Astudiaeth ar yr ensymau microbaidd a gynhyrchwyd yn ystod eplesiad bacteriol cyfun a'u gweithgareddau biolegol ⅲ
Oct 28, 2024
Pennod 3 Astudiaeth ar weithgaredd gwrthocsidiol ensymau
Profwyd bod llawer o afiechydon dynol yn gysylltiedig âocsigen gweithredol a radicalau rhydd, megisllid, arteriosglerosis,heneiddio, diabetes, ganser, ac ati.Radicalau rhydd gormodolYn y corff gall achosi dadnatureiddio protein, difrod celloedd a marwolaeth, a hyd yn oed newidiadau patholegol yn y corff. Felly, mae llawer o astudiaethau gartref a thramor yn chwilio am fwydydd sy'n llawn cynhwysion gwrthocsidiol naturiol i atal a rheoleiddio afiechydon a achosir gan radicalau rhydd trwy ddeiet. Heddiw, gyda'r safonau byw cynyddol, mae pobl yn symud eu ffocws i'w cyrff eu hunain yn raddol, felly mae mwy a mwy o gynhyrchion iechyd yn dod i'r amlwg mewn nant ddiddiwedd. Fodd bynnag, nid yw'n hawdd bod yn wirioneddol ddefnyddiol. Mae ensymau yn fath o fwyd y gellir ei wneud gennych chi'ch hun ym mywydau pobl. Nid yw'r gost yn uchel iawn ac mae yna lawer o fuddion.
Mae gan ensymau microbaidd amrywiaeth o swyddogaethau iechyd fel gwrthfacterol a gwrthlidiol, gan hyrwyddo metaboledd, gwella imiwnedd, gwynnu a gwrth-heneiddio, dadwenwyno a gwrth-ganser. Ar hyn o bryd, cymharol ychydig o astudiaethau sydd ar briodweddau gwrthocsidiol ensymau microbaidd gartref a thramor, felly rydym yn bwriadu cynnal ymchwil fanwl arnynt. Mae'r papur hwn yn cymryd ensym Apple fel y gwrthrych ymchwil, ac yn defnyddio cyfanswm y cynnwys ffenol, gan leihau pŵer, DPPH · radical rhydd, · OH Radical rhydd, radical rhydd uwchocsid ac ABTS Gallu scavenging radical rhydd fel y mynegeion penderfynu i gynnal ymchwiliad cynhwysfawr a systematig o ensym afal ar ôl eplesu am 3 mis. Astudiwyd cyfansoddiad a chynnwys cynhwysion actif gwrthocsidiol, a deallwyd ei weithgaredd gwrthocsidiol.
Perlysiau newydd cistanche gyda llawer mwy o bŵer gwrth-ocsidiad nag eplesu bacteria
Gwasanaeth cefnogol Wecistanche-yr allforiwr Cistanche mwyaf yn y Tsieina:
E -bost: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950
3.1 Deunyddiau a Dulliau
3.1.1 Deunyddiau
(1) Deunyddiau Arbrofol
Golchwch afalau ffres gyda dŵr di -haint o dan amodau di -haint, eu sychu'n naturiol mewn bwrdd gweithredu di -haint, eu pilio, a'u sleisio i'w defnyddio'n ddiweddarach. Ychwanegwch siwgr gwyn ac afalau mewn jar wydr wedi'i sterileiddio ar gymhareb màs o 1: 1. Ysgogi'r bacteria sy'n ofynnol ar gyfer yr arbrawf a'u brechu i'r ensym yn ôl y cynllun gorau posibl (hepgorir y cam llawdriniaeth hwn yn y grŵp rheoli), ei selio a'i roi mewn lle cŵl a sych. Ar ôl 3 mis o eplesu tymheredd ystafell, cymerwch sampl i gael yr hylif ensym cyfan sy'n cynnwys y mwydion, a'i hidlo. Cymerwch yr uwchnatur fel y sampl arbrofol, a centrifuge y sampl ar 10000rpm am 15 munud mewn centrifuge cyflym cyn pennu'r data perthnasol. Mae'n werth nodi, yn y broses o wneud ensymau, er mwyn osgoi halogi diangen, bod ein holl weithrediadau yn cael eu cyflawni o dan amodau di -haint.
(2) prif offerynnau
Sbectroffotomedr: V -1100, ffatri offeryn gwyddonol anting Shanghai;
Bath dŵr tymheredd cyson: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Mae offerynnau eraill yr un fath â 2.1.3.
3.1.2 Dulliau
(1) Penderfynu ar gyfanswm y cynnwys ffenol [53]
① Paratoi cromlin safonol:
Pwyso'n gywir {{{0}}. 123 g o asid galig, ei doddi mewn ychydig bach o ddŵr distyll, a'i drosglwyddo i fflasg gyfeintiol 5 0 0 ml i wneud y gyfrol. Cymerwch 8 glân 1 {{{1 {0}} ml fflasgiau cyfeintiol, ychwanegwch 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, ac 1.4 ml o doddiant safonol alig alig, yn y drefn honno, yn gwanhau i'r marc mewn bath o ddistyllu, ychwanegu 1 med o bath 1 munud, oeri a gwanhau i 20 ml, a'i roi ar dymheredd yr ystafell am 30 munud. Defnyddiwch sbectroffotomedr i fesur yr amsugnedd A ar donfedd o 650 nm, a thynnwch gromlin safonol gydag amsugnedd A fel yr echel lorweddol a chrynodiad sampl fel yr echelin fertigol. ② Canfod
Ychwanegwch ddŵr distyll i 100μl, 200μl, 300μl, 400μl, a hydoddiannau sampl 500μl i 46ml, yna ychwanegwch 1ml o ymweithredydd folin-ffenol, cymysgu'n gyfartal, adweithio am 3 munud, yna ychwanegwch 3ml o 20% NACO3, ysgwyd mewn tonnau tonnau cyson 25 gradd, a defnyddiwch ddistyllu dŵr ar gyfer 2h, a defnyddio 2h, gan ddefnyddio 2h, defnyddiwch A THEALTYng THEWER, A DEFNYDDIO A THEFLEER CYFLWYNIAD A THEFLETY THEALMEnM A THEFLEG A THEFLECT THWRGEM. sbectroffotomedr. Mynegir cyfanswm y cynnwys ffenol fel cyfwerth ag asid galig, a chyfrifir cyfanswm y cynnwys ffenol yn unol â'r hafaliad cromlin safonol.
(2) Assay lleihau [54]
Ychwanegwch 1 0 {0 μl, 2 0 0μl, 300μl, 400μl, a 500μl o sampl i 2.5ml o byffer ffosffad gyda chrynodiad o 0.2mol/L Canolbwyntiau (yna mae massy o 6.5m, yn ychwanegu at 2.5me, yna'n ychwanegu at 2.5m. ymateb ar 50 gradd am 30 munud. Yna ychwanegwch 2.5ml o asid trichloroacetig (w/v) gyda chrynodiad màs o 10%, a centrifuge ar 3000rpm am 10 munud mewn centrifuge cyflym. Yn syth ar ôl cymryd allan, cymerwch 2.5ml o uwchnatur i mewn i fflasg gyfeintiol, ychwanegwch 2.5ml o ddŵr distyll a 0.5ml o ferric clorid (w/v) gyda chrynodiad màs o 0.1%. Defnyddiwch ddŵr distyll fel rheolaeth wag, a mesur yr amsugnedd A ar donfedd o 700Nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr. Gellir barnu cryfder lleihau pŵer yn ôl y gwerth amsugno. Po uchaf yw'r gwerth amsugno, y cryfaf yw'r pŵer sy'n lleihau.
(3) Penderfynu Effaith Scavenging Radical Rhydd anion superoxide [55]
Cymerwch 4.5 ml o 0. 0 5 mol/l pH 8.2 byffer Tris-hcl a'i gynhesu mewn baddon dŵr 25 gradd ar gyfer 2 0 min. Ychwanegwch 1 ml o doddiant sampl ensym gyda chrynodiadau o 10%, 20%, 30%, 40%, a 50%a 0.4 ml o doddiant pyrogallol 25 mmol/L yn y drefn honno. Cymysgwch yn dda ac ymateb mewn baddon dŵr 25 gradd am 5 munud. Ychwanegwch 1.0 ml o 8 mol/L HCl i derfynu'r adwaith. Defnyddiwch byffer Tris-HCl fel cyfeirnod a defnyddiwch sbectroffotomedr i fesur yr amsugnedd A ar donfedd o 299 nm i gyfrifo'r gyfradd scavenging. Ar gyfer y grŵp rheoli gwag, defnyddiwyd 1 ml o doddydd yn lle sampl. Cyfrifwyd yr o 2- cyfradd scavenging yn ôl Fformiwla 3.1: o 2- cyfradd scavenging (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1) lle: a1 yw amsugno'r tiwb gwaharddedig; A2 yw amsugnedd y sampl.
(4) Pennu effaith scavenging ar radicalau hydrocsyl [56]
Ychwanegwyd hydoddiant sampl sampl 1 {0 0μl, 200μl, 300μl, 400μl, 500μl â dŵr, yna ei ychwanegu at 1.4ml o hydrogen perocsid gyda chrynodiad màs molar o 6mmol/L, yna ei ychwanegu gyda 0.6ml o fàs salige sodiwm gyda màs màs sodiwm gyda màs màs sodiwm a 2mml sodiwm gyda màs màs sodiwm gyda màs sodiwm gyda màs sodiwm/feroure gyda màs sodiwm/ferours 1.5mmol/L, a'i gynhesu mewn baddon dŵr tymheredd cyson ar 37 gradd ar gyfer 1h. Addaswch i sero â dŵr distyll, a mesur yr amsugnedd A ar donfedd o 562nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr. Perfformio 3 dyblyg ar gyfer pob triniaeth. Cyfrifwch y gyfradd scavenging radical hydrocsyl yn ôl Fformiwla 3.2: cyfradd scavenging radical hydrocsyl (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.2) lle: a1 yw amsugnedd cyfartalog y gwag; A2 yw amsugnedd cyfartalog yr hydoddiant sampl. (5) Pennu effaith scavenging radical rhydd DPPH [57]
Perlysiau newydd cistanche gyda llawer mwy o bŵer gwrth-ocsidiad nag eplesu bacteria
Pibed 2 ml yn gywir o doddiant sampl ensymau gyda chrynodiadau o 1 0%, 20%, 30%, 40%, a 50%yn fflasg gyfeintiol 10 ml, yna ychwanegwch 2 ml o 80%dpph toddiant dyfrllyd ethanol dpph i'r fflasg gyfeintiol. Y crynodiad màs molar yw 2 × 10-4 mol/l. Ar ôl cymysgu, gadewch iddo sefyll ar dymheredd yr ystafell am 30 munud. Gan ddefnyddio toddiant ethanol 80% fel cyfeiriad, mesurwch amsugnedd y sampl ar donfedd o 517 nm, a gofnodir fel A1. Cymysgwch 2 ml o doddiant DPPH a 2 ml o doddiant ethanol gyda chrynodiad màs o 80% a mesur eu hamsugnedd ar yr un donfedd, a gofnodir fel A0. Cymysgwch 2 ml o doddiant ensym a 2 ml o doddiant ethanol gyda chrynodiad màs o 80% a mesur eu hamsugnedd ar yr un donfedd, a gofnodir fel A2. Cyfrifwch gyfradd scavenging radical rhydd DPPH yn ôl Fformiwla 3.3:
Cyfradd sborio radical rhydd dpph (%) {{{0}} [1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3) lle: A1 yw toddiant a 2 ml dpph 80% Ethen 80% Ethane 80% 80% 80% ETHANC 80% ETHANCEOUS ETHANCEOUS ETHORE A2 yw amsugnedd toddiant cymysg o doddiant ensym 2 ml a 2 ml 80% ethanol yn ôl crynodiad màs; A0 yw amsugnedd toddiant cymysg o doddiant 2 ml DPPH a 2 ml 80% ethanol yn ôl crynodiad màs.
(6) Gallu scavenging radical rhydd ABTS [58]
Ychwanegwch rywfaint o sylffad potasiwm i doddiant 7 mmol/L ABTS nes bod crynodiad terfynol yr hydoddiant cymysg yn 2.45 mmol/L. Rhowch y toddiant cymysg mewn lle oer a sych ar dymheredd yr ystafell am 12 i 16 awr. Ategwyd 1μl, 3μl, 5μl, 7μl, a 9μl o doddiant sampl i 10μl gyda byffer ffosffad 5mmol/L ph7.4, ac yna eu cymysgu'n gyfartal â 10ml o'r sylffad potasiwm uchod ac toddiant cymysg ABTS, a chaniatáu i amser adweithio o 30 o 30 o 30 o 30 o raddau adweithio. Sero â dŵr distyll, a mesur yr amsugnedd A ar donfedd o 734nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr. Cyfrifwch gyfradd scavenging radical rhydd ABTS yn ôl Fformiwla 3.4:
ABTS Cyfradd Scavenging Radical Am Ddim (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.4) Lle: A1 yw amsugnedd y grŵp rheoli gwag; A2 yw amsugnedd y grŵp arbrofol
3.2 Canlyniadau a Dadansoddiad
3.2.1 Cyfanswm y cynnwys ffenol
(1) Cromlin Safonol
Tynnwyd cromlin safonol cyfanswm y cynnwys ffenol gyda chrynodiad asid gallig fel yr echel lorweddol a'r gwerth amsugno A fel yr echelin fertigol, fel y dangosir yn Ffigur 3.1.
Ffig.3.1 Cromlin safonol cyfanswm y cynnwys ffenol
O Ffig.3.1, gallwn weld mai'r hafaliad cromlin safonol yw y =11. 375x +0. 2593 (x yw'r crynodiad sampl, y yw'r amsugnedd), r 2=0. 9981.
(2) Penderfynu ar samplau
Dangosir canlyniadau cyfanswm penderfyniad cynnwys ffenol ensymau afal yn y grŵp rheoli a'r grŵp arbrofol mewn crynodiadau gwahanol yn Ffig.3.2.
Ffig.3.2 Cromlin Cyfanswm y Cynnwys Ffenolig
Fel y dangosir yn Ffig.3.2, mae gan yr ensymau Apple yn y grŵp rheoli a'r grŵp arbrofol gynnwys ffenolig cyfanswm uchel, ac mae'r ddau yn cynyddu gyda'r cynnydd yn maint yr ateb sampl a ychwanegir. Yn yr un graddiant crynodiad, cynyddodd cyfanswm cynnwys ffenolig yr ensym afal yn y grŵp rheoli o 0. 673mg i 2.8 0 7mg, a chynyddodd cyfanswm cynnwys ffenolig y grŵp arbrofol o 0.961mg i 4.185mg. Mae cyfanswm cynnwys ffenolig y grŵp arbrofol yn llawer uwch na chynnwys y grŵp rheoli, ac mae'r duedd ar i fyny yn fwy amlwg. Yn ôl cyfanswm y cynnwys ffenolig, mae gweithgaredd gwrthocsidiol cyffredinol y grŵp arbrofol yn fwy na gweithgaredd y grŵp rheoli.
3.2.2 Lleihau pŵer
Dangosir canlyniadau lleihau penderfyniad pŵer ensymau afal yn y grŵp rheoli a'r grŵp arbrofol mewn crynodiadau gwahanol yn Ffigur 3.3.
Fel y dangosir yn Ffigur 3.3, mae'r duedd newidiol o leihau pŵer ensymau afal yn debyg i duedd newidiol cyfanswm y cynnwys ffenol. Mae pŵer lleihau'r grŵp arbrofol yn uwch na phŵer y grŵp rheoli, ac ai hwn yw'r grŵp arbrofol neu'r grŵp rheoli, o fewn yr ystod crynodiad a gyflwynir yn yr arbrawf, mae'r pŵer sy'n lleihau yn dangos tuedd gynyddol gyda'r cynnydd o faint o doddiant sampl a ychwanegir. Cadarnhaodd y data arbrofol hefyd fod gweithgaredd gwrthocsidiol y grŵp arbrofol yn fwy na gweithgaredd y grŵp rheoli o ran lleihau pŵer.
3.2.3 Gallu Scavenging Radical Am Ddim Anion Superoxide
Dangosir canlyniadau gallu scavenging radical di -anion uwchocsid ensymau afal yn y grŵp rheoli a'r grŵp arbrofol mewn gwahanol grynodiadau yn Ffigur 3.4.
Fel y dangosir yn Ffigur 3.4, mae gwahaniaeth mawr yn y gallu scavenging radical di -anion superoxide rhwng y grŵp arbrofol a'r grŵp rheoli. O fewn yr ystod crynodiad a gyflwynir yn yr arbrawf, mae gallu scavenging radical di -anion superoxide y grŵp arbrofol yn newid yn fwyaf arwyddocaol pan fydd crynodiad y sampl 10%i 20%, ac nid yw'r newid yn amlwg ar ôl i'r crynodiad fod yn fwy nag 20%; Pan fydd y crynodiad yn 50%, mae'r gallu scavenging radical heb anion superoxide mor uchel ag 85.4%. Gellir gweld y gallu scavenging radical di -superoxide a ddangosir gan y grŵp rheoli yn glir o'r siart tueddiadau. Wrth i'r crynodiad ensymau gynyddu, mae'r gallu scavenging radical rhydd hwn hefyd yn cynyddu, yn newid yn araf, ac yn raddol yn tueddu i gyflwr sefydlog. Mae'r gallu scavenging yn cyrraedd uchafswm o 42.6%. Mae'r grŵp arbrofol bron ddwywaith mor uchel â'r grŵp rheoli.
3.2.4 gallu scavenging radical heb hydrocsyl
Dangosir y newidiadau yng ngallu scavenging radical di -hydrocsyl yr ensymau afal yn y grŵp rheoli a'r grŵp arbrofol mewn crynodiadau gwahanol yn Ffig. 3.5.
Ffig.3.5 Cromlin Scavenging Radical Rhydd Hydrocsyl
Gellir gweld yn Ffig. 3.5 bod gallu scavenging radical rhydd hydrocsyl yr ensymau yn y grŵp arbrofol a'r grŵp rheoli yn yr amrediad crynodiad a gyflwynir yn yr arbrawf a'r grŵp rheoli. Roedd gallu scavenging radical heb hydrocsyl y grŵp arbrofol yn is na gallu'r grŵp rheoli, ac roedd yn perfformio'n wael iawn ar grynodiadau isel. Mewn crynodiadau uchel, cynyddodd y gallu scavenging radical heb hydrocsyl yn sylweddol. Efallai mai'r rheswm yw bod mathau a chynnwys micro -organebau yn yr ensymau afal yn y grŵp arbrofol a'r grŵp rheoli yn wahanol yn ystod y broses eplesu, ac roedd cynnwys y metabolion eilaidd a chydrannau pob cynnyrch a gynhyrchwyd gan yr eplesiad yn wahanol, felly roedd y gallu gwrthocsidiol a ddangosir yn wahanol.
3.2.5 DPPH · Gallu Scavenging Radical Am Ddim
O'i gymharu â dulliau canfod eraill, defnyddir gallu scavenging radical DPPH · rhydd yn helaeth i werthuso gweithgaredd gwrthocsidiol mewn cyfnod byr o amser [59]. Cafodd y gallu scavenging radical rhydd DPPH · mewn gwahanol grynodiadau ei blotio yn ôl canlyniadau'r grŵp rheoli ac ensymau afal grŵp arbrofol, fel y dangosir yn Ffigur 3.6.
Fel y dangosir yn Ffigur 3.6, pan oedd crynodiad ensym afal y grŵp rheoli yn is na 30%, roedd y gallu scavenging radical rhydd DPPH · yn llai na 50%, ond roedd ensym afal y grŵp arbrofol hefyd yn dangos gallu scavenging radical rhad ac am ddim DPPH · uwch ar grynodiadau isel. Mae'r canlyniadau arbrofol yn dangos bod ychwanegu Aspergillus oryzae, burum, streptococcus thermoffilig a lactobacillus Bwlgaria yn fuddiol i allu scavenging radical rhydd DPPH · yr ensym. Pan fydd crynodiad yr ensym yn 50%, mae'r gallu hwn mor uchel â 91.4%, sy'n llawer uwch na'r 69.8%o'r grŵp rheoli ar yr un crynodiad.
3.2.6 ABTS Capasiti Scavenging Radical
Dangosir canlyniadau gallu scavenging radical ABTS yr ensymau afal yn y grŵp rheoli a'r grŵp arbrofol mewn crynodiadau gwahanol yn Ffig. 3.7.
Ffig.3.7 Cromlin ABTS Capasiti Scavenging Radical
Gellir gweld o Ffig. 3.7 bod cyfradd scavenging yr ensymau afal yn y grŵp arbrofol yn uwch pan fydd y swm adio ensymau yn fwy na 5μl. Mae'r astudiaeth gan Erel et al. dangosodd fod gallu scavenging radicalau ABTS yn dibynnu i raddau helaeth ar grynodiad uwch sylweddau ffenolig [60]. Dangosodd canlyniadau cyfanswm y penderfyniad cynnwys ffenol fod cyfanswm cynnwys ffenol y grŵp arbrofol yn uwch na chynnwys y grŵp rheoli. Mae'r canlyniadau arbrofol yn Ffig. 3.7 newydd wirio bod gallu scavenging radicalau ABTS yn fwy na chynhwysedd y grŵp rheoli.
3.3 Crynodeb o'r bennod hon
Mae'r bennod hon yn astudio'r berthynas rhwng gweithgaredd gwrthocsidiol ensymau afal a gynhyrchir trwy eplesu gyda phedwar math o afalau dethol, crynodiad samplau ensymau, a chymharu cydrannau gweithredol gwrthocsidiol a gallu sborio radical rhydd rhwng y grŵp arbrofol a'r grŵp rheoli. Mae'r canlyniadau arbrofol yn dangos bod cyfanswm cynnwys ffenol yr ensym afal yn y grŵp rheoli yn is na'r hyn yn y grŵp arbrofol, a'i bŵer sy'n lleihau, mae radical rhydd anion superoxide, radical rhydd DPPH a gallu sborio radical rhydd ABTS yn well na'r rhai yn y grŵp rheoli; Mae gan yr ensym yn y grŵp rheoli allu scavenging arbennig o dda ar gyfer radicalau heb hydrocsyl.
Yn gyffredinol, dangosodd y grŵp arbrofol weithgaredd gwrthocsidiol uwch, a gadarnhaodd ymhellach ymarferoldeb ychwanegu straenau yn artiffisial i wneud ensymau microbaidd. Yn y modd hwn, mae gan fwydydd ensymau microbaidd fwy o sylweddau sy'n fuddiol i iechyd pobl ar sail yr eplesiad naturiol gwreiddiol, a gallant ddatblygu'n well i'r cyfeiriad a ddisgwylir gan bobl.
