Mae Nc886, RNA Di-godio, Yn Fiomarcwr Newydd Ac yn Gyfryngwr Epigenetig O Heneiddedd Cellog mewn Ffibroblastiau

Crynodeb:

Mae astudiaethau swyddogaethol o organebau a modelau dynol wedi datgelu y gall newidiadau epigenetig effeithio'n sylweddol ar y broses heneiddio. Mae RNA di-godio (ncRNA), un o'r rheolyddion epigenetig, yn chwarae rhan bwysig wrth addasu mynegiant mRNAs a'u proteinau. Gall gyfryngu ffenoteip celloedd. Mae wedi cael ei adrodd y gall nc886 (=vtRNA2-1 neu cyn-miR-886), ncRNA hir, atal ffurfio tiwmor a llun-ddifrod o geratinocytes a achosir gan UVB. Nod yr astudiaeth hon oedd pennu rôl nc886 yn naws atgynhyrchu ffibroblastau a phenderfynu a allai sylweddau sy'n gallu rheoli mynegiant nc886 reoli henebiad cellog.

Mewn ffibroblastau heneiddedd atgynhyrchu, gostyngwyd mynegiant nc886 tra cynyddwyd methylated nc886. Roedd newidiadau mewn biofarcwyr heneiddedd gan gynnwys gweithgarwch SA- -gal a mynegiant p16INK4A a p21Waf1/Cip1 mewn celloedd senescent. Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod y gostyngiad o nc886 sy'n gysylltiedig â heneiddio yn gysylltiedig â heneiddedd cellog ffibroblastau a bod gan fynegiant nc886 cynyddol y potensial i atal heneiddedd cellog. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) wedi cynyddu mynegiant nc886 a gwellhad cellog o ffibroblastau trwy atal biofarcwyr cysylltiedig ag oedran. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod gan nc886 y potensial fel targed newydd ar gyfer gwrth-heneiddio ac y gall ATC fod yn gynhwysyn gwrth-heneiddio epigenetig cryf.

Mae heneiddedd cellog yn derm eang sy'n cwmpasu ffenomenau fel llai o weithrediad cellog, llai o gapasiti ymledol, a difrod DNA a achosir gan lawer o ffactorau. Nid proses unigol, ragweladwy yw heneiddedd cellog, ond effaith gyfunol ystod o wahanol ffactorau ffisiolegol, genetig ac amgylcheddol. Yn yr ymchwil, canfuwyd y gall Cistanche wrthsefyll heneiddio oherwydd bod egwyddor gwrth-heneiddio Cistanche yn ymwneud yn bennaf â'r gwahanol gynhwysion gweithredol y mae'n eu cynnwys. Mae Cistanche yn gyfoethog mewn amrywiaeth o sylweddau sy'n weithredol yn fiolegol, megis polysacaridau, flavonoidau, acetophenones, ac ati Yn eu plith, mae'r polysacarid yn un o brif gynhwysion gweithredol Cistanche, sydd â swyddogaethau iechyd amrywiol megis gwella imiwnedd, gwrth-ocsidiad, rheoleiddio metaboledd, ac ati, a gall liniaru gradd heneiddio'r corff.

Cliciwch budd-daliadau cistanche tubulosa

Geiriau allweddol:

ffibroblastau; heneiddrwydd atgynhyrchu; rheoleiddio epigenetig; nc886; dyfyniad te gwyrdd.

1. Rhagymadrodd

Mae heneiddedd cellog mewn cyflwr anwrthdroadwy yn dilyn arestiad ymlediad celloedd wedi dod i'r amlwg fel cyfrannwr a allai fod yn bwysig i gamweithrediad meinwe a heneiddio organebau [1]. Nodweddir heneiddedd gan actifedd uchel beta-galactosidase sy'n gysylltiedig â heneiddedd (SA- -gal), mynegiant cynyddol o fiomarcwyr heneiddedd fel p16INK4A a p21Waf1/Cip1, a mynegiant llai o LaminB1 [2]. Mae dau fath sylfaenol o heneiddedd cellog: heneiddedd atgynhyrchu a heneiddedd cynamserol a achosir gan straen. Diffinnir heneiddedd atgynhyrchu fel y ffenomen pan fydd celloedd normal yn rhoi'r gorau i rannu ar ôl cyrraedd niferoedd cyfyngedig o raniadau. Mae'n gysylltiedig â heneiddio cronolegol. Gall croniad difrod parhaus arwain at atgynhyrchu ffibroblastau, gan arwain at golli gallu i ailfodelu a threfnu'r matrics allgellog (ECM). Prif nodweddion y dermis oed yw llai o ffibrau colagen a chynhyrchiad cynyddol o feteloproteinasau matrics (MMPs), sy'n cyfrannu at strwythur tenau ac anhrefnus y dermis [3,4].

Mae mecanweithiau rheoleiddio epigenetig yn gyfryngwyr allweddol yn y broses heneiddio, gan addasu i straenwyr a newidiadau sy'n gysylltiedig ag oedran yn yr amgylchedd genomig a moleciwlaidd. Mae'r newidiadau epigenetig hyn yn digwydd ar wahanol lefelau, gan gynnwys gostyngiad enfawr o histone craidd, dadffurfiad histone trwy addasiad ôl-gyfieithiad a methylation DNA, amnewid histones canonaidd gydag amrywiadau histone, a mynegiant newidiedig o RNA heb godio (ncRNA) yn ystod heneiddedd organaidd ac atgynhyrchu [5] ,6]. Mae nc886 yn 101 niwcleotidau ncRNA hir sy'n gallu rhwymo i brotein targed, a thrwy hynny gyfryngu gweithgaredd y protein a rheoli mynegiant genynnau [7]. Mae nc886 hefyd wedi'i gynnig fel atalydd tiwmor a gasglwyd yn bennaf gan ei batrwm mynegiant a'i leoliad genomig ar gromosom dynol 5q31, locws y genyn atal tiwmor. Nodwedd o fynegiant nc886 yw tawelu malaeneddau'n aml gan methylation DNA CpG yn y rhanbarth hyrwyddwr [8]. Yn seiliedig ar astudiaethau blaenorol, rydym wedi canfod bod gostyngiad mynegiant nc886 a achosir gan arbelydru UVB yn gysylltiedig â chynnydd mewn COX-2 a MMP-9 trwy lwybr protein kinase-activated RNA (PKR) mewn keratinocytes a hynny gall hyrwyddo mynegiant nc886 fod yn strategaeth ddefnyddiol i ddatblygu deunyddiau amddiffynnol UVB [9,10].

Astudiwyd te gwyrdd fel triniaeth ar gyfer amrywiaeth o gyflyrau dermatolegol, megis acne, rosacea, psoriasis, dafadennau firaol, a hyd yn oed canser y croen. Mae cyfansoddion ffenolig gan gynnwys asid galig (GC) ac epigallocatechin gallate (EGCG) yn gyfansoddion gweithredol adnabyddus mewn te gwyrdd. Mae (-)-epigallocatechin-3-(3"-O-methyl) gallate (3" Me-EGCG) yn ffurf O-methylated unigryw o EGCG ac mae wedi'i gynnwys mewn te oolong a the gwyrdd. Yn benodol, mae Jangwon Rhif 3 (mathau Amorepacific o de gwyrdd) yn cynnwys mwy o 3" Me-EGCG na mathau eraill o de gwyrdd [11]. 3" Adroddwyd bod Me-EGCG yn arddangos effeithiau gwrthocsidiol a photoprotective ar keratinocytes [12] . Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i rôl nc886 yn heneiddedd atgynhyrchu ffibroblastau a phenderfynu a allai paratoad Me-EGCG te gwyrdd dwys iawn 3” (AbsoluTea Concentrate 2.0) a allai gynyddu mynegiant nc886 wella henebiad cellog.

2. Canlyniadau

2.1. Proffil Cemegol Crynodiad AbsoluTea 2.0 (ATC)

Dangosir proffil cemegol AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) yn Ffigur 1B. Cafwyd canlyniadau gan ddefnyddio HPLC ar gyfer ATC a baratowyd fel y disgrifir yn yr adran Dull. Roedd ATC yn cynnwys 30 y cant neu fwy 3" Me-EGCG (Ffigur 1B). Mae'n hysbys nad yw dyfyniad te gwyrdd yn cynnwys 3" Me-EGCG nac yn dangos crynodiad o lai na 6 y cant [13,14]. Dangosodd ffibroblastau ifanc a senescent a gafodd eu trin ag ATC fwy o gynnydd mewn mynegiant nc886 na'r rhai a gafodd eu trin â detholiad ethanolig o 70 y cant o de gwyrdd (Ffigur Atodol S1A). Yn ogystal, roedd lefelau mynegiant gal SA- -mewn ffibroblastau senescent a gafodd eu trin ag ATC wedi gostwng yn fwy nag yn y rhai a gafodd eu trin â detholiad te gwyrdd (Ffigur Atodol S1B).

2.2. nc886 Yn Rheoleiddio Senescence Cellular of Fibroblasts

Er mwyn arsylwi ar rôl nc886 yn henebiad cellog ffibroblastau, defnyddiwyd model senescent atgynhyrchu trwy dyfu ac is-ddiwylliant. Fel y dangosir yn Ffigur Atodol S2, cynyddwyd gweithgarwch SA- -gal a lefelau mynegiant marcwyr senescent p16INK4A a p21Waf1/Cip1 a lleihawyd mynegiant Lamin B1 mewn ffibroblastau senescent o gymharu â chelloedd ifanc. Mae llawer o astudiaethau blaenorol wedi nodi bod heneiddio yn cael ei achosi gan straen ocsideiddiol. I gadarnhau a yw'r gyfres hon o straen ocsideiddiol yn gysylltiedig â heneiddedd cellog, mesurwyd lefelau ROS mewn ffibroblastau ifanc (t3) a senescent (t30). Dangosodd canlyniadau fod lefelau ROS yn cynyddu wrth heneiddio (Ffigur Atodol S2D).

Er mwyn arsylwi effaith bosibl nc886 ar heneiddedd cellog mewn ffibroblastau, pennwyd lefel mynegiant genynnau nc886 ym mhob nifer o ddarnau. Gostyngwyd lefel mynegiant nc886 gyda nifer cynyddol y darn (Ffigur 2A). Adroddwyd bod mynegiant nc886 yn cael ei leihau gyda methylation ynysoedd CpG. Er mwyn penderfynu a gafodd is-reoleiddio nc886 mewn ffibroblastau senescent ei gyfryngu gan methylation o nc886, perfformiwyd PCR methylation-benodol. Fel y dangosir yn Ffigur 2A, cynyddwyd methylation nc886 gyda nifer treigl cynyddol (Ffigur 2A). Mae'r canlyniad hwn yn dangos mai cynnydd mewn methylation DNA nc886 sy'n gyfrifol am y mynegiant llai o nc886 mewn nifer uchel o ffibroblastau. Er mwyn gwirio rôl nc886 mewn heneiddedd ffibroblast, penderfynwyd ar newidiadau mewn marcwyr senescent mewn modelau gorfynegiant a dymchweliad nc886. Datgelodd y canlyniadau fod y grŵp o ffibroblastau senescent gyda gorfynegiant nc886 yn dangos gostyngiad mewn gweithgaredd SA-beta-gal, gostyngiad yn lefelau mynegiant p16INK4A a p21Waf1/Cip1, a lefelau uwch o laminB1.

Yn ogystal, gostyngwyd y cynnydd mewn ROS mewn ffibroblastau senescent gan orfynegiant nc886 (Ffigur 2B). I'r gwrthwyneb, yn y grŵp o ffibroblastau ifanc â chwalfa nc886, cyflymwyd heneiddedd cellog a chynyddwyd lefelau mynegiant marcwyr senescent cellog fel p16INK4A a p21Waf1/Cip1 (Ffigur 2C). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall nc886 reoleiddio heneiddedd cellog ffibroblastau trwy reoleiddio mynegiant marcwyr heneb (Ffigur 2B, C).

2.3. Mae ATC yn Lliniaru Senescence Cellog trwy Reoleiddio Mynegiant nc886

Dangosodd y canlyniadau a gafwyd uchod y gallai mynegiant cynyddol nc886 wella heneiddedd cellog trwy gyfryngu marcwyr senescent. Er mwyn arsylwi effaith ATC ar fynegiant nc886, gwerthuswyd lefel mynegiant, a methylation nc886 mewn ffibroblastau senescent ar ôl triniaeth gyda ATC mewn crynodiad nad yw'n sytotocsig (Ffigur 3A). Fel y dangosir yn Ffigurau 3B, a C, cynyddodd ATC fynegiant nc886 yn sylweddol a gostyngodd methylation nc886 mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad. Dangosodd y canlyniad hwn fod y cynnydd mewn mynegiant nc886 gan ATC wedi'i gyfryngu trwy atal methylation nc886. Yn ogystal, gwelsom fod ATC yn atal gweithgarwch SA- -gal ac wedi gostwng lefelau mynegiant marcwyr senescent p16INK4A a p21Waf1/Cip1 mewn ffibroblastau senescent (Ffigur 3D, E). Fodd bynnag, cynyddwyd mynegiant LaminB1 y gwyddys ei fod yn gostwng wrth heneiddio mewn ffibroblastau senescent a gafodd eu trin ag ATC (Ffigur 3E). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall ATC liniaru heneiddedd cellog trwy gynyddu mynegiant nc886.

Ffigur 2. Mae nc886 yn rheoleiddio henebiad cellog ffibroblastau. (A) Cadarnhawyd mynegiant nc886 a methylated nc886 yn ôl y darn gan PCR amser real a'i normaleiddio gyda rRNA 18s. (B) Cafodd y darn nc886 a gafodd ei fwyhau a'i buro o DNA genomig dynol ei drawsnewid i gelloedd senescent gyda Lipofectamine 3000. Cadarnhawyd gorfynegiant trwy arsylwi mynegiant nc886 gan fynegiant amser real PCR a SA{- -gal gan ficrosgopeg fflworoleuedd a sytometreg llif. Gwelwyd mynegiant o brotein marcio heneiddio a chynhyrchu ROS mewngellol yn y model gorfynegiant nc886. (C) Trawsnewidiwyd celloedd â gwrth-oligos (si-ctrl a si-nc886) mewn crynodiad o 250 ppm gan ddefnyddio adweithydd LipofectaminTM RNAiMAX. Cadarnhawyd dymchweliad nc886 trwy arsylwi mynegiant nc886 gan fynegiant amser real PCR a SA{- -gal gan ficrosgopeg fflworoleuedd a sytometreg llif. Cadarnhawyd mynegiant marcwyr heneiddrwydd gyda blot y Gorllewin. Bariau graddfa: 200 µm. Cyflwynir data fel ± DC cymedrig o dri asesiad annibynnol. *, p < 0.05; **, p < 0.01 o'i gymharu â rheolaeth.

2.4. Mae ATC yn Rheoleiddio Newidiadau ECM a SASP ar sail Oedran

Nodwedd o heneiddedd ffibroblast yw bod gweithgaredd MMP-1, cydran sy'n diraddio colagen, yn cynyddu, tra bod synthesis colagen yn gostwng [15,16]. Cadarnhawyd y cynnydd mewn MMP-1 a’r gostyngiad mewn colagen mewn ffibroblastau senescent gyda niferoedd uchel o dramwyfeydd (Ffigur 4A).

Fodd bynnag, ataliodd ATC fynegiant MMP-1 a mwy o synthesis colagen mewn ffibroblastau senescent. Mae'r canlyniad hwn yn dangos y gall ATC wella newid ECM sy'n gysylltiedig ag oedran trwy reoleiddio mynegiant MMP-1 a synthesis colagen mewn ffibroblastau senescent (Ffigur 4B). Adroddwyd bod ffenoteip cyfrinachol sy'n gysylltiedig â heneiddedd (SASP) lle mae celloedd senescent yn secretu ffactorau pro-llidiol penodol, ffactorau twf, ac ensymau proteolytig yn cyfrannu at gychwyn a dilyniant clefydau sy'n gysylltiedig â heneiddio [17-19]. Gwelsom effaith ATC ar SASP yn enwedig sytocinau pro-llidiol megis IL-1 , IL_6, ac IL-8. Fel y dangosir yn Ffigur 4C, is-reolodd ATC lefelau mynegiant IL -1 , IL-6, ac IL-8 a achosir gan heneiddedd. Mae hyn yn awgrymu y gall ATC gael effaith gwrth-heneiddio trwy atal SASP.

3. Trafodaeth

Mae celloedd Senescent yn cael newidiadau morffolegol nodweddiadol sy'n cynnwys ad-drefnu niwclear a chromatin mwy ac yn aml yn afreolaidd. Pan fydd henebrwydd yn cael ei achosi gan ddifrod DNA, disbyddiad atgynhyrchu, neu fynegiant oncogen, mae Lamin B1 yn cael ei golli'n bennaf. Gall amrywiol straenwyr mewnol neu allanol sbarduno'r llwybr ymateb difrod DNA (DDR) i actifadu'r llwybr p53 a/neu p16INK4A. Gall p16INK4A anactifadu Cdk4/6, arwain at groniad o pRb ffosfforylaidd, amharu ar reoleiddio ffactor trawsgrifio E2F, a chymell arestiad neu heneiddedd cylchred celloedd [20,21]. Gall cynhyrchu cynyddol o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) a gynhyrchir yn bennaf gan mitocondria camweithredol arwain at heneiddedd cellog trwy ddifrod DNA a thrawsweithredu llwybrau signalau heneiddedd, gan gynnwys p53, p16INK4A, a p21Waf1/Cip1 [22].

Yn yr astudiaeth hon, canfuom fod mynegiant nc886 wedi'i leihau gyda nifer cynyddol o dramwyfeydd a bod uwchreoleiddio mynegiant nc886 yn lliniaru heneiddedd cellog trwy gyfryngu LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1, a chynhyrchu ROS. mae nc886 yn cael ei drawsgrifio gan RNA polymerase III (Pol III) a'i dawelu gan hypermethylation DNA CpG mewn llawer o falaeneddau [8]. Gwelsom fod mynegiant nc886 wedi'i leihau gyda methylation ynysoedd CpG mewn ffibroblastau senescent. Mae'r canlyniad hwn yn dangos bod hypermethylation ynysoedd CpG yn amharu ar ymarferoldeb nc886 fel atalydd heneiddio cellog.

Mae llwybrau mynegiant genynnau penodol yr effeithir arnynt gan nc886 yn aneglur. Maent yn debygol o gynnwys a adroddwyd yn flaenorol ar gyfer ncRNAs eraill. Gall nc886 chwarae rolau hanfodol mewn heneiddedd cellog trwy gyfryngu'n uniongyrchol neu'n anuniongyrchol y llwybr signalau heneiddedd ar lefelau strwythur cromatin, gweithgaredd ffactor trawsgrifio, rheoleiddio genynnau ôl-drawsysgrifol ac ôl-gyfieithu [23]. Er enghraifft, gall nc886 gyfryngu llwybr synhwyro dilyniant cylchred celloedd.

Dywedwyd bod AK156230 fel ncRNA yn gysylltiedig ag anwythiad atgynhyrchu ffibroblastau trwy ei rolau mewn awtophagi a dilyniant cylchredau celloedd. Downregulation o gelloedd a achosir gan AK156230 i ddangos ymatebion heneiddedd trwy actifadu p53 a p21 tra'n lleihau kinase 1 sy'n ddibynnol ar cyclin (CDK1) [24]. Gelwir ncRNA1 sy'n gysylltiedig â heneiddedd (SAL-RNA1), MALAT1, a MIAT yn rheolyddion negyddol heneiddedd cellog. Maent yn gostwng mewn ffibroblastau senescent. Gall is-reoleiddio'r genynnau hyn arwain at gynnydd mewn marcwyr heneiddio fel SA- gal, t16, t21, a t53 [25]. Cyflawnwyd effaith MALAT1 ar heneiddedd cellog trwy ddirywiad ffactor trawsgrifio oncogenig b-Myb/Mybl2.

Er bod mynegiant ncRNAs amrywiol yn cael ei effeithio yn ystod heneiddedd, dim ond ychydig sy'n ymwneud yn swyddogaethol â heneiddedd. Oherwydd bod lleoleiddio ncRNAs yn bwysig ar gyfer deall y mecanweithiau sy'n ymwneud â swyddogaeth, mae ncRNAs niwclear a cytoplasmig yn cael eu trafod ar wahân wrth ddisgrifio'r mecanweithiau moleciwlaidd sy'n effeithio ar heneiddedd [26]. Gall yr ncRNA sydd wedi'i leoli yn y cytoplasm weithredu fel rheolydd cyfieithu trwy baru sylfaen gyda'r mRNA targed [27]. gall ncRNA effeithio ar lefelau mynegiant protein trwy gynyddu neu leihau sefydlogrwydd mRNA [28].

Er enghraifft, yn ystod heneiddedd a achosir gan RAS, mae cytoplasmig UCA1 yn cyfrannu at sefydlogi mRNA p16 trwy atafaelu hnRNPA1 [29]. Mae nc886 yn cynnwys safle rhwymo protein kinase-activated RNA (PKR). Gall rhwymiad PKR-nc886 atal gweithgaredd PKR. Mae PKR, derbynnydd cytoplasmig ar gyfer RNA llinyn dwbl (dsRNA), yn cael ei reoleiddio gan kinase protein serine / threonine sy'n cael ei actifadu gan haint, cytocinau, straen ocsideiddiol, ac arbelydru (gan gynnwys UV), gan arwain at anwythiad dilynol o lid ac apoptosis [20 ,21] [30,31]. Mae nc886 yn clymu i PKR gydag affinedd tebyg i dsRNA ac yn atal PKR rhag cael ei actifadu. Mae dymchwel nc886 yn arwain at ffosfforyleiddiad is-uned ffactor cychwyn ewcaryotig 2 (eIF2 ) trwy'r llwybr PKR, sy'n achosi marwolaeth celloedd ac yn atal synthesis protein cellog byd-eang. Dywedwyd bod cynhyrchu COX-2, IL-8, a MMPs gan TNF- yn cael ei gyfryngu gan y llwybr PKR mewn chondrocytes dynol [32].

Mewn astudiaeth flaenorol, rydym hefyd wedi dangos y gellir rheoleiddio llid a achosir gan UVB trwy'r llwybr nc886-PKR mewn keratinocytes [10]. Ar ben hynny, mae PKR yn gysylltiedig ag anaf ocsideiddiol a achosir gan straen mewn myocytes cardiaidd newyddenedigol. Mae atal PKR yn amddiffyn rhag anaf a achosir gan H2O trwy wanhau apoptosis a llid [33]. Mae llid a straen ocsideiddiol yn ffactorau mawr sy'n cymell y broses heneiddio. Felly, gall y llwybr PKR gyfryngu heneiddedd cellog ffibroblastau a achosir gan ddisbyddiad nc886. Er mwyn egluro'r mecanwaith rheoleiddio manwl sy'n gysylltiedig ag effaith nc886 ar heneiddedd cellog ffibroblastau, mae angen astudiaethau pellach.

Mae effeithiau gwrth-heneiddio dyfyniad te gwyrdd wedi'u hadrodd yn eang mewn astudiaethau blaenorol. Mae gweithgareddau gwrthocsidiol a gwrthlidiol te gwyrdd yn fecanweithiau adnabyddus sy'n cyfrannu at ei effaith gwrth-heneiddio. Mewn prawf rhagarweiniol, canfuom fod ATC wedi cynyddu mynegiant nc886 yn sylweddol o fwy na 70 y cant o echdyniad ethanolig o de gwyrdd (Ffigur Atodol S1A). Mae'r canlyniad hwn yn awgrymu y gall catechins crynodedig gan gynnwys 3" Me-EGCG briodoli i upregulation mynegiant nc886. Er mwyn penderfynu a allai'r cyfrwng ysgogol nc886 atal heneiddedd cellog, gwelsom effaith ATC ar ffibroblasts senescent. llesteirio lefel methylation y genyn nc886 mewn ffibroblastau senescent (Ffigur 3B, C). Roedd ATC hefyd yn lleddfu heneiddedd cellog trwy gyfryngu biomarcwyr atgasedd megis gweithgaredd SA- -gal, LaminB1, p16INK4A, a t21Waf1/Cip1 (Ffigur 3E). ). At hynny, cafodd cynnydd MMP-1 a llai o gynhyrchiant colagen a achosir gan heneiddedd cell eu hadfer gan ATC (Ffigur 4B) Mae ffactorau SASP yn amrywio ychydig yn dibynnu ar y math o gell a'r math o straen a achosir gan heneiddio, maent yn gyffredin yn a elwir yn genynnau targed ar gyfer NF-κB sy'n rheoleiddio cytocinau pro-llidiol megis IL-6 ac IL-8.

Yn yr astudiaeth hon, cadarnhawyd bod y mynegiant cynyddol o IL-1 , IL_6, ac IL-8 mewn celloedd senescent wedi'i atal gan ATC (Ffigur 4C). Ni allwn eithrio'r posibilrwydd bod effaith gynyddol te gwyrdd ar heneiddedd cellog yn cael ei gyflawni trwy fecanweithiau lluosog, gan gynnwys rheoleiddio nc886, gwrth-ocsidiad, a gwrth-llid. Fodd bynnag, mae ein canlyniadau'n awgrymu bod cynnydd mewn nc886 gan ATC yn chwarae rhan hanfodol wrth atal heneiddedd cellog, gan effeithio wedyn ar gynhyrchu ffibroblastau ECM.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Paratoi ATC

Cafwyd dail te gwyrdd sych (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No. 3) a ddefnyddiwyd ar gyfer yr astudiaeth gyfredol o blanhigion te a dyfwyd yng ngardd de Dolsongi (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, De Korea. Echdynnwyd dail te sych (170 g) gyda 70 y cant EtOH (v / v) ar dymheredd ystafell am 16 h. Yna cafodd y dyfyniad ei bowdro gan ddefnyddio lyophilizer (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Tsieina). I baratoi ATC, cafodd y detholiad EtOH ei grynhoi ddeg gwaith gydag anweddydd cylchdro a'i lwytho ar golofn wedi'i phacio â resin AB-8 (diamedr mewnol 5 cm, hyd 45 cm). Elution toddyddion y golofn yn perfformio gyda 4 gwaith cyfaint gwely (BV) o 20 y cant , 30 y cant , a 100 y cant EtOH ( v / v ) . Yn yr astudiaeth hon, tynnwyd toddyddion gweddilliol yn y golofn gyda chywasgydd aer cyn elution. Crynhowyd y eluate 30 y cant EtOH ugain gwaith a'i gymhwyso i golofn polyamid (diamedr mewnol 2.5 cm, hyd 40 cm). Roedd y golofn polyamid yn aneglur 5 gwaith BV o 10 y cant a 100 y cant EtOH. Roedd y 100 y cant EtOH eluate wedi'i grynhoi a'i lyophilized yn ofalus.

4.2. Diwylliant Cell a Thrin Cell gyda ATC

Prynwyd ffibroblastau dermol dynol (HDFs) gan ATCC (Manassas, VA, UDA). Cynhaliwyd diwylliant celloedd o dan amodau rheoledig ar 37 ◦C gyda 5 y cant o CO2 gan ddefnyddio cyfrwng addasedig Dulbecco's Eagle (WELGENE, Daegu, Korea) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) ac 1 y cant o benisilin -streptomycin (WELGENE, Daegu, Korea). Cafodd celloedd eu hadu i 6-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 2 × 105 o gelloedd/plât. Ar ôl cyrraedd cydlifiad 60 y cant, cawsant eu trin â'r crynodiad a nodwyd o ATC am 72 h.

4.3. SA- -Staining Gal a Dadansoddiad Cytometreg Llif

Cafodd celloedd eu staenio gan ddefnyddio SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japan) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Dadansoddwyd celloedd gyda System Delweddu Cell EVOS® FL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) a sytomedr llif BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

4.4. Mesur ROS mewngellol

Cafodd cynhyrchiad ROS mewngellol ei fonitro gan ddefnyddio C20,70 -dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA; Molecular Probes), dangosydd ROS fflwroleuol. Deorwyd celloedd â H2DCFDA (5 µM) am 30 munud ar 37 ◦C. Canfuwyd fflworoleuedd sy'n gysylltiedig â gell gyda sytomedr llif BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, UDA).

4.5. PCR Amser Real a PCR Penodol Methylation

Echdynnwyd cyfanswm RNA gan ddefnyddio TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA). Perfformiwyd mesuriad meintiol o RNA gan ddefnyddio sbectrophotometer microplate Epoch (BioTek, Winooski, VT, UDA). Cafodd cDNA ei syntheseiddio gan ddefnyddio Cymysgedd Meistr Platinwm Synthesis cDNA am-fiRivert (GenDEPOT, Barker, TX, UDA). Echdynnwyd DNA genomig gan ddefnyddio Pecyn Echdynnu DNA Genomig AccuPrep® (BIONEER, Daejeon, Korea). Cyflawnwyd trawsnewid bisulfite gan ddefnyddio pecyn methylation DNA EZ (Zymo Research, CA, UDA). I berfformio qRT-PCR, defnyddiwyd Pecyn Synthesis cDNA APIGENE® (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, UDA) a system PCR amser real ABI7500 (Ambion Inc, Austin, TX, UDA). Disgrifir y dilyniannau cysefin a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl 1.

4.6. Assay Dehydrogenase Lactate

Defnyddiwyd assay LDH i bennu'r sytowenwyndra trwy fesur gweithgaredd lactad dehydrogenase (LDH) a ryddhawyd o gelloedd wedi'u difrodi. Perfformiwyd yr assay gan ddefnyddio pecyn Assay LDH Cytotoxicity WST (gwyddorau bywyd Enzo, Farmingdale, NY, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

4.7. Trawsnewidiad DNA ar gyfer nc886 Overexpression a siRNA Transfection ar gyfer nc886 Knockdown

I gael DNA ar gyfer gorfynegiant o nc886 mewn celloedd, cafodd DNA ei fwyhau gyda AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Korea) gan ddefnyddio DNA genomig o HDFs fel templed a disgrifiwyd y paent preimio canlynol yn Nhabl 2.

Cafodd DNA chwyddedig ei buro gan ddefnyddio Pecyn Puro PCR QIAquick (QIAGEN, Hilden, yr Almaen). Trawsnewidiwyd y DNA puredig ag adweithydd LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA). I ddymchwel nc886, trosglwyddwyd celloedd â gwrth-oligos (si-ctrl a si-nc886) ar grynodiad o 250pM gan ddefnyddio adweithydd Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA).

4.8. Blotio Gorllewinol

Paratowyd lysates celloedd gydag Ateb Echdynnu Protein PRO-PREP™ (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Korea). Gwahanwyd cyfanswm y proteinau â system electrofforesis NuPAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) a'i drosglwyddo i bilenni polyvinylidene difluoride (PVDF). Perfformiwyd Immunoblotting gan ddefnyddio gwrthgorff cynradd yn erbyn p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, UDA), MMP1, Col1A2, ac -actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, UDA). Dadansoddwyd gwerthoedd densitometrig sganio bandiau gan ddefnyddio ImageJ, fersiwn meddalwedd 1.52a (Y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol, Bethesda, MD, UDA).

4.9. Assay Imiwnosorbent Cysylltiedig ag Ensym

Ar ôl deori a nodwyd, mesurwyd colagen (Procollagen Math I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan) a MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, UDA) mewn uwchnatur diwylliant gan ddefnyddio'r assay imiwnosorbent cysylltiedig ag ensymau (ELISA) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

4.10. Dadansoddiad Ystadegol

Cyflwynir yr holl ganlyniadau fel gwyriad safonol cymedrig ± (SD). Gwerthuswyd y gwahaniaethau rhwng y ddau grŵp gan y prawf-t neu'r dadansoddiad o amrywiant (ANOVA) gan ddefnyddio GraphPad Prism. Nodwyd arwyddocâd ystadegol naill ai fel p < 0.05 neu p < 0.01.

5. Casgliadau

I gloi, gall rheoleiddio mynegiant nc886 fod yn darged posibl o heneiddedd cellog mewn ffibroblastau, a gall ATC fod yn gynhwysyn gwrth-heneiddio epigenetig cryf.

Cyfraniadau Awdur:

Cysyniadoli, YK, KH, ac EJ; methodoleg YK, HJ, N.-HP, a K.-SL; curadu data, YK, HJ ac EC; ymchwiliad, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP, ac EJ; gweinyddu prosiect, WP, DP, ac EJ; adnoddau, WP a DP; goruchwyliaeth, DP, ac EJ; ysgrifen— drafft gwreiddiol, YK; ysgrifennu — adolygu a golygu, N.-HP, KH, WP, DP, ac EJ Mae pob awdur wedi darllen a chytuno i fersiwn gyhoeddedig y llawysgrif.

Ariannu:

Ni dderbyniodd yr ymchwil hwn unrhyw gyllid allanol.

Datganiad y Bwrdd Adolygu Sefydliadol:

Ddim yn berthnasol.

Datganiad Cydsyniad Gwybodus:

Ddim yn berthnasol.

Datganiad Argaeledd Data:

Bydd data ar gael ar gais.

Gwrthdaro Buddiannau:

Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw wrthdaro buddiannau.

Cyfeiriadau

1. Campisi, J. ; d'Adda di Fagagna, F. Senescence cellog: Pan fydd pethau drwg yn digwydd i gelloedd da. Nat. Parch Mol. Cell Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Heneiddio: Agweddau tuag at ei reolaeth. Discov Cyffuriau. Heddiw Ther. Strategaeth. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datata, S.; Voorhees, JJ Mecanweithiau ffotograffiaeth a heneiddio croen cronolegol. Arch. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J. ; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F. ; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Nodweddion heneiddio ffibroblast. Mech. Heneiddio Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A. ; Berger, SL Epigeneteg heneiddio a chlefyd sy'n gysylltiedig â heneiddio. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AC; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A. ; Zhavoronkov, A. Geneteg ac epigeneteg heneiddio a hirhoedledd. Cylchred Cell 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]

7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I. ; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Parc, HS; Leelayuwat, C.; Mae Lee, YS Precursor miR-886, RNA di-godio newydd wedi'i atafaelu mewn canser, yn cysylltu â PKR ac yn modiwleiddio ei weithgarwch. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Parcb, JL; Lee, YS; Cân, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Yma, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; et al. Rheoleiddio epigenetig o drawsgrifiadau RNA polymerase III mewn tumorigenesis cynnar y fron. Oncogene 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E. ; Im, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Parcb, D.; Frechet, M. ; Chajra, H.; Mae Jung, E. nc886, RNA di-godio, yn atal mynegiant MMP-9 a COX-2 a achosir gan UVB trwy'r llwybr PKR mewn keratinocytes dynol. Biocemeg. Bioffys. Res. Cymmun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, CA; Cho, E. ; Weon, JB; Parcb, D.; Frechet, M. ; Chajra, H.; Jung, E. Atal Llid a Achosir gan UVB gan Laminaria japonica Detholiad trwy Reoliad Llwybr nc886-PKR. Maetholion 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, Llsgr; Hwang, KH; Kim, EH; Parcb, JS; Hong, YS Adnabod epigallocatechin-3-O-(3-Omethyl)-gallate (EGCG300Me) a phroffiliau asid amino mewn cyltifarau te (Camellia sinensis L.) amrywiol. Briff Data. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY Gwrthocsidiol a Sytoprotective Effeithiau (-)-Epigallocatechin-3-(300-O-methyl) Gallate. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Effeithiau dyfyniad te gwyrdd ar fenywod dros bwysau a gordew sydd â lefelau uchel o colesterol-lipoprotein-dwysedd isel (LDL-C): Treial clinigol ar hap, dwbl-ddall, a thraws-dros-ben a reolir gan placebo. Ategiad BMC. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S. ; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Rhyngweithiadau llafar rhwng detholiad flavanol te gwyrdd a detholiad anthocyanin gwin coch gan ddefnyddio model newydd yn seiliedig ar gelloedd: Mewnwelediadau ar effaith gwahanol epithelia llafar. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Lefi, N. ; Papismadov, N.; Solomonov, I. ; Sagi, I. ; Krizhanovsky, V. Llwybr ECM o heneiddrwydd wrth heneiddio: Cydrannau ac addaswyr. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V. ; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I. ; Battaglia, C. ; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Triniaeth Resveratrol Cronig Yn Lliniaru Ymlyniad Celloedd ac yn Lliniaru'r Ffenoteip Llidiol mewn Ffibroblastau Dynol Senescent. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, YH; Patil, CK; Rodier, F.; Haul, Y. ; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Mae ffenoteipiau secretory sy'n gysylltiedig â Senescence yn datgelu swyddogaethau cell-anymreolaethol RAS oncogenig a'r atalydd tiwmor p53. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Tchkonia, T. ; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Heneiddedd cellog a'r ffenoteip gyfrinachedd synhwyrus: Cyfleoedd therapiwtig. J. Clin. Ymchwilio. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Heneiddedd cellog: O ffisioleg i batholeg. Nat. Parch Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G. ; O'Carroll, D.; Rembold, M. ; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. Swyddogaeth hanfodol histone deacetylase 1 mewn rheoli amlhau ac atalydd atalydd CDK. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas- Rodriguez, A.S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Rôl metalloproteinasau matrics mewn heneiddio: Ailfodelu meinwe a thu hwnt. Biochim. Bioffys. Acta Mol. Cell Res. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]

22. Victorelli, A.S.; Passos, JF Canfod Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol mewn Celloedd Senescent. Dulliau Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNAs Rhwydweithiau Rheoleiddio mewn Heneiddedd Cellog. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, FY; Xu, S.; Meng, M. ; Ren, X. ; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X. ; Yang, JM; Xiong, XD Adnabod yr lncRNA, AK156230, fel rheolydd newydd o heneiddedd cellog mewn ffibroblastau embryonig llygoden. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J. ; Selimyan, R. ; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Wood, WH, 3ydd; Becker, KG; et al. lncRNAs sy'n gysylltiedig â heneb: RNAS digodio hir sy'n gysylltiedig â heneb. Cell Heneiddio 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH Rolau lncRNAs yn dod i'r amlwg mewn heneb. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C. ; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A. ; Zucchelli, A.S.; Ffedele, S.; Pesce, E. ; Ferrer, I. ; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. Mae RNA antisense hir nad yw'n codio yn rheoli cyfieithiad Uchl1 trwy ailadrodd SINEB2 wedi'i fewnosod. Natur 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C. ; Webster, DE; Zehnder, A. ; Qu, K. ; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J. ; et al. Rheoli gwahaniaethu meinwe somatig gan yr RNA TINCR di-godio hir. Natur 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, U.S.; Smith, R.; Franklin, A.S.; Moore, B.; Yandell, M.A.; Lessnick, SL; Moon, AC Rheolaeth gydgysylltiedig o heneiddedd gan lncRNA a chyfadeilad cyd-wrthwasgydd T-box3 newydd. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A. ; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Mae colled B1 Lamin yn fiomarciwr sy'n gysylltiedig â heneidd-dra. Mol. Biol. Cell 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, A.S.; Barrera, I. ; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Kinase i'w Chofio. Blaen. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Mae actifadu Tsai, KL PKR yn achosi llid a secretiad MMP-13 mewn chondrocytes articular dirywiedig dynol. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Dynion, M. ; Xie, B. ; Shan, J.; Wang, C. ; Liu, J. ; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. Mae atal PKR yn amddiffyn rhag anaf a achosir gan H2O ar myocytau cardiaidd newyddenedigol trwy wanhau apoptosis a llid. Sci. Cynrychiolydd 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]

Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Parc Nok-Hyun 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Parc Wonseok 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 ac Eunsun Jung 1 ,*.

1 Sefydliad Gwyddor Bywyd Biosbectrwm, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Korea; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EC); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 Is-adran Ymchwil ac Arloesi Sylfaenol, Canolfan Ymchwil a Datblygu Corfforaeth Amorepacific, Youngin-si 17074, Korea; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

* Correspondence: bioso@biospectrum.com

For more information:1950477648@nn.com