Mae MiR-214 yn lleddfu Anaf Acíwt i'r Arennau a achosir gan Sepsis Trwy Awtophagi a reoleiddir gan PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
Haniaethol. Mae astudiaethau blaenorol wedi awgrymu bod straen ocsideiddiol ac awtophagy yn arwain at acíwtanaf i'r arennau (AKI) yn ystod sepsis ac mae microRNA (miR)-214 yn chwarae rhan hanfodol wrth amddiffynarennauyn destun straen ocsideiddiol. Nod yr astudiaeth bresennol oedd profi a yw ad-amddiffyniad miR-214 yn gysylltiedig ag awtoffagi mewn sepsis. Ymchwiliwyd i rôl awtophageg mewn model llygoden o ligation coeg a thyllu (CLP). Defnyddiwyd adwaith cadwyn polymeras meintiol trawsgrifio gwrthdro (RT-qPCR) i ddadansoddi mynegiant miR-214. Strwythur a swyddogaetharennaucynaeafu o'r llygod yn cael eu gwerthuso.Arennaucanfuwyd lefelau awtoffagi gyda blotio imiwn-histocemegol, imiwnfflworoleuol a gorllewinol. Canfuwyd y gallai miR-214 liniaru AKI mewn llygod septig trwy atal lefel yarenawtophagy. At hynny, roedd miR-214 yn atal awtophagy trwy dawelu mynegiant PTEN yn yarenmeinweoedd llygod septig. Nododd y canfyddiadau hyn fod miR-214 wedi lleddfu AKI a achosir gan CLP trwy leihau straen ocsideiddiol ac atal awtophagi trwy reoleiddio'r llwybr PTEN / AKT / mTOR.
Geiriau allweddol:microRNA-214, sepsis, anaf acíwt i'r arennau, awtophagi, arennol
Rhagymadrodd Aciwtanaf i'r arennau(AKI) yw un o gymhlethdodau mwyaf cyffredin sepsis ac mae'n digwydd mewn 40-50 y cant o gleifion septig, gyda chyfradd marwolaethau mor uchel â 60 y cant (1). Fodd bynnag, mae pathogenesis AKI a achosir gan sepsis yn parhau i fod yn aneglur. Adroddwyd bod awtophagy yn chwarae rhan allweddol mewn AKI a achosir gan sepsis ac mae atal awtophag yn arwain at ddatblygiad AKI yn ystod sepsis (2,3). Mae astudiaethau blaenorol (4,5) wedi cadarnhau bod sepsis yn sbarduno autophagy mewn organau lluosog, gan gynnwys yaren(6) a phrosesau awtoffagic yn ymwneud â chael gwared ar mitocondria difrodi a straen ocsideiddiol (7). Fodd bynnag, gall awtophagi gormodol achosi marwolaeth gell ddieisiau a niweidiol (8). Felly, lefel gymedrol o awtophagi yw'r allwedd i leihau AKI a achosir gan sepsis. Mae astudiaethau blaenorol wedi nodi bod miR-214 yn lleddfu AKI a achosir gan ischemia-atlifiad trwy atal apoptosis (9) a miR-214 yn atal straen ocsideiddiol mewn neffropathi diabetig trwy'r llwybr signalau rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) / AKT / mTOR (10). Canfu'r astudiaeth bresennol y gall miR-214 wanhau camweithrediad myocardaidd a achosir gan sepsis mewn llygod trwy atal awtoffagi (11). Fodd bynnag, mae angen egluro a all miR-214 liniaru AKI a achosir gan sepsis. Yn yr astudiaeth bresennol, rhagdybiwyd bod miR-214 yn gwanhau AKI a achosir gan CLP trwy leihau straen ocsideiddiol ac atal awtophagi trwy reoleiddio'r llwybr PTEN / AKT / mTOR.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR ARREN/ARENAU
Defnyddiau a dulliau
Anifeiliaid.Defnyddiwyd cyfanswm o 100 o lygod gwrywaidd Kunming (pwysau, 20.40 ± 2.92 g; oed, 6-8 wythnos) a ddarparwyd gan Ganolfan Anifeiliaid Labordy Meddygol Prifysgol Feddygol Hebei (Shijiazhuang, Tsieina) yn yr astudiaeth bresennol. Roedd pob llygod wedi ymgynefino â chylch golau/tywyll 12-h ar 24˚C gyda 50 y cant o leithder a rhoddwyd mynediad am ddim i fwyd a dŵr iddynt yn Fwy na neu'n hafal i 1 wythnos cyn yr arbrofion. Perfformiwyd yr holl weithdrefnau arbrofol yn unol â chanllawiau'r Sefydliad Cenedlaethol dros Iechyd (Cyhoeddiad NIH Rhif 85-23, adolygwyd 1996) a chymeradwyaeth gan Bwyllgorau Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Ysbyty Canolog Cangzhou (cymeradwyaeth rhif. 2017-020- 01). Perfformiwyd pob meddygfa o dan anesthesia a gwnaethpwyd pob ymdrech i leihau dioddefaint.
Cecal ligation a thyllu (CLP).Perfformiwyd CLP ar lygod i greu model sepsis murine, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (12). Yn dilyn anestheteiddio trwy fewnanadlu isoflurane (wedi'i achosi ar 3 y cant a'i gynnal ar 0.5 y cant), torrwyd toriad llinell ganol o 1 cm. Roedd y cecum agored (pellter 1 cm o'r diwedd) wedi'i glymu â dau dyllu gan ddefnyddio nodwydd 23-medr. Roedd y cecum yn allwthio ychydig bach o feces yn ysgafn ac fe'i gosodwyd yn ôl yn ei safle anatomegol. Roedd wal yr abdomen wedi'i phwytho mewn haenau â braid sidan 3‑0. Yn dilyn y driniaeth, chwistrellwyd 1 ml o 0.9 y cant o halwynog yn isgroenol. Roedd y llygod yn cael mynediad am ddim i ddŵr yn unig. Roedd llygod model Sham yn cael eu gweithredu yn yr un modd â'r model CLP heb CLP.
Dyluniad arbrofol. Cafodd llygod (n{0}} ar gyfer llawdriniaeth ffug a CLP) eu neilltuo ar hap i saith grŵp: grŵp Sham, grŵp CLP, adenovirws (Ad) - protein fflwroleuol gwyrdd (GFP) ynghyd â grŵp CLP, grŵp Ad-miR-214 ynghyd â grŵp CLP , gwrth-miR-214 ynghyd â grŵp CLP, atalydd PTEN ynghyd â grŵp CLP ac atalydd Ad-miR-214 ynghyd ag atalydd PTEN ynghyd â grŵp CLP. Amlygwyd llygod y grŵp Sham i'r un driniaeth ond heb glymu na thyllu'r cecum. Roedd llygod yn y grwpiau eraill yn derbyn ligation cecal a thrydylliad. Anestheteiddiwyd pob llygod yn gyflym gan fewnanadliad isoflurane i gasglu gwaed, wrin aarensamplau 24 awr ar ôl y driniaeth ddiwethaf.
Ad-miR-214 wedi'i gyfryngu gan adenofirws, gwrth-miR-214, neu Ad-GFPtrosglwyddo genynnau in vivo a chwistrelliad atalydd PTEN. Dosbarthwyd Ad-miR-214, gwrth-miR-214, neu Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) i geudod abdomen llygod 4 diwrnod cyn CLP. Yn fyr, anestheteiddiwyd llygod gan anadliad isoflurane. Rhoddwyd cathetr yn cynnwys 200 µl o adenovirws (2x1011 pfu, yn mynegi miR-214, gwrth-miR-214, neu Ad-GFP) i lygod arferol trwy chwistrelliad mewnperitoneol. Rhoddwyd yr atalydd PTEN (VO-OHpic, intraperitoneal, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) i lygod CLP a oedd wedi derbyn gwrth-miR-214 trwy chwistrelliad mewnperitoneol ar un dos o 10 µg / kg 30 min cyn rhoi adenovirws .
Asesiad o swyddogaeth yr arennau. Cynaeafwyd samplau gwaed o galon llygod, ac yna allgyrchiad (ar dymheredd ystafell am 15 munud ar 3,000 xg) ar gyfer casglu serwm. Pennwyd lefelau serwm nitrogen wrea gwaed (BUN) a creatinin serwm (Cr) gan ddefnyddio dadansoddwr awtomatig Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). Defnyddiwyd ELISA i ddadansoddi lefelau oanaf i'r arennaumoleciwl-1 (KIM-1; cath. rhif. RKM100; R&D Systems, Inc.) a lipocalin cysylltiedig â neutrophil gelatinase (NGAL; cath. rhif. DY3508; R&D Systems, Inc.) mewn samplau wrin.
Assay ar gyfer llid serwm cytocine.Archwiliwyd Serum TNF- (cath. rhif H052) ac IL-6 (cat. rhif H007) gan ddefnyddio pecynnau ELISA masnachol (Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.Mesur marcwyr straen ocsideiddiol. Defnyddiwyd y pecyn assay cyfatebol (Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng, Nanjing, Tsieina) i fesur lefelau malondialdehyde (MDA) a phrofi gweithgaredd superoxide dismutase (SOD) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Histoleg a sgôr anafiadau tiwbaidd. Darostyngwyd pob llygodarendarlifiad o dan anesthesia 24 awr ar ôl CLP. Mae'rarengosodwyd sbesimenau mewn paraformaldehyd 4 y cant am 72 h ar 4˚C. Yna cafodd y samplau meinwe eu dadhydradu mewn cyfres raddedig o hydoddiannau ethanol, wedi'u hymgorffori mewn darnau paraffin a thoriadau 4-µm. Torrwyd adrannau (4 µm) gan ddefnyddio microtome a staeniwyd y darnau meinwe â hematocsilin (5 munud) ac eosin (1 munud) ar dymheredd ystafell ar gyfer archwiliad histolegol. Cafodd y sleidiau eu gwerthuso a'u graddio gan ddefnyddio microsgop (BX51, Olympus Corporation).Arennoltissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 y cant (13).
Microsgopeg electron trawsyrru (TEM).Ffresarennaueu golchi mewn halwynog byffer ffosffad, a'u torri'n giwbiau 1 mm a'u gosod yn olynol mewn glutaraldehyde 2.5 y cant am 24 h ar 4˚C. Cafodd yr adrannau eu trochi mewn 1 y cant o osmium tetroxide am 2 h ar 4˚C, wedi'u dadhydradu mewn ethanol graddedig a'u hymgorffori mewn epoxyresin. Yn olaf, dyblwyd yr adrannau ultrathin (60 nm) wedi'u staenio ag asetad uranyl a sitrad plwm ar 20˚C am 60 min. Perfformiwyd yr arsylwi ar ficrosgop electron trawsyrru (Tecnai; Hitachi, Ltd.) ar 80 kV gan ddefnyddio Electron Microsgopeg Film 4489 (sylfaen trwchus ESTAR; Kodak).
Imiwnohistocemeg (IHC).Ffresarengosodwyd meinweoedd mewn paraformaldehyd 4 y cant (am 72 h ar 4˚C) a'u hymgorffori mewn paraffin. Cafodd sbesimenau eu torri'n adrannau 4 µm-trwch a'u dadbaraffinio mewn sylene. Ar ôl golchi darnau meinwe â PBS, cawsant eu berwi mewn byffer citrad 10 mM (pH 6.0) am 4 munud ar gyfer adalw antigen ac yna eu rhwystro â serwm gafr 10 y cant yn PBS ar dymheredd ystafell am 1 h. Ychwanegwyd y gwrthgorff cynradd (gwrth-LC3B; 1:400; cath. rhif 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) yn unol â'r cyfarwyddiadau a'i ddeor ar 4˚C am 12 h. Ychwanegwyd y gwrthgorff eilaidd (HRP gwrth-rabbit gafr; 1:2,000; cath. rhif BS13278; Bioworld Technology, Inc.) a'i ddeor ar dymheredd ystafell am 10 munud. Ychwanegwyd DAB (100 µl) a'i wrth-staenio am 5 munud gyda'r staenio a welwyd o dan ficrosgop ysgafn (Model CX31-P; Olympus Corporation). Pennwyd dwyster y staenio positif, a oedd yn ymddangos yn frown, gan ddefnyddio meddalwedd dadansoddi delwedd Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). Cyfrifwyd y dwysedd optegol annatod (IOD) i gynrychioli'r dwyster. Cynyddodd gwerthoedd IOD wrth i fynegiant protein gynyddu.
Trawsgrifio gwrthdro-meintiol(RT‑q) PCR. Tynnwyd cyfanswm RNA omeinwe arennauyn dilyn sefydlu'r model gan ddefnyddio adweithydd TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Yn ôl cyfarwyddiadau pecyn trawsgrifio cefn TaqMan (cat. rhif. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), trawsgrifiwyd RNA o chwith yn cDNA. Defnyddiwyd yr amodau thermogylchu canlynol (miR-214): Dadnatureiddio cychwynnol ar 95˚C am 5 munud; yna 40 cylch o ddadnatureiddio ar 95˚C am 30 eiliad, anelio ar 60˚C am 30 eiliad ac elongation ar 72˚C am 30 eiliad. Perfformiwyd RT-qPCR gan ddefnyddio System Canfod Dilyniant Prism 7500 ABI (PerkinElmer, Inc.) a phecyn PCR Gwyrdd SYBR safonol (Gwyddor Bywyd Toyobo). Defnyddiwyd U6 fel y rheolaeth fewnol ar gyfer miR-214. Roedd y dilyniannau preimio fel a ganlyn: miR-214, ymlaen, 5'-AGCATACAGCAGGCACAGAC-3' a gwrthdroi, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, ymlaen, 5'‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3' a chefn, 5'‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3'. Cafodd yr arbrofion hyn eu hailadrodd chwe gwaith. Dadansoddwyd canlyniadau gan ddefnyddio'r dull 2-ΔΔCq (14). Gwerthuswyd lefelau mynegiant mRNA LC3, p62, PTEN, AKT a mTOR trwy RT-qPCR. Gyda -actin fel cyfeiriad mewnol o'r genynnau hyn, defnyddiwyd y 2-ΔΔCq i fesur mynegiant cymharol genynnau targed. Cafodd y dilyniannau paent preimio a ddangosir yn Nhabl I eu syntheseiddio gan Sangon Biotech Co., Ltd.
Blotio gorllewinol. Arennaucymysgwyd meinwe â lysate RIPA (Sefydliad Biotechnoleg Beyotime) i wneud y homogenad a rhoddwyd y gorau i lysis pan na welwyd meinwe gweladwy. Cafodd y samplau eu centrifugio ar 13,000 xg am 10 munud ar -4˚C a chafodd y supernatant ei adennill ar gyfer y dadansoddiad blotiau gorllewinol. Yn gryno, pennwyd crynodiadau protein gan ddefnyddio pecyn assay protein micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Gwahanwyd samplau protein (80 µg y sampl) trwy leihau electrofforesis dodecyl sylffad-polyacrylamidegel sodiwm 12 y cant ac yna eu trosglwyddo i bilenni polyvinylidene difluoride ar 4˚C dros nos. Trosglwyddwyd proteinau wedi'u gwahanu i bilenni PVDF. Yn dilyn blocio mewn llaeth sgim 5 y cant ar dymheredd ystafell am 2 awr, deorwyd pilenni dros nos (ar 4˚C) gyda gwrthgyrff cynradd. Defnyddiwyd y gwrthgyrff cynradd canlynol (holl Cell Signaling Technology, Inc.): Cadwyn ysgafn 3B (1:1,000; cath. rhif 4412), t62 (1:1,000; cath . rhif 4412), Gwrth-PTEN (1:1,000; cath. rhif 9188), gwrth-ffosfforyleiddiad (p)-AKT (Ser473) (1:1,000; cath . rhif 4060), gwrth-AKT (1:1,000; cath. rhif 9272), gwrth-p‑mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cath. na . 5536), gwrth-mTOR (1:1,000; cath. rhif 2972) a -actin (1:2,000; cath. rhif 4970). Ar ôl golchi, deorwyd y pilenni (ar dymheredd ystafell am 2 h) â'r gwrthgyrff eilaidd gwrth-gwningen cyfun HRP-cyfun (1:3,{{{{000); cath. rhif A0208; Sefydliad Biotechnoleg Beyotime). Canfuwyd bandiau protein gydag Immobilon Western (MilliporeSigma) a'u dadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd Total-Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). Cafodd mynegiant protein ei normaleiddio i -actin.
Dadansoddiad ystadegol. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio'r GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Cyflwynwyd yr holl ddata fel modd ± gwyriad safonol neu ganolrifau (ystodau rhyngchwartel) ar gyfer newidynnau parhaus, yn dibynnu ar eu dosraniadau. Cymharwyd nodweddion a chanlyniadau gwaelodlin gan ddefnyddio ANOVA un ffordd ac yna prawf posthoc Tukey, neu brawf Kruskal-Wallis ac yna prawf Dunn fel y bo'n briodol. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Canlyniadau
Pwynt amser 24 h ar ôl CLP. Mae astudiaethau blaenorol wedi nodi (6,15,16) bod dadansoddiad biocemegol (hy, LC3 a t62) yn datgelu bod fflwcs awtophagi yn cael ei atal gyda dilyniant sepsis yn dilyn 6-8 h o CLP. Yn yr astudiaeth bresennol, mae nifer yr autolysosomau yn yarencynyddodd nifer y llygod a gafodd eu trin â CLP o fewn 24 awr yn dilyn llawdriniaeth. Yn ogystal, mae'r dadansoddiad o farcwyr oanaf i'r arennaudangos hynnyswyddogaeth arennolwedi'i ddifrodi'n fwyaf difrifol 24 awr ar ôl CLP. Felly, dewiswyd y pwynt amser 24 h ar ôl CLP ar gyfer yr arbrofion canlynol.
Effaith reoleiddiol ar miR-214 mewn meinweoedd arennau. Defnyddiwyd dadansoddiad RT-qPCR i ganfod mynegiant miR-214 mewn llygod wedi'u trin â CLP. Canfuwyd bod mynegiant miR-214 wedi'i uwchreoleiddio ychydig yn yarenmeinweoedd yn dilyn llawdriniaeth CLP 24 h, o gymharu â’r grŵp ffug (1.47-plyg, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">arenmeinwe, o'i gymharu â'r grŵp ffug (y ddau P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
BYDD CISTANCHE YN GWELLA METHIANT YR AREN/ARENAU
Effaith miR-214 ar gamweithrediad arennol mewn llygod septig.Aberthwyd pob llygod i gasglu gwaed, wrin aarensamplau 24 awr ar ôl llawdriniaeth CLP. Mae BUN a Cr yn ddangosyddion pwysig o ddifrifoldebarennolnam (17). At hynny, mae NGAL a KIM-1 wedi'u nodi fel biofarcwyr penodol oanaf i'r arennauac y mae eu hymadrodd cynyddol yn gysylltiedig â boreuarennolanaf tiwbaidd yn AKI (17). Fel y dangosir yn Ffig. 2A-D, cynyddwyd lefelau BUN, Cr, KIM-1 a NGAL yn sylweddol yn dilyn llawdriniaeth CLP o gymharu â'r grŵp ffug. Fodd bynnag, gostyngodd Ad-miR-214 lefelau BUN, Cr, KIM-1 a NGAL yn sylweddol o gymharu â'r grŵp CLP (pob un P.<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">swyddogaeth yr arennauparamedrau. Fodd bynnag, yn dilyn cyn-driniaeth ag atalydd PTEN, gwellwyd effeithiau amddiffyn Ad-miR-214. Mae'r canlyniadau'n dangos bod miR-214 yn gwanhau camweithrediad yr arennau mewn llygod septig.
Effaith miR-214 ar lid arennol a straen ocsideiddiol.Fel y dangosir yn Ffig. 3A a B, cododd CLP lefelau TNF- ac IL-6 yn sylweddol, tra gostyngodd Ad-miR-214 lefelau'r marcwyr hyn yn sylweddol. O'i gymharu â'r
Effaith miR-214 ar awtophagi arennol mewn llygod septig.Archwiliodd yr astudiaeth bresennol y newidiadau yn LC3 ynarenmeinweoedd trwy staenio IHC. Fel y dangosir yn Ffig. 6, cynyddodd dwyster LC3 staenio positif yn sylweddol yn y grŵp CLP o'i gymharu â'r grŵp ffug (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
Mae miR-214 yn actifadu'r llwybr AKT / mTOR i atalawtoffagi drwy dawelu PTEN ym meinweoedd yr arennau.Effaith CLP ar awtophagi mewnarenymchwiliwyd i feinweoedd trwy asesu lefelau LC3-II/I a t62. Mae llwybr signalau PTEN/AKT/mTOR yn chwarae rhan bwysig mewn awtophagi (18). Er mwyn ymchwilio i effaith miR-214 ar y llwybr PTEN-AKT/mTOR, dadansoddwyd lefelau protein LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR a PTEN trwy blotio gorllewinol a RT- qPCR anal- ysis. Fel y dangosir yn Ffig. 7A-C, mae'r proteinau hyn yn cael eu haddasu'n gyflym, gyda chynnydd yn y gyfradd LC3-II/LC3-I, a gostyngiad yn lefelau p62 (y ddau P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">aren tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Dangosodd y canlyniadau hyn fod CLP wedi achosi awtophagi, a gallai gorfynegiant miR-214 ei atal yn rhannol.
Fel y dangosir yn Ffig. 7A a D-F, mae lefel mynegiant PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">aren tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod CLP yn cymellarenawtophagi meinwe trwy atal y llwybr AKT/mTOR. Fe wnaeth Ad-miR-214 actifadu llwybr AKT/mTOR trwy dawelu PTEN i mewnarenmeinweoedd. Fodd bynnag, o'i gymharu â'r grŵp CLP, nid oedd gwrth-miR-214 yn atal mynegiant mTOR yn sylweddol. Felly, defnyddiwyd RT-qPCR ymhellach i bennu mynegiant mRNA genynnau sy'n gysylltiedig â llwybr signalau PTEN / AKT / mTOR. Yn ôl canlyniadau RT-qPCR (Ffig. 8), o gymharu â'r grŵp Sham, cynyddwyd lefelau mynegiant mRNA p62, LC3 a PTEN yn sylweddol, tra gostyngwyd mynegiant mRNA AKT a mTOR yn y grŵp CLP. O'i gymharu â'r grŵp CLP, yr Ad-miR-214, PTEN
Roedd atalydd ac Ad-miR-214 ynghyd â grwpiau atalyddion PTEN yn dangos mynegiant mRNA gostyngol o LC3 a PTEN, ond mwy o fynegiant mRNA o p62, AKT a mTOR (pob P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Felly, gall effaith t62 ar awtophagi ddigwydd ar y lefel drawsgrifiadol yn hytrach nag ar y lefel ôl-drawsysgrifol. Dangosodd y canlyniadau presennol fod miR-214 yn is-reoleiddio mynegiant PTEN ac wedi actifadu llwybr signalau AKT/mTOR.
Trafodaeth
Canfu'r astudiaeth bresennol fod awtophagi gormodol yn niweidiol iswyddogaeth arennolmewn llygod septig. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod miR-214 yn gysylltiedig â mwy o amlhau, metastasis, goresgyniad a swyddogaethau fel oncogen ar gyfer celloedd a meinweoedd (19-22). Mae astudiaethau'n adrodd bod miR-214 yn gwasanaethu rôl amddiffynnol yn erbyn AKI trwy wanhau apoptosis, straen ocsideiddiol a ffactorau llidiol is-reoleiddio (21,23). Archwiliodd yr astudiaeth bresennol ymhellach y mecanweithiau sy'n sail i effaith amddiffynnol miR-214 ar AKI a achosir gan sepsis trwy ganolbwyntio ar gyfranogiad posibl miR-214 wrth fodiwleiddio awtophagi. Dangosodd y canlyniadau bod straen ocsideiddiol yn digwydd yn yarenar ôl rhoi llawdriniaeth CLP. Yn y cyfamser, mae activation autophagy yn digwydd yn yaren.LC3 II/I uchel a gostyngiad o t62 yn yarenarsylwyd ar ôl triniaeth gyda llawdriniaeth CLP. Yn ôl y disgwyl, gwanhaodd gorfynegiant miR-214 yn sylweddolarenanafiadau patholegol aarencamweithrediad a achosir gan sepsis. Fodd bynnag, roedd ataliad miR-214 yn dangos tuedd gyferbyniol i ad-amddiffyniad. Yn ogystal, cafodd effaith amddiffyn Ad-miR-214 ei wella gan atalydd PTEN.
Mewn septigaren, mae llid gormodol yn cyd-fynd â chynnydd enfawr yn y cynhyrchiad ROS ac mae nifer fawr o ROS yn sbarduno newidiadau mewn strwythur mitocondriaidd ac yn amharu ar swyddogaeth mitocondriaidd, sy'n achosi i'r corff fynd i mewn i gylchred dieflig sy'n gwaethyguarendifrod (24,25). Felly, gall straen ocsideiddiol fod yn un o brif fecanweithiau patholegol AKI a achosir gan sepsis. Darparodd yr astudiaeth bresennol dystiolaeth bellach yn dangos straen ocsideiddiol gormodol, a nodwyd gan gynnydd mewn cynhyrchiant MDA a llai o weithgaredd SOD yn yarenmeinweoedd yn dilyn llawdriniaeth CLP. Ar ben hynny, canfuwyd y gallai gorfynegiant miR-214 amddiffyn yarenyn erbyn anaf ocsideiddiol a achosir gan CLP, sy'n ymwneud ag ataliad awtoffagic. Mae hyn yn gyson â'r astudiaethau blaenorol bod miR-214 yn amddiffyn amrywiol gelloedd a meinweoedd rhag straen ocsideiddiol (26,27).
Mae awtophagi yn gweithredu fel 'cleddyf dwyfin' yn natblygiad sepsis: Gall awtophagi gwaelodol gael effeithiau amddiffynnol trwy gael gwared ar broteinau ocsideiddiol gwenwynig, ond gall awtophagi gormodol arwain at farwolaeth cellog awtoffagig o dan straen difrifol, fel ffrwydrad ROS (28,29) . Dangoswyd bod awtoffagi yn cael ei actifadu i ddechrau mewn sepsis, ac yna cam dilynol o gamweithrediad oherwydd marwolaeth celloedd awtoffagig (30), sy'n gwaethygu anaf ocsideiddiol a achosir gan sepsis. Yn yr astudiaeth bresennol, dangosodd atalydd PTEN neu orfynegiant o miR-214 amddiffyniad adfywiad gwrthocsidiol mewn llygod wedi'u trin â CLP. Fodd bynnag, roedd ataliad miR-214 yn dangos tuedd gyferbyniol i ad-amddiffyniad gwrthocsidiol. Felly gall awtoffagy gormodol neu annigonol achosiniwed i'r arennau; mae'r ddau yn gamaddasol ac yn y pen draw yn ysgogi marwolaeth celloedd. Felly, cadw lefelau cymedrol o awtoffagi yw'r allwedd i wanhau anaf ocsideiddiol mewn cyflwr septig.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA POEN YN YR AREN/ARENIAD
Mae tystiolaeth gronnus wedi nodi bod miR-214 yn atal awtoffagi mewn amrywiol gelloedd a meinweoedd (31-33). Yn yr astudiaeth bresennol, canfuwyd bod gorfynegiant miR-214 yn atal awtophag a achosir gan CLP mewnmeinweoedd yr arennau,fel y nodir gan y newidiadau mewn marcwyr protein, megis LC3-II/I a t62. At hynny, dangosodd y canlyniadau fod gorfynegiant miR-214 wedi gwanhau anaf ocsideiddiol a achosir gan CLP trwy atal awtophagi gormodol. Ymchwiliodd yr astudiaeth bresennol hefyd i'r mecanweithiau moleciwlaidd y mae miR-214 yn modiwleiddio trwyddyntarenawtoffagi mewn AKI a achosir gan sepsis. Mae PTEN/AKT/mTOR yn llwybr signalau pwysig sy'n rheoleiddioarenawtoffagi (34,35) ac sy'n gwasanaethu rôl allweddol mewn AKI a achosir gan sepsis, ac mae PTEN yn atalydd negyddol llwybr signalau PI3K / AKT / mTOR. Nododd astudiaethau blaenorol y gall miR-214 reoleiddio awtophagi trwy'r llwybr signalau PI3K / AKT / mTOR mewn modelau amrywiol (36-38). Canfu Ma et al (39) y gall miR-214 reoleiddio awtophagi mewn arennau diabetig i lawr. Felly, rhagdybiwyd y gallai effeithiau miR-214 ar AKI a achosir gan CLP fod yn rhan o reoleiddio'r llwybr PTEN / AKT / mTOR. Yn nodedig, dangosodd canlyniadau'r astudiaeth bresennol fod llawdriniaeth CLP wedi codi lefelau PTEN yn sylweddol ond wedi gostwng lefelau p-AKT a p-mTOR, gan nodi bod llawdriniaeth CLP wedi anactifadu'r llwybr AKT/mTOR. Yn ogystal, mae gorfynegiant miR-214 wedi ysgogi llwybr AKT/mTOR trwy dawelu PTEN mewn awtophag a achosir gan CLP mewnarenmeinweoedd. Fodd bynnag, nid oedd gwrth-miR-214 yn atal mynegiant mTOR yn sylweddol mewn dadansoddiadau blot gorllewinol. Felly, defnyddiwyd RT-qPCR ymhellach i bennu mynegiant mRNA genynnau sy'n gysylltiedig â llwybr signalau PTEN / AKT / mTOR. Nododd yr astudiaeth bresennol fod miR-214 yn is-reoleiddio mynegiant PTEN ac wedi actifadu llwybr signalau AKT/mTOR i atal awtophagi. Fodd bynnag, dylid cynnal astudiaethau cynhwysfawr pellach i gael manylion ychwanegol yn ymwneud â mecanwaith yarenawtoffagi mewn cyflwr septig.
I gloi, awgrymodd canlyniadau'r astudiaeth bresennol fod miR-214 yn cyflawni rôl amddiffynnol yn erbyn sepsis a achosiranaf i'r arennautrwy leihau straen ocsideiddiol ac atal awtoffagi trwy reoleiddio'r llwybr PTEN / AKT / mTOR. Roedd y canfyddiadau presennol yn awgrymu y gallai miR-214 fod yn darged therapiwtig posibl ar gyfer AKI a achosir gan sepsis. Fodd bynnag, roedd yr astudiaeth bresennol yn defnyddio llygod 6-8 wythnos oed, felly mae angen ymchwil pellach ar fecanwaith miR-214 mewn llygod oedolion.