Clonio Moleciwlaidd A Nodweddion Biocemegol Coumarin Newydd Glycosyltransferase CtUGT1 O Cistanche Tubulosa

am ragor o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

ABSENOLDEB

Mae CDU-glycosyltransferases (UGTs) yn deulu pwysig ac amrywiol o ensymau sy'n ymwneud â biosynthesis metabolyn eilaidd. Coumarin yw un o'r sgerbydau mwyaf cyffredin o gynhyrchion naturiol gyda gweithgareddau ffarmacolegol ymgeisydd. Fodd bynnag, hyd yn hyn, roedd llawer o GTs a adroddwyd o blanhigion yn cydnabod yn bennaf flavonoidau fel derbynwyr siwgr. Dim ond GTs cyfyngedig a allai gataleiddio glycosyleiddiad coumarinau. Yn yr astudiaeth hon, cloniwyd UGT newydd oCistanche tubulosa, perlysiau Tsieineaidd tonig traddodiadol gwerthfawr, sy'n doreithiog â glycosidau amrywiol megis glycosidau ffenylethanoid, glycosidau lignan, a glycosidau iridoid. Dangosodd aliniad dilyniant a dadansoddiad ffylogenetig hynnyCtUGT1yn ffylogenetig bell oddi wrth y rhan fwyaf o'r UGTs flavonoid a adroddwyd ac yn gyfagos i UGTs ffenylpropanoid. Er bod profion ensym in vitro helaeth wedi canfodCtUGT1nad oeddent yn ymwneud â biosynthesis glycosidau bioactif ynCistanche tubulosa, gallai gataleiddio glucosylation coumarins umbelliferone 1, esculetin 2, a hymecromone 3 mewn cnwd sylweddol. Nodwyd y cynhyrchion glycosylaidd o'u cymharu â'r safonau cyfeirio neu sbectrosgopeg NMR, ac roedd y canlyniadau'n nodi hynnyCtUGT1yn gallu cataleiddio glwcosyliad coumarinau hydrocsyl yn y safle C7- OH yn reg-benodol. Y gweddillion allweddol a benderfynoddCtUGT1's trafodwyd gweithgaredd ymhellach yn seiliedig ar fodelu homoleg a dadansoddiadau tocio moleciwlaidd. Ar y cyd â chanlyniadau mutagenesis a gyfeiriwyd gan y safle, canfuwyd bod H19 yn chwarae rhan anadferadwy fel sail catalysis hanfodol.CtUGT1gellid ei ddefnyddio wrth baratoi'n ensymatig glycosidau coumarin bioactif.

Geiriau allweddol:glycosyltransferases planhigion, glycosidau Coumarin,Cistanche tubulosa, Modelu homoleg, Mutagenesis wedi'i gyfeirio at safle

Cliciwch i cistanche echdynnu budd-daliadau cynnyrch

Rhagymadrodd

Glycosylation yw un o'r mathau addasu strwythur mwyaf cyffredin o gynhyrchion naturiol eilaidd. Gallai glycosyleiddiad newid sefydlogrwydd a/neu hydoddedd yr aglycon, a chyfrannu llawer at amrywiaeth cynhyrchion naturiol/annaturiol oherwydd y mathau lluosog o gyfuniadau. Mewn planhigion, cynhaliwyd yr adweithiau hyn fel arfer gan glycosyltransferases (UGTs) sy'n dibynnu ar wridin diffosffad (UDP), math o ensymau sy'n cataleiddio trosglwyddiad moieties monosacarid o siwgr niwcleotid actifedig i foleciwl derbynydd glycosyl a all fod yn garbohydrad, glycosid, oligosaccharid. , neu polysacarid [1,2]

Hyd yn hyn, mae llawer o enynnau sy'n amgodio UGTs wedi'u hynysu o sawl planhigyn [3]. Digwyddodd y glycosylation yn bennaf mewn grwpiau hydroxyl neu grwpiau carboxyl o ystod eang o gynhyrchion eilaidd, megis flavonoidau [4], ffenylpropanoidau [5], terpenoidau [6], steroidau [7], alcaloidau [8], ac ati. Mae coumarins yn fetabolion ffenylpropanoidau a ddosberthir yn eang mewn llawer o rywogaethau planhigion. Mae coumarinau sy'n digwydd yn naturiol yn aml yn bodoli fel glycoconjugates, ac roedd y deilliadau hyn yn arddangos sbectrwm eang o weithgareddau ffarmacolegol, gan gynnwys gwrthocsidiol [9], gwrthfeirysol [10,11], hepatoprotective [12], gwrthlidiol [13], gwrth-ganser [14] ], gweithgareddau ataliol antimutagenig [15], a cholinesterase (ChE) a monoamine oxidase (MAO) [14,15], ac ati Fodd bynnag, hyd yn hyn, o'i gymharu â'r UGTs flavonoidau a adroddwyd amlaf ac a ymchwiliwyd yn helaeth, dim ond UGTs cyfyngedig oedd adroddwyd ei fod yn gallu trosglwyddo'r moiety siwgr i coumarins [16-18].

Gallai planhigion sy'n gyfoethog mewn glycosidau amrywiol fod yn gronfa genynnau ddelfrydol o UGTs gyda gweithgareddau catalysis newydd. Ar ben hynny, adroddwyd bod gan nifer o UGTs gryn dipyn o amwysedd derbyniol i gataleiddio glycosyleiddiad swbstradau lluosog, ac nid oedd rhai ohonynt hyd yn oed wedi'u gwahanu yn y planhigion [19]. Yn yr erthygl hon, mae glycosyltransferase nofelCtUGT1ei adnabod oCistanche tubulosa, perlysiau meddyginiaethol traddodiadol sy'n doreithiog â glycosidau amrywiol megis glycosidau ffenylethanoid (PhGs), glycosidau lignan, a glycosidau iridoid. Roedd mynegiant heterologaidd a nodweddion swyddogaeth yn dangos er eu bod yn ailgyfunolCtUGT1nad oedd yn ymwneud â biosynthesis y glycosidau hyn ynCistanche tubulosa, gall gataleiddio glucosylation coumarins hydroxyl, a digwyddodd yr adwaith regiospecifically ar y 7- sefyllfa OH o coumarins umbelliferone 1, yn cynyddu 2, a hymecromone 3 i gynhyrchu tri sgimio cyfansoddion gweithredol ffarmacolegol (1a), cichorin (2a) , a 4-methylumbelliferyl glucoside (3a) gyda chynnyrch sylweddol, yn y drefn honno. Yn ogystal, gallai swbstrad benzophenone 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), genistein swbstrad isoflavone (5), a swbstrad anthraquinone aloe-emodin (6) hefyd gael ei dderbyn ganCtUGT1. Priodweddau catalytig a gweddillion allweddol sy'n tanlinellu gallu catalysisCtUGT1eu gwerthuso hefyd yn seiliedig ar fodelu homoleg, dadansoddiad AutoDock, a mutagenesis wedi'i gyfeirio at safle.

2. Arbrofol

2.1. Deunydd planhigion a chemegau

Cistanche tubulosaa ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon ei gasglu o ardaloedd anialwch yn Hetian, Xinjiang rhanbarthau ymreolaethol. Cadarnhawyd eu hunaniaeth fotanegol gan yr Athro Pengfei Tu ym Mhrifysgol Peking. Prynwyd y coumarinau a'r swbstradau eraill a brofwyd yn yr astudiaeth hon gan Sigma-Aldrich (St Louis, UDA), Chengdu Push Biotechnology Co, Ltd (Chengdu, China), a Chengdu Biopurify Phytochemicals Co, Ltd (Chengdu, China). ) oni nodir yn wahanol. Prynwyd safonau cyfeirio sgimio (1a) a cichoriin (2a) gan Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Tsieina).

2.2. Clonio moleciwlaidd o CtUGT1 o Cistanche tubulosa

Cyfanswm RNA oCistanche tubulosaei dynnu o'r coesyn cigog gan ddefnyddio Pecyn RNA Planhigion OMEGA (GA, UDA) a'i drawsgrifio o'r chwith i cDNA gyda PrimeScript™ RT reagent Kit (TaKaRa, Japan) gan ddilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Dyluniwyd paent preimio dirywiedig ar gyfer 3′RACE yn seiliedig ar y dilyniannau aminoasid yn y PSPG (Cynnyrch Eilaidd Planhigion Glycosyltransferases) - blwch o glycosyltransferases planhigion. Mae ymhelaethiadau 3′-diwedd a 5′-diwedd oCtUGT1eu cynnal gan ddefnyddio Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, UDA) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr gan ddefnyddio paent preimio (Tabl S1). Mae cDNA hyd llawn yCtUGT1ei chwyddo gan PCR gan ddefnyddio KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japan) gyda pharau preimio genyn-benodol (Tabl S1) o dan yr amodau canlynol: cam dadnatureiddio cychwynnol ar 94 ◦C am 2 funud, ac yna 35 cylch o ddadnatureiddio yn 98 ◦C am 15 s, anelio ar 55 ◦C am 30 s, ac estyniad ar 68 ◦C am 55 s, gyda cham estyniad terfynol yn 68 ◦C am 7 munud. Cafodd yr holl ddarnau DNA a gafwyd eu clonio i fector peasY-Blunt (TransGen Biotech, Tsieina) a'u dilyniannu.

2.3. Aliniad dilyniant a dadansoddiad ffylogenetig

Aliniad dilyniant oCtUGT1gyda glycosyltransferases a adroddwyd (Tabl S2) yn cael ei berfformio gan ddefnyddio pecyn meddalwedd DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Canada). Dadansoddwyd y motiffau a'r parthau gan ddefnyddio offeryn parth cadw (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi). Adeiladwyd y goeden ffylogenetig trwy osod meddalwedd MEGA 7.0.14 cychwyn gan ddefnyddio'r dull ymuno â chymdogion gyda 1000 o atgynyrchiadau bootstrap [20]. Mae'r dilyniant protein wedi'i gyfieithu oCtUGT1wedi'i alinio â'r glycosyltransferases planhigion hysbys a adneuwyd yng nghronfa ddata GenBank NCBI (Tabl S3) gyda ClustalW.

2.4. Mynegiant heterologaidd a phuro protein o CtUGT1 yn Escherichia coli

Mae'r rhanbarth codio oCtUGT1wedi'i chwyddo gyda BamH I ac Nid I fel safleoedd cyfyngu gan ddefnyddio paent preimio a ddangosir yn Nhabl S1. Cynhaliwyd adweithiau PCR gan ddefnyddio DNA Polymerase KOD-Plus-Neo (TOYOBO, Osaka, Japan). Dilyswyd y dilyniannau a gafwyd trwy glonio i mewn i'r fector pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China). Mae'r cynnyrch ymhelaethu wedi'i gadarnhau oCtUGT1wedyn yn cael ei dreulio a'i is-glonio i mewn i'r mynegiant fector pET-28a( plws ) (Novagen, UDA). Yna cafodd y lluniad wedi'i ddilysu ei drawsnewid yn E. coli Transetta (DE3) i gael y straen ailgyfunol. Cafodd diwylliant dros nos o straen ailgyfunol ei frechu i gyfrwng Luria-Bertani (LB) sy'n cynnwys 50 ug⋅mL− 1 kanamycin a 40 ug⋅mL− 1 cloromycetin ar gymhareb o 1:1{{ 19}}0. Tyfwyd y diwylliannau ar 37 ◦C, 200 rpm nes i werth OD600 gyrraedd 0.4-0.6. Wedi hynny, ychwanegwyd Isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) at grynodiad terfynol o 0.5 mM a thyfwyd y celloedd am 16 h ar 18 ◦C, 180 rpm. Yna pelenni cell eu cynaeafu gan centrifugation (7600 × g, 10 munud, 4 ◦C), ac ail-atal dros dro mewn 3 ml/g clustogi lysis oeri (Data Atodol Nodyn 1), ac yn tarfu gan sonication ar rew. Tynnwyd y malurion cell trwy allgyrchu ar 7600 × g, 4 ◦C am tua 30 munud. Defnyddiwyd colofn Histrap wedi'i chydbwyso ymlaen llaw (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) ar gyfer cromatograffaeth affinedd yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd y protein ailgyfunol ei ddiystyru gan gyfrolau 10 colofn o glustogiad elution (Nodyn Data Atodol 1) yn cynnwys imidazole 250 mM. Dadansoddwyd purdeb protein gan 10 y cant SDS-PAGE. Crynhowyd y protein wedi'i buro gan diwb uwch-hidlo 30 kDa (Sigma-Aldrich, UDA) a'i ddihalwyno gan ddefnyddio colofn PD-10 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) gyda byffer dihalwyno (Nodyn Data Atodol 1). Pennwyd crynodiad protein gan ddull Bradford gan ddefnyddio BSA fel safon.

2.5. Profion gweithgaredd ensymatig a phenodoldeb swbstrad CtUGT1

Ymchwilio i weithgaredd glycosyleiddiadCtUGT1, perfformiwyd profion ensymau mewn cymysgedd adwaith (150 μL) sy'n cynnwys 0.4 mM aglycone, 0.8 mM UDP-glucose (UDPG), a 50 ug o wedi'i buroCtUGT1protein yn y byffer dihalwyno. Cafodd pob adwaith ei ddeor ar 30 ◦C am 12 h a'i derfynu trwy ychwanegu 300 μL o fethanol oer. Cafodd y cymysgeddau eu centrifugio ar 15,000 ×g am 30 munud i gasglu'r uwchnatant ar gyfer dadansoddiadau HPLC-UV/ESI-MS. Roedd tri asesiad cyfochrog yn cael eu cynnal fel mater o drefn ar gyfer pob adwaith. Roedd gan HPLC (Agilent 1260, UDA) synhwyrydd arae deuod a cholofn CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Shiseido, Japan) ar gyfradd llif o 1 mL⋅min− 1, a thymheredd y golofn ei gadw ar 30 ◦C. Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys A (hy, hydoddiant dyfrllyd asid ffurfig 0.1 y cant) a B (hy, acetonitrile). Rhestrwyd y rhaglenni graddiant yn Nhabl S4. Cofnodwyd data HRESI-MS ar system LCMS-IT-TOF, wedi'i ffitio â rhyngwyneb ESI (Shimadzu, Kyoto, Japan) gyda He purdeb uwch-uchel fel y nwy gwrthdrawiad, ac N2 fel y nwy nebulizing. Roedd y paramedrau ffynhonnell ESI optimized fel a ganlyn: cyfradd llif nwy gwain, 1.5 mL⋅min - 1; cyfradd llif nwy ategol, 1.5 mL⋅min− 1; foltedd chwistrellu, 4.5 kV; tymheredd capilari, 200 ◦C. Cofnodwyd y sbectra yn yr ystod 100-1500 m/z ar gyfer dadansoddiad MS sgan llawn.

2.6. Effeithiau amser adweithio, gwerth pH a thymheredd ar actifedd ensymau, ac astudiaethau cinetig o CtUGT1

Effeithiau amser adweithio, gwerth pH, ​​a thymheredd ar actifedd ensymauCtUGT1eu profi gan ddefnyddio UDPG fel rhoddwr siwgr a 3 fel y derbynnydd siwgr yn yr amodau adwaith a ddisgrifir uchod. I ganfod y pH optimaidd, cymharwyd actifedd yr ensymau mewn byffer 100 mM (citrad asid citrig-sodiwm) gyda gwerthoedd pH yn amrywio o 3.0 i 6.{{ 14}}, 10{{20}} byffer mM (KH2PO4-K2HPO4) gyda gwerthoedd pH yn amrywio o 6.0 i 8.{{29} }, byffer 100 mM (Tris-HCl) gyda gwerthoedd pH yn amrywio o 7.0 i 9.0, byffer 100 mM (Na2CO3-NaHCO3) gyda gwerthoedd pH yn amrywio o 9.0 i 11.0. Er mwyn asesu'r tymheredd adwaith gorau posibl, cafodd yr adweithiau eu deor ar dymheredd amrywiol yn amrywio o 0 i 65 ◦C. Gwerthuswyd cyrsiau amser yr adwaith ar 12 pwynt amser gwahanol rhwng 0 a 24 h. Perfformiwyd yr holl arbrofion yn driphlyg. Dadansoddwyd cymysgeddau'r adwaith gan HPLC-MS fel y disgrifir uchod. Ar gyfer astudiaethau cinetig oCtUGT1, cynhaliwyd profion ensymatig mewn cyfrol derfynol o 100 μL yn cynnwys byffer KH2PO 100 mM4-K2HPO4 (pH 8.0), 25 ug o byffer wedi'i buroCtUGT1, 3 mM o UDPG, a chrynodiadau amrywiol (50-3000 μM) o 3. Cynhaliwyd yr adweithiau ar 37 ◦C am 30 munud ac yna eu terfynu gyda methanol rhew-oer 100 μL. Perfformiwyd yr holl adweithiau hyn mewn triphlyg, a gwerthuswyd gweithgaredd ensymau trwy feintioli'r deilliadau glwcosylated cyfatebol. Cyfrifwyd paramedrau cinetig, gan gynnwys cysonyn Michaelis-Menten (Km) a Vmax, trwy ddadansoddiad atchweliad aflinol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism 5.

2.7. Dewisoldeb rhoddwr swbstrad a siwgr o CtUGT1

Archwilio dewisiadau swbstrad oCtUGT1, profwyd cyfanswm o 27 o swbstradau sy'n perthyn i wahanol fathau o strwythurol gan ddefnyddio UDPG fel y rhoddwr. Rhestrwyd eu gwybodaeth gemegol yn Nhabl S5, a dangoswyd eu strwythurau yn Ffigys. S1 ac S2. Ymchwilio i ddetholiad rhoddwyr siwgrCtUGT1, cynhaliwyd profion gan ddefnyddio umbelliferone (1), esculetin (2), hymecromone (3), 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), genistein (5), ac aloe-emodin (6) fel swbstradau gyda UDPG, CDU- N acetyl galactosamine, CDU-galactose, CMC-manose, CDP-ffiwcos, asid galacturonig CDU, CDU-rhamnose fel rhoddwyr siwgr, yn y drefn honno. Perfformiwyd yr holl arbrofion yn driphlyg. Dadansoddwyd cymysgeddau'r adwaith gan HPLC-MS fel y disgrifir uchod.

2.8. Paratoi 4-methylumbelliferyl glucoside (cyfansoddyn 3a) gan CtUGT1

Roedd y cymysgedd adwaith paratoadol yn cynnwys {{0}}.034 mmol swbstrad cyfansawdd 3, 0.04 mmol UDPG, 5 mg puroCtUGT1mewn byffer adwaith 50 mL. Cafodd yr adweithiau eu cynhyrfu'n ysgafn ar yr amodau gorau posibl (100 mM KH2PO4-K2HPO4 gyda pH 8.0; 37 ◦C). Ar ôl deoriad ar 37 ◦C am 24 h, gwahanwyd y supernatant adwaith gan cromatograffaeth golofn gyda resin macroporous (MCI GEL CHP) ar ôl centrifugio ar 12,000 × g am 30 munud. Roedd y cyfnod symudol yn elution graddiant o 100 y cant o ddŵr i 100 y cant methanol. Dadansoddwyd pob ffracsiwn gan HPLC-UV. Ffracsiynau a oedd yn cynnwys dim ond cynhyrchion wedi'u targedu a anweddwyd i sychder o dan bwysau llai a'u nodweddu gan sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear 1H (NMR) a sbectrosgopeg 13C NMR.

2.9. Tocio moleciwlaidd a mwtagenesis wedi'i gyfeirio at y safle o CtUGT1

Mae'r model protein oCtUGT1ei sefydlu trwy ddefnyddio MODEL SWISS [21–25]. Dewiswyd strwythur grisial Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) fel y strwythur templed [26]. Aseswyd y model sefydledig gan VERIFY-3D [27,28]. Defnyddiwyd Auto-Dock Vina ar gyfer astudiaethau tocio moleciwlaidd [29]. Defnyddiwyd strwythur grisial UGT74F2 [30], glycosyltransferase o Arabidopsis thaliana, mewn cymhleth â ligand CDU ac asid salicylic (PDB ID 5U6M) fel y strwythur rheoli ar gyfer poced rhoddwr siwgr a dadansoddiad poced derbynnydd siwgr, yn y drefn honno . Defnyddiwyd y Auto-Dock-Tools 1.5.6 o'r MGLTools (offer Labordy Graffeg Moleciwlaidd) i baratoi'r UDPG rhoddwr siwgr a swbstrad 1, 2 ar gyfer tocio moleciwlaidd. Gosodwyd y cadwyni ochr o weddillion o amgylch y ceudod safle gweithredol yn hyblyg, a gadawyd bondiau ligandau cylchdroi yn rhydd i gylchdroi. Roedd yr ystum uchaf fel y barnwyd gan fodel tocio Vina gyda'r affinedd uchaf (kcat/môl) yn destun dadansoddiad gweledol gan ddefnyddio meddalwedd PyMOL 2.0.

Ar gyfer ymchwiliadau mutagenesis, mae'r dilyniant wedi optimeiddio genyn oCtUGT1(data atodol Nodyn 2) wedi'i syntheseiddio a'i brofi fel y math gwyllt. Mutagenesis a gyfeiriwyd at y safle o'rCtUGT1ei gynnal gan ddefnyddio'r System Mutagenesis Cyflym (TransGen Biotech). Cafodd y mutants eu mwyhau o dempled y genyn wedi'i optimeiddio sydd wedi'i gynnwys yn y pET{0}}fector gan ddefnyddio'r preimwyr penodol a ddangosir yn Nhabl S1. Gwiriwyd y mutants a adeiladwyd gan PCR a dilyniannu cyn eu trawsnewid yn E. coli (DE3) ar gyfer mynegiant heterologaidd. Perfformiwyd puro protein ac adweithiau ensymau a'u dadansoddi fel y disgrifir uchod.

3. Canlyniadau a thrafodaeth

3.1. Clonio cDNA hyd llawn y genyn CtUGT1 oCistanche tubulosa

Cistanche tubulosaMae (L.) (RouCongRong) yn berlysiau meddyginiaethol Tsieineaidd traddodiadol sy'n cynhyrchu amrywiaeth eang o glycosidau naturiol bioactif. Dylai fod nifer sylweddol o enynnau glycosyltransferases newydd yn bodoli yn ei genom. I chwilio am glycosyltransferases newydd gyda gweithgareddau catalysis diddorol, dyluniwyd paent preimio dirywiol ar gyfer 3′-RACE yn seiliedig ar y motiff PSPG wedi'i gadw i glonio UGTs caniataol oCistanche tubulosa. Dadansoddwyd y dilyniant diwedd 3 'a gafwyd ymhellach gan chwyth NCBI a dyluniwyd y paent preimio penodol ar gyfer 5′-RACE yn seiliedig ar y dilyniant a gafwyd. Cafodd y pennau chwyddedig 5′ cDNA a 3′ cDNA ends eu hollti a hyd llawn yCtUGT1dilyniant, gan gynnwys 1739 niwcleotidau, Cafwyd (Ffig. S3) ac a restrir yn Data Atodol Nodyn 3. Yn dilyn hynny, ffrâm darllen agored (ORF) oCtUGT1Canfuwyd gan offer NCBI ORF Finder a chafodd y dilyniant codio 1482 bp ei glonio'n llwyddiannus gan ymhelaethiad RT-PCR gan ddefnyddio paent preimio penodol yn Nhabl S1. Mae'r dilyniant cDNA o CtUGT1 wedi'i gyflwyno i NCBI (Rhif derbyn MW629113).

3.2. Dadansoddiad dilyniant a mynegiant heterologaidd o CtUGT1

Mae'rCtUGT1roedd disgwyl i'r genyn amgodio protein o 493 o weddillion asid amino gyda màs moleciwlaidd amcangyfrifedig o 55.78 kDa. Datgelodd chwyth NCBI fod y dilyniant protein diddwytho oCtUGT1yn rhannu'r hunaniaeth uchaf (76.39 y cant ) ag ensymau tebyg i UGT. Nid yw swyddogaethau biocemegol y math hwn o ensym wedi'u nodweddu'n llawn. Rhagwelir y gallant fod yn rhan o'r broses o addasu planhigion i straen anfiotig. Dangosir aliniad y dilyniannau asid amino o CtUGT1 a glycosyltransferases planhigion eraill yn Ffig. S4.

Daethpwyd o hyd i 44 o weddillion y motiff PSPG, sydd wedi'u cadw'n fawr, yn nherfynell C.CtUGT1. O fewn y PSPG-box, roedd dilyniant peptid o HCgwNS wedi'i leoli yn y 373ain asid amino, sydd wedi'i ganfod mewn 95 y cant o'r holl glycosyltransferases [31]. Gweddill olaf y motiff PSPG oedd glutamine, a nododd fod yr ensym hwn yn tueddu i ddefnyddio UDPG fel ei roddwr siwgr [32] (Ffig. S4). Adeiladwyd y goeden ffylogenetig yn seiliedig ar y dilyniannau polypeptid a ragwelir oCtUGT1a gwahanol fathau o glycosyltransferases tarddiad planhigion a oedd yn ymwneud â biosynthesis amrywiol fetabolion eilaidd. Hyd yn hyn, roedd y rhan fwyaf o'r glycosyltransferases yr adroddwyd amdanynt o blanhigion yn cydnabod flavonoidau fel eu swbstradau, megis y flavone 7-O-glycosyltransferases, flavonoid 3-O-glucosyltransferases, isoflavone 7-O-glycosyltransferases, a glycosyltransferases calcone. Dangosodd canlyniadau dadansoddiad ffylogenetig hynnyCtUGT1heb ei grwpio i'r clâd o GTs flavonoid. Yn lle hynny, mae wedi'i leoli gerllaw UGT74T1 ac UGT74S1 (lignan glycosyltransferases o Linum usitatissimum) ac NtGT2 (coumarin glycosyltransferase o Nicotiana tabacum), a nododd fodCtUGT1Gall fod â rhai gweithgareddau catalysis newydd tuag at swbstradau ffenylpropanoid (Ffig. 1), yn enwedig o ystyried mai dim ond aelodau cyfyngedig sydd wedi'u nodi'n swyddogaethol sy'n perthyn i'r cladau hyn.

Er mwyn datgelu ymhellach ei weithgaredd catalysis, mae'rCtUGT1mynegwyd dilyniant o dan reolaeth hyrwyddwr lac T7 mewn celloedd E. coli Transetta (DE3) fel ei6-brotein ymasiad wedi'i dagio. Yr ailgyfuniad His-taggedCtUGT1wedi'i buro'n effeithlon i homogenedd gan gromatograffeg affinedd Ni-NTA. Roedd pwysau moleciwlaidd y CtUGT1 ailgyfunol puro tua 55 kDa (Ffig. S5), sy'n gyson â'r màs moleciwlaidd a ragwelir.

3.3. Penodoldeb swbstrad derbyn in vitro o CtUGT1

I brofi gweithgaredd glycosylation oCtUGT1, cynhaliwyd profion ensymatig in vitro. Defnyddiwyd UDPG fel rhoddwr siwgr. Dewiswyd derbynwyr siwgr yn seiliedig ar wahanol bryderon. Yn gyntaf, yCtUGT1cloniwyd genyn oCistanche tubulosay mae eu prif gydrannau cemegol yn PhGs. I wirio aCtUGT1yn ymwneud â biosynthesis PhGs, yr aglyconau cyffredin o PhGs ynCistanche tubulosamegis tyrosol (NP1, Ffig. S2) a salidroside (NP2, Ffig. S2) eu dewis yn gyntaf fel swbstradau. Yn anffodus, ni chanfu dadansoddiadau HPLC a HRESI-MS unrhyw gynhyrchion glycosylaidd, a oedd yn nodi hynnyCtUGT1efallai na fyddant yn ymwneud â biosynthesis PhGs.

Yn ail, yn seiliedig ar yr aliniad dilyniant a chanlyniadau dadansoddi ffylogenetig (Ffig. 1),CtUGT1yn gysylltiedig yn ffylogenetig â glycosyltransferases lignanoid a coumarin, a awgrymodd hynnyCtUGT1mae'n debyg ei fod yn glycosyltransferase ffenylpropanoid. I wirio'r rhagfynegiad hwn, profwyd tri swbstrad coumarin 1, 2, a 3 ynghyd ag un swbstrad lignanoid magnolol NP17 fel derbynwyr siwgr, yn y drefn honno. Defnyddiwyd ensymau gwres-anweithredol (100 ◦C, 10 munud) fel rheolaeth negyddol. Ni chanfu dadansoddiad HPLC-HRESI-MS o adweithiau gan ddefnyddio NP17 fel swbstrad unrhyw gynnyrch. Mewn cyferbyniad,CtUGT1dangosodd alluoedd glwcosylation amlwg yn erbyn y swbstradau coumarin a brofwyd (1,2,3). Gan ddefnyddio swbstrad 1 fel enghraifft, fel y dangosir yn Ffig. 2A, cynhyrchwyd uchafbwynt newydd (1a) gyda llai o amser cadw (11.46 mun) o'i gymharu â swbstrad 1 (19.75 mun) ganCtUGT1ar gynnyrch o 37.78 y cant. Mae ei sbectrwm amsugno UV yn cyfateb i 1. Dangosodd sbectrwm HRESI-MS fod brig 1a yn arddangos [M plws H] plws ar m/z 325.1029, ac a [M plws Na] plws ar m/z 347.0710 (calcd. 347.0737 ar gyfer C15H16O8Na ) gyda'r fformiwla ragfynegedig o C15H16O8, a oedd 162 amu yn fwy na'r un o 1 ac yn gyson â fformiwla ddamcaniaethol cynnyrch glucosylated (Ffig. 2A). Yn yr un modd, canfuwyd cynnyrch glucosylated swbstrad 2 (14.21 min, Ffig. 2B) a 3 (21.92 min, Ffig. 2 C) hefyd ar yr amser cadw o 10.85 min a 13.80 min, gyda'r gyfradd trosi o 22.03 y cant a 68.67 y cant , yn y drefn honno. Roedd màs moleciwlaidd y cynhyrchion yn cyfateb yn union i'r màs a gyfrifwyd o gynhyrchion glucosylated, a gadarnhaodd hynnyCtUGT1gallai gataleiddio glwcosyliad cyfansoddion coumarin 1–3 (Tabl 1).

Yn dilyn hynny, o ystyried bod y rhan fwyaf o'r ensymau a adroddwyd yn ddiweddar yn arddangos amleidd-dra catalysis in vitro, er mwyn archwilio sbectrwm swbstrad ymhellachCtUGT1, cynhaliwyd profion ensymau eang tuag at gyfansoddion amrywiol sy'n perthyn i wahanol fathau o gynhyrchion naturiol, gan gynnwys flavonoidau, cyfansoddion ffenolig, coumarins, stilbene, anthraquinones, benzophenone, naphthalene, ac iridoid (Ffig. S1-S2), gan ddefnyddio UDPG fel y rhoddwr siwgr. Canfuwyd y gallai'r swbstrad benzophenone 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), genistein swbstrad isoflavone (5), a swbstrad anthraquinone aloe-emodin (6) hefyd gael ei gataleiddio ganCtUGT1i ffurfio'r cynnyrch glucosylated cyfatebol 4a, 5a, 6a gyda polaredd uwch (Ffig. 3). Dangosodd dadansoddiad HRESI-MS fod brigau ïon y cynhyrchion i gyd 162 amu yn fwy na'r swbstradau, sy'n awgrymu bodCtUGT1gallai gataleiddio glwcosyliad y cyfansoddion hyn i ffurfio eu cynnyrch mono glucoside cyfatebol. Roedd y cyfraddau trosi o 4 , 5 a 6 yn 4.12 y cant , 14.14 y cant a 23.33 y cant , yn y drefn honno ( Tabl 1 ) .

Detholiad y rhoddwr siwgr oCtUGT1archwiliwyd hefyd. Yn ogystal â UDPG, profwyd chwe rhoddwr arall, gan gynnwys UDP-N-acetyl galactosamine, UDP galactose, GDP-mannose, GDP-fucose, asid UDP-galacturonig, a rhamnose CDU, gan ddefnyddio swbstradau 1-6 fel derbynyddion. Dangosodd y canlyniadau hynnyCtUGT1dewiswyd UDPG yn unig fel y rhoddwr siwgr. Ni welwyd unrhyw gynnyrch pan brofwyd siwgrau actifedig eraill (data heb ei ddangos).

3.4. Priodweddau biocemegol a pharamedrau cinetig CtUGT1

Priodweddau biocemegol oCtUGT1ymchwiliwyd iddynt gan ddefnyddio 3 fel derbynnydd siwgr a UDPG fel y rhoddwr siwgr fel y nodir yn Ffig. 4. Gweithgaredd catalysisCtUGT1ei brofi mewn ystod tymheredd o 4-60 ◦C, y gweithgaredd gorau posibl ei ganfod yn 37 ◦ C (Ffig. 4 A). Dangosodd dadansoddiad o'r gweithgaredd ensymau rhwng pH 3.0 a 9.0 fod y gwerth pH optimaidd wedi'i arsylwi ar pH 8.0 (byffer 100 mM KH2PO4-K2HPO4, Ffig. 4C). Cynyddodd cynnyrch y cynnyrch glucosylation 3a yn llinol o fewn 1 h ac roedd y gyfradd twf yn lefelu ar ôl 5 h (Ffig. 4 B). Gwerth Km ymddangosiadolCtUGT1ar gyfer 3 oedd 218.7 ± 7.176 μM, a Vmax oedd 0.0 2255 ± 0.0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1 .

3.5. Paratoi ensymatig ac adnabod strwythurol cynhyrchion glucosylated

Yn seiliedig ar ganlyniadau'r profion ensymau,CtUGT1yn tueddu i fod yn glucosyltransferase penodol a allai gataleiddio glucosylation gwahanol fathau o gynhyrchion naturiol. Crynhowyd gwybodaeth HPLC-HR-MS o'r cynhyrchion yn Nhabl 1. Yn eu plith, roedd swbstradau coumarins yn arddangos cyfradd trosi sylweddol. Dadansoddwyd gweithgaredd yr ensymau yn erbyn cwmarinau ymhellach. Dylid nodi bod pob un o'r tri swbstradau coumarin a brofwyd yn derbyn ganCtUGT1sydd â grŵp hydrocsyl yn y safle C-7, tra bod gan esculetin (2) grŵp hydrocsyl ychwanegol yn y safle C-6. Mae proffil HPLC y cynnyrch glwcosylated o esculetin i'w weld yn Ffig. 2. Dim ond un cynnyrch a arsylwyd, sy'n awgrymu bod yr adwaith glwcosylation regiospecialation wedi digwydd yn y safle C-6 neu C-7. I gadarnhau'r safle glycosylation, nodwyd cynnyrch 2a o'i gymharu â'r glwcosidau dilys trwy ddadansoddiad HPLC-UV/HRESI-MS. Wrth ychwanegu'r cichoriin glucoside dilys (glwcosyleiddio ar safle 7-OH o 2) yn y system adwaith, roedd y brig yn gorgyffwrdd â 2a, cadarnhaodd proffil cyd-HPLC ymhellach fod y cynnyrch glycosyledig o 2 wedi'i gataleiddio ganCtUGT1yw cichoriin [33], a brofodd fod y moiety glucosyl wedi'i drosglwyddo'n benodol ar safle C7-OH. Nodwyd cynnyrch 1a hefyd o'i gymharu â'r safon gyfeirio. Datgelodd sbectra UV-HPLC ynghyd â dadansoddiad cyd-HPLC (Ffig. 2) fod adeiledd cemegol 1a wedi'i briodoli fel sgimio [34], sef cynnyrch glucosylated 1 ar safle C7-OH.

Paratowyd cynnyrch 3a o adwaith graddedig a nodweddwyd yn strwythurol gan HRESI-MS, 1H NMR, a sbectrosgopeg NMR 13C (Ffig. S13, S14, a Nodyn 4). Yn y signal NMR 1H, o'i gymharu â swbstrad 3, diflannodd signal hydrocsyl ffenolig yn y safle C{{10}, a symudodd signal carbon C-7 δ 1.{{25} } ppm i'r cae uchel, tra bod signalau C-6 a C-8 yn symud i'r cae isel yn 13C NMR. Cadarnhaodd y canfyddiadau hyn fod y gweddillion glucopyranosyl ynghlwm wrth y grŵp hydroxyl ffenolig yn y sefyllfa C-7 o 3 [35]. Heblaw, dangosodd sbectrwm 1H NMR signalau proton anomerig ar δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); nodwyd bod y gydran siwgr yn -D-glucopyranose. Dangosodd y canlyniad hwnCtUGT1yn coumarin O-glucosyltransferase sy'n cataleiddio glucosylation o hydrocsyl coumarin yn y safle 7-OH.

3.6. Modelu homoleg, tocio moleciwlaidd, a mwtagenesis wedi'i gyfeirio at y safle o brotein CtUGT1

Datgelodd adweithiau ensymau helaeth hynnyCtUGT1gallai gataleiddio glwcosyliad tri chwmarin i'w cynnyrch glucosylated cyfatebol, a digwyddodd y sefyllfa glucosylated yn benodol yn y safle OH 7-. Nodi'r gweddillion allweddol a benderfynodd weithgareddau catalysisCtUGT1, modelu homoleg, tocio moleciwlaidd, ac ymchwiliadau mutagenesis wedi'u cyfeirio at y safle o CtUGT1. Sefydlwyd modelu moleciwlaidd homologaidd ar gyfer CtUGT1 gan ddefnyddio MODEL SWISS [21-25]. Roedd strwythur grisial Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), a bennwyd ar gydraniad o 2.1 Å, yn dangos y sgôr cyfanswm uchaf gyda homoleg dilyniant uchaf ac E-werth isel, fel y strwythur templed [26]. Dangoswyd asesiad rhesymoldeb o'r model sefydledig yn y plot Ramachandran (Ffig. S6), mae 88.5 y cant o'r gweddillion yn y model sefydledig yn y rhanbarth mwyaf ffafriol. Mae model homoleg CtUGT1 yn cynnwys dau fotiff plygiadau tebyg Rossmann yn y terfynell N- a C, yn y drefn honno (Ffig. 5 A). Mae gan y parth N-terminal ddalennau paralel saith llinyn o gwmpas gan ddeg helices. Mae parth C-terminal yn cynnwys dalennau chwe-sownd gyda naw helice ar y naill ochr a'r llall (Ffig. 5A, S7).

Er mwyn egluro ymhellach y boced weithredol oCtUGT1, perfformiwyd tocio moleciwlaidd. Gan mai dim ond y strwythur ffurf apo sydd gan UGT85H2, dewiswyd homolog UGT74F2 arall gyda CDU ac asid salicylic fel dau ligand fel y templed rheoli. Paratowyd y UDPG fel y rhoddwr siwgr. Paratowyd dau swbstrad coumarin 1 a 2 fel derbynyddion siwgr yn y drefn honno. Cyfrifwyd safleoedd rhwymo rhoddwr a derbynnydd glycosyl a'u tocio ar wahân fel y dangosir yn Ffig. 5. Roedd y canlyniadau'n dangos bod y ddau boced rhwymo wedi'u lleoli y tu mewn i'r hollt dwfn yn ardal ryngweithio'r parth N-terminus llawn a C. -terminus parth oCtUGT1ac yn ofodol agos at ei gilydd (Ffig. 5A). Mae terfyniad C oCtUGT1yn ymwneud yn bennaf â chyswllt â'r rhoddwr glycosyl fel y disgrifir yn UGTs planhigion eraill, ac mae'r rhan fwyaf o'r gweddillion amgylchynol yn hydroffilig ac wedi'u cadw'n fawr. Fel y blwch PSPG nodweddiadol, gallai gweddillion W377 yn y motiff hwn ffurfio bondiau hydrogen gyda grŵp glwcos UDPG (Ffig. 5 B); Gallai N378 ac S379 yn y motiff hwn ffurfio bondiau hydrogen gyda'r grŵp diffosffad o UDPG (Ffig. 5B). Yn ogystal, yn ôl y canlyniadau docio, gall gweddillion W356 a Q359 ryngweithio â'r grŵp wridin trwy ryngweithio bond hydrogen i sefydlogi'r rhoddwr yn y boced weithredol. I wirio swyddogaeth y gweddillion allweddol hyn a ragfynegwyd, dewiswyd cyfanswm o 16 o safleoedd a bu'n destun mutagenesis sganio alanin. Profwyd gweithgareddau catalysis y mutants hyn gan ddefnyddio pob un o'r chwe swbstrad positif a grybwyllwyd uchod. Dangosodd dadansoddiadau HPLC, pan oedd gweddillion G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397, a D398 wedi'u treiglo'n alanin, gweithgaredd glycosylau oedd y protein. ar goll yn llwyr tuag at yr holl swbstradau a brofwyd. Roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu mai’r 16 gweddillion uchod yw’r gweddillion allweddol a benderfynodd rwymo’r rhoddwr UDPG a gweithgaredd glycosyleiddiadCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 y cant ) megis V14, V132, E153, T212, ac I209 (Ffig. S8). Rhagwelir y gallai'r gweddillion hydroffobig hyn o amgylch y cylch aromatig ffurfio rhyngweithiadau van der Waals â'r swbstrad yn y boced rhwymo.

4. Trafodaeth

Glycosylation yw un o'r camau addasu pwysicaf mewn llawer o lwybrau biosynthesis metabolion eilaidd. Gallai glycosyleiddiad gynyddu bio-argaeledd cynhyrchion naturiol trwy wella eu hydoddedd dŵr a lleihau eu gwenwyndra. Ystyrir mai Coumarin yw'r ffurf symlaf o fewn dosbarth enfawr o sylweddau ffenolig sy'n digwydd yn naturiol wedi'u hadeiladu o fodrwy -pyrone wedi'i asio â chylch bensen. Mae cyfansoddion naturiol a synthetig sy'n seiliedig ar coumarin wedi denu llawer o sylw gan gemegwyr meddyginiaethol a gwyddonwyr dylunio cyffuriau o ganlyniad i'w priodweddau ffarmacolegol a biolegol amrywiol [36]. Gallai addasiadau glycosylaidd pellach o goumarin helpu i gyfoethogi amrywiaeth strwythurol y cyfansoddion hyn a hefyd gwella eu hydoddedd a'u bioargaeledd. Mewn planhigion, mae proses glycosyleiddiad o'r fath yn cael ei gataleiddio gan CDU-glycosyltransferase. Er bod UGTs lluosog wedi'u nodi o wahanol weithfeydd, hyd yma, roedd y rhan fwyaf o'r UGTs yr adroddwyd amdanynt yn ymwneud ag addasu flavonoidau glycosylaidd. Dim ond UGTs cyfyngedig yr adroddwyd eu bod yn gallu derbyn cwmarinau fel swbstradau. Yn yr astudiaeth hon, genyn glycosyltransferase newyddCtUGT1wedi'i glonio o'r perlysiau Tsieineaidd traddodiadolCistanche tubulosa. Dangosodd canlyniadau aliniad dilyniant a dadansoddiad ffylogenetig hynnyCtUGT1yn ffylogenetig bell oddi wrth y rhan fwyaf o'r UGTs flavonoid a adroddwyd, ac yn llawer agos at UGTs ffenylpropanoid. Datgelodd profion ensymau helaeth na allai CtUGT1 gataleiddio glycosyleiddiad cyfansoddion ffenyl ethanol i ffurfio PhGs, sef prif gydran gemegol yCistanche tubulosa. Yn lle hynny, gallai adnabod cwmarinau fel ei swbstradau, a chynnal yr adwaith glycosyleiddiad. Strwythur elucidation o'r cynhyrchion yn dangos bod y safle glycosylation catalyzed ganCtUGT1digwyddodd yn regiospecific yn safle C7-OH coumarins. Gan ddefnyddio CtUGT1, cafodd tri glycosid coumarin gan gynnwys sgimio (1a), cichoriin (2a), a 4- methylumbelliferyl glucoside (3a) eu syntheseiddio ensymatig a'u nodi'n strwythurol. Adroddwyd bod y tri chyfansoddyn hyn i gyd yn foleciwlau sy'n weithredol yn fferyllol. Er enghraifft, ystyriwyd bod gan 1a amrywiol weithgareddau ffarmacolegol, gan gynnwys gweithgaredd renoprotective, gwrthlidiol, gwrth-ganser, ac eiddo gwrth amoebig [37]. Dangosodd 2a weithgaredd gwrthfacterol uchel yn erbyn rhai bacteria Gram-positif fel Bacillus cereus a Staphylococcus aureus [38]. Gall 3a helpu'r planhigion i wella eu gallu i ymateb i gemegau a thocsinau [39].

Yn ogystal â coumarins, canfu profion ensymau helaeth hynnyCtUGT1hefyd yn dangos gweithgaredd glwcosylation gweladwy tuag at swbstrad benzophenone 4, swbstrad isoflavone 5, a swbstrad anthraquinone 6, a nododd fod gan CtUGT1 goddefgarwch swbstrad penodol. Serch hynny,CtUGT1ni allai gataleiddio biosynthesis cydrannau glycosidau ynCistanche tubulosamegis glycosidau ffenylethanoid (PhGs), glycosidau lignanoid, a glycosidau iridoid. Yn ogystal, yn ôl yr ymchwiliadau blaenorol, ni chafodd unrhyw glycosidau coumarin eu hynysuCistanche tubulosa. Felly, mae swyddogaeth in vivoCtUGT1mae angen ei archwilio ymhellach o hyd. Mae gweithgaredd glucosylation CtUGT1 tuag at swbstradau coumarin yn gwneud yr ensym hwn yn arf defnyddiol ar gyfer addasu glycosyleiddiad enzymatig coumarinau a nododd hefyd y gallai ensymau metabolaidd eilaidd planhigion gyflawni gweithgareddau catalysis anfesuradwy sydd ymhell y tu hwnt i'w swyddogaethau brodorol.

Datganiad o Ddiddordeb Cystadleuol

Mae'r awduron yn datgan nad oes unrhyw wrthdaro buddiannau.

Cydnabyddiaeth

Cefnogwyd y gwaith hwn yn ariannol gan Sefydliad Gwyddoniaeth Naturiol Beijing (Grant Rhif 7192112); Rhaglen Noddi Gwyddonwyr Elitaidd Ifanc gan CAST (Rhif Grant CACM− 2018− QNRC1− 02); Sefydliad Cenedlaethol Gwyddoniaeth Naturiol Tsieina (Grant Rhif 81402809); Cronfa Ysgoloriaeth Talaith Cyngor Ysgoloriaeth Tsieina (Grant Rhif 201906555010) a Sefydliad Gwyddoniaeth ar gyfer Ysgolheigion Ifanc Elitaidd Prifysgol Meddygaeth Tsieineaidd Beijing (Rhif Grant 2018-JYB-XJQ006).

Atodiad A. Data atodol

Gellir dod o hyd i ddata atodol i'r erthygl hon ar-lein yn https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

O: ' Clonio moleciwlaidd a nodweddu biocemegol o coumarin glycosyltransferase newyddCtUGT1rhagCistanche tubulosa' ganXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Cyfeiriadau

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Dadansoddiad Phylogenetic o'r teulu UDPglycosyltransferase multigene o Arabidopsis thaliana, J. Biol. Cemeg. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: glycosidasau mutant ar gyfer synthesis oligosacarid, J. Am. Cemeg. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Biosynthesis siwgr anarferol a glycodiversification cynnyrch naturiol, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Cynnydd ar y glycosylations in vivo ac in vitro o flavonoids, Appl. Microbiol. Biotechnol. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Clonio moleciwlaidd a nodweddu CDU-glwcos: bensenoid anweddol/phenylpropanoid glucosyltransferase mewn blodau petunia, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic CDU-glycosyltransferases o blanhigion, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Archwilio arwyddocâd swyddogaethol ensymau glycosyltransferase sterol, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, Glucosyltransferase alcaloid steroidal in vivo cynradd o datws, Phytochemistry. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Gweithgaredd gwrthocsidiol limonoidau sitrws, flavonoids, a coumarins, J. Agric. Cemegydd Bwyd. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Gweithgaredd gwrthfeirysol o angelicin yn erbyn firysau gammaherpes, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, deilliadau seiliedig ar Coumarin gyda gweithgaredd gwrth-HIV cryf, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] YN Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Gweithgaredd gwrthocsidiol a photensial hepatoprotective o Cedrelopsis grevei ar cypermethrin achosir straen ocsideiddiol a niwed i'r afu mewn llygod gwrywaidd, Ategiad BMC. Altern. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: cnewyllyn posibl ar gyfer moleciwlau gwrthlidiol, Med. Cemeg. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Coumarin deilliadau fel asiantau gwrthganser ar gyfer therapi canser yr ysgyfaint: adolygiad, Anti Cancer Agents Med. Cemeg. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/187152061866171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: sgaffald naturiol, breintiedig ac amlbwrpas ar gyfer cyfansoddion bioactif, Moleciwlau 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/moleciwlau23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, clonio a nodweddu glucosyltransferase sy'n adweithio ar 7-grŵp hydrocsyl o flavonol a 3-grŵp hydrocsyl o cwmarin o celloedd tybaco, Arch. Biocemeg. Bioffys. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosynthesis o coumarin glycosides gan wreiddiau blewog trawsenynnol o Polygonum multiflorum, Biosci. Biotechnol. Biocemeg. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Clonio moleciwlaidd a nodweddu coumarin glucosyltransferase mewn gwreiddiau blewog o Pharbitis dim (Ipomoea dim), Cwlt Meinwe Planhigion. Lett. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Moleciwlaidd a nodweddu strwythurol Cglycosyltransferase anlwg o Trollius Chinensis, Angew. Cemeg. Int. Ed. Eng. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: fersiwn dadansoddi geneteg esblygiadol moleciwlaidd 7.0 ar gyfer setiau data mwy, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, MODEL SWISS: modelu homoleg o strwythurau a chymhlygion protein, Asidau Niwcleig Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Modelu strwythur protein cymharol awtomataidd gyda SWISS-MODEL a gwyliwr Swisaidd-Pdb: persbectif hanesyddol, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, Ystorfa SWISS-MODEL-nodweddion ac ymarferoldeb newydd, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-cyfyngiadau pellter yn berthnasol ar amcangyfrif ansawdd model, Biowybodeg. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Modelu protein strwythur cwaternaidd o homo- a hetero-oligomerau y tu hwnt i ryngweithio deuaidd gan homology, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, strwythur grisial Medicago truncatula UGT85H2-mewnwelediadau i sail strwythurol flavonoid amlswyddogaethol (iso) glycosyltransferase, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Asesiad o fodelau protein gyda phroffiliau tri dimensiwn, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: rhaglen i wirio ansawdd stereocemegol strwythurau protein, J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: gwella cyflymder a chywirdeb tocio gyda swyddogaeth sgorio newydd, optimeiddio effeithlon, a multithreading, J. Comput. Cemeg. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AC George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Gwahaniaethau mewn cyfuniadau glwcos asid salicylic gan UGT74F1 ac UGT74F2 o Arabidopsis thaliana, Sci. Sylw 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases mewn synthesis cynnyrch naturiol planhigion: nodweddu teulu supergene, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Newid nodweddion rhoddwr siwgr o glycosyltransferases planhigion trwy fwtaniad un pwynt, Arch. Biocemeg. Bioffys. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation o gyfansoddion ffenolig gan Pharbitis dim gwreiddiau blewog: I. Glucosylation o coumarin a deilliadau flavon, Biosci. Biotechnol. Biocemeg. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hydrolysis o glwcosidau naturiol gwenwynig wedi'i gataleiddio gan dicyanohydrins cyclodextrin, Eur. J. Org. Cemeg. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformation o ddeilliadau hydroxycoumarin gan gelloedd ataliad diwylliedig o Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Datblygiadau diweddar o asiantau gwrthganser yn seiliedig ar coumarin: adolygiad cyfoes, Bioorg. Cemeg. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Effeithiau deilliad coumarin, 4-methylumbelliferone, ar egino hadau a sefydliad eginblanhigion yn Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Wyth newydd eudesmane- ac eremophilane-math sesquiterpenoids o Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Penderfyniad ac astudiaeth ffarmacocinetig o sgimio gan UHPLC-MS/MS mewn plasma llygod mawr, J. Pharm . Biomed. Rhefrol. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.