Mae Methyl Jasmonate yn Cael Ymatebion Tannin, Favonoid, A Phyto-oxylipin Nodedig mewn Pomgranad (Punica Granatum L.) Dail Rhan 1
Mar 18, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Gall methyl jasmonate (MeJA) a gynhyrchir mewn planhigion gyfryngu eu hymateb i straen amgylcheddol. Dangoswyd hefyd bod cymhwyso MeJA yn alldarddol yn ysgogi llwybrau signalau ac yn achosi crynhoad ffytoalecsin mewn llawer o rywogaethau planhigion. Er mwyn deall sut mae planhigion pomgranad yn ymateb yn biocemegol i straen amgylcheddol, cynhaliwyd dadansoddiad metabolit mewn dail pomgranad sy'n destun cais MeJA a datgelodd newidiadau unigryw mewn taninau hydrolyzable, flavonoidau, a Phyto-ocsilipinau. Yn ogystal, nododd dadansoddiadau qPCR trawsgrifiad ac amser real o ddail pomgranad ffug a driniwyd gan MeJA genynnau metabolaidd a fynegwyd yn wahaniaethol a ffactorau trawsgrifio a allai fod yn gysylltiedig â rheolihydrolysadwyllwybrau tannin, flavonoid, a Phyto-ocsilipin. Nodweddu moleciwlaidd, biocemegol, a biowybodus yr uniglipoxygenasegyda mynegiant parhaus, wedi'i ysgogi gan MeJA, yn dangos ei fod yn gallu ocsideiddio asidau brasterog amlannirlawn, er nad yw wedi'i leoli yn yr adran isgellog lle cynhyrchwyd Ffyto-ocsilipinau nad ydynt yn jasmonad (nad ydynt yn JA). Roedd y canlyniadau hyn gyda'i gilydd yn awgrymu, er bod ataliad eang flavonoids ac anthocyaninau yn cael ei reoli'n rhannol o leiaf ar y lefel drawsgrifiadol, y biosynthesis a achosir gan rai nad ydynt yn JA.Ffyto-ocsilipinaumae'n debygol nad yw'n cael ei reoleiddio'n drawsgrifio. Yn gyffredinol, bydd gwell dealltwriaeth o sut mae dail pomgranad yn ymateb i straen amgylcheddol nid yn unig yn hybu iechyd a chynhyrchiant planhigion ond hefyd yn cael effaith ar iechyd pobl gan fod ffrwythau a gynhyrchir gan blanhigion pomgranad yn ffynhonnell gyfoethog o gyfansoddion maethol.
Geiriau allweddol:Methyl jasmonad.Flavonoid·Anthocyanin · Asid brasterog.Ffyto-ocsilipin· Lipocsigenas
Rhagymadrodd
Pan gânt eu hanafu neu eu hymosod gan lysysyddion a phathogenau, mae planhigion yn cynhyrchu ac yn allyrru methyl jasmonate (MeJA), a ganfyddir gan feinweoedd planhigion heb eu clwyfo a phlanhigion cyfagos i ysgogi ymateb amddiffyn (Cheong a Choi 2003). Yn ogystal, dangoswyd bod cymhwyso MeJA yn alldarddol i blanhigyn yn arwain at lwybrau signalau yn ogystal â chynhyrchu proteinau sy'n gysylltiedig â pathogenesis a chemegau amddiffyn a elwir yn ffytoalecsinau. Mae ffytoalecsinau ffenolig, e.e. flavonoidau ac anthocyaninau, wedi dangos mwy o groniad mewn ymateb i driniaeth MeJA mewn gwahanol blanhigion, megis Arabidopsis thaliana, grawnwin (Vitis vinifera), banana (Musa acuminate), afal (Malus Domestica), a mafon coch (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res a Ruiz del Castillo 2014). Mae biosynthesis flavonoidau ac anthocyaninau yn dechrau gyda ffurfio naringenin chalcone o coumaroyl CoA a thri moleciwlau o malonyl CoA wedi'u cataleiddio gan chalcone synthase (CHS) a'r isomerization dilynol o chalcone naringenin i naringenin gan chalcone isomerase (CHI). Yna defnyddir Naringenin i gynhyrchu'r sgerbydau flavonoid craidd ac anthocyanin, sy'n cael eu haddasu ymhellach gyda grwpiau gweithredol glycosyl, methyl, hydroxyl, a prenyl i arwain at strwythurau a swyddogaethau amrywiol (Tian et al. 2008).
Gall cistanche wella imiwnedd
In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>tebygrwydd o 75 y cant) ac nid ydynt yn cynnwys peptid signal, tra bod gan LOXs math II debygrwydd dilyniant isel cyffredinol (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">
Mae pomegranad (Punica granatum L.) yn gnwd garddwriaethol arbenigol sy'n cael ei werthfawrogi am y cyfansoddion ffenolig toreithiog yn ei ffrwythau, fel flavonoidau, anthocyaninau, a thaninau hydrolyzable (HTs) sy'n deillio o ganolradd y llwybr shikimate (Ono et al.2016). ). Hyd yn hyn mae llawer o astudiaethau wedi canolbwyntio ar rôl ffenolig pomgranad wrth liniaru straen a salwch mewn pobl (Wu a Tian 2017). Mewn cyferbyniad, ychydig a wyddys am swyddogaeth ffenolig a ffytogemegau eraill wrth amddiffyn pomgranad yn erbyn ffactorau anfiotig a biotig (e.e. clwyfo, pathogenau, anwythiad MeJA) mewn dail a ffrwythau. Gwerthusodd dau adroddiad diweddar driniaeth MeJA cyn y cynhaeaf ar ansawdd ffrwythau pomgranad ar ôl y cynhaeaf (Koushesh Saba a Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Dadansoddwyd cyfanswm anthocyaninau, flavonoidau, a ffenolig ffrwythau wedi'u trin â MeJA, ond nid dail, ar y cyd gan ddefnyddio sbectroffotomedr. Roedd un o'r astudiaethau hefyd yn dadansoddi anthocyaninau unigol gan ddefnyddio sbectrometreg màs (Garcia-Pastor et al.2020). Fodd bynnag, mae'n parhau i fod yn aneglur sut mae meinweoedd planhigion pomgranad, naill ai dail neu ffrwythau, yn ymateb i straen amgylcheddol cyn y set ffrwythau.
I ddechrau dyrannu rhyngweithiadau rhwng planhigion pomgranad a ffactorau amgylcheddol, fe wnaethom ymchwilio i ymateb metabolaidd dail pomgranad i gymhwysiad MeJA alldarddol gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC) a sbectrometreg màs tandem cromatograffaeth hylif-electrochwistrellu ionization (LC-ESI-MS/MS) . Gwelwyd newidiadau unigryw mewn HTs, flavonoids, ac anthocyaninau yn ogystal â newidiadau mewn lipidau, asidau brasterog, a Phyto-ocsilipinau mewn dail pomgranad a gafodd eu trin â MeJA. Datgelodd dadansoddiad trawsgrifiad cymharol, a ddilyswyd gan ddadansoddiad qPCR amser real, fod genynnau strwythurol a / neu reoleiddiol sy'n ymwneud â metaboledd HT, flavonoid, anthocyanin, a Phyto-ocsilipin wedi'u mynegi'n wahaniaethol mewn dail pomgranad ffug a MeJA wedi'u trin. Roedd yr unig enyn LOX a oedd yn arddangos mynegiant cyson wedi'i uwchreoleiddio mewn dail wedi'u trin â MeJA yn destun nodweddiad moleciwlaidd, biocemegol a ffylogenetig pellach.
Defnyddiau a dulliau
Cemegau
Prynwyd y safonau -glucogallin a phentagalloylglucose gan Shanghai Yuanye Bio-Technology Co Ltd (Shanghai, Tsieina). Cafwyd y cemegau a ddefnyddiwyd yn yr assay LOX gan y gwerthwyr canlynol: 3- (dimethylamino) asid benzoig (DMAB)(Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, China), asid linoleig (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA), 3-methyl-2-benzothiazolinone(MBTH) a hemoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Tsieina).
Deunyddiau planhigion
Darparwyd ffrwythau a hadau pomgranad (cv. Wonderful) yn hael gan Academi Gwyddorau Amaethyddol a Choedwigaeth Panzhihua a'u nodi gan Dr Binjie Ge yng Ngardd Fotaneg Shanghai Chenshan. Adneuwyd sbesimen taleb (Rhif CSHO173966) yn llysieufa Gardd Fotaneg Shanghai Chenshan, Shanghai, Tsieina. Roedd eginblanhigion pomgranad yn cael eu tyfu mewn ystafell dwf a reolir gan dymheredd am 6 wythnos ar 25 gradd gradd a 16 h golau / 8h tywyll. Dywedir bod y crynodiad MeJA ar gyfer chwistrellu meinweoedd planhigion yn amrywio o 100 i 250 μM (Ku et al.2014; Hickman et al.2017). Cymhwyswyd crynodiadau gwahanol o MeJA i ddechrau i ddail pomgranad, ac arweiniodd 200μM MeJA at ymateb metabolaidd canfyddadwy yn y dadansoddiad rhagarweiniol ac fe'i defnyddiwyd ar gyfer y dadansoddiadau metabolit a mynegiant genynnau a ddisgrifir yn yr astudiaeth hon. Cyn y driniaeth MeJA, symudwyd hanner y planhigion pomgranad i ystafell dyfu arall gydag amodau tebyg. Tra bod planhigion mewn un ystafell dyfu wedi'u chwistrellu â 200 μM MeJA, cafodd y rhai yn yr ystafell dyfu arall eu chwistrellu â dŵr (hy. rheolaeth ffug). Ar 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,a72-h ar ôl y driniaeth, yn gadael o3 i 5 o blanhigion ffug neu wedi'u trin â MeJA eu cyfuno, sy'n gyfystyr ag un atgynhyrchiad biolegol. Casglwyd tri atgynhyrchiad biolegol ar gyfer yr arbrofion ffug a thriniaeth MeJA; rhannwyd pob atgynhyrchiad biolegol yn aliquots ar gyfer proffilio metabolion a dadansoddiadau mynegiant genynnau.
Dadansoddiad proffilio metabolit
Cafodd dail pomegranad eu lyophilized, eu pwyso, a'u malu'n bowdr mân gan ddefnyddio gleiniau zirconia mewn curwr gleiniau (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, yr Almaen) ar gyfer y 90au ar 30 Hz. Ar gyfer dadansoddiad HPLC, echdynnwyd y sampl dail mewn methanol 70 y cant am 60 munud o dan sonication a'i allgyrchu yn 13,000 rpm am 10 munud. Trosglwyddwyd y supernatant i ffiol HPLC, a chwistrellwyd 30μL ohono ar gam cefn HPLC (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, UDA) a'i ddadansoddi fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Wil-son et al.2019). Canfuwyd metabolion trwy amsugno UV ar 254 nm, 280 nm, 320 nm, a 360 nm. Adeiladwyd cromliniau graddnodi safonol o -glucogallin a phentagalloylglucose; fe'u defnyddiwyd ar gyfer trosi'r ardaloedd o gopaon sy'n cyfateb i'r amseroedd cadw a sbectra amsugno -glucogallin a phentagalloylglucose i'r crynodiadau priodol.
Ar gyfer dadansoddiad LC-ESI-MS/MS, echdynnwyd y sampl dail homogenaidd (1-0 mg) mewn 1 ml o 70 y cant o fethanol ar 4 gradd Covernight.Ar y diwrnod canlynol, cafodd y detholiad methanolig ei allgyrchu ar 10 ,000 × g am 10 munud a phasiwyd y superna-tant trwy cetris SPE Carbon-GCB CNWBOND （ANEL, Shanghai, China） a hidlydd chwistrell 0.22-μm (ANPEL) cyn dadansoddiad metabolion.
Dadansoddwyd y dyfyniad （2 μL） gan ddefnyddio LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a cholofn cam cefn C1s (ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 m, 2.1 mm × 10 0 mm, Waters, Milford, MA, UDA).Cafodd metabolion eu hanwybyddu gan ddefnyddio toddyddion(A) dŵr yn cynnwys 0.04 y cant o asid asetig ,a(B)asetonitrile sy'n cynnwys 0.04 y cant o asid asetig ar raddiant o 0-11 mun,95-5 y cant A;11-12 mun,5 y cant A;12-12.1 mun ,5-95 y cant A;12.1-15munud,95 y cant A.Cafodd y gyfradd llif ei chynnal ar 0.4 mL min-1. Cafwyd sganiau MS trap ïon llinol (LIT) a phedrypole triphlyg (QQQ) mewn moddau positif-a negyddol-ion. Gweithredwyd y ffynhonnell ïon chwistrellu turbo ar 500 gradd C gyda foltedd ionization o 5500 V. Gosodwyd y ffynhonnell ïon nwy I, nwy I, a nwy llen ar 55 psi,60 psi, a 25 psi, yn y drefn honno. Gosodwyd y nwy gwrthdrawiad (nitro-gen) ar 5 psi. Ar gyfer y dadansoddiad MRM, optimeiddiwyd potensial datglystyrau (DP) ac egni gwrthdrawiad (CE) ar gyfer pob trosglwyddiad ïon rhagflaenydd-cynnyrch.
For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>Ystyriwyd bod =1 wedi newid yn sylweddol.
Dadansoddiad trawsgrifiadol
Tynnwyd cyfanswm RNA o ddail pomgranad gan ddefnyddio adweithydd TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA) a'i feintioli gan ddefnyddio Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, UDA). Gwiriwyd cyfanrwydd y samplau RNA trwy wahanu ar gel agarose (dim diraddiad gweladwy) a chanfod y gymhareb OD20/28o (rhwng 1.8 a 2.2) gan ddefnyddio Nanodrop2000. Llwyddwyd i gyfoethogi mRNA o gyfanswm RNA gan ddefnyddio gleiniau magnetig oligo (dT) (Invitrogen). Adeiladwyd llyfrgelloedd mRNA-Seq gan ddefnyddio pecyn paratoi llyfrgell Truseq RNA (Illumina, San Diego, CA, UDA). Cynhaliwyd dadansoddiad trawsgrifiad ar Illumina HiSeq4000 a chafwyd 55-60 miliwn o 150-bp darlleniadau pen pâr(PE150) ar gyfer pob llyfrgell sampl.
Proseswyd y data dilyniant amrwd trwy gael gwared ar y dilyniannau addasydd yn ogystal â byr (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, a gwerth P wedi'i addasu<>
Dadansoddiad qPCR amser real
Echdynnwyd cyfanswm RNA o ddail pomgranad ffug a MeJA wedi'u trin gan ddefnyddio Pecyn Planhigion Pur RNAprep (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, Tsieina). Perfformiwyd trawsgrifio o chwith (RT) gan ddefnyddio RNA cyfanswm a Phecyn Adweithydd PrimeScriptTM RT (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan). Cynhaliwyd PCR meintiol (qPCR) gan ddefnyddio pecyn TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) ( Takara) a System PCR Amser Real StepOnePlus (Ther-moFisher Scientific). Cynhaliwyd dadansoddiad cromlin toddi a dangosodd un cynnyrch ymhelaethu ar gyfer pob pâr preimio. Ar gyfer y dadansoddiad RT-qPCR, archwiliwyd tri atgynhyrchiad biolegol a phob un â thri atgynhyrchiad technegol ar gyfer samplau ffug a samplau wedi'u trin â MeJA. Dadansoddwyd mynegiant genynnau gan ddefnyddio'r dull C,(△AC) cymharol (Livak a Schmittgen 2001), a phennwyd lefelau arwyddocâd gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr dau gynffon. Dangosir y dilyniannau preimio ar gyfer y dadansoddiad qPCR amser real ac effeithlonrwydd mwyhau'r parau preimio yn Nhabl S1.
Mynegiant a phuro proteinau ailgyfunol a phrofion ensymau
Cafodd ffrâm darllen agored Pgr025417 (gan amgodio LOX tybiedig) ei syntheseiddio ar gyfer y defnydd codon gorau posibl yn E. coli (Genewiz, Suzhou, Tsieina) a'i glonio mewn pET28a. Trawsnewidiwyd y plasmid ailgyfunol yn E. coli BL21 (DE3) celloedd. Dechreuwyd diwylliant 5-mL Luria Bertani (LB) gyda 50ug mL-Ikanamycin o un nythfa a'i ddeor dros nos gan ysgwyd ar 37C. Defnyddiwyd y diwylliant dros nos i frechu cyfrwng 100-mL LB gyda 50ug mL-'kanamycin a'i ganiatáu i dyfu i OD600 o 0.5. Yna ychwanegwyd isopropyl- -D-thiogalactoside(IPTG) at grynodiad terfynol o 0.1 mM ar gyfer sefydlu mynegiant protein. Ar ôl deori gyda ysgwyd ar 16 gradd gradd am 18 h, cynaeafwyd y celloedd gan centrifugation. Cafodd y pelenni celloedd eu hailddarparu yn y byffer lysis (50 mM NaH, PO, pH 7.4,300 mM NaCl, imidazole 10 mM) a'u homogeneiddio gan ddefnyddio aflonyddwr celloedd (Constant Systems Ltd, Northants, UK).Cafodd ei broteinau wedi'u tagio eu puro gan ddefnyddio Gleiniau Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) gyda'r byffer golchi (50 mM NaH, PO, pH 7.4,300 mM NaCl, imidazole 25 mM) a'r byffer elution (50 mM NaH, PO, pH 7.4,300 mM NaCl, 500 mM imidazole). Gwahanwyd y proteinau wedi'u puro ar gel SDS-TUDALEN 10 y cant ar gyfer delweddu purdeb protein. Pennwyd crynodiad y proteinau wedi'u puro gan ddefnyddio assay Bradford (Bradford 1976).
Ar gyfer y assay LOX, defnyddiwyd asid linoleig fel swbstrad mewn dull dau gam, lliwimetrig gydag addasiadau bach (Anthon a Barrett 2008）. Deorwyd y cymysgedd adwaith 500-μL, gan gynnwys 50 mM Na-ffosffad, pH 6, DMAB 10 mM, asid linoleig 0.5 mM, a symiau amrywiol o broteinau ailgyfunol puredig (1.5 mg mL-). ar 25 gradd am 10 munud.Ychwanegwyd ail doddiant (500 μL) yn cynnwys 0.2 mM MBTH a 0.1 mg mL-'haemoglobin at gymysgedd yr adwaith, a gafodd ei ddeor am 5 munud ychwanegol. Daeth yr adwaith i ben trwy ychwanegu 500μL 1 y cant (w/v) lauryl sylffad sodiwm. Penderfynwyd ar amsugno golau ar 598 nm.
Lleoleiddio isgellog a dadansoddiadau ffylogenetig
Roedd chwiliad o'r genom pomgranad anodedig(Qin et al. 2017)yn dynodi 1l LOXs hyd llawn tybiedig(786 aa i 970 aa), gan gynnwys Pgr025413,Pgr020032,Pgr025418,O7518,Pgr,O980(786 aa i 970 aa), dilyniant hyd llawn yn GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678, a PgrO13780. Rhagwelwyd safleoedd lleoli isgellog a holltiad peptidau signal ar gyfer y LOXs pomgranad gan ddefnyddio TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/)(Almagro Armenteros et al.2019).
Dadansoddiad safle TF-rwymol
Er mwyn rhagweld safleoedd rhwymo TFs, cafwyd 1000 bp i fyny'r afon o godon cychwyn ATG y genynnau targed gan GenBank a chwiliwyd yn erbyn yr Eucalyptus Grandis TFs yn PlantRegMap (fersiwn 5)(Tian et al.2020). Y gwerth trothwy ar gyfer rhwymo gosodwyd dull adnabod safle ar P Llai na neu hafal i le-4.
Dadansoddiad ystadegol
Disgrifir dadansoddiad ystadegol ar gyfer meintioli metabolit, trawsgrifiad, a data qPCR amser real yn yr adrannau priodol.
Canlyniadau
Mae MeJA yn modiwleiddio signalau celloedd a llwybrau metabolaidd mewn dail pomgranad
Er mwyn deall ymateb trawsgrifiadol genom-eang pomgranad i ddeffroad MeJA, trawsgrifio dail pomgranad ar 2-h,6-h,24-h, a 72-h ar ôl MeJA neu triniaeth ffug (pob un â thri atgynhyrchiad biolegol) eu dadansoddi (Ffig. S1). Cafwyd tua 55 miliwn o ddarlleniadau dilyniant amrwd (diwedd parau 2 × 150 bp) ar gyfer pob trawsgrifiad gyda chynnwys GC o gwmpas 52 y cant a gwerthoedd Q30 yn amrywio o 91.6 i 95 y cant (Tabl S2). Ar gyfer pob trawsgrifiad, roedd mwy na 96 y cant o'r darlleniadau dilyniant wedi'u glanhau wedi'u mapio i'r genom pomgranad cyfeirio (Qin et al.2017)(Tabl S3). 2000 bp (32.9 y cant), neu 2000 bp—3000 bp(18.1 y cant) (Tabl S4).
To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, P wedi'i addasu<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">
Cafodd genynnau llwybr Shikimate a HT a metabolion HT eu hysgogi mewn absenoldeb pomgranad wedi'i drin â MeJA Fel y datgelwyd yn y dadansoddiad cyfoethogi llwybr trawsgrifiad a KEGG, dangosodd tri genyn llwybr biosynthetig shikimate fynegiant wedi'i ddadreoleiddio mewn dail a driniwyd gan MeJA o'i gymharu â rheolaethau ffug yn {{3 }}h, gan gynnwys 3-deoxy-D-arabinose-heptulosonate-7-ffosffad synthase (DAHPS), 3-dehydrogenate synthase(DHS), a'r dehydratase dehydrogenate 3-dehydrogenate/ dehydrogenase shikimate (DHQ/SDH; wedi'i dalfyrru fel SDH)(Ffigs.S1b a la). Yn benodol, nodwyd tri isoform o SDHs pomgranad a dangoswyd mynegiant gwahaniaethol yn y dadansoddiad trawsgrifiad, Pgr020271, Pgr019030, a Pgr019029,
Er mwyn pennu a allai newidiadau yn y swm o drawsgrifiadau genynnau biosynthetig shikimate a HT effeithio ar lefel y metabolion sy'n deillio o'r llwybrau hyn, echdynnwyd metabolion ffenolig o ddail a gynaeafwyd ar 24-h, 30-h. 36-h,48-h, a 72-h ar ôl MeJA neu gymhwysiad ffug a'i ddadansoddi gan HPLC(Ffig.2). Dylid nodi bod y pwyntiau amser hyn wedi'u dewis i gyfrif am yr amser sydd ei angen ar gyfer synthesis protein a chynhyrchu a chronni metabolion ar ôl y newidiadau mynegiant a welwyd o genynnau shikimate a biosynthetig HT ar 6-h. Roedd amserau cadw a sbectra amsugno dau fetabolyn ysbeidiol ar 4.57 munud (uchafbwynt 1) a 24.98 munud (uchafbwynt 2) yn cyfateb i amseroedd canolradd llwybr HT -glucogallin a Penta aloeon-glwcos, yn y drefn honno (Ffig. la a 2a). Roedd y ddau uchafbwynt yn dangos newidiadau sylweddol mewn ardaloedd brig integredig ar adegau lluosog (Ffig.2b). Yn benodol, cynyddodd brig 1 mewn dail wedi'u trin â MeJA o'i gymharu â rheolyddion ffug ar 30-h, 36-h, a 48-h(Ffig.2b). Yn ddiddorol, gostyngodd brig 2 mewn dail wedi'u trin â MeJA ar 24-h i ddechrau, ond cynyddodd wedyn ar 30-h a 36-h cyn dychwelyd i lefel debyg i ffug reolyddion yn 48- h a 72-h (Ffig.2b).
Roedd gostyngiad yn y rhan fwyaf o flavonoidau ac anthocyaninau, yn ogystal â mwy o fflafonau methylated a flavonols, yn amlwg mewn dail pomgranad a driniwyd gan MeJA
To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tablau S5 a S6). Ar gyfer y metabolion a gronnwyd yn wahaniaethol, roedd cyfoethogiad cyffredinol o fetabolion sy'n ymwneud â metaboledd eilaidd/arbenigol planhigion (67 o 102), yn enwedig cyfansoddion ffenolig (63 o 102) (Tabl S6).
Ymhlith ffenoligau, roedd gostyngiad ar y cyd mewn ystod eang o flavonoids ac anthocyaninau (42 o'r 73 o gyfansoddion gostyngol) yn amlwg mewn dail wedi'u trin â MeJA (Ffig. 3; Tabl S6). Yn ddiddorol, cynyddwyd tri fflafon mono- neu di-O-methylated a flavonols, gan gynnwys quercetin di-O-methyl, chrysoberyl O-hexosyl-O-hexoside, a gwerthu 5-O-hexoside, mewn dail wedi'u trin gan MeJA (Ffig. 3; Tabl S6). Roedd modd canfod sawl canolradd o'r llwybrau flavonoid ac anthocyanin, gan gynnwys luteolin, chrysoberyl, dihydrokaempferol, dihydroquercetin, dihydromyricetin, epicatechin, delphinidin, a pelargonidin, ond ni ddangosodd newidiadau sylweddol mewn dail a driniwyd gan MeJA (Ffig.3; Tabl S5). Roedd deilliadau hydroxycin-namoyl, isoflavones, a chwmarinau ymhlith ffenoligau eraill a ddangosodd lai o groniad ar sefydlu MeJA (Tabl S6). Mewn cyferbyniad, cynyddwyd dau asid ffenolig, 2,3-asid dihydroxybenzoic ac asid protocatechuic (3,4-asid dihydroxybenzoic), a chwmarin, 6-methyl coumarin, mewn dail a gafodd eu trin â MeJA (Tabl S6).
Yn gyson â'r flavonoidau ac anthocyaninau sydd wedi'u lleihau i raddau helaeth mewn dail pomgranad a driniwyd gan MeJA, mae trawsgrifiadau dau ensym allweddol ar gyfer biosynthesis flavonoid ac anthocyanin. Roedd CHS(Pgr005566) a CHI (Pgr025966), wedi gostwng yn sylweddol ar 6-h a 24-h ar ôl cais MeJA yn ôl y dadansoddiad trawsgrifio (Ffig. 4). Cynhaliwyd dadansoddiad qPCR amser real i archwilio mynegiant CHS a CHI gyda phwyntiau amser ychwanegol, gan gynnwys 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h, a 72-h (Ffig.4). Gostyngodd trawsgrifiadau CHS mewn dail wedi'u trin â MeJA ar 3-h ac arhosodd i fod yn sylweddol is na'r rhai mewn ffug rheolaethau tan 72-h, gyda'r gostyngiad mwyaf ar 12-h. Mewn cyferbyniad, dim ond ar 24-h, 48-h, a 72-h driniaeth ar ôl MeJA) yr oedd gostyngiad mewn mynegiant CHI yn sylweddol (Ffig. 4).
Daw'r erthygl hon o Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9