Mae MiR{0}}p Yn Gwella Adfywio Cyhyrau Ac Yn Gwella Nychdod Cyhyrau A Chyhyrau Oed
Sep 22, 2022
Cysylltwch â oscar.xiao@wecistanche.com am ragor o wybodaeth
Mae arbrofion parabiosis yn awgrymu bod ffactorau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig ag adnewyddu a heneiddio yn cylchredeg yn y gwaed. Yma, rydym yn dangos bod miR{0}}p, sy'n cylchredeg yn y gwaed fel miRNA di-gell, wedi gostwng yn sylweddol yng ngwaed llygod oedrannus o'i gymharu â llygod ifanc; ac mae gan miR-199-3p y gallu i wella gwahaniaethu myogenig ac adfywio cyhyrau. Arweiniodd rhoi dynwaredau miR-199, sy’n cyflenwi miR-199-3p, i lygod oedrannus at hypertroffedd ffibr cyhyr ac oedi wrth golli cryfder y cyhyrau. Fe wnaeth gweinyddu dynwarediadau miR-199 yn systemig i lygod mdx, model anifail adnabyddus o nychdod cyhyrol Duchenne (DMD), wella cryfder cyhyrau llygod yn sylweddol. Gyda'i gilydd, gall miR{8}}p di-gell yn y gwaed gael effaith gwrth-heneiddio megis effaith ahypertroffig mewn ffibrau cyhyrau oedrannus a gallai fod â photensial fel therapiwteg RNA newydd ar gyfer DMD yn ogystal â chlefydau sy'n gysylltiedig ag oedran. Mae'r canfyddiadau'n rhoi cipolwg newydd i ni ar miRNAs sy'n cylchredeg gwaed fel moleciwlau sy'n gysylltiedig ag oedran.
Mae swyddogaethau hanfodol, megis grym cyhyrau, gweithrediad y system nerfol, swyddogaeth resbiradol, amddiffyniad rhag haint, a gwrthsefyll afiechydon, yn dirywio wrth heneiddio. Mae clefydau a chamweithrediadau sy'n gysylltiedig â dirywiad swyddogaethol o'r fath yn cynyddu ac yn dod yn broblemau mawr mewn cymdeithasau sy'n heneiddio. Mae newidiadau amrywiol, megis newidiadau metabolig a rheoleiddio genynnau, yn digwydd yn y corff ag heneiddio-3; a gall astudio newidiadau o'r fath helpu i ddeall heneiddio a darparu strategaethau i ddelio â'r problemau sy'n wynebu cymdeithasau sy'n heneiddio. Mae biomoleciwlau (gan gynnwys genynnau) sy'n gysylltiedig â heneiddio wedi'u nodi a gallant fod yn ddefnyddiol mewn ymchwil heneiddio; ee mae mynegiant -galactosidase a plolnk4a yn gysylltiedig â heneiddedd cellog4-6, ac mae model llygoden heb y genyn klotho yn cael ei adnabod fel model heneiddio gyda nifer o ffenoteipiau, sy'n debyg i heneiddio cynamserol dynol.
Parabiosis yw'r undeb rhwng dau unigolyn sy'n rhannu system fasgwlaidd gyffredin, a gellir ei gynhyrchu'n arbrofol gan lawdriniaeth8. Dangosodd arbrofion gyda pharabiosis, lle'r oedd cnofilod ifanc ac oedrannus yn cael eu cyfuno i rannu system fasgwlaidd gyffredin, fod y broses heneiddio mewn anifeiliaid ifanc wedi'i chyflymu, tra bod anifeiliaid oedrannus yn cael eu hadnewyddu9-12. Mae’r canfyddiadau’n awgrymu’n gryf bod rhai ffactorau sy’n ymwneud ag adnewyddu a heneiddio yn bresennol, ac yn cylchredeg â gwaed yn y system fasgwlaidd; fodd bynnag, nid yw ffactorau cylchredol o’r fath wedi’u deall yn llawn eto3.
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Mae microRNAs (miRNAs) yn 21-23-RNAs bach di-godio o hyd niwcleotid, sy'n cael eu prosesu o drawsgrifiadau hirach (miRNAs pri-mary) trwy dreuliad, gyda chymhleth microbrosesydd yn y cnewyllyn a Dicer yn y cytoplasm, a'u hymgorffori mewn mae'r cyfadeilad tawelu a achosir gan RNA (RISC)14,15.MiRNA mewn RISC yn gweithredu fel cyfryngwr mewn tawelu genynnau, lle mae cyfieithu RNAS negeseuol (mRNAs) sydd â chyfatebiaeth rhannol i'r miRNA yn cael ei atal neu mRNAs sy'n cario dilyniannau sydd bron yn gyflenwol i'r miRNA. treuliol4,15.Detholiad Cistanche Gwrth YmbelydreddFelly, mae miRNAs yn chwarae rhan bwysig yn y rheoliad genynnau trwy atal eu mynegiant genynnau targed. Mae miloedd o enynnau miRNA wedi'u canfod mewn anifeiliaid a phlanhigion [gweler y gronfa ddata microRNA (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Mae proffil mynegiant miRNAs wedi'i archwilio, ac mae mynegiant meinwe-a chyfnod datblygu-benodol a mynegiant miRNAs sy'n gysylltiedig â chlefydau wedi'u canfod6-21. Mae cysylltiad agos rhwng rheoleiddio genynnau sy'n cynnwys miRNAs a swyddogaethau hanfodol amrywiol a ffenomenau bywyd, gan gynnwys clefydau14,16,21-24
Mae MiRNAs yn bresennol y tu allan, yn ogystal â thu mewn i'r celloedd25. Er enghraifft, mae miRNAs yn bresennol yn y gwaed fel niwcleotidau di-gell ac yn cylchredeg yn y system fasgwlaidd2627. Mae miRNAs di-gell o'r fath (cf-miRNAs) wedi'u hymgorffori mewn fesiglau bach a elwir yn fesiglau allgellog neu'n gysylltiedig â phroteinau, a thrwy hynny'n cael eu hamddiffyn rhag niwcleasau allgellog25,28. Gall presenoldeb rhai cf-miRNAs fod yn arwyddocaol; er enghraifft, mae cysylltiadau arwyddocaol rhwng cf-miRNAs a rhai clefydau wedi'u canfod26,27,29-31. Gall Cf-miRNAs adlewyrchu newidiadau yn y cyflwr corfforol; felly, gall miRNAs o'r fath fod yn fiofarcwyr posibl ar gyfer monitro systemau cynnal a chadw bywyd, yn ogystal â chlefydau.
Cynhaliwyd yr astudiaeth bresennol i archwilio cysylltiadau rhwng cf-miRNAs a heneiddio, ac ymchwiliwyd i cf-miRNAs yng ngwaed llygod ifanc ac oedrannus. Datgelodd y canlyniadau newidiadau mewn cf-miRNAs rhwng gwaed llygoden ifanc ac oedrannus. Ymhlith miRNAs o'r fath, roedd miR-199-3p wedi gostwng yn sylweddol mewn gwaed oed o gymharu â gwaed ifanc. Yn ddiddorol, mae gan miR-19-3p y gallu i wella gwahaniaethu ac adfywiad cyhyrau, ac arweiniodd ei roi i lygod oedrannus at ehangu ffibr cyhyrau. Pan gyflwynwyd miR{5}}p i lygod mdx, roedd model anifail o nychdod cyhyrol Duchenne (DMD) wedi gwella'n sylweddol ar gryfder cyhyrau llygod. Mae'r astudiaeth bresennol yn rhoi mewnwelediadau newydd i cf-miRNAs sy'n cylchredeg gwaed o ran heneiddio, gallu cudd, a chymwysiadau meddygol.
Canlyniadau
Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-mis oed) Llygod C57BL/6J, gan ddefnyddio micro-arae DNA i nodi gwahaniaethau sy'n gysylltiedig ag oedran. Roedd proffil cf-miRNAs yn dangos gwahaniaethau amlwg rhwng llygod ifanc ac oedrannus, hy, canfuwyd cf-miRNAs sy'n gogwyddo tuag at waed llygoden ifanc ac oedrannus (Tabl 1). O'r fath miRNAs, roedd miRNAs myogenig (ee, miR-1 a miR-133)1833 yn bresennol yn y grŵp miRNA sy'n doreithiog mewn gwaed ifanc; mewn geiriau eraill, miRNAs myogenig yn sylweddol llai mewn gwaed oed (Tabl 1).cistanche herbaCadarnhawyd y gwahaniaeth yn y miRNAs rhwng gwaed ifanc ac oedrannus gan adwaith cadwynol trawsgrifio-polymerase meintiol gwrthdro (qRT-PCR; Ffig. la), a'i atgynhyrchu ymhellach gan ddefnyddio ffynonellau RNA a dynnwyd o fesiglau bach, a elwir yn ecsosomau, wedi'u hynysu o'r plasma ( Atodol Ffig.1).
Datgelodd arbrofion diwylliant celloedd, ar y llaw arall, fod gan serwm llygoden ifanc y gallu i gymell gwahaniaethu myogenig, ac roedd y gallu yn gryfach na llygod oedrannus (Ffig. 1b). Archwiliwyd ffactor twf tebyg i inswlin I (IGF-I), sy'n ffactor mawr sy'n gallu achosi gwahaniaethu myogenig yn y gwaed34,35; fodd bynnag, ni sylwyd ar unrhyw wahaniaeth arwyddocaol rhwng gwaed ifanc ac oedrannus (Ffig. lc). Felly, gall ffactorau heblaw IGF-I mewn gwaed ifanc fod yn gysylltiedig â gwahaniaethu myogenig.
Mae miR{0}}p yn gallu ysgogi gwahaniaethau myogenig yn gryf. Fe wnaethom ymchwilio i effeithiau miRNAs sy'n doreithiog mewn gwaed ifanc ar wahaniaethu myogenig. Cyflwynwyd dynwared miRNA synthetig i gelloedd C2C12, archwiliwyd llinell gell myoblast llygoden, ac archwiliwyd mynegiant marcwyr gwahaniaethu myogenig, y genynnau cadwyn trwm myogenin (Myog) a myosin 1 (Myh1). Roedd y canlyniadau'n annisgwyl ac yn denu ein diddordeb: miR-199-3p, a ragwelwyd fel miRNA negyddol oherwydd yr ychydig o wybodaeth am wahaniaethu myogenig, a achoswyd yn amlwg i fynegiant Myog a Myh1 (Ffig. 2a, b). Yn ogystal, roedd anwythiad miR-199-3p yn gryfach nag anwythiad miRNAs myogenig confensiynol: roedd mynegiant cadwyn drom myosin ym mhresenoldeb miR-199-3p yn arbennig o nodedig (Ffig. 2b, c).
Er mwyn egluro'r berthynas rhwng miR{0}}p a gwahaniaethu myogenig, gwnaethom ymchwilio i miR{-199-3p cellog ac allgellog (exoso-mal) yn ystod gwahaniaethu myogenig, a hefyd effeithiau atalyddion miR-199-3p ar y gwahaniaeth. Cafodd mynegiant miR-199-3p mewndarddol (cellog) ei ddadreoleiddio ar ôl dechrau gwahaniaethu. Cynyddwyd miR ecsosomaidd-19-3p unwaith a gostyngwyd wedi hynny (Ffig Atodol 2a). Roedd triniaeth atalydd yn atal mynegiant marcwyr gwahaniaethu myogenig, Myog, Myh1, a creatine kinase (Ckm) (Ffig Atodol 2b).twf pidyn cistancheFelly, mae'r canfyddiadau'n awgrymu bod miR{0}}p yn cymryd rhan mewn gwahaniaethu myogenig.
Wrthi'n dylunio miR{0}} dynwarediadau. Fe wnaethom ddylunio dynwaredau miR-199 fel bod y dynwaredwyr yn gallu cynhyrchu miR-199-3p yn effeithlon fel cyfryngwr swyddogaethol (llinyn canllaw) wrth dawelu genynnau. Cafodd y dynwarediadau miRNA a ddyluniwyd eu sgrinio a dewiswyd miR199#4 fel dynwared miR-199 cymwys (Ffig Atodol 3). Yn dilyn hynny, defnyddiwyd miR199#4 mewn arbrofion in vivo ac in vitro.
Targedu genynnau miR-199-3p mewn gwahaniaethu myogenig. Er mwyn nodi genynnau targed ar gyfer miR-199-3p o dan fyoblastau myogenig, buom yn chwilio am enynnau ymgeisiol o gronfa ddata TargetScan a chanolbwyntio ar y genynnau Lin28b a Suz12, a fynegir ill dau mewn myoblastau C2C12. Mae gan Lin28b a Suz12 ddilyniannau rhwymo miR-199-3p tybiedig yn eu rhanbarth 3'heb ei gyfieithu (UTR; Ffig. 3a). Dangoswyd bod y dilyniannau tybiedig yn safleoedd rhwymo dilys ar gyfer miR-19-3p, gan ddefnyddio genynnau'r gohebydd Luciferase sy'n cario'r dilyniannau rhwymo a dilyniannau cyfatebol nad ydynt yn cyfateb (Ffig. 3a, b). Cafodd y genynnau Luciferase sy'n cario'r dilyniannau rhwymo tybiedig eu hatal yn sylweddol gan miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983), a pSuz{12-(973)], tra bod y dilyniannau anghydweddu, sydd â threigladau amnewid sylfaenol yn yr had [pLin28b-(81)mut, rhanbarth, wedi diddymu ei effaith atal [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut, a Pan gyflwynwyd dynwared miR-199 i gelloedd C2Cl2, roedd mynegiant Lin28b a Suz12 yn cael ei atal yn gyson (Ffig. 3c).I asesu a oedd ataliad Lin28b a/ neu Suz12 yn cyfrannu'n uniongyrchol at wahaniaethu myogenig, cynhaliwyd ataliad penodol o Lin28b a Suz12 trwy dawelu genynnau, gan ddefnyddio rhyng-gyfeiriad RNA (RNAi; Ffig. 3d, e). Yn ôl y disgwyl, dadreoleiddiwyd mynegiant marcwyr gwahaniaethu myo-genig, megis Ckm, Myh1, a Myog o dan ddistewi genynnau Lin28b a Suz12 (Ffig. 3f, g).
Gan fod Lin28b yn brotein sy'n rhwymo RNA sy'n ymwneud â phrosesu miRNAs3637, fe wnaethom ymchwilio i effeithiau dynwared miR-19 trwy Lin28b ar brosesu miRNA myogenig. Archwiliwyd lefel miR-1, miRNA myogenig mawr, oherwydd bod prosesu ei ragflaenydd yn cael ei reoleiddio gan Lin28b37. Cynyddwyd miR{8}} aeddfed yn sylweddol gan driniaeth dynwared miR-199 (Ffig. 3h), sy'n awgrymu y gall miR-199-3p reoleiddio mynegiant swyddogaethol miR-1 trwy ataliad o'i darged Lin28b. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau'n awgrymu bod miR-199-3p yn ymwneud â gwahaniaethu myogenig trwy atal ei enynnau targed, Lin28b a Suz12.
Gwella adfywio cyhyrau gan miR199#4 mewn llygod anaf cyhyr.manteision cistanche salsaFe wnaethom archwilio effeithiau dynwared miR-199 (miR199#4) in vivo gan ddefnyddio modelau anafiadau cyhyr (Ffig. 4a, b). Chwistrellwyd llygod C57BL / 6J wyth wythnos oed â BaClz i'r tibialis anterior (TA) i achosi anaf i'r cyhyrau, a rhoddwyd miR19 # 4 i'r safleoedd a ddifrodwyd 24 awr yn ddiweddarach. Dau ddiwrnod ar ôl gweinyddu miR199#4, archwiliwyd mynegiant genynnau marciwr myogenig. Cynyddwyd mynegiant Myog yn sylweddol a chafodd gwahaniaethiad myogenig 1 (Myod1) a ffactor myogenig 5 (Myf5) hefyd eu huwchreoleiddio gan weinyddiaeth miR199 # 4 (Ffig. 4c). Mae'r data yn gyson â'r canlyniadau in vitro a ddisgrifir uchod (Ffig. 2).
Perfformiwyd dadansoddiad imiwnohistocemegol o gyhyrau adfywio 9 diwrnod ar ôl gweinyddu miR199 #4. Archwiliwyd yr ardaloedd trawsdoriadol o adfywio ffibrau cyhyrau (myofibers), a nodweddir gan niwclysau canolog (Ffig. 4b). Roedd yr ardal drawsdoriadol gymedrig o myofibrau adfywio a gafodd ei drin â miR199 # 4 yn fwy na myofibrau rheoli a gafodd eu trin â rheolaeth ddi-distewi RNA dwplecs (nsCont; Ffig. 4d), gyda'r gwahaniaeth yn agosáu at arwyddocâd ystadegol. Yn ogystal â'r arwynebedd trawsdoriadol cymedrig, dangosodd histogram maint-rhanedig yr ardal drawstoriadol gynnydd mewn myofibrau chwyddedig ym mhresenoldeb miR199#4(Ffig.4e).
Effaith hypertroffig miR199#4 ar ffibrau cyhyrau oed. Archwiliwyd effeithiau miR199#4 ar lygod oed (~ 24 mis oed). Dangosodd llygod oedrannus ostyngiad sylweddol mewn miR-199-3p cyhyr (Ffig. 5a), fel mewn cf-miR-19-3p, o gymharu â llygod ifanc. Fe wnaethom weinyddu miR199 # 4 i gyhyrau TA llygod oedrannus, a 2 ddiwrnod yn ddiweddarach archwiliwyd y cyhyrau TA trwy ddadansoddiad immunohistochemical (Ffig. 5b). Roedd arwynebedd trawsdoriadol cymedrig myofibrau a gafodd eu trin â miR199#4 yn sylweddol fwy na myofibrau rheoli a gafodd eu trin â nsCont (Ffig. 5c). Yn gyson â hyn, datgelodd y dadansoddiad histogram maint-rhanedig gynnydd amlwg mewn myofibrau chwyddedig ym mhresenoldeb miR199#4(Ffig.5d).
Gan fod cf-miR{2}}p sy'n cylchredeg gwaed yn cael ei leihau mewn llygod oedrannus, fe wnaethom gyflwyno miR199#4 i waed llygod hen sy'n cylchredeg trwy ofer y gynffon. Ar ôl gweinyddu miR19#4 mewnwythiennol, archwiliwyd a dadansoddwyd ardal drawsdoriadol myofibers, fel y disgrifir uchod. Mae'r canlyniadau, fel y dangosir yn Ffig. 5e, yn gyson â chanlyniadau gweinyddu miR199#4 yn lleol i gyhyrau oedrannus (Ffig. 5c, d).
Dylid nodi bod gwahaniaeth mewn ffibrau cyhyrau chwyddedig rhwng y model anafiadau cyhyrau a llygod oedrannus. Gwelir niwclysau canolog mewn ffibrau cyhyr sy'n adfywio (Ffig. 4b), ond prin y canfuwyd myofibrau o'r fath mewn llygod oedrannus a gafodd eu trin â miR199#4 (Ffig. 5b). Mae hyn yn awgrymu y gall ffibrau cyhyrau sy'n bodoli eisoes ehangu mewn llygod oedrannus yn dilyn triniaeth miR199 #4. Fe wnaethom ddamcaniaethu y gallai mecanwaith arall gwahanol i adfywio cyhyrau fod yn rhan o ehangu myofiber mewn llygod oedrannus, a chynigiwyd cynnwys llwybr atroffi'r cyhyrau.dos cistanche tubulosa redditMae'r genynnau Atroginl a MuRFI yn perthyn yn agos i atrophy cyhyr38, ac mae eu lefelau mynegiant yn sylweddol uwch mewn cyhyrau oed o'u cymharu â chyhyrau ifanc (Ffig. 6a). Fe wnaethom archwilio lefel yr Atroginl a MuRFI yng nghyhyrau llygod oedrannus ar ôl gweinyddu miR199#4 yn systemig. Gostyngwyd Atroginl a MuRFI yn sylweddol mewn gwahanol gyhyrau gan weinyddiaeth miR19#4 (Ffig. 6b), sy'n awgrymu y gallai atal y llwybr atroffi cyhyrau gan miR199#4 achosi ehangiad myofiber mewn llygod oedrannus.
Mae MiR199#4 yn gohirio colli cryfder cyhyrau mewn llygod oedrannus. Mae effaith miR199#4 ar weithrediad cyhyr mewn llygod oedrannus o ddiddordeb. Perfformiwyd y prawf cryfder gafael ar lygod oedrannus cyn ac ar ôl gweinyddu systemig miR199#4. Perfformiwyd yr arbrawf mewn modd dwbl-ddall; cynhaliwyd pigiad RNA a'r prawf gafael 100 y cant gan wahanol arbrofwyr heb rannu gwybodaeth. Roedd llygod C57BL/6 (80-wythnos oed) gwrywaidd yn cael prawf gafael, yna 1 wythnos yn ddiweddarach, cawsant eu chwistrellu'n fewnwythiennol â miR199#4 ac nsCont, a rhoddwyd prawf gafael arnynt eto. Mae'r newid yng nghryfder y cyhyrau ar ôl pigiad miR199#4 yn MiR199#4 yn gwella cryfder cyhyrau llygod mdx. Gan fod miR199#4 yn cael effaith gadarnhaol ar gyhyrau, cynhaliom arbrawf i asesu effaith gweinyddu miR199#4 mewn llygod mdx, model anifeiliaid DMD adnabyddus32. Chwistrellwyd llygod mdx wyth wythnos oed yn fewnwythiennol gyda miR199 # 4 (1.6 mg / kg) ddwywaith (cyfwng 1 wythnos), a chynhaliwyd y prawf gafael 1 wythnos ar ôl y weinyddiaeth ddiwethaf. Perfformiwyd yr arbrawf mewn modd dwbl-ddall fel y dangosir yn Ffig.7. Mae'r canlyniadau (Ffig. 8a) yn dangos gwelliant sylweddol mewn cryfder cyhyrau mewn llygod mdx a gafodd eu trin â miR199#4 o gymharu â llygod mdx a gafodd eu trin ag nsCont. Yn ogystal, gwelwyd gostyngiadau sylweddol mewn gweithgaredd creatine kinase (CK) a miR di-gell-1 yng ngwaed llygod mdx a gafodd eu trin â miR199#4(Ffig. 8b, c), sy'n arwyddion posibl o'r clefyd gwelliant.
Fel adweithydd cyflenwi cyffuriau, mae atelocollagen yn gludiog ac yn anodd ei drin, ac roedd yn ymddangos bod y llygod a gafodd eu trin ag atelocollagen yn dioddef effeithiau negyddol oherwydd y cerbyd. Felly, buom yn edrych am ddewisiadau amgen i atelocollagen i wella ein system cyflenwi cyffuriau (DDS) a chanfuwyd liposomau cationig DC-CHOL/DOPE fel adweithydd DDS newydd sy'n hafal neu'n well nag atelocollagen (Ffig Atodol 4). Dangosodd dosbarthiad cyffuriau miR199#4 gyda'r liposomau cationig fod y miR19#4 a roddwyd yn cael ei ddosbarthu i'r cyhyr a'i gymryd yn gyson mewn symiau mawr yn yr afu (Ffig Atodol 5). Gall miR199#4 allgellog a ddosberthir i'r cyhyr weithredu fel cyfryngwr wrth dawelu genynnau a chyfrannu at y rheoliad genynnau sy'n ymwneud â gwella cryfder y cyhyrau.
Ceisiwyd nodi biomoleciwlau yn ymwneud â'r gwelliant yn dilyn gweinyddiaeth miR199#4. Archwiliwyd poly-peptidau amrywiol yn ymwneud â DMD gan blotio gorllewinol; fodd bynnag, ni chanfuwyd signalau penodol yn ymwneud â'r gwelliant yn yr astudiaeth hon (Ffig Atodol 6). Byddwn yn trafod y pwynt hwn ymhellach yn yr adran ganlynol.
Trafodaeth
Mae biomoleciwlau yn newid yn ansoddol ac yn feintiol gyda heneiddio--3. Mae cofnodi newidiadau o'r fath a'u hastudio yn hanfodol ar gyfer deall heneiddio, a gallant ddatgelu strategaethau ar gyfer delio â phroblemau mewn cymdeithasau sy'n heneiddio. Mae astudiaethau parabiosis lle mae anifeiliaid ifanc ac oedrannus yn cael eu cyfuno i rannu system fasgwlaidd gyffredin wedi rhoi mewnwelediadau pwysig i heneiddio ac adnewyddu9-l2. Mae'r canfyddiadau'n awgrymu'n gryf bod yna ffactorau adfywio a heneiddio mewn gwaed ifanc ac oedrannus sy'n cylchredeg, yn y drefn honno. Adroddodd astudiaethau blaenorol fod moleciwlau amrywiol yn ymgeiswyr yn ymwneud ag adnewyddu a heneiddio, ond mae'r canlyniadau'n ddadleuol3.
Mae ein harbrofion meithrin celloedd in vitro gan ddefnyddio sera ifanc ac oedrannus yn debyg i arbrofion parabiosis (Ffig. lb), a daethom o hyd i miR-199-3p, sy'n newid gydag oedran, mewn gwaed sy'n cylchredeg; nodwyd bod y miRNA yn gostwng yn sylweddol mewn gwaed oed (Tabl 1 a Ffig. la). Yn ogystal, mae mynegiant cyhyr (cellog) miR-199-3p yn gostwng yn sylweddol mewn cyhyrau oedrannus o'u cymharu â chyhyrau ifanc (Ffig. 5a); felly, gall cf-miR-199-3p yn y gwaed gyfateb i miR cyhyr-199-3p. Gwelir y gostyngiad mewn mynegiant miR-199-3p wrth heneiddio hefyd mewn bôn-gelloedd mesenchymal sy'n deillio o fêr esgyrn macac rhesws39. Felly, gall mynegiant cellog miR-19-3p fod o dan reolaeth sy'n gysylltiedig ag oedran. Mewn cyferbyniad â miR-19-3p, mae mynegiant miRNAs myogenig cellog, megis miR-1 a miR-133, yn parhau'n ddigyfnewid mewn cyhyrau ifanc ac oedrannus (Ffig. 5a), ond mae'r lefel o'u miRNAs allgellog yn y gwaed yn cael ei leihau'n sylweddol mewn llygod oed (Ffig. la). Gall y gwahaniaeth rhwng miR-199-3p a myogenic miRNAs(miR-1 a-133) adlewyrchu'r gwahaniaeth mewn prosesu cf-miRNA a/neu mewn rheolaeth sy'n gysylltiedig ag oedran ar cf-miRNAs rhyngddynt . Er mwyn egluro'r gwahaniaeth hwn, mae angen cynnal astudiaethau pellach yn y dyfodol.
Awgrymodd astudiaethau blaenorol fod miR{0}}p yn cymryd rhan mewn amrywiol swyddogaethau cellog a ffenomenau hanfodol trwy atal ei enynnau targed; e.e., gall y miRNA hyrwyddo amlhau a mudo celloedd blaenau endothelaidd a modiwleiddio dyfodiad glasoed, yn y drefn honno, trwy is-reoleiddio'r semafforin wedi'i dargedu-3genyn40 a thrwy atal genynnau targed (Cdc42,Map3k2,Map3k4,a Taok1)yn ymwneud â llwybr p38MAPK41. Mae'r astudiaeth bresennol wedi canfod bod miR-19-3p yn ymwneud â gwahaniaethu myogenig trwy atal ei enynnau targed, Lin28b a Suz12 (Ffig. 3). Mae Lin28b yn brotein sy'n rhwymo RNA ac mae'n atal aeddfedu miRNAs, gan gynnwys miR-1, sef miRNA cyhyr-benodol a myogenesis pro-motes37. Mae ataliad Lin28b gan miR-19-3p yn achosi cynnydd mewn miR aeddfed-1 (Ffig. 3), a all ganiatáu i wahaniaethu myogenig fynd rhagddo.
Mae Suzl2 yn is-uned graidd o gymhleth ataliad polycomb 2 (PRC2), sy'n cymryd rhan mewn atal cromatin42. Mae rheoleiddio genynnau PRC2 yn ymwneud â chynnal bôn-gelloedd, datblygiad embryonig, amlhau celloedd a gwahaniaethu, gan gynnwys gwahaniaethu myogenig42. Mae PRC2 yn bresennol ar loci cyhyr tawel penodol, fel Myog a creatine kinase cyhyrau (MCK) mewn myoblastau diwahaniaeth, ond mae wedi'i ddatgysylltu. o loci o'r fath mewn myotiwbiau gwahaniaethol43. Mae tawelu genynnau yn erbyn Suz12 gan RNAi yn achosi gwella mynegiant genynnau myogenig (Ffig. 3). Mae ataliad y enhancer o'r protein zeste homolog 2 (Ezh2), is-uned graidd arall o PRC2, hefyd yn achosi gwahaniaethu myogenig44. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gallai atal ffurfio PRC2 oherwydd atal ei is-unedau craidd ysgogi creu cyflwr genomig ar gyfer gwahaniaethu cyhyrau. Felly, gall atal Suz12 gan miR-199-3p arwain at wahaniaethu myogenig. Gyda'i gilydd, gall miR{18}}p chwarae rhan bwysig mewn gwahaniaethu myogenig trwy atal dau lwybr annibynnol sy'n cynnwys Lin28b a Suzl2, y mae pob un ohonynt yn ymwneud â chynnal cyflwr diwahaniaeth myoblastau.
Mae effaith miR-199-3p ar wahaniaethu myogenig hefyd wedi'i ddangos yn vivo (Ffig. 4). Mae difrod cyhyrau yn sbarduno pro-liferation gell a gwahaniaethu oherwydd adfywio cyhyrau. Mae cyflwyno miR199#4, sy'n cyflenwi miR-199-3p, i safleoedd sydd wedi'u difrodi wedi gwella adfywiad cyhyrau ac ehangu myofibrau adfywio (Ffig. 4). Roedd mynegiant genynnau myogenig yn cael ei uwchreoleiddio'n gyson o dan driniaeth miR199#4 (Ffig. 4). O safbwynt ymarferol, gallai miR199#4 fod yn effeithiol ac yn ddefnyddiol ar gyfer triniaethau llawfeddygol.
Pan roddwyd miR199#4 i lygod oedrannus â diffyg miR sy'n cylchredeg gwaed, dangosodd y llygod myofibrau wedi'u hehangu'n sylweddol (Ffig. 5) ac roedd oedi wrth golli cryfder cyhyrau wrth heneiddio (Ffig. 7). Mae'r myofibers ehangedig mewn llygod oedrannus yn wahanol i myofibers adfywio, sy'n cael eu chwyddo ym mhresenoldeb miR199#4; mae'r cyntaf yn deillio o myofibers sy'n bodoli eisoes, a'r olaf yn dod o neo-myofibers (myofibers newydd-anedig). Felly, mae yna fecanweithiau gwahanol, annibynnol yn y helaethiadau ffibr cyhyrau. Mae ein hastudiaeth yn awgrymu bod (i) yn yr achos cyntaf, atal atroffi cyhyrau oherwydd ataliad Atroginl a MuRFI trwy driniaeth miR199 # 4 yn arwain at ehangu myofibrau oedrannus, a (ii) yn yr achos olaf, atal genynnau targed, Lin28b a Suz12, yn achosi ehangu myofibrau adfywio. At ei gilydd, gall genynnau gwahanol (lluosog) a reoleiddir gan miR-19-3p ymwneud â hypertroffedd cyhyr mewn gwahanol sefyllfaoedd. Mae'r canfyddiadau hefyd yn awgrymu y gallai miR{14}}p gael o leiaf effaith gwrth-heneiddio ar gyhyr, ac y gallai miR199#4 sy'n cyflenwi miR-199-3p fod â photensial fel meddyginiaeth RNA newydd ar gyfer clefydau cyhyrau sy'n gysylltiedig ag oedran, megis sarcopenia.
Yn seiliedig ar effeithiolrwydd uchel miR199 # 4 ar gyhyrau, fe wnaethom weinyddu miR199 # 4 i lygod mdx, model DMD adnabyddus, a chael canlyniadau rhyfeddol: gwnaeth gweinyddiaeth systemig miR199 # 4 wella cryfder cyhyrau yn y llygod o ~ 20 y cant ( Ffig.8a). Er mwyn deall mecanwaith adferiad cryfder y cyhyrau, fe wnaethom geisio nodi biomoleciwlau a gafodd eu gwella (neu eu dylanwadu) gan miR-199-3p. Fodd bynnag, ac eithrio gwelliannau gwaed CK a cf-miR-1 (Ffig. 8b, c), nid oeddem yn gallu canfod gwelliannau o'r fath ar y lefel foleciwlaidd. Gall yr anhawster hwn wrth ganfod fod oherwydd y boblogaeth gell gymhleth, sy'n cynnwys cymysgedd o adfywio ac amharu ar gelloedd cyhyrau mewn llygod mdx. Hyd yn oed os bydd miR199#4 yn arwain at welliant, byddai'r sŵn cefndir uchel a achosir gan y boblogaeth celloedd cymhleth yn cuddio tystiolaeth o'r gwelliant. I ddatrys y broblem hon, mae angen cynnal astudiaethau mwy helaeth gan ddefnyddio poblogaeth celloedd cyhyrau homogenaidd sy'n deillio o lygod mdx neu sy'n canolbwyntio ar feinweoedd amrywiol, gan gynnwys cyhyrau.
Er bod mecanwaith moleciwlaidd adferiad cryfder y cyhyrau erbyn miR199 # 4 yn anhysbys o hyd, mae'r dos o miR19 # 4 ar gyfer cryfder cyhyrau gwell yn nodedig. Gwellodd gweinyddiad dwywaith o ~1.6 mg/kg miR199#4 gryfder cyhyrau llygod mdx. Ymddengys bod y dos effeithiol yn is na dos oligonucleotidau antisense ar gyfer sgipio exon yn erbyn genynnau dystroffin mutant in vivo45-47. Mae'n bosibl mai'r rheswm pam y gall miR199 #4 wella cryfder y cyhyrau ar ddosau is o'r fath yw ei wahanol fecanwaith gweithredu o'i gymharu ag oligonucleotides antense. Mecanwaith gweithredu miR19#4 yw tawelu genynnau catalytig. Mewn cyferbyniad, mae mecanwaith antisense oli-gonucleotides yn seiliedig ar hybridization corfforol. Felly, gellir priodoli gwahaniaethau yn y dosau priodol i ddangos effeithiolrwydd cyffuriau i'r gwahanol fecanweithiau gweithredu.
Nid yw'r mecanwaith y mae organau, meinweoedd, neu gelloedd yn rhyddhau miRNAs i'r gwaed sy'n cylchredeg wedi'i ddeall yn llawn eto, ac mae'r rheoliad sy'n gysylltiedig ag oedran ar ryddhau miRNAs o'r fath hefyd yn aneglur. Dangosodd yr astudiaeth bresennol fod myogenig cf-miR-NAs, gan gynnwys cf-miR-199-3p yn cylchredeg gyda'r gwaed yn y system fasgwlaidd ac yn lleihau wrth heneiddio. Gall cf-miRNAs o'r fath fod yn bresennol mewn ecsosomau, hy, miRNAs ecsosomaidd ydynt.
Mae miRNAs myogenig yn cymryd rhan mewn gwahaniaethu myogenig, adfywio cyhyrau, a chynnal homeostasis cyhyrol33. Nododd astudiaethau blaenorol y gwelwyd bod miRNAs myogenig, megis miR-1 a miR-133, yn cynyddu yn y gwaed mewn ymateb i ymarfer corff4849. Yn seiliedig ar yr adroddiadau hyn, gall llygod ifanc gweithredol ryddhau mwy o miRNAs myogenig i'r gwaed na llygod sy'n symud yn araf oed, a gall miRNAs allgellog o'r fath, gan gynnwys cf-miR-199-3p gyfrannu at gynnal homeostasis cyhyrau mewn llygod ifanc trwy weithredu awtocrin. . Fodd bynnag, nid yw lefel y miRNA allgellog (exosomal) bob amser yn cyfateb i'r lefel miRNA cellog, a gwelwyd gwahaniaethau mewn miRNAs myogenig a miR-199-3p rhwng llygod ifanc ac oedrannus (Ffig. la a 5a) ac yn ystod gwahaniaethu myogenig (Ffig Atodol 2a). Felly, fel posibilrwydd arall, mae'n bosibl y gallai rheoleiddio ffurfiad ecsosomaidd sy'n gysylltiedig ag oedran ac sy'n gysylltiedig â gwahaniaethu effeithio ar gynhyrchiant cf-miRNA; yn benodol, gall fod gwahaniaethau mewn ffurfiant ecsosomaidd rhwng llygod ifanc a llygod oedrannus. Yng nghyd-destun y rhagdybiaethau hyn, mae angen astudiaeth bellach i egluro rhyddhau miRNAs myogenig i'r gwaed sy'n gysylltiedig ag oedran.
Ar wahân i'r mecanwaith rhyddhau, pan fydd cf-miRNAs myogenig ifanc sy'n cynnwys cf-miR-199-3p yn llifo i'r system sy'n cylchredeg gwaed oedrannus o system fasgwlaidd ifanc trwy barabiosis, gallai'r cf-miRNAs ysgogi actifadu cyhyrau ac atal cyhyrau atroffi ar yr ochr oedranus; cefnogir y cysyniad hwn gan dystiolaeth gan lygod oedrannus a chwistrellwyd yn fewnwythiennol â miR19#4 yn yr astudiaeth hon (Ffig. 5-7). Gall Cf-miRNAs yn y gwaed fod yn gysylltiedig â swyddogaeth homeostatig sy'n gysylltiedig ag oedran a gallent gynrychioli homeostasis wedi'i newid. Pan fo cf-miRNAs o'r fath yn bresennol yn ectopig, er enghraifft, pan fydd cf-miRNAs mewn gwaed ifanc yn cael eu trosglwyddo i'r hen system cylchrediad gwaed, gall rhai cf-miRNAs ddangos effeithiau adfywiol ar yr ochr oedrannus, hy, gallant gynhyrchu effeithiau gwrth-heneiddio. Mewn cyferbyniad, gall cf-miRNAs mewn gwaed oed gynrychioli homeostasis wedi'i newid gyda heneiddio. Pan fydd cf-miRNAs o'r fath yn cael eu trosglwyddo i'r system cylchrediad gwaed ifanc, gallai rhai cf-miRNAs sbarduno dirywiad sy'n gysylltiedig â heneiddio a gallent achosi heneiddio cynamserol ar yr ochr ifanc. Mae Cf-miRNAs sydd wedi'u cynyddu'n sylweddol mewn gwaed oedrannus yn cynrychioli ymgeiswyr y bydd angen dadansoddiad mecanistig manwl arnynt i ddeall ac atal heneiddio.
I gloi, mae ein hastudiaeth gyfredol wedi darparu mewnwelediadau newydd i cf-miRNAs fel moleciwlau sy'n gysylltiedig ag oedran, ac wedi datgelu cyfeiriad ymchwil newydd i egluro'r berthynas rhwng heneiddio a RNAs swyddogaethol di-gell, gan gynnwys cf-miRNAs.
Daw'r erthygl hon o BIOLEG GYFATHREBU|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio
