Effaith Niwro-ddiogelwch Detholiad Bu-Shen-Huo-Xue yn Erbyn Apoptosis a achosir gan Glwcos Uchel mewn Celloedd PC12

Am fwy o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1 Stiwdio Ymchwil Integreiddio Meddygaeth Draddodiadol a Gorllewinol, Ysbyty Cyntaf, Prifysgol Peking, Beijing, Tsieina.

Labordy Allweddol Cyffuriau Naturiol a Biometig 2State, Ysgol Gwyddorau Fferyllol, Prifysgol Peking, Beijing, Tsieina.

Uchafbwyntiau

Mae niwrowenwyndra a achosir gan glwcos uchel (HG) yn gysylltiedig â phatholegdiabetigenseffalopathi (DE). Yn ein hastudiaeth, mae detholiad Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), fformiwla amllysieuol, yn arddangosniwro-amddiffynnolGall gweithgarwch ar gelloedd PC12 a achosir gan HG a'r mecanweithiau posibl fod yn gysylltiedig ag atal cynhyrchu ocsigen adweithiol (ROS) yn ogystal â llwybrau signalau caspase a chyfryngir gan mitocondria a JNK/p38 MAPK. Mae'r astudiaeth hon yn darparu asiant addawol ar gyfer trin DE mewn cymwysiadau clinigol.

Cliciwch i fuddion echdynnu cistanche a Cistanche ar gyfer aren

Cistancheyn berlysiau tonic adnabyddus sy'n gallu maethu ac amddiffyn yarennau. Mewn theori meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol,Cistancheyw'r perlysiau gorau ar gyferarennau.Cistancheyn gyfoethog mewn echinacoside, acteoside, a flavonoids.These cynhwysion effeithiol ynCistancheyn gallu lleihauarenapoptosis celloedd a chynnyddarenamlhau celloedd. Felly,Cistancheynatodiad arennau naturiol.

Haniaethol

Amcan: Ymchwilio i effaith niwro-amddiffynnol dyfyniad Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), fformiwla amllysieuol, yn erbyn niwrowenwyndra a achosir gan Glwcos Uchel (HG) mewn celloedd PC12. Dulliau: Assay hyfywedd celloedd, assay Lactate Dehydrogenase (LDH), canfod Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol (ROS), Hoechst 33258, Acridine Orange (AO) / Bromid Ethidium (EB) staen dwbl, ac assay Potensial Membran Mitocondriaidd (MMP). Yn ogystal, canfuwyd Bax, Bcl-2, caspase-3, caspase hollt-3, PARP, PARP hollt, cytochrome c, a Chinasau Protein a Actifadir gan Mitogen (MAPKs) gan blot gorllewinol. Canlyniadau: Cynyddodd dyfyniad BSHX hyfywedd celloedd a lleihau gollyngiadau LDH mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad mewn celloedd PC12 a achosir gan HG. At hynny, gostyngodd dyfyniad BSHX lefel y ROS mewngellol, mwy o botensial pilen mitocondriaidd, rheolodd ymadroddion Bax a Bcl-2, a rhwystrodd rhyddhau cytochrome c o mitocondria. At hynny, gwanhaodd dyfyniad BSHX actifadu caspase-3 a PARP ac atal ffosfforyleiddiadau c-Jun N-terminal kinase (JNK) a p38 MAPKs. Casgliad: Dangosodd detholiad BSHX effaith niwro-amddiffynnol sylweddol ar apoptosis a achosir gan HG mewn celloedd PC12. Gall yr effaith hon fod yn gysylltiedig ag atal cynhyrchu ROS yn ogystal â llwybrau signalau caspase-mediated mitocondria a JNK/p38 MAPK.

Geiriau allweddol:enseffalopathi diabetig, meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol, dyfyniad Bu-Shen-Huo-Xue,niwro-amddiffynnol, glwcos uchel

Talfyriad: AO: oren acridine; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Enseffalopathi Diabetig; DM: Diabetes Mellitus; DMSO: Dimethyl Sulfoxide; EB: Ethidium Bromid; ERK: Kinases Protein Allgellog a Reoleiddir; HG: Glwcos Uchel; JNK: c-Mehefin N-terminal Kinase; LDH: Lactate Dehydrogenase; MAPKs: Kinases Protein wedi'u Actifadu â Mitogen; MWP: Presgripsiwn Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazolium Bromid; PBS: Halen Clustogi Ffosffad; PBST: Halen Clustog Ffosffad, 0.1 y cant Tween 20; ROS: Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol; T2DM: Diabetes Mellitus Math 2; TCM: Meddyginiaethau Tsieineaidd Traddodiadol

Cefndir

Yn y blynyddoedd diwethaf, mae Enseffalopathi Diabetig (DE), cymhlethdod o Diabetes Mellitus (DM) sy'n digwydd yn y System Nerfol Ganolog (CNS), wedi cael sylw eang. Gall DE fod yn gysylltiedig â nifer o ffactorau risg megis oedran, hyd, a rheolaeth glycemig o ddiabetes [1, 2]. Amlygiadau clinigol DE yw newidiadau morffolegol a ffisiolegol yn yr ymennydd a chamweithrediad gwybyddol canlyniadol. Efallai mai hyperglycemia, straen ocsideiddiol, a llid cronig yw achosion pathogenig pwysig DE [3]. Er bod nifer cynyddol o arbrofion wedi dangos y gall hyperglycemia parhaus hirdymor gyflymu heneiddio'r ymennydd, nid yw union pathogenesis DE wedi'i archwilio.

Mae apoptosis yn farwolaeth celloedd wedi'i rhaglennu a reolir gan enynnau i gynnal sefydlogrwydd y micro-amgylchedd. Mae'r proteinau sy'n gysylltiedig ag apoptosis yn cynnwys y teulu Bcl-2, caspases, t53, ac ati. Mae teulu Bcl-2 wedi'i rannu'n ddau gategori, un sy'n hyrwyddo marwolaeth celloedd, megis Bax, a'r llall yn gwrthsefyll apoptosis, megis Bcl-2. Gallant reoleiddio apoptosis trwy'r llwybr signalau caspase, sef adwaith ymhelaethu rhaeadru o swbstrad hydrolysis meidraidd anwrthdroadwy o caspase [4-6]. Yn ogystal, mae astudiaethau wedi dangos bod apoptosis a achosir gan Glwcos Uchel (HG) yn gysylltiedig â chamweithrediad mitocondriaidd, difrod DNA, a chynhyrchiad gormodol o Rywogaethau Ocsigen Adweithiol (ROS) [7]. Dangosodd astudiaeth o lygod diabetig y gallai Protein Kinase (AMPK) wedi'i actifadu gan Adenosine 5'-monophosphate (AMP), derbynnydd egni a straen mewngellol, atal apoptosis wedi'i gyfryngu gan ROS. Ar ben hynny, mae tystiolaeth gynyddol wedi dangos y gallai atal Kinases Protein wedi'i Actifadu â Mitogen (MAPKs) fod o fudd i atal apoptosis niwronaidd. Dangosodd adroddiad arall y gallai llwybrau signalau c-Jun N-terminal Kinase (JNK), Kinases Protein Rheoleiddiedig Allgellog (ERK), p38 MAPK reoleiddio apoptosis niwronaidd [8,9].

Yn seiliedig ar theori meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol,arenmae diffyg hanfod a stasis gwaed yn cael eu hystyried fel pathogenesis sylfaenol DE. Felly, y strategaeth o faethuarennauac mae actifadu gwaed yn cael ei ddefnyddio'n gyffredin mewn cymwysiadau clinigol ar gyfer DE. Gallai astudiaethau blaenorol gadarnhau bod presgripsiwn Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) wedi'i addasu, presgripsiwn sy'n anelu at faethuarennau, yn gallu gwella nam gwybyddol a diogelu niwronau trwy leihau gwenwyndra A [10, 11]. Mae presgripsiwn Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), lle mae gelod yn cael ei ychwanegu yn seiliedig ar MWP, wedi'i lunio'n benodol imaetharennauac actifadu gwaed. Yn ddiweddar mae astudiaethau wedi dangos y gall presgripsiwn BSHX wella syndrom dirywiad cof cleifion DM, gan awgrymu eiddo niwro-amddiffynnol pwerus [12]. Fodd bynnag, mae'r mecanwaith ffarmacolegol manwl ar gyfer BSHX yn parhau i fod yn aneglur. Yn yr astudiaeth hon, ein nod yw arsylwi effaith amddiffynnol dyfyniad BSHX ar gelloedd PC12 a achosir gan HG ac archwilio mecanweithiau moleciwlaidd posibl.

Dulliau

Deunyddiau ac adweithyddion

Prynwyd yr holl berlysiau gan Kang Ren Tang Chinese Medicine Co, Ltd (Beijing, Tsieina) a'u dilysu gan Dr. PF Tu, ffarmacognosydd, yn ôl Pharmacopoeia Tsieineaidd (Comisiwn Pharmacopoeia PRC, 2010). Daeth 3- [4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) o Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, UDA). Prynwyd pecyn profi lactad dehydrogenase (LDH) gan Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng. (Nanjing, Jiangsu, Tsieina). Cafwyd pecyn staen dwbl Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromid (EB) a Hoechst 33258 gan Solar Co., Ltd. (Beijing, Tsieina). Prynwyd pecyn profi potensial pilen mitocondriaidd gyda JC-1, 2, 7-dichlorofluorescein diasetate (DCFH-DA) gan Sefydliad Biotechnoleg Beyotime (Shanghai, Tsieina). Gwrthgyrff cynradd ar gyfer caspase-3, caspase hollt-3, PARP, PARP hollt, cytochrome C, Bax, Bcl-2, t38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, t Cafwyd -JNK, a -tubulin gan Cell signaling Technology (Boston, MA, UDA).

Paratoi dyfyniad BSHX

Mae BSHX yn cynnwys saith cydran feddyginiaethol (Tabl 1). Ar gyfer paratoi dyfyniad BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) a Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) yn y gyfran o 8:8:4:1:2:1:8 a'u trochi mewn cyfanswm cyfaint o 10 gwaith (v/w) dŵr distyll am 30 munud , yna ei ferwi am 1 h a'i ferwi eto am 1h mewn cyfanswm cyfaint o 5 gwaith (v/w) dŵr distyll. Cyfunwyd y supernatants a'u sychu gan lyophilization. Y detholiad sych olaf oedd 25 y cant (w/w) o bwysau'r perlysiau amrwd a chafodd sbesimen taleb ei adneuo yn y Ganolfan Ymchwil Fodern ar gyfer Meddygaeth Tsieineaidd Traddodiadol, Canolfan Gwyddor Iechyd Prifysgol Peking, Beijing, Tsieina.

Diwylliant celloedd

Cafwyd llinellau celloedd pheochromocytoma llygod mawr (celloedd PC12) gan Fanc Cell Coleg Meddygol Peking Union (Beijing, Tsieina) a'u tyfu yn Eryr Addasedig Canolig (DMEM) Dulbecco (Macgene, Beijing, Tsieina) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (Biowest, Ffrainc). ) ac 1 y cant Penisilin-Streptomycin (100 ×, Macgene, Beijing, Tsieina) mewn deorydd llaith sy'n cynnwys 95 y cant o aer a 5 y cant CO2 ar 37 gradd.

Triniaeth sampl

Yn y prawf rhagarweiniol, cafodd celloedd PC12 eu trin â dyfyniad BSHX (20, 50, 100 mg/L) yn unig am 48 h i werthuso'r sytowenwyndra. Ar gyfer dadansoddiad effaith niwro-amddiffynnol o echdyniad BSHX yn erbyn niwrowenwyndra a achosir gan glwcos uchel (HG), cafodd celloedd PC12 eu trin ar y cyd â dyfyniad BSHX (20, 50, 100 mg/L) a HG (75 mM) am 48 h, ac yna assay MTT ar gyfer hyfywedd celloedd. Gwnaed yr holl brofion eraill o dan yr un cyflwr gyda'r ystod o grynodiad echdynnu BSHX o 20 i 100 mg/L.

Assay hyfywedd celloedd

Cafodd celloedd PC12 eu hadu i 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 3.5 × 103 cell y ffynnon. Ar ôl deor gyda detholiad BSHX (gyda neu heb HG) am 48 h, tynnwyd y supernatant ac ychwanegwyd MTT ateb (0.5 mg / mL). Ar ôl deori ar 37 gradd am 4 h, tynnwyd hydoddiant MTT a diddymwyd y celloedd mewn dimethyl sulfoxide (DMSO) i'w ysgwyd am 5 munud. Mesurwyd y dwysedd Optegol (OD) ar 570 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate. Hyfywedd celloedd ( y cant )=[OD (triniaeth) – OD (gwag)]/ [OD (rheolaeth heb ei drin) – OD (gwag)] × 100 y cant .

Assay LDH

Cafodd celloedd PC12 eu meithrin a'u hysgogi i driniaeth echdynnu HG a BSHX fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Yna, canfuwyd yr LDH a ryddhawyd o'r celloedd gan ddefnyddio pecyn LDH masnachol yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mesurwyd amsugnedd ar 450 nm. LDH (U/L)=[OD (triniaeth) – OD (gwag)] / [OD (safonol) – OD (gwag)] × 0.2 (mmol/L) × 1000.

staenio Hoechst 33258 a staen AO/EB

Ar gyfer staenio Hoechst 33258, gosodwyd y celloedd gan baraformaldehyd 4 y cant am 30 munud. Yna golchwyd y celloedd â Saline Clustogi Ffosffad (PBS) 3 gwaith a'u deor â hydoddiant gweithio Hoechst 33258 (1 ug/ml) yn y tywyllwch am 30 munud ar dymheredd ystafell. Cafodd delweddau eu dal gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd (IX73, Olympus, Japan) o dan donfedd cyffroi 352 nm / tonfedd allyriadau 461 nm. Ar gyfer staenio AO/EB, tynnwch y cyfrwng o 96-blatiau ffynnon ac ychwanegwch gymysgedd AO/EB (100 ug/mL AO a 100 ug/mL EB cymysg) am 5 munud yn y tywyllwch ar dymheredd ystafell. Yna golchwyd y celloedd â PBS 3 gwaith. Delweddwyd y celloedd gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd o dan donfedd excitation 490 nm / tonfedd allyriadau 530 nm ar gyfer staenio AO a thonfedd cyffro 520 nm / tonfedd allyriadau 590 nm ar gyfer staenio EB.

Canfod ROS mewngellol

Ar gyfer canfod ROS mewngellol, cafodd celloedd PC12 eu hadu i blatiau ffynnon 6- ar ddwysedd o 5 × 105 a buont yn destun triniaeth echdynnu HG a BSHX am 24 h. Ar ôl deori 24 h, golchwyd celloedd PC12 â chyfrwng eryr addasedig Dulbecco heb serwm am 3 gwaith a'i ychwanegu at 10μΜ 2', diasetad 7'-dichlorofluorescein (DCF-DA), sy'n cael ei ocsidio i fflwroleuol 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF) gan hydroperocsidau, ar 37 gradd am 30 munud yn y tywyllwch. Yna, golchwyd y celloedd â PBS oer 3 gwaith a'u hailddarparu yn PBS. Canfuwyd lefel fewngellol ROS trwy fesur dwyster fflworoleuedd cymedrig yn ôl cytometreg llif (BD FACSCaliburTM, UDA). Roedd y tonfeddi cyffro/allyriad yn 488 / 525 nm. Cafodd o leiaf 10,{23}} o ddigwyddiadau eu cyfrif fesul sampl. Mynegwyd y gwerthoedd fel yr amsugnedd cymedrig wedi'i normaleiddio i ganran y gwerth rheoli.

Assay potensial pilen mitocondriaidd

Aseswyd dadbolariad mitocondriaidd gan ddefnyddio pecyn assay JC-1 masnachol. Ar ôl cael eu trin â dyfyniad HG a BSHX, cafodd y celloedd eu deor â hydoddiant gweithio JC-1 (1 ×) ar 37 gradd am 15 munud yn y tywyllwch. Yna, tynnwch y supernatant a golchwch y celloedd 2 waith gyda JC-1 hydoddiant byffer (1 ×). Delweddwyd y celloedd gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd o dan donfedd cyffro 460 nm / tonfedd allyriad 530 nm ar gyfer monomer JC-1 (wedi'i ganfod mewn celloedd â mitocondria wedi'i ddadbolaru), a thonfedd cyffro 520 nm / tonfedd allyrru 590 nm ar gyfer JC{{13} }} polymer (yn bresennol mewn mitocondria polariaidd). Ystyriwyd bod gan y celloedd â fflworoleuedd gwyrdd (monomerig) mitocondria wedi dadbolaru; ystyriwyd bod gan y celloedd â fflworoleuedd coch (polymerig) mitocondria arferol.

Dadansoddiad o blotiau gorllewinol

Casglwyd celloedd PC12 a'u gosod mewn byffer RIPA oer gydag atalydd proteas coctel 1 ×. Casglwyd y supernatant drwy allgyrchiant cyflym ar 12,000 rpm am 11 munud ar 4 gradd . Pennwyd crynodiadau protein gan assay Bradford. Cafodd ffracsiynau wedi'u cyfoethogi â chytosol a mitocondria eu hynysu gyda'r Pecyn Ynysu Mitocondria (Pierce, Rockford, UDA) ar gyfer dadansoddi cytochrome c. Ar gyfer proteinau eraill, gwahanwyd cyfanswm y lysadau celloedd gan SDS-PAGE (10 y cant -15 y cant) a'u trosglwyddo i bilenni Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Yna cafodd y pilenni fflworid polyvinylidene eu rhwystro â 5 y cant o laeth di-fraster a'u deor â'r gwrthgyrff cynradd a nodwyd ar 4 gradd am dros nos. Cafodd y pilenni eu golchi â PBST (hallt wedi'i glustogi â ffosffad, 0.1 y cant Tween 20) dair gwaith a'u deor â gwrthgyrff eilaidd ar dymheredd ystafell am 2 awr. Yna, golchwyd y pilenni gyda PBST deirgwaith arall a'u delweddu gan ddefnyddio swbstrad cemiluminescent gwell, a'u sganio gyda System Delweddu Digidol Kodak (Gel Logic 2200Pro, Kodak, UDA).

Dadansoddiad ystadegol

Mynegir yr holl werthoedd fel cymedr ± gwyriad safonol (SD). Pennwyd arwyddocâd y gwahaniaethau rhwng gwerthoedd cymedrig gan ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) gan ddefnyddio'r Pecyn Ystadegol ar gyfer Gwyddorau Cymdeithasol (meddalwedd SPSS 16.0). Ystyriwyd bod P < 0.05="" o="" gymharu="" â'r="" grŵp="" rheoli="" yn="" ystadegol="">

Canlyniadau

Mae detholiad BSHX yn amddiffyn celloedd PC12 rhag anaf celloedd a achosir gan HG

Er mwyn ymchwilio i weld a allai dyfyniad BSHX amddiffyn celloedd PC12 rhag sarhad HG, gwnaethom drin celloedd PC12 ag ystod o grynodiadau echdynnu BSHX (20, 50, a 100 mg/L) am 48 h o dan amodau HG (75 mM). Dangosodd asesu hyfywedd celloedd gan ddefnyddio'r assay MTT fod sarhad HG wedi achosi gostyngiad sylweddol yn hyfywedd celloedd PC12 (roedd hyfywedd celloedd tua 56.9 ± 6.7 y cant) a bod triniaeth echdynnu BSHX yn atal marwolaeth celloedd yn sylweddol mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad. Cynyddodd hyfywedd y gell i 87.8 ± 9.2 y cant pan gafodd y celloedd eu cyd-drin â dyfyniad BSHX (100 mg / L) (Ffigur.1A). Mae Lactate Dehydrogenase (LDH) yn cael ei ryddhau o gelloedd sydd wedi'u difrodi ac felly gellir ei ddefnyddio hefyd fel dangosydd o wenwyndra celloedd. Yn gyson â chanlyniadau'r assay MTT, canfuom fod sarhad HG yn cynyddu'n sylweddol y rhyddhad LDH o gelloedd PC12 a bod triniaeth echdynnu BSHX yn atal rhyddhau LDH mewn modd sy'n dibynnu ar ganolbwyntio (Ffigur 1B), Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod dyfyniad BSHX yn cynyddu hyfywedd celloedd mewn celloedd PC12 a achosir gan HG.

Mae detholiad BSHX yn atal apoptosis celloedd PC12 trwy'r llwybr dibynnol caspase-9/3-

Er mwyn pennu effaith dyfyniad BSHX ar apoptosis celloedd, defnyddiwyd llifyn DNA Hoechst 33258 fel assay sensitif ar gyfer apoptosis. Dangosodd cnewyllyn celloedd arferol a staeniwyd gan Hoechst 33258 fflworoleuedd glas unffurf, tra bod celloedd apoptotig y dangosodd pyknosis cwmwl cromatin niwclear gronynnau fflworoleuol hyper-cromatig a thrwchus. Cyfrifwyd canran yr apoptosis yn ôl nifer y celloedd apoptotig yn erbyn cyfanswm nifer y celloedd. Datgelodd ein data fod sarhad HG (75 mM) wedi cynyddu cyfran y celloedd apoptotig yn ddramatig (51.7 ± 4.3 y cant) a thriniaeth echdynnu BSHX wedi'i diogelu'n sylweddol yn erbyn apoptosis a achosir gan HG mewn celloedd PC12 (Ffigur.2A). Ategwyd y canlyniadau hyn ymhellach gan ddadansoddiad staenio dwbl AO/EB. Mae AO yn mynd i mewn i gelloedd normal ac apoptotig ac yn allyrru fflworoleuedd gwyrdd tra bod EB yn mynd i mewn i gelloedd apoptotig yn unig ac yn allyrru fflworoleuedd coch [13]. Dangosodd yr assay AO / EB fod canran y celloedd apoptotig wedi cynyddu'n sylweddol yn dilyn sarhad HG (75 mM) (47.8.7 ± 2.6 y cant ) a gostyngodd ar driniaeth echdynnu BSHX mewn celloedd PC12 (Ffigur.2B), gan awgrymu y gallai dyfyniad BSHX yn effeithiol atal apoptosis celloedd PC12 a achosir gan HG.

Yna, gwnaethom ymchwilio i effaith dyfyniad BSHX ar y llwybr caspase-3/PARP, llwybr pwysig ar gyfer apoptosis sy'n gysylltiedig â mitocondria [14]. Datgelodd blot gorllewinol fod sarhad HG (75 mM) wedi cynyddu mynegiadau ffurfiau gweithredol caspase-3 a PARP yn sylweddol ac wedi lleihau mynegiadau cyfanswm caspase-3 a PARP mewn celloedd PC12, ac roedd yr effaith hon wedi'i gwrthdroi'n sylweddol gan driniaeth echdynnu BSHX (Ffigur.2C), sy'n awgrymu bod echdyniad BSHX yn amddiffyn celloedd PC12 yn effeithiol rhag apoptosis trwy reoleiddio'r llwybr caspase-3/PARP sy'n ddibynnol ar mitocondriaidd.

Mae dyfyniad BSHX yn atal cynhyrchu ROS mewngellol mewn celloedd PC12 a achosir gan HG

Gan y gallai HG wella ffurfio ROS mewngellol [15], gwnaethom brofi lefel y ROS mewngellol i benderfynu a allai dyfyniad BSHX atal cynhyrchu ROS. Roedd cynnydd o 3.{2}}yn y dwysedd fflworoleuedd cymedrig a arsylwyd mewn celloedd PC12 a oedd yn agored i 75 mM HG am 48 h o gymharu â rheolaeth. Mewn cyferbyniad, roedd cyd-driniaeth â detholiad BSHX wedi lleihau'r dwysedd fflworoleuedd cymedrig yn sylweddol i tua 0.76-, 0.{{10}}, a 0.{ {12}}plyg y grŵp model, yn y drefn honno, gan nodi y gallai detholiad BSHX atal cynhyrchu ROS a achosir gan HG (Ffigurau.3A, B).

Mae dyfyniad BSHX yn cynnal homeostasis mitocondriaidd mewn celloedd PC12 a achosir gan HG trwy reoleiddio mynegiant Bax a Bcl-2

Mae potensial pilen mitocondriaidd yn baramedr pwysig o'r swyddogaeth mitocondriaidd a ddefnyddir fel dangosydd iechyd celloedd. Mae JC{0}} yn liw lipoffilig, cationig a all fynd i mewn i mitocondria yn ddetholus a newid lliw o wyrdd i goch yn wrthdroadwy wrth i botensial y bilen gynyddu. Mewn celloedd iach â photensial pilen mitocondriaidd uchel, mae JC-1 yn ffurfio cymhlygion o'r enw J-agregau â fflworoleuedd coch dwys yn ddigymell. Ar y llaw arall, mewn celloedd apoptotig â photensial pilen mitocondriaidd isel, mae JC-1 yn parhau i fod yn y ffurf monomerig, sy'n dangos fflworoleuedd gwyrdd yn unig [16, 17]. Felly gall y gymhareb o fflworoleuedd gwyrdd i fflworoleuedd coch adlewyrchu dadbolariad mitocondriaidd. Yn ein hastudiaeth, cynyddwyd nifer y celloedd â mitocondria wedi'u dadbolaru (fflworoleuedd gwyrdd) yn sylweddol yn dilyn HG (75 mM) am 48 h, a chafodd y cynnydd hwn ei wrthdroi gan driniaeth echdynnu BSHX mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad (Ffigur.4A).

Yna fe wnaethom ganfod dosraniadau mitocondriaidd a sytoplasmig cytochrome c, chwaraewr allweddol yn y llwybr apoptosis sy'n dibynnu ar caspase actifadu. Canfuom fod sarhad HG (75 mM) am 48 h wedi achosi trawsleoliad dramatig o cytochrome c o mitocondria i'r cytoplasm, a chafodd yr adleoli hwn ei atal yn sylweddol gan driniaeth echdynnu BSHX (Ffigur.4B), sy'n nodi y gallai detholiad BSHX atal rhyddhau cytochrome c o mitocondria.

Ymhellach, mae proteinau teulu Bcl-2 yn rheolyddion pwysig o wahanol lwybrau apoptotig. Gall Bcl-2 atal apoptosis celloedd a achosir gan amrywiaeth o ffactorau sytotocsig ac mae'n atalydd rhyddhau cytocrom c o mitocondria i'r cytoplasm. Fodd bynnag, mae Bax, fel aelod o'r teulu Bcl-2, yn ffactor pro-apoptosis. Pan fydd apoptosis yn cael ei ysgogi, mae Bax yn mudo o'r cytoplasm i'r mitocondria ac yn dinistrio'r cyfanrwydd mitocondriaidd [5, 18]. Yn ein hastudiaeth, is-reoleiddiwyd lefel protein Bcl-2 a chafodd Bax ei uwchreoleiddio gan sarhad HG (75 mM) am 48 h, cafodd yr effaith hon ei wrthdroi yn ddibynnol ar grynodiad gan echdyniad BSHX (Ffigur.4C). Roedd yr holl ganlyniadau hyn uchod yn awgrymu bod echdyniad BSHX yn diogelu celloedd PC12 rhag dadbolariad mitocondriaidd a achosir gan HG trwy reoleiddio mynegiant Bax a Bcl-2.

Effaith dyfyniad BSHX ar apoptosis celloedd trwy lwybrau signalau JNK/p38 MAPK

Mae rhai astudiaethau wedi dangos bod mwy o gynhyrchiad ROS wedi bod yn gysylltiedig ag actifadu llwybrau MAPK, i sbarduno apoptosis celloedd9 [19, 20]. Felly fe wnaethom ymchwilio i effaith dyfyniad BSHX ar lwybr signalau Protein Kinase (MAPK) wedi'i Weithredu â Mitogen i benderfynu a allai dyfyniad BSHX wanhau apoptosis a achosir gan HG. Fel y dangosir yn Ffigur 5, cynyddodd sarhad HG (75 mM) am 48 h ffosfforyleiddiadau c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) a p38 mewn celloedd PC12, a gafodd eu rhwystro'n sylweddol gan echdyniad BSHX mewn crynodiad- modd dibynnol. Fodd bynnag, ni welwyd canlyniad tebyg gyda Protein Kinase Allgellog a Reoleiddir (ERK) MAPK. Mae'r canlyniadau'n awgrymu y gallai dyfyniad BSHX atal apoptosis celloedd a achosir gan HG trwy lwybrau signalau JNK / p38 MAPK.

Trafodaeth

Mae enseffalopathi diabetig (DE) yn gymhlethdod cyffredin diabetes mellitus math 2 (T2DM). Gall achosi nam gwybyddol ar yr ymennydd ac mae'n ffactor risg pwysig o farwolaethau ac anabledd mewn cleifion diabetes mellitus math 2 ledled y byd [3]. Felly, mae'n hanfodol astudio mecanwaith DE yn ogystal â'i strategaethau atal a thrin.

Yn Tsieina, mae meddyginiaethau Tsieineaidd traddodiadol (TCMs) wedi'u defnyddio ar gyfer trin DM ers blynyddoedd lawer ac wedi dangos effaith iachaol. Mae rhai astudiaethau clinigol yn awgrymu y gall TCMs sy'n seiliedig ar arennau maethlon ac actifadu strategaethau gwaed is-reoleiddio glwcos yn y gwaed, hyrwyddo cylchrediad, a gwella camweithrediad gwybyddol yr ymennydd. Mae presgripsiwn BSHX yn gynrychiolydd o'r TCMs hyn. Dangosodd ein hastudiaeth glinigol ragarweiniol y gallai presgripsiwn BSHX wella glwcos gwaed, homocysteine ​​(HCY), a phrotein C-adweithiol sensitifrwydd uchel (hs-CPR) mewn serwm yn effeithiol, a gwella swyddogaeth wybyddol cleifion diabetig â nam gwybyddol ysgafn (MCI) [12]. Fodd bynnag, mae diffyg tystiolaeth i brofi effeithlonrwydd a mecanwaith ffarmacolegol hyd yn hyn.

Yn yr astudiaeth hon, canfuom y gallai dyfyniad BSHX wanhau'r gostyngiad hyfywedd celloedd a achosir gan HG, fel y'i mesurwyd gan MTT, assay LDH. Er mwyn archwilio ymhellach effaith amddiffynnol dyfyniad BSHX ar hyfywedd celloedd, astudiwyd apoptosis gan Hoechst 33258 a dadansoddiad staenio AO / EB. Dangosodd y canlyniadau y gallai dyfyniad BSHX leihau apoptosis a achosir gan HG yn sylweddol. Fel marciwr apoptosis, codwyd caspase-3 a PARP yn sylweddol ar ôl triniaeth gyda HG ond rhwystrwyd gweithrediad y ffactorau pro-apoptotig hyn gan echdynnu BSHX mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad. Dangosodd y canlyniadau uchod fod dyfyniad BSHX yn cael effaith amddiffynnol ar ddifrod celloedd PC12 a achosir gan HG.

Mae ROS yn cael ei ffurfio yn ystod y broses o ffosfforyleiddiad ocsideiddiol o gelloedd, a gall ei gynnydd mewn cynhyrchiad neu ddifrod systemau gwrthocsidiol arwain at straen ocsideiddiol mewn celloedd [21]. Mae astudiaethau wedi dangos y gallai glwcos uchel arwain at groniad o ROS mewngellol ac yn y pen draw llwybr signalau apoptotig gweithredol. A'r mecanwaith cyffredin o gymhlethdodau diabetig yw straen ocsideiddiol [22, 23]. Dangosodd ein canlyniadau y gallai glwcos uchel arwain at gynnydd ROS mewn celloedd PC12, a oedd yn gyson ag astudiaethau blaenorol [24]. Tybir y gellir cyflawni gwenwyndra glwcos uchel i gelloedd trwy apoptosis a achosir gan ROS. Mitocondria yw prif safleoedd cynhyrchu ROS mewngellol a'r prif organ darged ar gyfer ymosodiad ROS hefyd [25]. O dan amodau patholegol, gall cynnydd cyflym ROS arwain at gamweithrediad mitocondriaidd, cwymp potensial pilen mitocondriaidd ac yn y pen draw arwain at apoptosis celloedd [26]. Felly fe wnaethom ganfod cyfanrwydd y mitocondria. Dangosodd ein canlyniadau fod glwcos uchel wedi lleihau potensial y bilen mitocondriaidd yn sylweddol, cynyddu'r gymhareb Bax/Bcl-2 a oedd yn rheoli'r broses o newid mandwll trawsnewid athreiddedd mitocondriaidd (MPTP), a hyrwyddo gollyngiad cytochrome c, tra gallai dyfyniad BSHX gwrthdroi'r newidiadau hyn. Mae'r rhain yn awgrymu y gallai'r dyfyniad BSHX niwro-amddiffynnol yn erbyn celloedd PC12 a achosir gan HG ddeillio o gynnal cyfanrwydd mitocondria.

Mae llwybr signalau MAPK hefyd yn chwarae rhan bwysig mewn apoptosis celloedd. JNK, ERK, a t38 MAPK yw'r aelodau o'r teulu MAPK sydd wedi'u hastudio fwyaf. Eu prif ffordd o weithredu yw ffosfforyleiddio eu safleoedd penodol, a thrwy hynny reoleiddio apoptosis celloedd [8, 27, 28]. Ar ben hynny, mae astudiaethau wedi dangos y gall cynhyrchu gormod o ROS ysgogi ffosfforyleiddiad p38MAPK [29-31], a gall ROS gymell neu gyfryngu gweithrediad y llwybrau MAPK [32]. Gall sawl ysgogiad cellog sy'n cymell cynhyrchu ROS hefyd yn gyfochrog actifadu llwybrau MAPK mewn sawl math o gelloedd [32, 33]. Gall y mecanweithiau posibl ar gyfer actifadu MAPK gan ROS gynnwys anactifadu a diraddio'r ffosffatasau MAPK sy'n cynnal y llwybr mewn cyflwr anactif [19]. Ar y llaw arall, i gadarnhau ymhellach a gafodd llwybrau MAPK eu gweithredu gan gynhyrchu ROS, cafodd celloedd eu trin ymlaen llaw â gwrthocsidyddion (ee NAC, sborionwr ROS) i atal cronni ROS. A dangosodd y canlyniadau fod actifadu MAPK bron wedi'i atal ar ôl ysgogi celloedd ag ysgogiadau cellog [32, 33], gan nodi cyfranogiad ROS yn anactifadu llwybrau MAPK. Yn ogystal, dangosodd astudiaethau, pan gafodd celloedd eu trin â'r atalydd JNK penodol SP600125, y gellid rhwystro'r apoptosis a achosir gan Cardiotoxin III [34]. Canfu ein hastudiaeth flaenorol y gallai presgripsiwn Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) wedi'i addasu atal actifadu ERK/p38 MAPK mewn microglia BV2 wedi'i actifadu [10]. Fodd bynnag, yn yr astudiaeth hon, canfuom y gallai dyfyniad BSHX atal ffosfforyleiddiad JNK a p38 MAPK ac ni chyflawnwyd yr un canlyniad â p-ERK. Rydym yn dyfalu bod gelod yn chwarae rhan wahanol mewn detholiad BSHX. Mae'r canlyniadau'n awgrymu y gallai mecanwaith amddiffynnol arall o echdyniad BSHX yn erbyn apoptosis mewn celloedd PC12 a achosir gan HG fod trwy reoleiddio llwybrau signalau JNK/p38 MAPK.

Casgliad

Mae dyfyniad BSHX, fformiwla amllysieuol, yn dangos effeithiau niwro-amddiffynnol ar gelloedd PC12 yn erbyn sarhad HG. Roedd dyfyniad BSHX yn atal apoptosis celloedd PC12 a achosir gan HG yn effeithiol trwy leihau cynhyrchiant ROS mewngellol, cynnal cyfanrwydd y bilen mitocondriaidd, a rhwystro llwybrau signalau caspase-3 a JNK/p38 MAPK (Ffigur.6). Gyda'i gilydd, mae ein canfyddiadau'n awgrymu bod detholiad BSHX yn gyfrwng addawol ar gyfer trin DE mewn cymwysiadau clinigol.

Cyfraniadau awdur

Creu a dylunio'r arbrofion: Zeng KW, Wang XM. Wedi cynnal yr arbrawf: Zhao SY. Wedi dadansoddi'r data: Zhao SY, Zeng KW, a Wang XM. Adweithyddion / deunyddiau / offer dadansoddi cyfrannol: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW, a Wang XM. Ysgrifennodd y pater: Zhao SY.

Cyfeiriadau

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Yr ymennydd diabetig a gwybyddiaeth. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Anaf i'r ymennydd gyda diabetes mellitus: tystiolaeth, mecanweithiau a goblygiadau triniaeth. Arbenigwr Parch Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Damcaniaeth "Cof Metabolaidd" a Thriniaeth Gynnar o Hyperglycemia i Atal Cymhlethdodau Diabetig. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Potensial y bilen mitocondriaidd (Δψm) mewn apoptosis; diweddariad. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Cysylltu deinameg mitocondriaidd a digwyddiadau bywyd-neu-marwolaeth trwy broteinau teulu Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitocondria a marwolaeth celloedd. Agweddau mecanyddol a materion methodolegol. Chwef J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et al. Mae 1,25-(OH)2D3 yn atal apoptosis a achosir gan glwcos uchel a chynhyrchiad ROS mewn celloedd mesothelaidd peritoneol dynol trwy'r llwybr MAPK/P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. Mae rhag-driniaeth ffactor twf nerfol yn gwanhau ocsigen a glwcos a achosir gan amddifadedd c-Mehefin amino-terminal kinase 1 a kinases straen-actifadu p38 a p38 actifadu ac yn rhoi niwroprotection yn y model PC12 pheochromocytoma. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sul L, Wang J, et al. Cynnwys caspase-3 a p38 kinase protein-activated mitogen mewn apoptosis a achosir gan cobalt clorid mewn celloedd PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Effeithiau Antineuroinflammatory Presgripsiwn Wu-Zi-Yan-Zong wedi'i Addasu mewn Microglia BV2 wedi'i Ysgogi gan Amyloid trwy'r Llwybrau Signalu MAPK NF-κB ac ERK/p38. Alt Compl Wedi'i Seilio ar Evid 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. Mae presgripsiwn Wu-Zi-Yan-Zong wedi'i addasu, fformiwla amllysieuol Tsieineaidd draddodiadol, yn atal prosesau niwrolidiol a achosir gan lipopolysaccharid mewn astrocytes llygod mawr trwy lwybrau signalau MAPK NF-κB a JNK/p38. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. Effaith Presgripsiwn Bushen Huoxue ar Drin Amhariad Gwybyddol Ysgafn ar gyfer Diabetes Math 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Dadansoddiad o apoptosis a achosir gan cycloheximide mewn leukocytes dynol: Microsgopeg fflworoleuedd gan ddefnyddio anecsin V/propidium ïodide yn erbyn acridine orange/ethidium bromid. Cell Biol. Int 2006, 30:924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Caspases Cysylltu Arwyddion Cell-Marwolaeth â Homeostasis Organebol. Imiwnedd 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Ocsid nitrig: ffactor allweddol y tu ôl i gamweithrediad celloedd epiliaid endothelaidd mewn math o ddiabetes mellitus-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: Mae tonfeddi cyffro amgen yn hwyluso cytometreg potensial pilen mitocondriaidd. Cell Marwolaeth Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. stilwyr potensial pilen mitocondriaidd a graddiant y proton: canllaw defnydd ymarferol. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Sut mae proteinau BCL-2 yn ysgogi athreiddiad pilen allanol mitocondriaidd? Tueddiadau Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Mab Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Cinases protein wedi'i Actifadu â Mitogen a rhywogaethau ocsigen adweithiol: sut y gall ROS actifadu llwybrau MAPK? J Traphont Signal 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Mae esterau heterocyclic aromatig o podophyllotoxin yn cyflawni gweithgaredd gwrth-MDR mewn celloedd lewcemia dynol K562/ADR trwy lwybr signalau ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, Gwyn AR, Koistinaho J, et al. Targedu Glycogen Synthase Kinase-3 ar gyfer Budd Therapiwtig yn erbyn Straen Ocsidiol mewn Clefyd Alzheimer: Cynnwys y Llwybr Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011: 985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Rôl Straen Ocsidiol mewn Niwropathi Diabetig: Cynhyrchu Rhywogaethau Radical Rhad ac Am Ddim yn yr Adwaith Glycation a Pholymorffeddau Genynnau Amgodio Ensymau Gwrthocsidiol i Ragdueddiad Genetig i Niwropathi Diabetig mewn Poblogaeth o Gleifion Diabetig Math I. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Marwolaeth cellog, rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) a chymhlethdodau diabetig. Cell Marwolaeth Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, et al. Mae Ginkgolide B yn atal apoptosis mewn celloedd endothelaidd gwythiennau bogail dynol a ysgogir gan glwcos uchel. Bwletin Ffarmacolegol Tsieineaidd 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Rôl Ddifrïol Superoxide Dismutase yn y Gofod Rhyngbilen Mitocondriaidd. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Cinases protein a weithredir gan mitogen: llwybrau signalau newydd yn gweithredu mewn ymatebion cellog i straen amgylcheddol. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, et al. Mae MiR{1}}b yn gweithredu fel oncogen mewn celloedd glioblastoma ac yn atal apoptosis celloedd trwy lwybrau p53 a p38MAPK-annibynnol. Brit J Canser 2013, 109: 2853 .

28. Shi L, Yu X, Yang H, et al. Mae cynhyrchion terfynol glyciad uwch yn ysgogi apoptosis celloedd epithelial cornbilen dynol trwy gynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol ac actifadu llwybrau MAPK JNK a p38. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, et al. Mae Ghrelin yn atal apoptosis mewn celloedd niwronaidd hypothalamig yn ystod amddifadedd ocsigen-glwcos. Endocrinoleg 2007, 148:148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A yn newid proteinau rheoleiddio cylch-gell ac yn ysgogi apoptosis trwy actifadu p38MAPK ocsigen adweithiol sy'n ddibynnol ar rywogaethau yn llinell gell canser y fron dynol MCF-7. Bioleg Tiwmor 2014, 35: 10159 .

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. Anafiadau Ocsidiol a achosir gan ROS sy'n ymwneud â Pathogenesis o Keratitis Ffwngaidd trwy Ysgogi t38 MAPK. Cynrychiolydd Gwyddonol 2017, 7: 10421.

32. McCubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Actifadu llwybrau signalau kinase MAP a achosir gan ocsigen adweithiol. Arwydd Rhydocs Gwrthocsid 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. signalau Redox a llwybrau kinase MAP. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Mae Cardiotoxin III yn achosi apoptosis sy'n ddibynnol ar kinase-terminal c-jun mewn celloedd lewcemia dynol HL-60. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.