Mae MTHFD2 yn bwynt gwirio metabolaidd sy'n rheoli effaith a swyddogaeth rheoleiddiol celloedd T

Haniaethol graffigol

Awduron :

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Gohebiaeth:

jeff.rathmell@vumc.org

Yn fyr :

Mae angen synthesis niwcleotid i gefnogi amlhau celloedd T yn gyflym. Mae Sugiura et al. dangos bod metabolaeth purine de novo yn arwydd o wahaniaethu a swyddogaeth celloedd T yn uniongyrchol ac yn nodi MTHFD2 fel pwynt gwirio metabolaidd a tharged therapiwtig ar gyfer clefydau llidiol.

Uchafbwyntiau

• Mae MTHFD2 yn hanfodol ar gyfer celloedd CD4 T actifedig i gynnal synthesis purin de novo

• Mae MTHFD2 annigonol yn hyrwyddo ffenoteipiau a metaboledd tebyg i gelloedd Treg yng nghelloedd Th17 d Mae atal MTHFD2 yn atal signalau mTORC1 ac yn newid methylation histone

• Gellir targedu MTHFD2 i amddiffyn rhag llid ac awtoimiwnedd in vivo

Mae MTHFD2 yn bwynt gwirio metabolig sy'n rheoli effeithydd a thynged a swyddogaeth celloedd T rheoleiddiol

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Madden,¹Xiang Ie,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Blaidd,²Arissa C. Young,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewell,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Foerch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵a Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Canolfan Vanderbilt ar gyfer Imiwnobioleg, Adran Patholeg, Microbioleg, ac Imiwnoleg, Canolfan Feddygol Prifysgol Vanderbilt, Nashville, TN 37232, UDA

²Adran Meddygaeth, Is-adran Haematoleg ac Oncoleg, Canolfan Feddygol Prifysgol Vanderbilt, Nashville, TN 37232, UDA

³Adran Patholeg, Prifysgol Iowa, Dinas Iowa, IA 52242, UDA

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Canolfan Magdalen, Parc Gwyddoniaeth Rhydychen, Rhydychen, DU

⁵Adran Cemeg, Sefydliad Ymchwil Canser Ludwig Cangen Princeton, Sefydliad Lewis-Sigler ar gyfer Genomeg Integreiddiol, Prifysgol Princeton, Princeton, NJ 08544, USA6Lead contact

*Gohebiaeth: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

CRYNODEB

Mae ysgogiad antigenig yn hyrwyddo ailraglennu metabolaidd celloedd T i fodloni gofynion cynyddol biosynthetig, bio-ynni a signalau. Rydym yn dangos bod yr ensym metaboledd un-carbon (1C) methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2 (MTHFD2) yn rheoleiddio synthesis purin de novo a signalau mewn celloedd T wedi'u actifadu i hyrwyddo amlhau a chynhyrchu cytocinau llidiol. Mewn celloedd cynorthwyydd T pathogenig-17 (Th17), roedd MTHFD2 yn atal dadreoleiddio afreolaidd y ffactor trawsgrifio FoxP3 ynghyd â chynnydd amhriodol o gapasiti ataliol. Roedd diffyg MTHFD2 hefyd yn hyrwyddo gwahaniaethu celloedd T (Treg) rheoleiddiol. Yn fecanyddol, arweiniodd ataliad MTHFD2 at ddisbyddu pyllau purin, cronni canolradd biosynthetig purin, a llai o signalau synhwyrydd maetholion mTORC1. Roedd MTHFD2 hefyd yn hanfodol i reoleiddio DNA a methylation histone mewn celloedd Th17. Yn bwysig, roedd diffyg MTHFD2 wedi lleihau difrifoldeb y clefyd mewn modelau clefyd llidiol lluosog in vivo. Felly mae MTHFD2 yn bwynt gwirio metabolaidd i integreiddio metaboledd purin â signalau cell effaith pathogenig ac mae'n darged therapiwtig posibl o fewn llwybrau metaboledd 1C.

RHAGARWEINIAD

Mae symud yr ymateb imiwn addasol yn effeithiol yn gofyn am actifadu celloedd CD4 a T yn gadarn er mwyn iddynt dyfu'n gyflym ac ymledu. Mae hyn yn cynnwys ail-raglennu metabolaidd, a yrrir gan y synhwyrydd maetholion mTORC1, o gyflwr gorffwys catabolaidd i gyflwr twf anabolig gyda mwy o ofynion biosynthetig, bio-egni, a signalau. Yn dibynnu ar y milieu cytocine, mae celloedd CD4 a T yn gwahaniaethu i effeithydd yn ogystal ag is-setiau rheoleiddio sydd â rhaglenni metabolaidd gwahanol sy'n gyrru eu swyddogaethau effeithydd (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Mae cydbwysedd yr is-setiau hyn yn hanfodol ar gyfer imiwnedd arferol tra'n atal clefydau llidiol ac awtoimiwn. Er enghraifft, mae sglerosis ymledol (MS) yn cael ei nodweddu gan gelloedd cynorthwyydd T (Treg) sy'n cynhyrchu mwy o rynglewcinau (IL- 17) a chelloedd T (Treg) rheoleiddiol ataliol llai neu aneffeithiol. (Dendrou et al., 2015). Mae targedu rhaglenni metabolaidd penodol yr is-setiau celloedd T hyn yn cynnig dull amgen o imiwnotherapi.

Dechreuodd therapi seiliedig ar fetaboledd celloedd ym 1948 pan ddangoswyd bod cyfryngau cemotherapiwtig gwrth ffolad yn effeithiol mewn plant â lewcemia lymffoblastig acíwt (Farber et al., 1948). Mae ffolad yn cyfrannu at fetaboledd un-carbon (1C) ar gyfer biosynthesis purin, cynhyrchu rhoddwyr methyl, a chynnal cydbwysedd rhydocs cellog (Ducker a Rabinowitz, 2017; Yang a Vousden, 2016). Mae llawer o gyffuriau, gan gynnwys methotrexate (MTX), fluorouracil (5-FU), a mercaptopurine (6-MP), wedi'u datblygu ers hynny i dargedu'r llwybr hwn. Mae celloedd sy'n cynyddu'n gyflym, gan gynnwys celloedd canser a chelloedd T actifedig, yn rhannu dibyniaethau ar y llwybrau hyn i syntheseiddio DNA ac RNA. Mae MTX yn parhau i gael ei ddefnyddio'n gyffredin i drin clefydau awtoimiwn fel arthritis gwynegol (RA) (Brown et al., 2016). Fodd bynnag, oherwydd mynegiant eang yr ensymau a dargedir, mae'r asiantau therapiwtig hyn yn gysylltiedig ag effeithiau andwyol cyffredin a allai fod yn ddifrifol. Gallai nodi targedau ensymau metabolig sy'n ddetholus o bwysig mewn poblogaethau celloedd o ddiddordeb arwain at ddatblygu imiwnotherapïau mwy diogel a mwy effeithiol.

Mae metaboledd 1C yn cynnwys y cylchoedd ffolad a methionin gyda throsglwyddo unedau carbon sengl. Mae Serine yn rhoddwr 1C i actifadu tetrahydrofolate (THF) i 5,10-methyleneTHF, gyda chynhyrchiad glycin cydredol. Gall 5,10-methyleneTHF wedyn gael ei ocsidio gan ddefnyddio NAD(P) i gynhyrchu'r rhagflaenydd purin 10- formylTHF. Fel arall, gall 10-formylTHF gael ei syntheseiddio o formate a THF mewn modd sy'n dibynnu ar ATP. Yn y llwybr cytosolig, mae 10-cynhyrchu fomylTHF yn cael ei gyfryngu gan methyleneTHF dehydrogenase 1 (MTHFD1). Mae colli MTHFD1 yn newynu celloedd ar gyfer formylTHF cytosolig 10-, gan abladu gallu biosynthetig purin, a threigladau yn MTHFD1 achosi diffyg imiwnedd cyfun difrifol (SCID) (Field et al., 2015). Mae'r llwybr mitocondriaidd yn dibynnu ar debygrwydd mitocondriaidd MTHFD2 a MTHFD (MTHFD1L).

Ffigur 1. Mae metaboledd 1C a MTHFD2 yn cael eu huwchreoleiddio mewn CD4 wedi'i actifadu^plwsCelloedd T ac yng nghyd-destun EAE

(A) Newid mewn rhywogaethau metaboledd niwcleotid mewn CD4 gwahaniaethol in-vitro^plwsIs-setiau celloedd T o'u cymharu â chelloedd naïf wedi'u mesur gan sbectrometreg màs (n=3 atgynhyrchiadau biolegol).

(B) Llif gwaith ar gyfer sgrinio CRISPR wedi'i dargedu yn y model llid yr ysgyfaint in vivo.

(C) Newid mewn helaethrwydd gRNA o sgrinio metabolaeth 1C wedi'i dargedu mewn vivo CRISPR yn CD4 cynradd^plwsCelloedd T (dadansoddiad ystadegol a gyflawnir gan MAGECK, n=3 atgynhyrchiadau biolegol).

(D) mynegiant mRNA o enynnau a nodwyd yn (C) yn ystod datblygiad celloedd T a activation (data o'r porwr data ImmGen RNA-seq).

(H) Mynegiant protein o enynnau a nodir yn (C) yn CD4 naïf ac actifedig^plwsCelloedd T (data o'r Adnodd Proteome Imiwnolegol [ImmPRes]).

(F) mynegiant mRNA o enynnau a nodwyd yn (C) yng ngwaed cyfan unigolion sydd â'r anhwylderau llidiol a nodwyd o gymharu ag unigolion rheolaeth iach (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA o dan driniaeth MTX; SLE, lupus erythematosus systemig; MS-Tx naïf, triniaeth-naïf MS adeg diagnosis; MS-sefydledig, MS yn cael ei drin ac yn atal clefydau; n=3–8 rhoddwr.

(G) IHC yn dangos staen CD3 a MTHFD2 yn segment cauda equina llinyn asgwrn cefn llygod gydag EAE symptomatig yn 2003 (brig; bar graddfa, 100 mm) a 4003 (gwaelod; bar graddfa, 50 mm) chwyddhad (data yn gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol).

(H ac I) Mynegiad dwysedd fflworoleuedd cymedrig cymharol (H) (MFI) a (I) mRNA o MTHFD2 yn CD4^plwsMae celloedd T o ddueg a llinyn asgwrn cefn llygod gydag EAE symptomatig a dueg llygod rheoli (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, data yn gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 6 atgynhyrchiad biolegol).

(J) Mynegiant mRNA MTHFD2 mewn CD4 diwahaniaeth^plwsCelloedd T 0, 5, a 24 h ar ôl actifadu â gwrthgyrff gwrth-CD3 a gwrth-CD28 (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, n=3 copïau biolegol).

(K) MTHFD2 cymharol MFI dros 5 diwrnod ar ôl activation yn CD4 ynghyd ag is-setiau cell T, normaleiddio i gelloedd gorffwys (cymedr ± SD, n=3 dyblygu biolegol). Gweler hefyd Ffigur S1. Mae canlyniadau ystadegol arwyddocaol wedi'u labelu (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" y="" cant="">

Mae MTHFD2 yn un o'r genynnau sydd wedi'u cymell a'u gorfynegi fwyaf ym mhob tiwmor (Nilsson et al., 2014). Er ei fod wedi'i uwchreoleiddio'n fras yn ystod embryogenesis, nid oes gan MTHFD2 fawr ddim mynegiant yn y rhan fwyaf o feinweoedd oedolion (Nilsson et al., 2014). Mewn therapi gwrth-ganser (Zhu a Leung, 2020), gall ataliad MTHFD2 arwain at fwy o straen ocsideiddiol (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), dibyniaeth ar glycin (Koufaris et al., 2016), a annigonol synthesis purin (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman et al., 2016). Gall diffyg MTHFD2 hefyd atal gweithgaredd mTORC1 trwy fecanweithiau lluosog, gan gynnwys trwy ddisbyddu guanin ac ataliad dilynol o'r mTORC1-actifadu GTPase Rheb (Emmanuel et al., 2017). Mae diffyg MTHFD2 hefyd yn achosi croniad o ganolradd llwybr synthesis purin, gan gynnwys yr analog adenosine monophosphate (AMP) 5- aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) (Ducker et al., 2016), a all actifadu protein kinase AMP-activated (AMPK) i atal mTORC1 (Su et al., 2019).

Oherwydd bod metaboledd 1C yn integreiddio mewnbynnau maetholion lluosog a'i fod yn hydrin yn therapiwtig, fe wnaethom archwilio rôl 1Cmetaboledd yn CD4^plwsEffeithydd T (Teff) ac is-setiau cell Treg. Trwy sgrinio diduedd mewn vivo CRISPR-Cas9-wedi'i dargedu mewn celloedd T murine cynradd, fe wnaethom nodi MTHFD2 fel ergyd a oedd hefyd yn cael ei uwchreoleiddio'n gyson mewn unigolion ag anhwylderau llidiol. Yn nodedig, roedd diffyg MTHFD2 yn amharu ar amlhau a swyddogaeth celloedd Teff. Roedd diffyg MTHFD2 hefyd yn hyrwyddo mynegiant aberrant FoxP3 a gweithgaredd ataliol yng nghelloeddTh17 tra'n hyrwyddo gwahaniaethu celloedd Treg. Roedd yr effeithiau hyn yn gysylltiedig â chroniad AICAR, llai o grynodiadau purin, is-reoleiddio signalau mTORC1, mwy o fetaboledd mitocondriaidd, a methylation DNA a histone wedi'i newid. In vivo, targedu MTHFD2 wedi'i ddiogelu rhag modelau clefyd llidiol lluosog. Mae'r data hyn yn dangos bodMTHFD2 yn bwynt gwirio metabolaidd yng nghelloedd Th17 a Treg ac yn tynnu sylw at botensial yr ensym hwn fel targed ar gyfer imiwnotherapi gwrthlidiol.

CANLYNIADAU

Mae metaboledd 1C a synthesis purin yn weithgar yn wahanol yn CD4^plwsIs-setiau cell T

Fe wnaethom ddamcaniaethu y gall synthesis niwcleotid fod yn wahanol ar draws CD4^plwsIs-setiau cell T. CD4^plwsGwahaniaethwyd celloedd T mewn vitro i gelloedd Th1, Th17, a Treg a'u casglu ar ôl 72 h ar gyfer sbectrometreg màs. Yn gyffredinol, roedd symiau rhywogaethau niwcleotid yn uwch ym mhob is-set o gymharu â chelloedd naïf (Ffigur 1A). Yn nodedig, roedd canolradd synthesis purin yn wahaniaethol niferus, gyda'r casgliad uchaf o glycinamide ribonucleotide (GAR), 1- (phosphoribosyl) imidazole carboxamide (SAICAR), ac AICAR mewn celloedd Th17 (Ffigur S1A).

I brofi dibyniaeth CD4^plwsCelloedd T ar ensymau ym metabolaeth 1C, fe wnaethom berfformio sgrin in vivo CRISPR-Cas9-yn y CD4 cynradd^plwsCelloedd T (Ffigur 1B). Adeiladwyd llyfrgell canllaw arferol RNA (gRNA) i dargedu ensymau ym metabolaeth 1C, ynghyd â chymhleth sglerosis twberaidd 2 (TSC2) fel rheolaeth gadarnhaol a rheolaethau negyddol nad ydynt yn targedu (NTCs). CD4^plwsTrosglwyddwyd celloedd T wedi'u hynysu o ovalbumin (OVA)-derbynnydd cell T (TCR) trawsenynnol OT-II llygod dwbl-transgenig dwbl gyda'r llyfrgell hon a'u trosglwyddo'n fewnwythiennol i Rag1^{__ /__}gwesteiwyr. Yna roedd llygod yn cael eu himiwneiddio ag OVA intranasal i achosi llid yr ysgyfaint. Cafodd celloedd T a adferwyd o ysgyfaint y llygod hyn eu dilyniannu, a sefydlwyd cyfoethogiad neu ddisbyddiad gRNAs o'i gymharu ag amleddau mewnbwn. Cyfoethogwyd gRNA TSC2, gan gefnogi rôl ataliol y protein hwn mewn celloedd T. Mewn cyferbyniad, disbyddwyd gRNAs PPAT, AHCY, MAT2A a MTHFD1 yn sylweddol, a gostyngwyd gRNAs GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2, a MTHFD2 i raddau llai, gan nodi bod y genynnau hyn yn cyfrannu at amlhau celloedd T a swyddogaeth llidiol. in vivo (Ffigurau 1C ac S1B).

Nesaf, gwnaethom archwilio proffil mynegiant y genynnau a nodwyd o'r sgrin. Er bod pob un wedi'i uwch-reoleiddio'n gydlynol wrth ddatblygu thymocytes, ysgogwyd mRNA a phrotein MTHFD2 gryfaf mewn celloedd T ymylol ysgogol (Ffigurau 1D ac 1E). Ar ben hynny, mewn set ddata dilyniannu RNA (RNA-seq) a gyhoeddwyd ar wahân o waed cyfan unigolion ag amrywiaeth o glefydau llidiol ac awtoimiwn (Aune et al., 2017), roedd MTHFD2 wedi'i or-fynegi'n gyson ar draws cyflyrau lluosog, gan gynnwys colitis briwiol, clefyd Crohn. , clefyd coeliag, RA, lupus erythematosus systemig (SLE), soriasis, arthritis soriatig, syndrom Sjo¨ gren, ac MS (Ffigur 1F). Yn nodedig, roedd gan unigolion ag MS a gafodd ddiagnosis yn ddiweddar fynegiant MTHFD2 yn sylweddol uwch o'i gymharu â rhoddwyr iach neu unigolion ag MS sy'n cael therapi i leddfu'r afiechyd (Ffigur S1C). Felly, CD4^plwsMae amlder a goroesiad celloedd T yn dibynnu ar rai genynnau metaboledd 1C, ac mae mynegiant y genynnau hyn yn amrywio trwy gamau datblygiad celloedd T, actifadu a gwahaniaethu yn ogystal ag wrth osod llid patholegol.

Ffigur 2. Mae diffyg MTHFD2 yn amharu ar CD4^plwsAmrediad a swyddogaeth celloedd T

(A-D) Amrediad wedi'i fesur gan (A) gwanhau Fioled CellTrace (CTV), (B) hyfywedd, (C) mynegiant CD25, a (D) mynegiant TF yn CD4^plwsMae is-setiau celloedd T wedi'u trin â'r MTHFD2i am 72 h ar ôl actifadu (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, mae data'n gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 9 copi biolegol).

Mae MTHFD2 wedi'i uwchreoleiddio'n fawr mewn CD4 sy'n ymdreiddio i CNS^plwsCelloedd T mewn enseffalomyelitis awtoimiwn arbrofol (EAE) ac mewn CD4 wedi'i actifadu^plwsCelloedd T in vitro

Nid yw rheoleiddio MTHFD2 wedi'i ddisgrifio'n dda yng nghelloedd CD4 plws T. I fesur mynegiant MTHFD2 mewn briwiau llidiol in vivo, CD4^plwsCafodd celloedd T o lygod trawsgenig TCR 2D2 penodol myelin eu hactifadu a'u trosglwyddo'n fabwysiadol i Rag1^{__ /__}llygod i gymell EAE. Ar ôl i lygod ddechrau arddangos parlys cefn, dadansoddwyd segment cauda equina llinyn y cefn gan imiwn-histochemistry (IHC). Dangosodd llygod a dderbyniodd gelloedd 2D2 T gyfoethogi MTHFD2 a CD3^plwscelloedd a oedd yn absennol yn y rheolydd (Ffigur 1G). Penderfynu'n uniongyrchol a yw CD4^plwsRoedd celloedd T yn uwchreoleiddio MTHFD2 mewn briwiau llidus, casglwyd celloedd T o ddueg a llinyn asgwrn y cefn llygod sy'n destun model EAE a achosir gan oligodendrocyte myelin (MOG) a tocsin pertwsis (PTX) i'w dadansoddi. CD4 sy'n ymdreiddio i CNS^plwsRoedd celloedd T yn gorfynegi MTHFD2 o gymharu â CD4 splenig cyfatebol^plwsCelloedd T o reolaeth a llygod EAE, fel y'u mesurir gan sytometreg llif (Ffigur 1H) a qRT-PCR (Ffigur 1I). Cineteg mynegiant MTHFD2 yn CD4^plwsMesurwyd celloedd T in vitro nesaf. Canfuwyd upregulation cadarn o mRNA MTHFD2 ar ôl 5 awr o ysgogiad a dechreuodd leihau 24 h (Ffigur 1J), tra bod CD4 gwahaniaethol^plwsCyrhaeddodd is-setiau celloedd T y mynegiant uchaf o brotein MTHFD2 48 h ar ôl actifadu (Ffigur 1K). Mae'r data hyn yn dangos bod MTHFD2 wedi'i uwchreoleiddio yn CD4^plwsCelloedd T ag actifadu in vitro ac ar safle llid in vivo.

CD4^plwsMae is-setiau celloedd T yn gofyn am MTHFD2 yn wahanol ar gyfer actifadu, amlhau, goroesi, a chynhyrchu cytocin

Y tro nesaf fe wnaethon ni brofi rôl MTHFD2 mewn actifadu, gwahaniaethu, amlhau a swyddogaeth is-setiau celloedd T CD4. CD4^plwsCafodd celloedd T eu actifadu in vitro ym mhresenoldeb cytocinau ar gyfer y gwahaniaethu celloedd Th1, Th17, a Treg gorau posibl a cherbyd neu atalydd MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et al., 2019). Ar ôl 72 h, roedd pob is-set wedi lleihau ymlediad (Ffigur 2A) a nifer y celloedd beicio byw (Ffigurau S2A ac S2B). Gostyngwyd hyfywedd mewn celloedd Th1 a Th17 (Ffigur 2B), a gostyngwyd actifadu, fel y'i mesurwyd gan fynegiant CD25, ym mhob is-set (Ffigur 2C). Gostyngwyd mynegiant ffactor trawsgrifio (TF) sy'n nodweddu llinach yng nghelloedd Th1 (T-bet^plws) ond heb ei newid yng nghelloedd Th17 (ROR t^plws) ac wedi newid cyn lleied â phosibl yng nghelloedd Treg (FoxP3^plws) (Ffigur 1D). I fesur swyddogaeth celloedd Teff, cafodd celloedd eu hail-ysgogi â 12-myristate 13-asetad (PMA) ac ionomycin. Mynegodd llawer llai o gelloedd Th1 interfferon-g (IFNg), a llai o gelloedd Th17 IL-17 o'u gwahaniaethu ym mhresenoldeb y MTHFD2i (Ffigur 2E). Nid oedd hyn oherwydd amhariad actifadu cychwynnol oherwydd bod y ffenoteipiau hyn yn cael eu cynnal pan gafodd amlygiad i gyffuriau ei ohirio tan 24 h ar ôl ei actifadu, er na chafodd mynegiant TF nodwedd oedran llinell ei newid yn y gosodiad hwn (Ffigurau S2C-S2F). Felly mae angen MTHFD2 ar gyfer y CD4 uchaf^plwsYsgogi celloedd T, amlhau, goroesi, a chynhyrchu cytocin.

Er mwyn dilysu'r effeithiau ffarmacolegol hyn yn enetig, cynhyrchwyd Mthfd2 gennym^fl/flstraen llygoden a'i groesi â llygod Cd4- cre transgenic i gyflawni dileu genetig amodol. Fel y rhagwelwyd, CD4 wedi'i actifadu^plwsT celloedd o Mthfd2^fl/flCd{0}}cre plus (CD4^ΔMthfd2) roedd gan lygod fynegiant MTHFD2 is o gymharu â chelloedd o Mthfd2^fl/flCd{0}}cre^plws(math gwyllt [WT]) sbwriel (Ffigur 2F). Ar y gwaelodlin, roedd gan lygod CD4DMthfd2 ychydig yn llai o CD4^plwsCelloedd T yn y ddueg o gymharu â'r WT (Ffigur 2G). Ar ôl actifadu a gwahaniaethu in vitro, niferoedd celloedd a hyfywedd CD4^ΔMthfd2Roedd celloedd Th17 ac, i raddau llai, celloedd Treg yn sylweddol is (Ffigur 2H). Yn ogystal, gostyngwyd mynegiant CD25 yng nghelloedd Th17 a Treg a thueddwyd yn is mewn celloedd Th1 (Ffigur 2I). Yn olaf, CD4^ΔMthfd2Roedd gan gelloedd Th1 a Th17 fynegiant is o T-bet a ROR t, yn y drefn honno. Fodd bynnag, nid oedd FoxP3 yng nghelloedd Treg wedi newid (Ffigur 2J). Er gwaethaf newidiadau mewn mynegiant TF, roedd celloedd Teff a oedd yn gwahaniaethu yn cynhyrchu symiau arferol o cytocinau (Ffigur 2K). Gellir priodoli gwahaniaethau mewn canlyniadau rhwng y dulliau ffarmacolegol a genetig i amseriad a chyflawnrwydd colli swyddogaeth ensymau yn ystod datblygiad a mecanweithiau cydadferol posibl.

Mae'r MTHFD2i yn cymell mynegiant FoxP3 mewn celloedd Th17 ac yn gwella gwahaniaethu celloedd Treg

O ystyried dibyniaeth celloedd Teff ar MTHFD2, gwnaethom brofi rheoliad MTHFD2i o gelloedd FoxP3 a Treg. Yn nodedig, mae MTHFD2i wedi'i achosi gan driniaeth i ddadreoleiddio FoxP3 yn Th1 ac yn fwy amlwg mewn celloedd Th17 mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​(Ffigur 3A). Digwyddodd hyn hefyd pan gafodd y driniaeth ei gohirio tan 24 awr ar ôl y llawdriniaeth (Ffigur 3B). Gwelwyd tuedd debyg yn y celloedd CD4DMthfd2 Th17 (Ffigur 3C). Roedd y dadreoleiddiad FoxP3 hwn yn weithredol oherwydd bod celloedd Th17 a gafodd eu trin â MTHFD2i wedi ennill gallu ataliol wrth gael eu cyd-ddiwyllio â CD8^plwsCelloedd T (Ffigur 3D). Felly gall y MTHFD2i hyrwyddo ffenoteipiau tebyg i gelloedd FoxP3 a Treg mewn celloedd Th17. Roedd y MTHFD2i hefyd yn gwella gwahaniaethu celloedd Treg anwythol. Gwahaniaethwyd celloedd Treg gydag ystod o grynodiadau ffactor twf trawsnewidiol b (TGF-b) ym mhresenoldeb y MTHFD2i. Ym mhob crynodiad a brofwyd ac eithrio'r uchaf, cynyddodd mynegiant FoxP3 gyda thriniaeth MTHFD2i (Ffigurau 3E a 3F). Cynhaliwyd y ffenoteip hwn hefyd gydag oedi wrth drin MTHFD2i (Ffigur 3G).

Ffigur 3. Mae diffyg MTHFD2 yn achosi mynegiant FoxP3 ac yn hyrwyddo symudiad tuag at ffosfforyleiddiad ocsideiddiol

(A) Mynegiant FoxP3 mewn celloedd Th1 a Th17 wedi'u trin â MTHFD2i 72 h ar ôl actifadu (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, mae data'n gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 9 copi biolegol).

(B) Mynegiant FoxP3 mewn celloedd Th1 a Th17 wedi'i actifadu am 24 h ac yna'n cael ei drin â cherbyd neu 500 nM MTHFD2i am 48 h (cymedr ± SD, prawf t heb ei baru, mae data'n gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 9 copi biolegol).

(C) FoxP3 mynegiant mewn celloedd Th1 a Th17 o WT a CD4DMthfd2 littermates 72 h ar ôl activation (cymedr ± SD, prawf t heb eu paru, data yn gynrychioliadol o dri arbrofion annibynnol gyda 9 ailadrodd biolegol cyfanswm).

(D) Assay ataliad sy'n mesur cynhwysedd atal afreolaidd celloedd Th17 sy'n cael eu trin â MTHFD2i. Cafodd celloedd Th17 wedi'u trin ymlaen llaw eu cyd-ddiwyllio â chelloedd CD8 a T wedi'u staenio gan CTV i fesur amlhau wrth actifadu â gwrthgyrff gwrth-CD3 a gwrth-CD28 (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, n=3 atgynyrchiadau biolegol) .

(E) FoxP3 mynegiant mewn celloedd Treg gwahaniaethu ag ystod o grynodiadau TGF-b a thrin gyda'r MTHFD2i (cymedr ± SD, prawf t heb eu paru, data yn gynrychioliadol o dri arbrofion annibynnol gyda 9 ailadrodd biolegol cyfanswm).

(F) plotiau cytometreg llif ar gyfer data wedi'u tablu yn (E).

(G) Mynegiant FoxP3 yng nghelloedd Treg wedi'i actifadu a'i wahaniaethu â chrynodiadau isel o TGF-b am 24 h ac yna'n cael ei drin â'r MTHFD2i am 48h (cymedr ± SD, prawf t heb ei baru, mae data'n gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 9 atgynhyrchiad biolegol ).

(H) Perfformiwyd prawf straen Seahorse XF Cell Mito ar gelloedd Th17 a Treg a driniwyd gan MTHFD2i (cymedr ± SD, n=3 atgynhyrchiadau biolegol).(I) ECAR gwaelodol, OCR gwaelodol, OCR ar y mwyaf, ac OCR / ECAR gwaelodol cymhareb wedi'i mesur yn (H) (cymedr ± SD, prawf t heb ei baru, mae data'n gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 6 atgynhyrchiad biolegol). Mae canlyniadau ystadegol arwyddocaol wedi'u labelu (* p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, **** p y cant 0.001).

Mae gan gelloedd Treg fwy o fetaboledd mitocondriaidd na chelloedd Th17 (Michalek et al., 2011). Er mwyn pennu canlyniadau metabolaidd triniaeth MTHFD2i, aseswyd celloedd Th17 a Treg trwy ddadansoddiadau fflwcs allgellog. Cynyddodd yr MTHFD2i gyfradd defnyddio ocsigen gwaelodol ac uchaf (OCR) celloedd Th17 i ddangos symudiad tuag at resbiradaeth mitocondriaidd (Ffigur 3H). I'r gwrthwyneb, roedd gan gelloedd Th17 a Treg gyfradd asideiddio allgellog gwaelodol is (ECAR) gyda thriniaeth MTHFD2i, sy'n awgrymu llai o glycolysis (Ffigur 3I). Cynyddwyd y gymhareb waelodol o OCR i ECAR yn sylweddol yng nghelloedd Th17 a Treg oherwydd i'r MTHFD2i symud y rhaglen metabolig o glycolysis tuag at ffosfforyleiddiad ocsideiddiol. Mae'r data hyn yn dangos bod y MTHFD2i yn gwella mynegiant FoxP3 mewn celloedd Th17 a chelloedd Treg wedi'u gwahaniaethu o dan amodau TGF-b isel ac yn symud celloedd Th17 i fetaboledd mwy tebyg i gelloedd Treg.

Mae diffyg MTHFD2 mewn celloedd CD4 a T dynol yn lleihau amlder a hyfywedd celloedd Th17 wrth gynyddu mynegiant FOXP3 a lleihau gweithgaredd mTORC1

I brofi cyfieithadwyedd y canfyddiadau uchod i gelloedd dynol, CD4^plwsGwahaniaethwyd celloedd T a oedd wedi'u hynysu o waed ymylol rhoddwyr iach yn vitro i gelloedd Th1, Th17, a Treg a'u trin â cherbyd neu MTHFD2i o'r adeg y caiff ei actifadu. Gostyngodd ymlediad yn sylweddol mewn celloedd Th17 a Treg a driniwyd gan MTHFD2i (Ffigur 4A), ac roedd celloedd Th17 hefyd yn arddangos mwy o apoptosis (Ffigur 4B). Ail-ddangoswyd lleihad ymlediad mewn celloedd Th17 gyda dull genetig gan ddefnyddio RNA ymyriadol bach (siRNA) (Ffigurau 4C a S2G). Yn debyg i gelloedd murine, roedd mynegiant FOXP3 yn uwch mewn celloedd Th17 dynol a driniwyd gan MTHFD2i ac yn tueddu'n uwch mewn celloedd Treg dynol a driniwyd gan MTHFD2i (Ffigurau 4D a S2H). O ystyried bod echelin MTORC1-AMPK yn hanfodol ar gyfer gwahaniaethu celloedd Th17 a Treg, mesurwyd ffosfforyleiddiad y protein ribosomaidd targed mTORC1 S6 (ffosffo-S6) hefyd. Roedd hyn yn dangos llai o weithgaredd mTORC1 mewn celloedd Th17 gyda MTHFD2i neu siMTHFD2 (Ffigur 4E). Felly, gellir ailadrodd colli gallu lluosog ac ymsefydlu mynegiant FOXP3 yng nghelloedd Th17 a Treg yn CD4 dynol cynradd.^plwscelloedd T.

Ffigur 4. Mae diffyg MTHFD2 yn amharu ar amlhau ac yn achosi mynegiant FOXP3 mewn celloedd Th17 dynol

(A) Amrediad wedi'i fesur gan wanhau CTV mewn CD4 dynol ynghyd ag is-setiau celloedd T wedi'u trin â cherbyd neu 2 mM MTHFD2i am 72 h ar ôl actifadu â gwrthgyrff gwrth-CD3 a gwrth-CD28 (prawf t pâr, mae data'n gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda 5 –6 rhoddwr iach).

(B) Apoptosis wedi'i fesur gan Annexin V mewn celloedd dynol CD4 ynghyd â T a gafodd eu trin â'r MTHFD2i am 72 h (prawf t mewn parau, mae data'n gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda 5-6 o roddwyr iach).

(C) Mynegiant Ki-67 mewn celloedd dynol CD4 ynghyd â T a drosglwyddwyd â NTC neu siMTHFD2 (prawf t mewn parau, mae data yn gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda 4 rhoddwr claf iach).

(D) mynegiant FOXP3 mewn celloedd dynol CD4 ynghyd â T wedi'u trin â MTHFD2i am 72 h (prawf t mewn parau, mae data'n gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda 6-10 o roddwyr iach).

(E) Newid mewn mynegiant phospho-S6 mewn celloedd dynol CD4 ynghyd â T wedi'i drin â MTHFD2i am 72 h neu wedi'i drawsosod â siMTHFD2 (cymedr ± SD, un prawf sampl t, data cynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda 4-6 rhoddwr iach). Mae canlyniadau ystadegol arwyddocaol wedi'u labelu (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" y="" cant="">

Mae celloedd T yn dibynnu ar swyddogaeth ensymatig MTHFD2, a gellir achub ffenoteipiau yn ôl cynnyrch

Mae angen MTHFD2 ar gyfer cynnal a chadw'r gronfa formate mitocondriaidd ar gyfer synthesis purin (Ma et al., 2017) ond gall hefyd chwarae rolau nad ydynt yn ensymatig. Gan gefnogi gweithgaredd ensymatig hanfodol, arweiniodd triniaeth MTHFD2i at ddefnydd cydadferol o fformate o'r cyfrwng mewn is-setiau cell CD4 ynghyd â T (Ffigur 5A). Darperir yr uned 1C a ddefnyddir ar gyfer synthesis formate trwy drosi serine yn glycin, a serine mewngellol wedi'i gronni tra disbyddwyd glycin â thriniaeth MTHFD2i ym mhob is-set (Ffigur 5B). Cynyddwyd crynodiadau methionin ychydig hefyd, sy'n awgrymu atal y cylch methionin. Yn ôl y disgwyl, o ystyried bod y cam trosi serine-glycine i fyny'r afon o MTHFD2, ni achubwyd y newidiadau hyn trwy ddarparu fformat yn y cyfrwng.

Ffigur 5. Mae effeithiau MTHFD2i ar is-setiau celloedd T yn cael eu hachub gan fformat alldarddol

(A) Cymeriad fformat wedi'i fesur gan 1 sbectrosgopeg cyseiniant magnetig H (MRS) mewn CD4 ynghyd ag is-setiau cell T wedi'u trin â cherbyd neu 500 nM MTHFD2i am 72 h ar ôl actifadu (cymedr ± SD, prawf t heb ei baru, mae data'n gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 6 atgynhyrchiad biolegol).

(B) Newid mewn crynodiadau serine, glycin, a methionin mewn celloedd CD4 ynghyd â T wedi'u trin â 500 nM MTHFD2i neu 500 nM MTHFD2i ynghyd â fformat 1 mM am 4-6 h o'i gymharu â cherbyd, wedi'i fesur gan sbectrometreg màs (cymedr ± SD, n { {8}} copi biolegol).

(C) Cyfrif celloedd byw, hyfywedd, a mynegiant CD25 yn CD4 wedi'i drin â MTHFD2i ynghyd â chelloedd T wedi'u hachub gyda formate 1 mM neu 60 mM adenine a datrysiad purine guanine am 72 h ar ôl activation (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, mae data yn cynrychioli tri arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 9 copi biolegol).

(D) Cyfrif celloedd byw, hyfywedd, a mynegiant CD25 mewn celloedd CD4 ynghyd â chelloedd T o sbwriel WT neu CD4DMthfd2 wedi'u hachub gyda formate neu purines am 72 h ar ôl actifadu (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, n=3 dyblygu biolegol ).

Yna gwnaethom brofi a allai ychwanegu formate neu doddiant purin adenin a guanin achub swyddogaeth ensymatig ddiffygiol a gwrthdroi effeithiau diffyg MTHFD2 i lawr yr afon. Yn wir, adferodd fformat 1 mM amlder, hyfywedd ac actifadu mewn celloedd a driniwyd gan MTHFD2i (Ffigur 5C). Llwyddodd ychwanegiad purin i achub ymlediad ym mhob is-set ac actifadu yng nghelloedd Th1 a Th17 ond nid hyfywedd ym mhob is-set ac actifadu yng nghelloedd Treg. Fe wnaeth Formate hefyd achub amlhau, hyfywedd a gweithrediad yn CD4^ΔMthfd2Celloedd T (Ffigur 5D). Cafodd cynhyrchiad cytocin â nam mewn celloedd Th1 a Th17 a gafodd eu trin â MTHFD2i ei wrthdroi i symiau cerbyd gydag ychwanegiad formate neu purine (Ffigur 5E). Yn nodedig, cafodd upregulation aberrant o FoxP3 mewn celloedd Th17 ei achub trwy adio purine ond nid formate, tra bod formate ac adio purine wedi lleihau mynegiant FoxP3 i waelodlin mewn celloedd Treg wedi'i wahaniaethu â chrynodiadau isel o TGF-b (Ffigur 5F). Mae'n ymddangos bod ffenoteipiau MTHFD2i yn dibynnu ar gynnal a chadw'r fformat mitocondriaidd neu'r pyllau purin MTHFD2.

Mae MTHFD2 yn rheoleiddio gweithgaredd mTORC1 a DNA a methylation histone yn CD4^plwscelloedd T

Mewn celloedd canser anfarwoledig, gall diffyg MTHFD2 arwain at grynhoi'r canolradd synthesis purin GAR, SAICAR, ac AICAR, sydd i fyny'r afon o 10-camau fformiwleiddio wedi'u cyfryngu gan formylTHF (Ducker et al., 2016). CD4^plwsCafodd is-setiau celloedd T eu meithrin am 72 h cyn dod i gysylltiad â MTHFD2i am 4-6 h. Dewiswyd yr amserlen fer hon i osgoi unrhyw effeithiau eilaidd, gan gynnwys newidiadau cydadferol. Arweiniodd triniaeth dros dro MTHFD2i at gronni GAR, SAICAR, ac AICAR ym mhob is-set (Ffigur 6A). Achubwyd yr effaith hon yn llwyr trwy ychwanegu fformat 1 mM, gan gefnogi rôl enzymatig MTHFD2. Cafodd niwcleotidau a basau niwcleobaidd, gan gynnwys gwanin, eu disbyddu hefyd gan y MTHFD2i a'u hachub gan formate yng nghelloedd Th17 a Treg (Ffigur 6B).

Ffigur 6. Mae MTHFD2i yn arwain at gronni canolradd synthesis purin wedi lleihau gweithgaredd mTORC1 a methylation DNA a histone wedi'i newid

(A) Newid mewn crynodiadau GAR, SAICAR, ac AICAR mewn celloedd CD4 ynghyd â T wedi'u trin â 500 nM MTHFD2i neu 500 nM MTHFD2i ynghyd â fformat 1 mM am 4-6 h o'i gymharu â cherbyd, wedi'i fesur gan sbectrometreg màs (cymedr ± SD, un- ffordd ANOVA, n=3 atgynhyrchiadau biolegol).

(B) Newid mewn rhywogaethau metaboledd niwcleotid mewn celloedd Th17 a Treg wedi'u trin â MTHFD2i gyda neu heb fformat am 4-6 h o'i gymharu â cherbyd, wedi'i fesur gan sbectrometreg màs (n=3 atgynhyrchiadau biolegol).

(C) Immunoblot o phospho-S6, S6, Rheb, phospho-ACC, ACC, HIF-1a, a b-actin mewn celloedd CD4 ynghyd â T wedi'u trin â MTHFD2i gyda neu heb fformat am 72 h ar ôl ei actifadu (data cynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol gyda n=3 atgynhyrchiadau biolegol).

(D) Newid mewn metabolion cylch TCA mewn celloedd Th17 sy'n cael eu trin â MTHFD2i gyda neu heb formate am 6 h o'i gymharu â cherbyd, wedi'i fesur gan sbectrometreg màs (cymedr ± SD, ANOVA unffordd, n=3 dyblygu biolegol).

(E) Mapiau gwres o gymhareb reoli H3K27me3 i IgG mewn rhanbarthau ±10-kb o amgylch hyrwyddwyr genynnau hysbys UCSC yng nghelloedd Th17 a Treg wedi'u trin â MTHFD2i, wedi'i fesur gan CUT&RUN (data wedi'i gronni o 3 atgynhyrchiad biolegol).

(F) Map gwres o amledd methylation DNA canolrifol locws Foxp3 yn ôl safle CpG mewn celloedd Th1 a Th17 wedi'u trin â cherbyd neu 500 nM MTHFD2i ac mewn celloedd nTreg o sbwriel WT neu CD4DMthfd2 (prawf Mood, n=3 dyblygu biolegol).

(G) Tabliad o (F) gan hyrwyddwr procsimol, hyrwyddwr distal, a TSDR (prawf t pâr). Gweler hefyd Ffigurau S3 a S4. Mae canlyniadau ystadegol arwyddocaol wedi'u labelu (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" y="" cant="">

Mae AICAR a niwcleotidau yn rheolyddion sefydledig echelin mTORC1-AMPK (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). Yn wir, gostyngwyd mynegiant phospho-S6 gyda thriniaeth MTHFD2i ym mhob is-set a'i adfer yn llawn trwy ychwanegu formate (Ffigurau 6C a S3A). Gall y protein sy'n rhwymo GTP Rheb, sy'n ysgogydd gorfodol o mTORC1, fod yn sensitif i argaeledd gwanin mewngellol (Emmanuel et al., 2017), a chafodd mynegiant Rheb ei leddfu gyda thriniaeth MTHFD2i (Ffigurau 6C a S3B). Mae AICAR yn ysgogydd analog adenosine ac AMPK (Rae a Mairs, 2019; Su et al., 2019). Fodd bynnag, ni newidiodd 72 h ar ôl actifadu, ffosfforyleiddiad AMPK neu ei dargedau, asetyl-coenzyme A(CoA) carboxylase (phospho-ACC) ac Unc-51-fel autophagy yn actifadu kinase (phospho-ULK1), gyda thriniaeth MTHFD2i (Ffigurau 6C, S3C, ac S3D). Mae gweithgaredd mTORC1 yn hyrwyddo Th17 ac yn gwanhau gwahaniaethu celloedd Treg yn rhannol trwy sefydlu HIF-1metabolaeth glycolytig dibynnol (Shi et al., 2011). Yn gyson â hyn, gostyngwyd mynegiant HIF mewn celloedd a driniwyd gan MTHFD2i a CD4DMthfd2 Th17 (Ffigurau 6C, S3E, a S3F). Nid oedd y newidiadau hyn mewn gweithgaredd mTORC1 yn gysylltiedig ag unrhyw ddiffygion mewn signalau TCR, fel y'i mesurwyd gan fynegiant Nur77 gyda a heb ail-ysgogiad (Ffigur S3G). Roedd transducer signal ac ysgogydd gweithgaredd trawsgrifio 3 (STAT3), sy'n hanfodol ar gyfer datblygiad celloedd Th17, heb ei newid neu wedi cynyddu'n gymedrol gyda thriniaeth MTHFD2i (Ffigur S3H). Roedd gostyngiad mewn gweithgaredd mTORC1 a symudiad o glycolysis tuag at ffosfforyleiddiad ocsideiddiol gyda thriniaeth MTHFD2i yn awgrymu newidiadau yn niferoedd cymharol metabolion cylchred asid tricarboxylic (TCA). Gostyngwyd crynodiadau sudden a fumarate yn sylweddol gan y MTHFD2i ond fe'u hachubwyd gan formate (Ffigur 6D).

Gwyddys bod metabolion TCA yn atalyddion DNA a histone demethylases (Su et al., 2016), a gall disbyddu pyllau succinate a fumarate gefnogi cyflwr hypomethylated. Mesurwyd H3K27 tri-methylation (H3K27me3) ar draws y genom gan ddilyniant CUT&RUN (holltiad o dan dargedau a rhyddhau gan ddefnyddio niwcleas) (Skene a Henikoff, 2017). Yn wir, roedd celloedd Th17 wedi'u trin â MTHFD2i wedi lleihau H3K27me3 o'i gymharu â cherbyd (Ffigurau 6E ac S4A). Mesurwyd methylation DNA yn y locws Foxp3 hefyd trwy ddilyniannu bisulfate i benderfynu a oedd methylation gwahaniaethol wedi cyfrannu at ddadreoleiddio FoxP3 a achosir gan MTHFD2i. Er bod nifer o loci CpG yn amrywio o ran amlder methylation rhwng amodau cerbyd a MTHFD2i, nid oedd patrwm canfyddadwy yn rhanbarth demethylated cell-benodol Treg (TSDR). Nid oedd unrhyw wahaniaethau ychwaith rhwng celloedd nTreg (CD4 ynghyd â CD25 a mwy) wedi'u hynysu o lygod WT a CD4DMthfd2 (Ffigur 6F), er bod purdeb pob poblogaeth gyfoethog yn isel (Ffigur S4B). Fodd bynnag, bu gostyngiad sylweddol mewn amledd methylation DNA dros ranbarth hyrwyddwr procsimol Foxp3 mewn celloedd Th17 a driniwyd gan MTHFD2i o gymharu â cherbyd (Ffigur 6G), gan nodi gwelliant posibl o drawsgrifio gyda MTHFD2i.

Yn ogystal â chynnal y gronfa fformat mewngellol, mae gweithgaredd MTHFD2 yn cyfrannu at y cydbwysedd rhydocs cellog trwy drosi NAD^plwsi NADH a NADP^plwsi NADPH (Shin et al., 2017) a chefnogaeth i'r llwybr trawssulfuration a synthesis glutathione dilynol. Roedd celloedd Th17 a gafodd eu trin â MTHFD2i wedi lleihau crynodiadau o NAD^plws, NADH, NADP^plws, a NADPH, a achubwyd gyda formate (Ffigur S4C). Fodd bynnag, NAD^plws/NADH a NADP^plwsNid oedd y cymarebau NADPH wedi newid ar draws amodau. Mae hyn, ynghyd â diffyg newid mewn rhywogaethau ocsigen adweithiol cellog (ROS) a superoxide mitocondriaidd (Ffigur S4D), yn awgrymu bod newidiadau yn y cyflwr rhydocs yn annhebygol o gyfrannu'n fawr at ffenoteip MTHFD2i.

Mae diffyg MTHFD2 mewn vivo yn lleihau difrifoldeb clefydau llidiol lluosog

Profwyd effeithiolrwydd MTHFD2 fel targed therapiwtig nesaf mewn model gorsensitifrwydd tebyg i oedi wrth ddibynnu ar gelloedd T (DTH) in vivo. Cafodd llygod eu himiwneiddio a'u herio ar y glust gyda hemocyanin llygad y clo (KLH) i achosi llid lleol a'u trin â cherbyd geneuol neu MTHFD2i. Nid oedd triniaeth yn dangos unrhyw wenwyndra amlwg oherwydd bod anifeiliaid yn cynnal eu pwysau (Ffigur S5A). Yn bwysig, cynyddwyd trwch a phwysau clust mewn llygod rheoli DTH ond nid mewn anifeiliaid sy'n cael eu trin ag atalyddion, gan nodi amddiffyniad rhag llid ar driniaeth MTHFD2i (Ffigurau 7A, 7B, a S5B). Gostyngwyd hefyd imiwnoglobwlin G (IgG) KLH-benodol ar y dos uchaf o atalydd, gan nodi effeithiau posibl yn ymestyn i swyddogaeth celloedd B (Ffigur 7C).

Ffigur 7. Mae targedu MTHFD2 in vivo yn lleihau difrifoldeb y clefyd mewn modelau DTH, EAE, ac IBD

(A a B) Clust (A) trwch cymharol a (B) pwysau biopsi 10 diwrnod ar ôl KLH gydag imiwneiddiad CFA a 3 diwrnod ar ôl her KLH i gymell DTH (ANOVA unffordd). Roedd llygod yn cael eu trin ddwywaith y dydd gyda rhai geneuol 0, 100, neu 300 mg/kg MTHFD2i (cymedr ± SEM, n=8 atgynyrchiadau biolegol).

(C) Crynodiad IgG KLH-benodol ar ddiwrnod 10 o DTH a achosir gan KLH (cymedr ± SEM, prawf Kruskal-Wallis, n=8 dyblygu biolegol).

(D) Sgôr glinigol gyfartalog dros amser mewn sbwriel WT a CD4DMthfd2 wedi'u himiwneiddio â MOG gyda CFA a PTX i gymell EAE (cymedr ± SEM, profion Mann-Whitney lluosog, mae data'n gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol, pob un â 5 atgynhyrchiad biolegol).

(E) cyfrif celloedd ac amlder celloedd CD4 ynghyd â T ym llinyn asgwrn cefn llygod EAE ar ddifrifoldeb afiechyd brig (cymedr ± SEM, prawf t heb ei baru, mae data'n gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 9 atgynhyrchiad biolegol).

(F) mynegiant CD25 a CD44 yn CD4 ynghyd â chelloedd T o linyn asgwrn y cefn o EAE llygod (cymedr ± SEM, prawf t heb eu paru, n=4 dyblygu biolegol).

(G a H) Cyfrif celloedd (G) T-bet plus , RORgt plus , FoxP3 plus , cymhareb FoxP3 plws /T-bet plus, cymhareb FoxP3 plws /RORgt plws a (H) IL-17 plws , IFNg plws , ac IL-17 ynghyd ag IFNg a CD4 ynghyd â chelloedd T o linyn asgwrn cefn llygod EAE (cymedr ± SEM, prawf t heb ei baru, mae data yn gynrychioliadol o ddau arbrawf annibynnol gyda chyfanswm o 9 atgynhyrchiad biolegol).

(I) H&E, gwrth-CD3 IHC, a Luxol Fast Blue (LFB) yn staenio ar gyfer myelin ym madruddyn y cefn o lygoden WT heb unrhyw imiwneiddiad a sbwriel WT a CD4DMthfd2 gydag EAE yn ystod afiechyd brig (chwyddiad 2003, cynrychioli 5 atgynhyrchiad biolegol ).

(J) Newid ym mhwysau'r corff dros amser Rag1^__/__llygod chwistrellu ip gyda WT neu CD4DMthfd2 naïf CD4 ynghyd â chelloedd T i gymell colitis IBD (cymedr ± SEM, profion t lluosog, n=8 dyblygu biolegol).

(K ac L) Cyfrif celloedd o (K) cyfanswm CD4 ynghyd â chelloedd T a (L) T-bet plus , RORgt plus , a FoxP3 ynghyd â chelloedd CD4 plws T o MLNs o lygod IBD (cymedr ± SEM, prawf t heb ei baru n { {4}} atgynhyrchiadau biolegol). Gweler hefyd Ffigurau S5 ac S6. Mae canlyniadau ystadegol arwyddocaol wedi'u labelu (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" y="" cant="">

Yn yr un modd, roedd yr atalydd MTHFD1/2 deuol LY345899 (Gustafsson et al., 2017) yn effeithiol wrth wella afiechyd mewn model EAE. Cafodd EAE ei ysgogi gyda MOG a PTX, a chafodd llygod eu trin yn ddyddiol gyda chwistrelliad mewnperitoneol (ip) o DMSO neu LY345899. Arweiniodd triniaeth atalyddion at ostyngiad sylweddol mewn difrifoldeb afiechyd a sgôr glinigol gronnus o gymharu â cherbyd (Ffigurau S5C ac S5D). Aberthwyd llygod ar ddiwrnod 26, a chasglwyd celloedd sy'n ymdreiddio i fadruddyn y cefn ar gyfer proffilio imiwnedd. Yn nodedig, gryn dipyn yn llai o CD45^plws, CD4^plws, a CD8^plwsgwnaeth celloedd ymdreiddio i linyn asgwrn y cefn llygod a gafodd eu trin â LY345899-(Ffigurau S5E–S5G). Nid oedd unrhyw newidiadau yn amlder ROR t^plwsneu LlwynogP3^plwscelloedd ymhlith y CD4 sy'n ymdreiddio^plwsCelloedd T (Ffigur S5H). Fodd bynnag, bu gostyngiad yn amlder IFNg ac IL-17 plws celloedd a chynnydd mewn IL-17 ynghyd â chelloedd (Ffigur S5I), gan awgrymu newid posibl i ffenoteip llai pathogenig.

Er mwyn profi dibyniaeth cell-gynhenid ​​​​T yn uniongyrchol ar MTHFD2 in vivo, roedd sbwriel WT a CD4DMthfd2 yn destun tri model gwahanol: EAE, clefyd y coluddyn llid (IBD), a chlefyd llwybr anadlu alergaidd. Cafodd EAE ei ysgogi eto gyda MOG a PTX, ac, yn debyg i'r arbrawf atalydd, roedd llygod CD4DMthfd2 wedi lleihau difrifoldeb afiechyd yn sylweddol dros 26 diwrnod (Ffigur 7D). Cafodd carfan ar wahân ei ewthaneiddio adeg afiechyd brig ar ddiwrnod 15 ar ôl sefydlu ar gyfer ffenoteipio celloedd T (Ffigurau S6A a S6B). Er bod CD4^plwsneu CD8^plwsNid oedd cyfrif celloedd T wedi newid yn y ddueg (Ffigur S6C), gostyngodd ymdreiddiad celloedd T4 i linyn y cefn yn sylweddol (Ffigur 7E). Roedd gan linyn y cefn yn treiddio celloedd CD4 ynghyd â T mewn llygod CD4DMthfd2 fynegiant CD25 tebyg i'r WT ond gostyngodd mynegiant CD44, gan bwyntio at actifadu â nam rhannol (Ffigur 7F). Mae niferoedd y T-bet^plwsGostyngwyd celloedd , ROR t plus , a FoxP3 plus (Ffigur 7G), yn ogystal â chelloedd IL-17 plus ac IFNg plus (Ffigur 7H), ym llinyn asgwrn cefn llygod CD4DMthfd2 o'i gymharu â'r WT. Yn nodedig, dyrchafwyd cymarebau celloedd FoxP3 plus i T-bet plus a RORgt plus mewn llygod CD4DMthfd2 o gymharu â'r WT ar adegau brig, gan adlewyrchu canfyddiadau in vitro mynegiant FoxP3 cynyddol gyda diffyg MTHFD2 (Ffigur 7G). Er bod amlder celloedd mynegi TF ymhlith celloedd ymdreiddio yn tueddu i fod yn uwch, nid oedd amlder mynegiant cytocin wedi newid (Ffigurau S6D a S6E). Histoleg llinyn asgwrn cefn llygod rheoli heb EAE a WT a CD4^ΔMthfd2dangosodd llygod ag EAE fwy o gellogedd a CD3 positif ym madruddyn y cefn mewn llygod WT a oedd yn gysylltiedig â dadmyelination, fel y dangosir gan staenio Luxol Fast Blue (Ffigur 7I). Roedd y newidiadau hyn yn absennol mewn rheolaeth dim-EAE a CD4^ΔMthfd2llygod.

Profwyd rôl MTHFD2 nesaf mewn modelau IBD a chlefyd llwybr anadlu alergaidd. Trosglwyddwyd celloedd CD4 plus T naïf WT a CD4DMthfd2 i Rag1 / derbynwyr i gychwyn IBD. Er bod llygod a dderbyniodd gelloedd WT wedi dechrau colli pwysau wrth i IBD fynd rhagddo, parhaodd derbynwyr celloedd T CD4DMthfd2 i ennill pwysau (Ffigur 7J). Canfuwyd cryn dipyn yn llai o niferoedd ac amlder celloedd T CD4DMthfd2 mewn dueg (Ffigur S6F) a nodau lymff mesenterig (MLNs) sy'n draenio'r colon (Ffigurau 7K a S6G). Gostyngwyd nifer y celloedd T-bet plus , ROR t plus , a FoxP3 ynghyd â CD4DMthfd2 T hefyd mewn MLNs, ond cynyddwyd amlder celloedd FoxP3 plus (Ffigurau 7L a S6H). Fodd bynnag, nid oedd unrhyw wahaniaethau yng nghymarebau cyfrif celloedd FoxP3/T-bet a FoxP3/RORgt mewn MLNs ar y pwynt amser cam hwyr hwn (Ffigur S6I). Yn debyg i ganfyddiadau MTHFD2 fel trawiad cymedrol yn y sgrin CRISPR llid llwybr anadlu in vivo (Ffigur 1C), roedd gan lygod CD4DMthfd2 a oedd yn destun clefyd llwybr anadlu alergaidd a achosir gan Alternaria duedd o ostyngiad yn helaethrwydd niwtroffil yn hylif lavage bronciolfeolar (BALF), er na gwelwyd newidiadau mewn cyfrifon lymffocyt BALF, eosinoffil, a macrophage (Ffigur S7A).

Yn olaf, profwyd effaith y MTHFD2i ar weithgaredd imiwnedd cyffredinol. CD45.2 OT-II penodol OVA^plwsCD4^plwsTrosglwyddwyd celloedd T yn fabwysiadol i CD45.1^plwsllygod, a gafodd eu himiwneiddio wedyn yn isgroenol ag emwlsiwn o OVA gyda chynorthwyydd Freund cyflawn (CFA) a'u trin yn ddyddiol gyda cherbyd llafar neu'r MTHFD2i. Nid oedd pwysau corff wedi newid o dan bob amod (Ffigur S7B). Ehangu'r CD45.2 OT-II a drosglwyddwyd^plwsbu oedi ychydig mewn celloedd o ran llygod a gafodd eu trin â MTHFD2i wedi'u himiwneiddio ond cyrhaeddodd nifer y cerbydau erbyn diwrnod 7 (Ffigurau S7C-S7E). Fodd bynnag, gostyngwyd amlder celloedd IFNg plws wrth ddraenio LNs (Ffigur S7F). Mae'r data hyn yn dangos bod triniaeth MTHFD2i in vivo yn caniatáu ehangu celloedd T sy'n benodol i antigen yn dilyn ysgogiad acíwt, er gyda chynhyrchiad cytocin llidiol llaith.

TRAFODAETH

Mae actifadu, gwahaniaethu a swyddogaeth celloedd T yn gofyn am ailraglennu metabolaidd priodol i fodloni gofynion cynyddol y celloedd am ynni, blociau adeiladu biosynthetig a moleciwlau signalau. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i swyddogaeth metaboledd 1C mewn celloedd CD4 cynradd ynghyd â T. Gan ddefnyddio cyfuniad o sgrinio cell T sylfaenol CRISPR yn seiliedig ar CRISPR a data mynegiant genynnau, nodwyd MTHFD2 fel targed posibl ar gyfer therapïau gwrthlidiol. Yn gyffredinol, arweiniodd ataliad neu ddiffyg MTHFD2 at ostyngiad mewn amlhau celloedd CD4 ynghyd â T. Yn nodedig, roedd hyn yn gysylltiedig ag ymsefydlu mynegiant FoxP3 a swyddogaeth ataliol yng nghelloedd Th17 yn ogystal â gwell gwahaniaethu celloedd Treg. Mae'r data hyn yn awgrymu y gall MTHFD2 weithredu fel pwynt gwirio metabolig yn echelin cell Th17-Treg, gyda thriniaeth MTHFD2i yn gwnïo'r cydbwysedd o ffenoteip pathogenig i ffenoteip mwy gwrthlidiol. Yn wir, roedd ataliad MTHFD2 neu ddiffyg genetig yn lleddfu difrifoldeb y clefyd mewn modelau lluosog mewn vivo o awtoimiwnedd a gorsensitifrwydd.

Mae metaboledd 1C yn cynnwys metaboledd serine-glycine, y cylch ffolad, a'r cylch methionin ac mae'n ganolog i sawl proses, gan gynnwys synthesis purin de novo, cynhyrchu rhoddwyr methyl, a rheoleiddio rhydocs (Yang a Vousden, 2016). Mae metaboledd 1C yn ymgysylltu'n gadarn ag ysgogiad TCR (Tan et al., 2017) ac mae'n ofynnol i gefnogi ehangu celloedd T (Ma et al., 2017). Mae'r gylchred ffolad wedi'i rhannu'n gydrannau sytosolig a mitocondriaidd. Yn y cytosol, mae MTHFD1 yn rhyng-drosi 5,10-methyleneTHF, 10-formylTHF, a fformat. Mewn mitocondria, cyflawnir yr un adweithiau gan MTHFD2 a MTHFD1L. Defnyddir y canolraddau canlyniadol hyn i gefnogi camau ffurfio mewn synthesis purin de novo. Gall MTHFD1 a MTHFD2 hefyd fodiwleiddio cyflwr rhydocs trwy gynhyrchu NAD(H) a NADP(H) (Ducker a Rabinowitz, 2017). Er bod rhai mathau o gelloedd yn dangos hyblygrwydd wrth newid i’r ffynhonnell sytosolig o dan osodiadau camweithrediad llwybr mitocondriaidd (Ducker et al., 2016), cynigiwyd yn flaenorol bod celloedd T yn dibynnu’n bennaf ar y llwybr mitocondriaidd i ddarparu unedau 1C a rhywogaethau gostyngol (Ron-). Harel et al., 2016). Dangoswyd hefyd bod celloedd T yn dibynnu ar dderbyniad serine, a gall ymatebion imiwn in vivo gael eu modiwleiddio gan symiau serine dietegol. Mae effeithiau newyn serine yn cael eu cyfryngu trwy gyfyngu ar biosynthesis purin hyd yn oed ym mhresenoldeb llwybrau achub cyfan a gellir eu hosgoi trwy ddarparu glycin a formate (Ma et al., 2017). Mae ein data yn ychwanegu at y canfyddiadau hyn ac yn cyfeirio at MTHFD2 fel rheolydd hanfodol sy'n dylanwadu ar CD4^plwsAmlhau a gwahaniaethu celloedd T.

Echanicoside

Er bod metaboledd 1C yn chwarae rhan eang mewn metaboledd celloedd, canfuom fod rhai swyddogaethau'n wahanol i ddewis is-setiau celloedd T. Ymledodd pob cell T dynol a llygoden i raddau llai gyda diffyg MTHFD2, gan nodi swyddogaeth a rennir ar gyfer MTHFD2 i gefnogi twf celloedd T a rhannu. Fodd bynnag, roedd effeithiau diffyg MTHFD2 ar wahaniaethu celloedd T a swyddogaeth effeithydd yn wahanol ym mhob is-set a brofwyd. Dangosodd celloedd Th1 wahaniaethau diffygiol gyda llai o anwythiad o T-bet a llai o gynhyrchu cytocin. Roedd celloedd Th17 hefyd wedi newid gwahaniaethu ac wedi lleihau cynhyrchiant cytocin. Er na chafodd ROR t ei newid, fe wnaeth celloedd diffygiol Th17 MTHFD ail-reoleiddio cell Treg TF FoxP3 a chael y gallu i atal toreth o gelloedd CD8 a T actifedig. Roedd celloedd Treg yn dangos gwahaniaethu gwell o dan amodau TGF-b isel. Mae wedi’i hen sefydlu bellach y gall fod gan bob un o’r is-setiau hyn ofynion metabolaidd gwahanol (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Mae ein data yn dangos bod angen MTHFD2 hefyd yn ddetholus ar gyfer celloedd Teff wrth hyrwyddo tynged a swyddogaeth celloedd Treg. Mae'n nodedig bod y canlyniadau hyn yn wahanol i ddiffygion GLUT1, GLS, neu ASCT2 sy'n amharu ar neu'n newid gwahaniaethu celloedd Teff tra'n cael effeithiau cymedrol i hyrwyddo gwahaniaethu celloedd Treg yn uniongyrchol neu drawswahaniaethu o gelloedd Th17 i Treg (Johnson et al., 2018; Macintyre et al ., 2014; Nakaya et al., 2014).

Mae'n ymddangos bod y tynged celloedd T gwahanol hyn yn dibynnu ar weithgaredd ensymatig MTHFD2 oherwydd bod effeithiau diffyg MTHFD2 wedi'u hachub gyda niwcleobasau formate neu purine. Er na welsom unrhyw effaith sylweddol o newid cydbwysedd rhydocs gyda diffyg MTHFD2, mae'n ymddangos bod newid synthesis purin de novo yn hollbwysig. Arweiniodd triniaeth MTHFD2i at lai o grynodiadau purin, yn enwedig guanîn wrth achosi croniad o'r canolradd synthesis purin GAR, SAICAR, ac AICAR. Mae angen ffurfiant ar y canolraddau hyn ar gyfer biosynthesis pellach, a chafodd yr effeithiau eu hachub pan ychwanegwyd y fformat metabolyn sy'n deillio o MTHFD2- at y cyfrwng, gan gefnogi mecanwaith biocemegol ar y targed ar gyfer y MTHFD2i. Mae synthesis niwcleotid de novo i gefnogi synthesis DNA a RNA yn hanfodol ar gyfer amlhau celloedd T (Que’me´ neur et al., 2003, 2004). Felly, mae'n ymddangos bod elfen o'r mecanwaith y mae'r MTHFD2i yn ei ddefnyddio i amharu ar ehangiad celloedd T yn cynhyrchu niwcleotidau annigonol.

Flavonoid

Gall methu â syntheseiddio niwcleotidau digonol atal celloedd effaithydd T trwy fecanweithiau lluosog. Mae AMPK a mTORC1 yn brif yrwyr ailraglennu metabolaidd gyda rolau gwrthwynebol yn gyffredinol yng nghelloedd Teff a Treg (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Rydym yn dangos bod triniaeth MTHFD2i mewn celloedd T wedi arwain at groniad acíwt o AICAR, metabolyn sy'n nodedig fel ysgogydd analog adenosine ac AMPK (Rae a Mairs, 2019; Su et al., 2019). Fodd bynnag, nid oedd unrhyw dystiolaeth o gynnydd mewn gweithgaredd AMPK ar yr adegau penodol. Gall hyn adlewyrchu rheoleiddio ychwanegol o AMPK, ond gall AICAR hefyd gael effeithiau annibynnol ar AMPK (Dembitz et al., 2019). Mae mTORC1 hefyd yn sensitif i grynodiadau purin oherwydd bod llai o guanîn ar gael yn atal gweithgaredd yr actifydd mTORC1 Rheb (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). Gall croniad AICAR a gostyngiad mewn gweithgaredd mTORC1 felly gyfrannu at gynhyrchu nam o gelloedd Th1 a Th17 a driniwyd gan MTHFD2i a chynhyrchu gwell o gelloedd Treg. Gall atal signalau mTORC1 hefyd gyfrannu at y newid yn y rhaglen metabolig o glycolysis i resbiradaeth mitocondriaidd a helaethrwydd metabolyn TCA wedi'i newid mewn celloedd Th17 sy'n cael eu trin â MTHFD2i. Mae llwybr mTORC1 yn chwarae rhan ganolog wrth hyrwyddo metaboledd anabolig a gall ysgogi crynhoad o'r TF ATF4, a all, yn ei dro, gymell mynegiant MTHFD2 (Ben-Sahra et al., 2016).

Mae fflwcs metabolig yn gysylltiedig â rheoleiddio epigenetig oherwydd bod metabolion yn cyfrannu at lawer o addasiadau epigenetig (Sharma a Rando, 2017), gan gynnwys metaboledd 1C i gynhyrchu'r rhoddwr methyl cyffredinol S-adenosyl methionine (SAM) ar gyfer protein a methylation DNA. Fodd bynnag, mae arbrofion olrhain carbon mewn celloedd T actifedig yn awgrymu nad yw unedau 1C sy'n deillio o serine sy'n deillio o glwcos a serine alldarddol yn cyfrannu'n ystyrlon at y cylch methionin a methylation (Ma et al., 2017). Gall fflwcs metabolig hefyd effeithio ar batrymau methylation trwy newidiadau yn y doreth o fetabolion TCA, gan gynnwys alffa-ketoglutarate, fumarate, a succinate. Yn benodol, mae fumarate a succinate yn atal DNA a histone demethylases (Su et al., 2016). Yn gyson â disbyddu'r metabolion hyn mewn celloedd Th17 a gafodd eu trin â MTHFD2i, gostyngwyd H3K27me3 yn eang ar draws y genom, a gostyngwyd methylation DNA yn benodol yn hyrwyddwr procsimol Foxp3, a allai fod yn cyfrannu at y ffenoteip trawswahaniaethu. Ni achubwyd ffenoteip trawswahaniaethu celloedd Th17 trwy atodiad formate, sy'n nodi bod llwybrau ychwanegol yn debygol o gyfrannu at reoleiddio FoxP3, megis trwy weithgaredd mecanweithiau synhwyro-crynhoad niwcleotid eraill.

Acteoside(Verbascoside)

Adroddwyd hefyd bod MTHFD2 yn chwarae rolau nad ydynt yn enzymatig a allai gyfrannu at weithredoedd pro-llidiol yr ensym hwn. Mewn celloedd canser, gall MTHFD2 gael swyddogaethau niwclear, gan gyd-leoli â safleoedd atgynhyrchu DNA i hyrwyddo dilyniant cylchred celloedd (Gustafsson Sheppard et al., 2015). Mewn bôn-gelloedd murine, dangoswyd bod MTHFD2 yn modiwleiddio atgyweirio DNA i gynnal sefydlogrwydd genomig (Yue et al., 2020). Mewn carcinoma celloedd arennol, canfuwyd bod MTHFD2 yn hanfodol ar gyfer ailraglennu metabolaidd trwy methylation mRNA (Green et al., 2019). Er nad yw'r rolau hyn ar gyfer MTHFD2 yn annibynnol ar ei gilydd gyda'n canfyddiadau, mae gallu formate i achub llawer o'r ffenoteipiau o ddiffyg MTHFD2 mewn celloedd T yn awgrymu mai gweithgaredd ensymatig MTHFD2 yw prif yrrwr amlhau a thynged celloedd T.

Mae MTHFD2 wedi'i ystyried i raddau helaeth yn darged cyffuriau mewn lleoliadau gwrth-ganser. Gall hefyd fod yn darged gwrthlidiol addawol a chynnig llai o effeithiau andwyol o gymharu â gwrth-ffoladau sydd ar gael ar hyn o bryd, o ystyried mynegiant isel yn y rhan fwyaf o feinweoedd oedolion. Er enghraifft, mynegir un targed o MTX, DHFR, yn helaeth mewn meinweoedd oedolion (Nilsson et al., 2014). Felly, gall MTX fod yn gysylltiedig ag amrywiaeth o effeithiau andwyol, gan gynnwys gwenwyndra gastroberfeddol. At hynny, nid yw mecanwaith gweithredu MTX yn cael ei ddeall yn dda er gwaethaf ei hanes helaeth (Cronstein ac Aune, 2020). Gall y mynegiant tra rheoledig o MTHFD2 a'r potensial ar gyfer diswyddo gyda'r llwybr MTHFD1 sytosolig arwain at ddibyniaeth ddetholus o boblogaethau celloedd penodol ar MTHFD2. Mae ein canfyddiadau yn nodi MTHFD2 fel pwynt gwirio metabolig critigol yn CD4^plwscelloedd T. Er bod gorgyffwrdd eang rhwng bioleg celloedd canser a bioleg celloedd T sy'n amlhau'n gyflym, gwelwn fod is-setiau celloedd T CD4 ynghyd â T yn dangos sensitifrwydd ychwanegol trwy fodiwleiddio gwahaniaethu celloedd a swyddogaeth. Mae'n debygol y gallai targedu MTHFD2 mewn therapïau canser atal imiwnedd gwrth-tiwmor. Fodd bynnag, gall lleoliadau fel carcinoma colorefrol, lle mae llid trwy gyfrwng celloedd Th17 yn cyfrannu at afiechyd, fod yn addas iawn ar gyfer MTHFD2is. Gall sensitifrwydd celloedd T i MTHFD2is fod yn ffurf effeithiol o imiwnotherapi mewn lleoliadau CD4^plwsLlid a yrrir gan gelloedd T y tu hwnt i ganser ac yn arwain at lai o effeithiau andwyol nag asiantau therapiwtig sydd ar gael ar hyn o bryd.

Cyfyngiadau astudio

Mae gan yr MTHFD2i a ddefnyddir yn yr astudiaeth hon werth IC50 o 0.0063 mM ar gyfer MTHFD2 a 0.57 mM ar gyfer MTHFD1; felly, ni ellir eithrio mân effeithiau ataliad deuol MTHFD2 a MTHFD1 oddi ar y targed. O ystyried na chafodd y dadreoleiddiad FoxP3 afreolaidd mewn celloeddTh17 ei achub trwy ddarparu fformat ond roedd gweithgaredd mTORC1, mae angen ymchwilio ymhellach i'r mecanwaith sy'n sail i'r ffenoteip hwn. Yn ogystal, perfformiwyd yr holl fodelau in vivo gyda thriniaeth MTHFD2i neu abladiad genetig o adeg sefydlu'r clefyd, a pherfformiwyd ffenoteipio celloedd T ar un pwynt amser. Er mwyn nodweddu effaith diffyg MTHFD2 yn well ar bathogenesis afiechyd, dylai astudiaethau pellach gynnwys arbrofion cwrs amser gyda nodweddu cyfresol poblogaethau celloedd T i benderfynu'n fwy pendant a yw is-setiau celloedd T CD4 a T yn cael eu heffeithio'n wahaniaethol in vivo. Yn olaf, er mwyn gwella perthnasedd yr astudiaeth hon i gymwysiadau clinigol, dylid profi effeithiolrwydd triniaeth MTHFD2i a ddechreuwyd ar ôl i'r clefyd ddechrau.

DULLIAU STAR★

Darperir dulliau manwl yn fersiwn ar-lein y papur hwn ac maent yn cynnwys y canlynol:

• TABL ADNODDAU ALLWEDDOL

• ARGAELEDD ADNODDAU

• B Cyswllt arweiniol

• B Deunyddiau sydd ar gael

• B Data a chod sydd ar gael

  
  

• MODEL ARBROFOL A MANYLION PWNC

• B Llygod B Celloedd T Dynol

• B Llinellau Cell

  
  

• MANYLION Y DULL

• B Llygoden in vitro CD4^plwsGweithrediad celloedd T a gwahaniaethu

• B Th17 assay ataliad celloedd

• B CD4 dynol in vitro^plwsT amodau diwylliant cell

• B Sgrinio CRISPR B Metabolomeg sbectrometreg màs

• B Sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear proton (1H-MRS)

• B Imiwnoblotio

• B TORRI A RHEDEG B EpigenDx Wedi'i Dargedu NextGen Bisulfifite Sequencing

• B Modelau EAE in vivo ar gyfer IHC a sytometreg llif

• B Triniaeth in vivo LY345899 mewn model EAE

• B Triniaeth in vivo DS18561882 mewn model DTH B Model IBD in vivo gyda WT a CD4^ΔMthfd2sbwriel

• B Model clefyd llwybr anadlu alergaidd in vivo gyda WT a CD4^ΔMthfd2sbwriel

• B Triniaeth in vivo DS18561882 mewn model imiwneiddio OVA

  
  

• MESURIAD A DADANSODDIAD YSTADEGOL

GWYBODAETH ATODOL

Gellir dod o hyd i wybodaeth atodol ar-lein yn https://doi.org/10.1016/j. imiwn.2021.10.011.

DIOLCHIADAU

Diolchwn i aelodau labordy Rathmell am gyfrannu at y prosiect hwn. Diolchwn i Thomas Aune am ddarparu data RNA-seq a J. Cools (VIB) am ddarparu'r lluniad pMx-U6-gRNA-GFP. Diolchwn i Max R. Van Belkum am ddylunio paent preimio qPCR MTHFD2. Diolchwn i Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman, a Mark Manfredi o Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) am ddarparu cyfansoddyn Raze 1459, a ddefnyddiwyd i gadarnhau canfyddiadau (data heb ei ddangos). Crëwyd diagramau gyda BioRender. Rydym yn cydnabod yr Adnodd a Rennir Patholeg Drosiadol, a gefnogir gan grant cymorth NCI/NIH Cancer Centre 5P30 CA68485-19 a grant offeryniaeth a rennir S10 OD023475-01A1, ar gyfer Leica Bond RX. Cefnogwyd y gwaith hwn gan Wobr Arloeswr Nodedig William E. Paul ar gyfer Cynghrair Ymchwil Lupus (i JCR), R01s DK105550 (i JCR), HL136664 (i JCR a DCN), CA217987 (i JCR), AI153167 (i JCR), AI137075 (i AKM), T32 DK101003 (KV), a T32 GM007347 (i UG).

CYFRANIADAU AWDUR

AS, GA, a JCR gynlluniodd yr ymchwil. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB, a JCG-C. gwneud yr ymchwil. Dadansoddodd AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR, a JCR ddata. Ysgrifennodd AS a JCR y papur gyda chyfraniadau gan yr awduron eraill.

DATGANIAD O DDIDDORDEBAU

Mae JCR yn un o sylfaenwyr, aelod bwrdd cynghori gwyddonol, a deiliad stoc Sitryx Therapeutics; aelod o fwrdd cynghori gwyddonol a deiliad stoc o Caribou Biosciences; aelod o fwrdd cynghori gwyddonol NirogyTherapeutics; wedi ymgynghori ar ran Merck, Pfizer, a Mitobridge o fewn y 3 blynedd diwethaf; ac mae wedi derbyn cymorth ymchwil gan Incyte Corp., CalitheraBiosciences, a Tempest Therapeutics. Mae JDR yn gyd-sylfaenydd a deiliad stoc yn Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics, a Farber Partners ac yn gynghorydd a deiliad stoc yn Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, Sefydliad Barer, a LEAF Pharmaceuticals; mae wedi derbyn ffioedd ymgynghori a chyllid ymchwil gan Pfizer a Rafael ac ef yw dyfeisiwr patentau a ddelir gan Brifysgol Princeton. Mae AMC, PF, a TB yn weithwyr Sitryx Therapeutics.

CYNHWYSIAD AC AMRYWIAETH

Buom yn gweithio i sicrhau cydbwysedd rhwng y rhywiau wrth ddewis pynciau nad ydynt yn ddynol. Mae un neu fwy o awduron y papur hwn yn nodi eu hunain fel lleiafrif ethnig heb gynrychiolaeth ddigonol mewn gwyddoniaeth. Wrth ddyfynnu cyfeiriadau sy’n wyddonol berthnasol i’r gwaith hwn, buom hefyd yn gweithio’n frwd i hyrwyddo cydbwysedd rhwng y rhywiau yn ein rhestr gyfeirio. Mae rhestr awduron y papur hwn yn cynnwys cyfranwyr o’r lleoliad lle cynhaliwyd yr ymchwil a gymerodd ran yn y gwaith o gasglu data, dylunio, dadansoddi a/neu ddehongli’r gwaith.

CYFEIRIADAU

Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R., et al. (2017). Mae Tirwedd o Gydweithrediad Therapiwtig mewn Canserau Mutant KRAS yn Datgelu Egwyddorion ar gyfer Rheoli Esblygiad Tiwmor. Cell Rep. 20, 999–1015.

Aune, TM, Crooke, PS, 3ydd, Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ, a Spurlock, CF, 3ydd (2017). Mynegiant o RNAS hir heb godio mewn awtoimiwnedd a chyswllt â swyddogaeth enhancer ac amrywiadau genetig risg clefyd awtoimiwn. J. Autoimmun. 81, 99–109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G., a Hess, C. (2018). Sbectrwm metaboledd celloedd T mewn iechyd ac afiechyd. Nat. Parch Immunol. 18, 19–34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM, a Manning, BD (2016). Mae mTORC1 yn ysgogi synthesis purin trwy reoli'r cylch tetrahydrofolate mitocondriaidd. Gwyddoniaeth 351, 728–733.

Brown, PM, Pratt, AG, ac Isaacs, JD (2016). Mecanwaith gweithredu methotrexate mewn arthritis gwynegol, a chwilio am fiofarcwyr. Nat. Rheumatol y Parch. 12, 731–742.

Buck, MD, O'Sullivan, D., a Pearce, EL (2015). Mae metaboledd celloedd T yn gyrru imiwnedd. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA, a Sabatini, DM (2017). Mae Cyfrwng Ffisiolegol yn Ail-weirio Metabolaeth Cellog ac yn Datgelu Asid Wrig fel Atalydd Mewndarddol o Synthase UMP. Cell 169, 258–272.e17.

Cronstein, BN, ac Aune, TM (2020). Methotrexate a'i fecanweithiau gweithredu mewn arthritis llidiol. Nat. Rheumatol y Parch. 16, 145–154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A., a Visnjic, D. (2019). Mae'r AICAr ribonucleoside yn cymell gwahaniaethu lewcemia myeloid trwy actifadu'r ATR/Chk1 trwy ddisbyddu pyrimidin. J. Biol. Cemeg. 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L., a Friese, MA (2015). Imiwnopatholeg sglerosis ymledol. Nat. Parch Immunol. 15, 545–558.

Ducker, GS, a Rabinowitz, JD (2017). Metabolaeth Un-Carbon mewn Iechyd a Chlefyd. Cell Metab. 25, 27–42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y., a Rabinowitz, JD (2016). Mae Gwrthdroi Fflwcs Carbon Cytosolig Un yn Digolledu am Golli Llwybr Ffolad Mitocondriaidd. Cell Metab. 23, 1140–1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT, ac Unsal-Kacmaz, K .(2017). Argaeledd Niwcleotid Purin Yn Rheoleiddio Gweithgaredd mTORC1 trwy'r Rheb GTPase. Cell Rep. 19, 2665–2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF, a Wolff, JA (1948). Rhyddhad dros dro mewn lewcemia acíwt mewn plant a gynhyrchir gan antagonist asid ffolig, 4-asid aminopteroyl-glutamig. N. Saesneg. J. Med. 238, 787–793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS, a Stover, PJ (2015). Mewnwelediadau newydd i benderfynyddion metabolaidd a maethol diffyg imiwnedd cyfun difrifol. Dis Prin. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr., a Newcomb, DC (2018). Testosterone yn Lleihau Llwch Tŷ Gwiddonyn-Anwythol Math 2 ac IL-17Llid Llwybr Anadlu A-Gyfryngol. J. Immunol. 201, 1843–1854.

Govindaraju, V., Young, K., a Maudsley, AA (2000). Sifftiau cemegol Proton NMR a chysonion cyplu ar gyfer metabolion yr ymennydd. NMR Biomed. 13, 129–153.

Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E., a Danesh, FR (2019). Mae MTHFD2 yn cysylltu methylation RNA ag ailraglennu metabolaidd mewn carcinoma celloedd arennol. Oncogen 38, 6211–6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€aggblad, M., et al. (2017). Strwythur Crisial y Canser sy'n Dod i'r Amlwg Targed MTHFD2 mewn Cymhleth ag Atalydd Seiliedig ar Is-haen. Canser Res. 77, 937–948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M. ., a Nilsson, R. (2015). Mae'r ensym cyplydd ffolad MTHFD2 yn brotein niwclear ac yn hyrwyddo amlhau celloedd. Sci. Cyf 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I., a Manning, BD (2017). Mae Rhwydwaith Signalau mTORC1 yn Synhwyro Newidiadau mewn Lefelau Niwcleotid Pwrin Cellog. Cell Rep. 21, 1331–1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, et al. (2018). Rheoliad Unigryw o Gwahaniaethu Celloedd Th17 a Th1 yn ôl Metabolaeth Glutaminase-Dibynnol. Cell 175, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., et al. (2019). Modiwleiddio Homeostasis Redox trwy Atal MTHFD2 mewn Canser Colorectol: Mecanweithiau a Goblygiadau Therapiwtig. J. Natl. Sefydliad Canser. 111, 584–596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., et al. (2019). Darganfod Atalydd MTHFD2 Galluol, Dewisol, sydd ar Gael ar Lafar (DS18561882) gyda Gweithgaredd Antitumor Vivo. J. Med. Cemeg. 62, 10204–10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J., a Ha, J. (2016). Ysgogyddion AMPK: mecanweithiau gweithredu a gweithgareddau ffisiolegol. Exp. Mol. Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN, a Keun, HC (2016). Mae Atal MTHFD2 mewn MCF-7 Celloedd Canser y Fron yn Cynyddu Glycolysis, Dibyniaeth ar Glycine Alldarddol, a Sensitifrwydd i Ddisbyddu Ffolad. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Cariad, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M., a Liu, XS (2014). Mae MAGECK yn galluogi adnabyddiaeth gadarn o genynnau hanfodol o sgriniau taro allan ar raddfa genom CRISPR/Cas9. Genom Biol. 15, 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, et al. (2017). Mae Serine yn Fetabolit Hanfodol ar gyfer Ehangu Cell T Effeithydd. Cell Metab. 25, 345–357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, et al. (2014). Mae'r Gludwr Glwcos Glut1 yn Hanfodol yn Ddewisol ar gyfer Ysgogi Cell T CD4 a Swyddogaeth Effeithydd. Cell Metab. 20, 61–72.

Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG, a Rathmell, JC (2011). Ar flaen y gad: mae rhaglenni metabolaidd glycolytig a lipid ocsideiddiol gwahanol yn hanfodol ar gyfer is-setiau celloedd T CD4 a rheoleiddiol. J. Immunol. 186, 3299–3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X., a Sun, S.-C . (2014). Mae ymatebion llidiol celloedd T yn dibynnu ar hwyluso cludwr asid amino ASCT2 o gymryd glutamin ac actifadu kinase mTORC1. Imiwnedd 40, 692–705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A., a Mootha, VK (2014). Mae mynegiant ensymau metabolig yn amlygu rôl allweddol ar gyfer MTHFD2 a'r llwybr ffolad mitocondriaidd mewn canser. Nat. Cymmun. 5, 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC, a Skaar, EP (2019). Mae'r Protein Imiwnedd Cynhenid ​​S100A9 yn Amddiffyn rhag Llid Llwybr Anadlu Alergaidd Math T-Helper 2-Math o gelloedd. Yn. J. Anadl. Cell Mol. Biol. 61, 459–468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, et al. (2016). Targedu MTHFD2 mewn lewcemia myeloid acíwt. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.

Que’ me’ neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P., a Genestier, L. (2003). Rheolaeth wahaniaethol o gylchred celloedd, ymlediad, a goroesiad lymffocytau T cynradd gan niwcleotidau purin a pyrimidin. J. Immunol. 170, 4986–4995.

Que’ me’ neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P., a Marvel, J. (2004). Mae cyfyngu ar biosynthesis niwcleotid de novo yn ymyrryd ag ehangiad clonal a gwahaniaethu i gelloedd effeithydd a chof CD8 T. J. Immunol. 173, 4945–4952.

Rae, C., a Mairs, RJ (2019). Mae gweithrediad AMPK gan AICAR yn sensiteiddio celloedd canser y brostad i radiotherapi. Oncotarget 10, 749–759.

Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB, et al. (2016). Biogenesis Mitochondrial ac Ailfodelu Proteome Hyrwyddo Metabolaeth Un-Carbon ar gyfer Ysgogi Cell T. Cell Metab. 24, 104–117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA, a Mangalam, AK (2019). Mae Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Mor Bwerus â COPAXONE mewn Model Anifeiliaid o Sglerosis Ymledol. Blaen. Imiwnol. 10, 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG, a Zhang, F. (2014). Sgrinio taro allan ar raddfa genom CRISPR-Cas9 mewn celloedd dynol. Gwyddoniaeth 343, 84–87.

Sharma, U.D., a Rando, OJ (2017). Mewnbynnau Metabolaidd i'r Epigenom. Cell Metab. 25, 544–558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR, a Chi, H. (2011). Mae llwybr glycolytig sy'n ddibynnol ar HIF1alpha yn trefnu pwynt gwirio metabolaidd ar gyfer gwahaniaethu celloedd T H17 a Treg. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.

Shin, M., Momb, J., ac Appling, DR (2017). Mae MTHFD2 mitocondriaidd dynol yn cofactor rhydocs deuol-benodol methylenetetrahydrofolate dehydrogenase / methyltetrahydrofolate cyclohydrolase. Metab Canser. 5, 11.

Skene, PJ, a Henikoff, S. (2017). Strategaeth niwcleas effeithlon wedi'i thargedu ar gyfer mapio cydraniad uchel o safleoedd rhwymo DNA. eBywyd 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., et al. (2019). Mae AICAR yn Cymell Apoptosis ac yn Atal Ymfudo a Goresgyniad yng Nghelloedd Canser y Prostad Trwy Lwybr Dibynnol AMPK/mTOR. Int. J. Mol. Sci. 20, 1647.

Su, X., Wellen, KE, a Rabinowitz, JD (2016). Rheolaeth metabolaidd o methylation ac asetyliad. Curr. Barn. Cemeg. Biol. 30, 52–60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. , et al. (2017). Proffilio Proteomeg Integreiddiol a Ffosffoproteomeg yn Datgelu Rhwydweithiau Arwyddion Deinamig a Llwybrau Bio-ynni sy'n Sail i Weithrediad Cell T. Imiwnedd 46, 488–503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Micaux, L., Cools, J., a Demoulin, J.-B. (2009). Mae'r proteinau ymasiad TEL-PDGFR a FIP1L1-PDGFR yn dianc rhag hollbresennol a diraddio. Haematologica 94, 1085–1093.

Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P., a Yu, W. (2020). Mae cisplatin yn atal SIRT3-deacetylation MTHFD2 i darfu ar gydbwysedd rhydocs cellog yng nghell canser y colon a'r rhefr. Cell Marwolaeth Dis. 11, 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W., a Rabinowitz, JD (2019). Peiriant Anodi a Dilysu Brig ar gyfer Metabolomeg LC-MS Heb ei Darged. Rhefrol. Cemeg. 91, 1838–1846.

Yang, M., a Vousden, KH (2016). Metaboledd serine ac un-carbon mewn canser. Nat. Parch Cancr 16, 650–662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., et al. (2020). Mae Mthfd2 yn Modylu Swyddogaeth Mitocondriaidd ac Atgyweirio DNA i Gynnal Lluosogrwydd Bôn-gelloedd Llygoden. Adroddiadau Bôn-gelloedd 15, 529–545.

Zhu, Z., a Leung, GKK (2020). Mwy Nag Ensym Metabolaidd: MTHFD2 fel Targed Newydd ar gyfer Therapi Gwrthganser? Blaen. Oncol. 10, 658.

DULLIAU STAR★

TABL ADNODDAU ALLWEDDOL

ARGAELEDD ADNODDAU

Cyswllt arweiniol

Dylid cyfeirio rhagor o wybodaeth a cheisiadau am adnoddau ac adweithyddion at y Prif Gyswllt, Dr. Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org) a byddant yn cael eu cyflawni ar ôl cwblhau'r MTA priodol.

Argaeledd deunyddiau

Bydd plasmidau a llinellau llygoden a gynhyrchir yn yr astudiaeth hon ar gael ar ôl cwblhau MTA priodol ar gais.

Argaeledd data a chod

Mae data dilyniannu CUT&RUN wedi'u hadneuo yn GEO ac maent ar gael i'r cyhoedd o'r dyddiad cyhoeddi (GSE180356). Bydd data microsgopeg a delweddau blotiau gorllewinol gwreiddiol a adroddir yn y papur hwn yn cael eu rhannu gan y prif gyswllt ar gais. Mae unrhyw wybodaeth ychwanegol sydd ei hangen i ail-ddadansoddi'r data a adroddir yn y papur hwn ar gael gan y prif gyswllt ar gais.

Cliciwch i Cistanches i gael imiwnedd