwythder meddwl, a chof sy'n digwydd gyda heneiddio yn broses amlochrog a all gael ei sbarduno gan farwolaeth celloedd niwronaidd1. Rhagwelir y bydd y disgwyliad oes mewn llawer o wledydd yn fwy na 85 mlynedd erbyn 20302. Oherwydd y gostyngiad yn ansawdd bywyd yr henoed a'r gwariant economaidd a phersonol cysylltiedig, mae namau gwybyddol sy'n gysylltiedig â heneiddio wedi dod i'r amlwg fel mater cymdeithasol sylweddol. Yn ogystal, heneiddio'r ymennydd yw prif achos datblygiad clefydau niwroddirywiol sy'n aml yn datblygu'n ddiwrthdro3. Ychydig iawn o driniaethau effeithiol sydd ar gael ar hyn o bryd, os o gwbl, ar gyfer nam niwrowybyddol sy'n gysylltiedig â heneiddio4.

Mae d-galactos (D-gal), monosacarid sy'n doreithiog mewn cynhyrchion llaeth, fel arfer yn cael ei drawsnewid yn glwcos gan ensymau. Fodd bynnag, gall gweinyddiaeth systemig D-gal hirdymor achosi peryglon iechyd sylweddol5. Awgrymodd ymchwil blaenorol y gallai cyflenwad systemig parhaus o D-gal i lygod mawr eu trawsnewid yn fodelau o heneiddio ac anhwylderau niwroddirywiol sy'n gysylltiedig ag oedran6. Mae gan y model heneiddio D-gal nifer o fanteision dros y model heneiddio naturiol, gan gynnwys y gallu i ganolbwyntio ar y broses heneiddio yn unig. Yn y model heneiddio naturiol, mae cyd-forbidrwydd gan gynnwys diabetes a gorbwysedd yn newidynnau cymhleth7.

Credir bod D-gal yn cynhyrchu anomaleddau biocemegol tebyg i'r rhai a welir yn yr ymennydd dynol sy'n heneiddio, megis llai o weithgaredd ensymau gwrthocsidiol a gwanhau'r niwronau colinergig. Mae cynhyrchion terfynol glyciad uwch, sy'n gysylltiedig â heneiddio arferol a pathoffisioleg llawer o afiechydon, yn cael eu cynhyrchu trwy ryngweithio D-gal â grwpiau amino protein. Achosodd anifeiliaid a ddarparwyd gan D-gal niwro-llid, difrod mitocondriaidd, a difrod ocsideiddiol yn sgil datblygiad Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol (ROS) ynghyd â phroblemau o ran cynefino newydd-deb, diffygion mewn dysgu gofodol, a swyddogaethau gwybyddol8.

Gallai llid fod yn ffactor allweddol mewn dirywiad gwybyddol ymhlith yr henoed. Mae lefelau uchel o interleukin-6, IL-1, ffactor necrosis tiwmor- , a phrotein C-adweithiol wedi’u cysylltu â risg uwch o afiachusrwydd a marwolaethau ymhlith yr henoed9. Triniaeth d-galactos cronig mewn llwybrau signalau apoptotig niwronaidd a achosir gan lygod mawr actifadu a niwro-llid yn y cortecs cerebral a hippocampus1.

Mae heneiddio yn arwain at ddirywiad mewn ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r Ymennydd (BDNF) sy'n brotein hanfodol sy'n ymwneud â newidiadau plastig sy'n gysylltiedig â dysgu a chof yn ogystal â chyfryngwr hanfodol ar gyfer amlhau niwronau ac uniondeb10.

Mae darganfod cyfansoddion newydd sy'n gohirio heneiddio a chefnogi perfformiad gwybyddol wedi dod yn un o'r heriau mwyaf. Mae metformin yn treiddio i'r rhwystr gwaed-ymennydd yn gyflym ac yn cronni mewn sawl maes yn yr ymennydd, gan gynnwys y chwarren bitwidol a'r hipocampws11. Dangoswyd bod gweinyddu metformin hirdymor yn lleihau dyfodiad cymhlethdodau patholegol sy'n gysylltiedig ag oedran ac yn ymestyn hirhoedledd mewn bodau dynol12. Ar ben hynny, dangoswyd bod metformin yn gwella nam gwybyddol ac anhwylderau ymddygiadol fel gorbryder mewn unigolion diabetig a heb fod yn ddiabetig13,14 a chleifion â chlefydau niwroddirywiol15. Fodd bynnag, mae mecanweithiau sylfaenol effeithiau metformin wrth wella nam niwrowybyddol sy'n gysylltiedig ag oedran yn gymhleth ac eto heb eu deall yn llwyr.

Gellir priodoli effeithiau niwro-amddiffynnol metformin yn bennaf i actifadu llwybr signalau Protein Kinase (AMPK) wedi'i Actifadu gan AMP11. Mae actifadu AMPK yn uwch-reoleiddio mynegiant BDNF, sydd â rôl hanfodol mewn trosglwyddo synaptig a chydgrynhoi cof10. Yn ogystal â'r eiddo sefydledig hwn o actifadu AMPK, mae canlyniadau blaenorol wedi dangos y gall metformin wella'r cof trwy adfer straen ocsideiddiol, lleihau niwro-lid, ac ataliad o apoptosis, a all ehangu ei arwyddion clinigol ym maes anhwylderau niwroddirywiol14. Mae Metformin yn ysgogydd cryf o'r llwybr ffosffatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) sy'n llwybr signalau hanfodol pwysig wrth atal apoptosis a hyrwyddo goroesiad celloedd16.

Gan gymryd i ystyriaeth fanteision metformin, sy'n cynnwys ei ddiogelwch, ei fforddiadwyedd a'i ddefnyddioldeb; astudiwyd effeithiau niwro-amddiffynnol gweinyddu metformin yn erbyn nam niwrowybyddol a achosir gan heneiddio a achosir gan d-galactos mewn llygod mawr. Yn ogystal, ymchwiliwyd i fecanweithiau moleciwlaidd sylfaenol yr effeithiau amddiffynnol hyn.

Defnyddiau a dulliau

Anifeiliaid.Defnyddiwyd llygod mawr gwrywaidd Tirty Wister albino yn pwyso 200-250 gram yn yr arbrawf ar ôl cael y gymeradwyaeth angenrheidiol gan y Pwyllgor Moesegol Ymchwil yn y Gyfadran Feddygaeth, Prifysgol Menoufa, yr Aifft (cofrestriad Rhif 10/2022 PHYS 9). Roedd gweithdrefnau arbrofol yn dilyn canllawiau CYRRAEDD. Cafodd y llygod mawr eu cadw mewn cewyll rhwyll wifrog (80 × 40 × 30 cm). Rhoddwyd mynediad llawn i fwyd a dŵr i bob anifail yn ystod cyfnod yr astudiaeth ar ôl eu cyflyru am 2 wythnos o dan amodau amgylcheddol cyson a chylch golau/tywyll o 12:{10}}.

Dyluniad arbrofol.Rhannwyd yr anifeiliaid ar hap yn dri grŵp (10/grŵp):

1. Grŵp rheoli: Derbyniwyd hydoddiant halwynog trwy gavage llafar.

2. grŵp d-galactos (D-gal): Wedi derbyn d-galactose (Sigma-Aldrich St. Louis, UDA) wedi'i hydoddi mewn hydoddiant halwynog mewn dos o 100 mg/kg pwysau'r corff trwy lavage gastrig am wyth wythnos yn olynol17

3. d-galactose ynghyd â Metformin (D-gal a Met) grŵp wedi'i drin: Wedi derbyn d-galactose (yn ôl yr un dos yn y grŵp D-gal) ynghyd â metformin (Sigma-Aldrich St. Louis, UDA) wedi'i hydoddi mewn hydoddiant halwynog mewn dos o 200 mg / kg / dydd trwy lavage gastrig am wyth wythnos yn olynol16

Ar ôl cwblhau wyth wythnos, cynhaliwyd asesiad niwro-ymddygiadol o'r holl lygod mawr. Wedi hynny, cafodd llygod mawr eu hanestheteiddio a'u haberthu gan elongation serfigol ac afleoliad. Cafodd yr ymennydd ei dynnu a'i olchi â halwynog byffer ffosffad (pH 7.4). Roedd yr hemisffer chwith yn cael ei bwyso a'i rannu'n ddau hanner; defnyddiwyd un ohonynt ar gyfer dadansoddiad biocemegol a defnyddiwyd yr hanner arall ar gyfer astudiaethau RT-PCR. Gosodwyd yr hemisffer cywir mewn halwynog fformalin 10 y cant ar gyfer asesiad histopatholegol ac imiwn-histocemegol o feinweoedd hippocampal.

Profion niwro-ymddygiadol.Adnabod gwrthrych newydd. Defnyddiwyd y prawf adnabod gwrthrychau newydd i asesu gallu'r llygod mawr i adnabod gwrthrych newydd mewn lleoliad cyfarwydd. Roedd gan bob llygoden fawr dri diwrnod o brofi, a oedd yn cynnwys tri cham: cynefino, hyfforddi a phrofi. Rhoddwyd llygod mawr mewn offer maes agored (50 cm × 50 cm × 40 cm) yn ystod y cyfnod cynefino, a rhoddwyd deg munud iddynt i'w haddasu heb unrhyw eitemau. Cadwyd pob llygoden fawr mewn siambr gyda dau wrthrych union yr un fath am bum munud yn ystod y cyfnod hyfforddi. Ar ôl pedair awr ar hugain, gosodwyd pob llygoden fawr yn y siambr am bum munud yn ystod y cyfnod prawf, a oedd yn cynnwys disodli un o'r hen wrthrychau ag un newydd. Defnyddiwyd y stopwats i amseru hyd archwilio gwrthrychau. Defnyddir y mynegai gwahaniaethu [=(amser archwilio gwrthrych newydd – amser archwilio gwrthrychau teuluol)/cyfanswm amser archwilio × 100 y cant ] i asesu perfformiad gwybyddol llygod mawr. Defnyddiwyd alcohol i lanhau'r cae agored a'r gwrthrychau rhwng llygod mawr18.

Y ddrysfa ddŵr Morris. Defnyddiwyd drysfa ddŵr Morris i archwilio effaith metformin ar ddysgu gofodol a chof. Roedd pwll wedi'i wneud o ddur di-staen, roedd ganddo ddiamedr o 210 cm ac uchder o 50 cm gan gynnwys llwyfan dianc tanddwr 1 cm o dan wyneb y dŵr. Roedd y dŵr yn cael ei gynnal ar 24±1 gradd. Profwyd y dasg caffael dros bum niwrnod o brofi gyda phedwar treial bob dydd. Cofnodwyd yr amser yr oedd ei angen i gyrraedd y llwyfan cyfrinachol yn ystod pob treial fel cuddni dianc. Rhoddwyd uchafswm o 60 eiliad i'r llygod mawr i leoli'r llwyfan cudd. Neilltuwyd terfyn amser uchaf o 60 s, a chafodd y llygoden fawr ei thywys â llaw i'r platfform cudd. Cynhaliwyd treial un stiliwr 24 awr ar ôl y treial olaf ar y pumed diwrnod. Tynnwyd y platfform a gosodwyd y llygoden fawr yn y pwll o'r cwadrant gyferbyn â'r cwadrant hyfforddi. Yna, caniatawyd i'r llygoden fawr nofio'n rhydd am 60 s. Cofnodwyd yr amser a dreuliwyd yn y cwadrant targed19.

Y prawf plws-ddrysfa uchel (EPM). Mae EPM yn dechneg sefydledig ar gyfer gwerthuso ymddygiad tebyg i bryder mewn llygod mawr. Fe'i gwnaed o bren ac roedd yn cynnwys breichiau agored a chaeedig (50 cm o hyd × 10 cm o led). Amgaewyd y ddwy fraich gaeedig gan waliau 40 cm o uchder. Cafodd y breichiau eu cysylltu gan lwyfan sgwâr canolog (10 × 10 cm). Roedd y cyfarpar 50 cm uwchben y llawr. Gosodwyd pob llygoden fawr yng nghanol y cyfarpar yn wynebu braich gaeedig a'i gadael i symud yn rhydd am bum munud. Cofnodwyd yr amser a dreuliwyd yn y breichiau agored a chaeedig. Hefyd, cofnodwyd cofnodion breichiau agored yn 20. Rydym hefyd yn mesur y Cudd Trosglwyddo (TL) a ddefnyddir i asesu cof a dysgu. Ar y diwrnod cyntaf (y sesiwn caffael), roedd pob llygoden fawr yn agored i EPM am 90 s. Cofnodwyd yr amser a gymerodd y llygoden fawr i gyrraedd y fraich gaeedig fel y TL. Cafodd llygod mawr a fethodd â mynd i mewn i freichiau caeedig yn y 90au eu heithrio o'r astudiaeth. Ar yr ail ddiwrnod (y sesiwn gadw), rhoddwyd pob llygoden fawr yn y fraich agored, a chofnodwyd y TL am uchafswm o 90 s21.

Dadansoddiad biocemegol.Cafodd meinwe'r ymennydd ei ddarlifo â hydoddiant PBS, yna ei homogeneiddio mewn byffer oer 5 ml fesul meinwe gram. Gwnaethpwyd allgyrchu meinwe'r ymennydd ar 4000 rpm am 15 munud, yna tynnwyd y supernatant a'i storio ar − 80 gradd hyd nes y mesurwyd Malondialdehyde (MDA) a Superoxide Dismutase (SOD) trwy ddefnyddio'r lliwimetrig confensiynol (QuantiChrom™, BioAssay Systems,). UDA), Ffactor Necrosis Tiwmor Serwm (TNF- ), Interleukin 10 (IL-10), a Ffactor Niwrotropig sy'n Deillio o'r Ymennydd (BDNF) trwy ddefnyddio pecyn ELISA (Quantikine, cwmni Abcam, Caergrawnt, DU) yn ôl y gwneuthurwr cyfarwyddiadau.

Asesiad meintiol o fynegiant genynnau AMPK a PI3K gan ddefnyddio techneg adwaith cadwyn polymeras gwrthdro trawsgrifiad (RT-PCR).Paratowyd meinweoedd yr ymennydd ar gyfer ynysu RNA llwyr gan ddefnyddio Qiagen RN Easy plus Universal Kit o UDA. Yna, sicrhawyd ansawdd a phurdeb RNA. Cafodd RNA ei storio ar − 80 gradd nes ei ddefnyddio. Yna, y cam cyntaf oedd synthesis cDNA gan ddefnyddio QuantiTect Reverse Transcription Kit, Qiagen o UDA, gan ddefnyddio beiciwr thermol Applied Biosystems 2720 (Singapore) am un cylch yn unig. Defnyddiwyd paent preimio GAPDH mewn adweithiau RT-PCR fel rheolydd llwytho RNA. Yr ail gam oedd ymhelaethu cDNA: defnyddiwyd cDNA yn PCR meintiol amser real gwyrdd SYBR ar gyfer Meintioli Cymharol (RQ) o fynegiant genynnau AMPK a PI3K gan SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit, UDA, gan ddefnyddio'r paent preimio cynlluniedig canlynol (Midland, Texas). ): Te ymlaen primer ar gyfer AMPK oedd (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC). A'r preimiwr cefn oedd (TGTGACTTCCAGGTCGGGGTT). Y preimiwr ymlaen ar gyfer PI3K oedd (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA), a'r paent preimio cefn oedd (GAAACTTTTTTCCCACCACGA). Yn olaf, dadansoddwyd data gyda meddalwedd Applied Biosystems 7500 fersiwn 2.0.1. Perfformiwyd RQ mynegiant genynnau AMPK a PI3K gan ddefnyddio dull ∆∆ Ct cymharol, lle mae swm y genynnau targed (AMPK a PI3K) mRNA yn cael ei normaleiddio i enyn cyfeirio mewndarddol (GAPDH) ac yn gymharol â rheolydd.

Asesiad histopatholegol o feinwe'r ymennydd.Archwiliad histolegol. Gosodwyd meinwe'r ymennydd mewn hydoddiant fformalin 10 y cant, wedi'i fewnosod mewn paraffin, a chafwyd adrannau coronaidd cyfresol o drwch 5 μm. Yna cafodd rhannau o hipocampws yr ymennydd eu staenio â Hematoxylin ac Eosin (H&E) i'w harchwilio â microsgop ysgafn.

Staeniad imiwnohistocemegol o'r hipocampws. Perfformiwyd staenio imiwnohistocemegol caspase-3 (rhif CAT: ab32351, cwmni Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, UDA) a synaptoffiseg (rhif CAT: ab32127, cwmni Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, UDA) trwy ddefnyddio cwningen gwrthgyrff monoclonaidd. Ar gyfer Bcl-2 (rhif CAT: ab59348, cwmni Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, UDA), fe'i cynhaliwyd trwy ddefnyddio gwrthgyrff polyclonaidd cwningen. Fe'u derbyniwyd mewn ffiol sengl yn cynnwys 1 ml o wrthgorff. Defnyddiwyd gwrth-caspase-3, gwrth-synaptoffiseg, a gwrth-Bcl-2 mewn meintiau gwanedig 1:50, 1:400, ac 1:100 yn y drefn honno. Torrwyd adrannau ar 5 µm a'u staenio gan imiwnogydd awtomataidd LINK 48 (Dako, Agilent Technologies Inc, Santa Clara, UDA). Ar gyfer adalw gwres, defnyddiwyd byffer citrad gan immunostainer. Cafodd sleidiau eu staenio'n awtomatig gan wrthgyrff gwanedig cynradd. Perfformiwyd rheolaeth gadarnhaol ar yr adwaith gan ddefnyddio adrannau penodol wedi'u mewnblannu â pharaffin o'r tonsil dynol arferol, y pancreas dynol, ac adenoma ffoliglaidd ar gyfer caspase-3, synaptoffiseg, a Bcl-2, yn y drefn honno. Gwnaed rheolaethau negyddol trwy roi serwm di-imiwn yn lle'r gwrthgyrff cynradd.

Cynhaliwyd asesiad o farcwyr histopatholeg ac imiwn-histocemegol (caspase-3, synaptophysin, a Bcl-2) mewn gwahanol feysydd o'r hipocampws gan gynnwys CA1, CA2, ac CA3.

Dadansoddiad ystadegol.Mynegir canlyniadau fel cymedrig ± Gwyriad Safonol (SD). Defnyddiwyd Dadansoddiad o Amrywiannau (ANOVA) ar gyfer dadansoddiad ystadegol o'r gwahanol grwpiau, gan ddefnyddio meddalwedd Origin® a'r tebygolrwydd o siawns (gwerthoedd p). gwerthoedd P<0.05 were considered significant.

Cymeradwyaeth foesegol a chaniatâd i gymryd rhan.Cymeradwywyd y gwaith hwn gan a chan ganllawiau Pwyllgor Moesegol y Gyfadran Feddygaeth, Prifysgol Menoufa, yr Aifft.

Canlyniadau

Profion niwro-ymddygiadol.O ran y prawf gwrthrych newydd, roedd canran y mynegai gwahaniaethu yn sylweddol is yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli (-37.16±3.31 y cant yn erbyn 30.16±2.92 y cant, yn y drefn honno, P).<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

O ran prawf drysfa Morris, roedd gwerth cymedrig hyd cuddni dianc yn sylweddol uwch yn y diwrnod cyntaf, yr ail, y trydydd, y pedwerydd, a'r pumed diwrnod yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli (58.16 ± 1.94, 4{ {19}}.62±1.33, 32.75±1.10, 24.37±1.58, a 15.29±0.98 s vs. ±0. 86 s, yn y drefn honno, P<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

Yn y prawf plws-ddrysfa uchel, roedd gwerth cymedrig yr hyd a dreuliodd y llygod mawr yn y breichiau agored yn sylweddol is yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli (60±6.54 s yn erbyn 90.83±3.48 s, yn y drefn honno , p<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

Profion biocemegol.Roedd gwerth cymedrig lefel MDA yr ymennydd yn sylweddol uwch, tra bod gwerth cymedrig lefel SOD yr ymennydd yn sylweddol is yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli (70 ± 3.23 nmol/mg protein a 13.05±1.{{7) }} protein U/mg yn erbyn 33.76±2.13 nmol/mg protein a 29.11±4.34 U/ mg o brotein yn y drefn honno, P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

Roedd gwerth cymedrig lefel TNF yr ymennydd yn sylweddol uwch, tra bod gwerth cymedrig lefel IL-10 yr ymennydd yn sylweddol is yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli (67.50 ± 10.03 pg/mg protein a 72.91 ±8.45 pg/mg protein yn erbyn 16.61 ±1.21 pg/mg protein a 157.23 ±12.46 pg/mg protein, yn y drefn honno, P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

Roedd gwerth cymedrig lefel BDNF yr ymennydd yn sylweddol is yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli (125.72 ± 4.17 pg/mg protein yn erbyn protein 225.20 ± 5.52 pg/mg, yn y drefn honno, P<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

Meintiol RT-PCR (qRT-PCR). Mynegiant y genynnau AMPK a PI3k (0.52±0.11a 0.37±0.03, yn y drefn honno, P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) o gymharu â'r grŵp rheoli (Ffig. 6).

Histopatholeg.Datgelodd y staen H&E o feinwe hippocampal yn y grŵp rheoli newidiadau patholegol hynod. Dangosodd y grŵp D-gal lawer o ddirywiad niwronaidd a chyrff apoptotig ag oedema a gliosis enfawr. Fodd bynnag, ychydig o ddirywiadau niwronaidd a ddangosodd adrannau grŵp D-gal plus Met ac ychydig o gyrff apoptotig ag oedema ysgafn a gliosis ffocal ysgafn (Ffig. 7).

Imiwnohistocemeg. Datgelodd y canlyniadau imiwn-histocemegol fod gwerth sgôr H mynegiant synaptoffiseg mewn meinwe hippocampal yn sylweddol is (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

Roedd gwerth sgôr H y mynegiad caspase-3 mewn meinwe hippocampal yn sylweddol uwch (P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

Roedd gwerth sgôr H mynegiant Bcl-2 mewn meinwe hippocampal yn sylweddol is (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

Trafodaeth

Mae'r cynnydd mewn disgwyliad oes cyfartalog yn cynyddu'r risg o salwch ymhlith yr henoed, yn enwedig yn yr arena wybyddol a allai fod, yn rhannol o leiaf, oherwydd colled niwronaidd yn yr ymennydd. Derbynnir yn dda bod y chwistrelliad hirdymor o d-galactose yn cyfrannu at gynnydd heneiddio a mân ddifrod niwronau a diffygion cof. Gan fod heneiddio wedi’i achosi gan D-galindio yn cyd-fynd â niwroddirywiad, gallai fod yn fodel delfrydol ar gyfer astudio’r mecanweithiau moleciwlaidd sy’n gysylltiedig â niwroddirywiad sy’n gysylltiedig ag oedran ac ar gyfer profi dulliau therapiwtig newydd22.

Dangosodd ein hastudiaeth fod gweinyddiaeth gronig o ymddygiadau archwiliadol a achosir gan newydd-deb D-gal a chof gweithio mewn llygod mawr. Roedd hyn yn amlwg yng nghanlyniadau gwrthrych y nofel, drysfa ddŵr Morris, a phrofion drysfa dyrchafedig. Roedd y canlyniadau hyn yn unol ag astudiaethau eraill a adroddwyd23. Ar y llaw arall; gwellodd triniaeth â metformin y cof gweithio a ffafriwyd newydd-deb o'i gymharu â'r grŵp D-gal. I gefnogi ein canlyniadau, nododd astudiaeth flaenorol fod metformin wedi gwella cof tymor byr mewn llygod diabetig a achosir gan streptozotocin24. Mae llawer o dystiolaeth bod heneiddio’n gysylltiedig nid yn unig â dirywiad mewn swyddogaethau gwybyddol ond hefyd â newidiadau emosiynol gan gynnwys ymddygiad tebyg i bryder sy’n arwain at nam gweithredol25. Yn yr astudiaeth bresennol, dangosodd canlyniadau profion EPM ymddygiad tebyg i bryder cynyddol yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Tra bod triniaeth gyda metformin yn gwanhau ymddygiad tebyg i bryder.

Datgelodd yr astudiaeth bresennol fod newidiadau niwroymddygiadol a achoswyd gan weinyddu D-gal yn y geg yn cyd-fynd ag aflonyddwch mewn marcwyr straen ocsideiddiol yr ymennydd. Roedd gwerth cymedrig lefel MDA mewn homogenad meinwe'r ymennydd yn sylweddol uwch, tra bod gweithgaredd yr ensym gwrthocsidiol SOD yn sylweddol is yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Adroddwyd canlyniadau tebyg yn flaenorol23,26. Mae D-gal yn rhyngweithio â gwahanol aminau rhydd yn y bensaernïaeth protein trwy glyciad anensymatig, gan arwain at gynhyrchu cynhyrchion glyciad uwch. Mae hyn yn arwain at gynhyrchu ROS sy'n cynyddu heneiddio ymennydd trwy niwed ocsideiddiol i DNA, lipidau a phroteinau. Gallai colli cof a nam dysgu a achosir gan weinyddiaeth gronig o D-gal gael eu priodoli i gynhyrchu radicalau rhydd, gan arwain at nam ar niwrogenesis ac, yn y pen draw, niwroddirywiad27. At hynny, mae niwronau ymennydd yn fwy agored i straen ocsideiddiol oherwydd presenoldeb cynnwys lipid uchel a defnydd uwch o ocsigen26.

I'r gwrthwyneb, mae gweinyddu metformin wedi adfer y cydbwysedd rhydocs yn sylweddol. Dangosodd tystiolaeth y gallai metformin atal y Mandwll Trosiannol Athreiddedd Mitocondriaidd (mPTP) a lleihau cynhyrchiant ROS a pherocsidiad lipid28. Felly, mae hyn yn dangos y gallai effaith gwrth-heneiddio metformin gael ei chyfryngu gan ei amddiffyniad gwrthocsidiol.

Ar wahân i straen ocsideiddiol, mae llid hefyd yn fecanwaith pwysig sy'n ysgogi heneiddio o driniaeth D-gal. Mae D-gal yn hyrwyddo cynhyrchu ROS sy'n ysgogi llwybrau llidiol3. Mae niwro-lid cronig a secretiad cytocinau pro-llidiol yn nodweddion heneiddio29. Mae cytundeb bod cytocinau llidiol yn gysylltiedig â straen ocsideiddiol. Mae TNF- , IL-6, ac IL-1 yn hanfodol i ddatblygiad a dilyniant straen ocsideiddiol. Mae'r cytocinau hyn yn gysylltiedig â ROS ac yn actifadu ffactor Niwclear-κB (NF-κB) i drawsleoli i'r cnewyllyn a rheoleiddio mynegiant genynnau pro-llidiol fel iNOS a COX2, sy'n ymwneud ag ymatebion llidiol ac imiwn, ac o ganlyniad yn arwain at ffibrosis, apoptosis, ac ymatebion cyfnod acíwt sy'n achosi niwed i organau30. Roedd y data uchod yn gyson â'n canlyniadau, gan fod lefel TNF-alpha yn sylweddol uwch, ac roedd IL-10 yn sylweddol is yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli.

Ar y llaw arall, arweiniodd triniaeth â metformin at ostyngiad sylweddol yn y marcwyr llidiol o'u cymharu â'r grŵp D-gal. Gellid priodoli effeithiau gwrthlidiol metformin i actifadu signalau AMPK, sy'n atal adweithiau llidiol trwy atal NF-κB29. Hefyd, gostyngodd gynhyrchu cytocinau pro-llidiol ac actifadu microglial yn yr ymennydd sydd, yn ei dro, yn lleihau straen ocsideiddiol30

Er mwyn deall ymhellach y mecanweithiau moleciwlaidd sy'n sail i gamau gweithredu metformin, gwnaethom archwilio mynegiadau protein AMPK a PI3k. Datgelodd ein hastudiaeth fod mynegiant AMPK wedi'i is-reoleiddio'n sylweddol yn y grŵp D-gal o'i gymharu â'r grŵp rheoli, tra bod ei lefel wedi'i huwchreoleiddio'n sylweddol yn y grŵp a driniwyd â metformin o'i gymharu â'r grŵp D-gal. Nododd astudiaethau blaenorol fod actifadu AMPK ac ymatebolrwydd AMPK yn lleihau gydag oedran, a allai esbonio'r newid yn y rheoliad metabolig, gan arwain at lai o awtophag a chynnydd mewn straen ocsideiddiol31. Canfuwyd bod Metformin yn actifadu AMPK trwy gynyddu ffosfforyleiddiad AMPK yn Tr-17232. AMPK yw prif darged metformin ar gyfer ei swyddogaeth amddiffynnol rhag tarfu ar wybyddiaeth. Dywedodd Ghadernezhad et al. adrodd bod actifadu AMPK a achosir gan metformin wedi arwain at actifadu llwybr BDNF/P70S6K mewn niwronau hippocampal i wella ffurfio cof mewn tasg osgoi goddefol mewn model llygod mawr byd-eang isgemia cerebral/atlifiad. Mae gan actifadu BDNF rôl hanfodol wrth reoleiddio swyddogaethau niwrowybyddol fel dysgu, cof, trawsyrru synaptig, a phlastigrwydd 33. Dangosodd sawl astudiaeth y gallai AMPK weithredu fel modulator Potentiation Hirdymor (LTP), ac mae ei angen ar gyfer ffurfio cof34 . Felly, gellid cyfryngu gwelliant cof a achosir gan metformin yn ein hastudiaeth trwy actifadu signalau AMPK.

【Am ragor o wybodaeth: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】