RHAN 1 Mae Acteoside yn Atal Osteoclastogenesis Cyfryngol RANKL Trwy Atal Ymsefydlu C-Fos A Llwybr NF- KB A Gwanhau Cynhyrchu ROS

Seung-Youp Lee^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Môr Hyun Yi^2., Sung-Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Sefydliad Ymchwil Meddygaeth Glinigol Prifysgol Genedlaethol Chonbuk, Sefydliad Ymchwil Biofeddygol Ysbyty Prifysgol Genedlaethol Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, De Korea, 2 Adran Orthodonteg, Sefydliad Biowyddorau Geneuol ac Ysgol Deintyddiaeth, Prifysgol Genedlaethol Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, De Korea, 3 Adran Gwyddorau Deunydd Bioactif, Canolfan Ymchwil Deunyddiau Bioactif, Prifysgol Genedlaethol Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, De Korea

Haniaethol

Mae nifer o astudiaethau wedi nodi bod cytocinau llidiol yn gyfryngwyr pwysig ar gyfer osteoclastogenesis, gan achosi atsugniad esgyrn gormodol ac osteoporosis.Acteoside, y prif gyfansoddyn gweithredol oRehmannia glutinosa, a ddefnyddir yn eang mewn meddygaeth Dwyreiniol traddodiadol, mae ganddo botensial gwrthlidiol a gwrthocsidiol. Yn yr astudiaeth hon, canfuwyd hynnyacteosidllesteirio gwahaniaethu a ffurfio osteoclast yn sylweddol o macroffagau mêr esgyrn (BMMs) a macroffagau RAW264.7 a ysgogwyd gan ysgogydd derbynnydd ligand ffactor niwclear-kappaB (NF-kB) (RANKL). Roedd pretreatment aceoside hefyd yn atal atsugniad esgyrn gan osteoclastau aeddfed mewn modd dos-ddibynnol.Acteoside(10 mM) gwanhau actifadu wedi'i ysgogi gan RANKL o kinase p38, kinases allgellog a reoleiddir gan signal, a kinase terfynell c-Jun, a hefyd atal actifadu NF-kB trwy atal ffosfforyleiddiad yr is-uned p65 a'r atalydd kBa. Yn ogystal, mae cynnydd wedi'i gyfryngu gan RANKL yn y mynegiant o c-Fos a ffactor niwclear celloedd T wedi'u actifadu, cytoplasmig 1 (NFATc1), ac mewn cynhyrchu necrosis ffactor-a tiwmor, interleukin (IL)-1b , ac mae'n debyg bod IL-6 wedi'u rhwystro gan ragdriniaeth acteoside. Ymhellach, llafaracteosidllai o golled esgyrn a achosir gan ofariectomi a chynhyrchiad cytocin llidiol i reoli lefelau. Mae ein data yn awgrymu hynnyacteosidyn atal gwahaniaethu osteoclast ac aeddfedu rhag rhagflaenwyr osteoclastig trwy atal actifadu kinases protein a ysgogir gan RANKL a ffactorau trawsgrifio megis NF-kB, c-Fos, a NFATc1. Gyda’i gilydd, mae’r canlyniadau hyn yn awgrymu hynnyacteosidGall weithredu fel asiant gwrth-atsugno i leihau colled esgyrn trwy rwystro gweithrediad osteoclast.

Am fwy o wybodaeth cysylltwch â:emily.li@wecistanche.com

Rhagymadrodd

Mae asgwrn yn cael ei ailfodelu'n gyson gan weithgaredd osteoclast cytbwys ac osteoblast [1]. Mae osteoclastau yn deillio o gelloedd rhagflaenol hematopoietig y llinach monocyte/macrophage, tra bod osteoblastau o'r llinach mesenchymal [2]. Gall actifadu annormalosteoclast neu leihau osteoblastogenesis amharu ar homeostasis esgyrn, gan achosi clefydau fel osteoporosis, arthritis, a chanser esgyrn yn y pen draw [3,4]. Mae osteoporosis yn glefyd esgyrn cyffredin sy'n arwain at risg uwch o dorri asgwrn. Mae'r math mwyaf cyffredin o osteoporosis yn cael ei achosi gan ddiffyg estrogen mewn menywod menopos. Gall meddyginiaethau fel corticosteroidau a gwrth-epileptig hefyd achosi anghydbwysedd rhwng atsugniad esgyrn a ffurfio, a all arwain at osteoporosis [5]. Mae llawer o atalyddion gwrth-adferol gan gynnwys bisffosffonadau, calcitonin, estrogen, a modulatyddion derbynyddion estrogen dethol wedi'u defnyddio i drin osteoporosis. Mae'r atalyddion hyn yn cynnal màs esgyrn trwy atal swyddogaeth osteoclast [6]. Therapi amnewid estrogen yw'r driniaeth fwyaf poblogaidd i atal a thrin osteoporosis ôlmenopawsol. Fodd bynnag, gall therapi amnewid estrogen hirdymor gynyddu'r risg o ganserau endometrial a chanser y fron. Felly, mae llawer o ymchwilwyr wedi canolbwyntio eu hymdrechion ar ddatblygu asiant gwrth-adfer newydd nad oes ganddo sgîl-effeithiau [7-10]. Gan fod osteoclastau yn gweithredu mewn atsugniad esgyrn, mae atal osteoclastau yn benodol wedi cael ei ystyried fel y prif darged mewn nifer o astudiaethau. Mae osteoclastau yn gelloedd anferth aml-niwclear a ffurfiwyd gan ehedyddion mononiwclear y teulu monocyte / macrophage trwy amlhau dilyniannol, gwahaniaethu, ac ymasiad celloedd rhagflaenol hematopoietig [11]. Mae ffactor ysgogi cytref Macrophage (M-CSF) ac ysgogydd derbynnydd ffactor niwclear (NF) -kB (RANK) ligand (RANKL) yn ffactorau hanfodol ar gyfer gwahaniaethu osteoclast[12]. Yn ogystal, mae nifer o cytocinau llidiol, megis ffactor necrosis tiwmor (TNF) ac interleukin (IL)-1b, yn cyfrannu at osteoclastogenesis trwy fodiwleiddio anwythiad RANKL, osteoprotegerin, a M-CSF [7,13]. Mae rhwymiad RANKL i'r derbynnydd RANK wyneb-gell yn arwain at RANKL/RANK/TNFR

cymhlygau ffactorau cysylltiedig (TRAF) sy'n actifadu NFkB yn olynol a kinases protein wedi'i actifadu gan mitogen (MAPKs), gan gynnwys cJun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase, a kinase allgellog sy'n gysylltiedig â signal (ERK) [14]. Mae'r actifadu hwn yn chwarae rhan allweddol wrth gyfryngu gwahaniaethu osteoclast, actifadu, a goroesi.RANKL hefyd yn actifadu mynegiant ffactorau trawsgrifio megis ffactor niwclear celloedd T activated, cytoplasmig 1 (NFATc1) a-Fos, sy'n hanfodol ar gyfer datblygiad osteoclast [ 7,9]. Felly, mae signalau RANKL yn cael ei ystyried yn brif darged o gyfryngau gwrth-atsugno sy'n atal actifadu osteoclast ac yn ddi-asgwrn.Acteosideyw prif gyfansoddyn gweithredol Rehmannia glutinosa, a ddefnyddir yn eang mewn meddygaeth Dwyreiniol traddodiadol [15,16].Acteosideyn gwrthocsidydd cryf ac mae ganddo weithgareddau gwrth-hepatotocsig, gwrthlidiol a gwrth-nociceptive [17-20]. Gwelsom hynny o'r blaenacteosidyn lleihau gweithgaredd tyrosinase a biosynthesis melanin trwy reoleiddio signalau ERK [21], yn amddiffyn rhag difrod gingival wedi'i gyfryngu gan rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) [22], ac yn atal difrod celloedd wedi'i gyfryngu gan mycotocsin [23]. Mae cysylltiad agos rhwng yr effeithiau hynacteosidgallu i ddileu ROS a rheoleiddio signalau trwy gyfrwng MAPK. Yn benodol, awgrymir ROS i gyfryngu llwybrau signalau a achosir gan RANKL a digwyddiadau cellog mewn osteoclastau. Roedd cyn-driniaeth â gwrthocsidyddion yn atal actifadu NF-kB, ERK, ac IkBa a achosir gan RANKL, a thrwy hynny atal osteoclastogenesis [24]. Roedd y canfyddiadau hyn yn awgrymu'n gryf, yn ogystal â gweithgaredd gwrthlidiol, a bod gweithgaredd gwrthocsidiol yn hanfodol ar gyfer asiant gwrth-atiannol, fellyacteosidyn gallu atal osteoclastogenesis a achosir gan RANKL. Yn yr astudiaeth bresennol, fe wnaethom archwilio aacteosidyn cael effaith therapiwtig ar golli esgyrn. Archwiliwyd effeithiauacteosidar wahaniaethu osteoclast ac atsugniad esgyrn a'r mecanweithiau cellog cysylltiedig gan ddefnyddio systemau arbrofol in vitro ac in vivo.

acteosid

Defnyddiau a Dulliau

Datganiad Moeseg

Cymeradwywyd arferion gofal a defnydd anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg wrth Ofalu a Defnyddio Anifeiliaid Labordy Prifysgol Genedlaethol Chonbuk (Rhif Trwydded CBU 2010-0007). Cynhaliwyd yr holl arbrofion yn yr astudiaeth hon yn unol â chanllawiau Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid y Brifysgol.

Llygod, Cemegau, a Nwyddau Labordy

Prynwyd llygod ICR benywaidd pedair wythnos oed gan OrientBio Inc. (Seoul, Korea) a'u cadw yn 2261uC a 5565 y cant o leithder ar gylchred golau/tywyll 12 h gyda mynediad am ddim i fwyd a dŵr. Roedd acteoside (3,4-dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Ffig. S1) wedi'i ynysu oddi wrth ddail Rehmannia glutinosa. Cafodd Acteoside ei hydoddi mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) cyn ei ddefnyddio. Prynwyd RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, ac M-CSF o systemau ymchwil a datblygu (Minneapolis, MN, UDA). Cafwyd gwrthgyrff sy'n benodol i c-Fos, t65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa, a b-actin gan Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, UDA ). Prynwyd gwrthgyrff ar gyfer p-p38 a p38 gan Cell Signaling Technology (Danvers, MA, UDA). Prynwyd Pecynnau EIA CalciumAssay ac Osteocalcin (OC) ganBioAssay Systems (Hayward, CA, UDA) a Biofeddygol Technologies (Stoughton, MA, UDA), yn y drefn honno, i bennu paramedrau biocemegol serwm. Defnyddiwyd pecyn asesu ffosffatas asid sy'n gwrthsefyll tartrad llygoden (TRAP) (Systemau Imiwnodiagnostig, Scottsdale, AZ, UDA) hefyd i fesur lefel TRAP5b serwm. Oni nodir yn wahanol, cafwyd cemegau ychwanegol gan Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, UDA), a daeth nwyddau labordy o SPL Life Sciences (Pochun, De Korea).

Diwylliannau Cell

Cafwyd celloedd mêr esgyrn o'r tibiae a femora o 6 wythnos oed llygod ICR benywaidd yn ôl dulliau a ddisgrifiwyd yn flaenorol [25]. Deorwyd y daliant mêr esgyrn mewn dysgl feithrin100-mm ym mhresenoldeb M-CSF 50 ng/ml. Ar ôl 3 diwrnod, defnyddiwyd celloedd ymlynol fel macroffagau mêr esgyrn (BMMs) i ysgogi gwahaniaethu osteoclastig. Cafodd rhai celloedd mêr esgyrn eu deor hefyd am 48 h heb M-CSF, a chafodd celloedd ymlynol eu meithrin mewn cyfrwng gwahaniaethu osteoblast, fel y disgrifir mewn man arall [25]. Cafodd celloedd macrophage RAW264.7 eu meithrin yng nghyfrwng addasedig Eagle's (DMEM) Dulbecco gyda 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS), 2 mM L glutamine, a gwrthfiotigau. Defnyddiwyd y celloedd hyn fel llinell gell cyfatebol ar gyfer BMMs i archwilio effaith acteoside ar osteoclastogenesis.

Gwahaniaethu Osteoclastig a staenio TRAP

Cafodd BMMs eu rhag-drin â chrynodiadau amrywiol (0-50 mM) o acteosid am 2 awr cyn eu hysgogi gyda 100 ng/ml RANKL. Disodlwyd cyfryngau diwylliant â chyfryngau ffres ar ddiwrnodau 2 a 5. Ar ôl 7 diwrnod o ddeori, gosodwyd y diwylliannau mewn paraformaldehyd wedi'i glustogi gan PBS 4 y cant a'u staenio â TRAP gan ddefnyddio pecyn Aldrich sigma yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyfrifwyd celloedd TRAP-positif gan ddefnyddio microsgopeg optig, ac ystyriwyd bod celloedd sy'n cynnwys 3 neu fwy o gnewyllyn yn osteoclasts.RAW 264.7 celloedd hefyd yn agored i 100 ng/ml RANKL ar ôl pretreatment ag acteoside am 2 h, ac ar ôl 7 diwrnod o deori, cafodd y celloedd eu prosesu ar gyfer staenio TRAP.

Mesur Hyfywedd Celloedd

Pennwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio adweithydd halen tetrazolium sy'n hydoddi mewn dŵr (WST)-8. Yn gryno, cafodd celloedd BMM neu RAW264.7 wedi'u meithrin mewn cyfrwng twf sy'n cynnwys 10 y cant FBS a gwrthfiotigau eu trin ag acteosid 10 mM neu gyfansoddion ffenolig fel quercetin, luteolin, apigenin, neu epigallocatechin-3-gallate(EGCG). Ychwanegwyd adweithydd WST-8 i'r diwylliannau ar ôl 48 awr o ddeor. Ar ôl deori am 4 h ychwanegol, mesurwyd amsugnedd penodol WST-8-ar 450 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, UDA).

Assay Adsugniad Esgyrn

Cafodd BMMs (16105 o gelloedd/ml) eu hatal mewn a-MEM sy'n cynnwys 50 ng/ml M-CSF a 100 ng/ml RANKL, yna wedi'u rhannu ar draws plât ffynnon wedi'i orchuddio â nanocrystalau calsiwm ffosffad (OAAS{{6} }; Is-haen Assay Activity Osteoclast, Oscotec Inc., Choongnam, De Korea) ar ddwysedd o 26104 o gelloedd/cm2 gyda acteoside a hebddo. Ar ôl deori am 7 diwrnod, tynnwyd y celloedd o'r platiau gyda 5 y cant o sodiwm hypoclorit, a gwelwyd ffurfio pyllau o dan ficrosgop optig. Mesurwyd yr ardal a atsugnwyd hefyd gan ddadansoddwr delwedd a'i fynegi fel canran o'r gwerth rheoli.

Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol

Paratowyd lysates protein cyfan mewn byffer lysis fel y disgrifir mewn man arall [26]. Paratowyd proteinau cytosolig a niwclear fel y disgrifiwyd yn flaenorol [25]. Gwahanwyd symiau cyfartal o brotein gan 12-15 y cant SDS-TUDALEN a'u blotio ar bilenni polyvinyl difluoride. Archwiliwyd y blotiau â gwrthgyrff cynradd dros nos yn 4uC cyn deor â gwrthgorff eilaidd mewn byffer blocio am 1 awr. Datblygwyd y blotiau gyda chemiluminescence gwell (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Swydd Buckingham, DU) ac yn agored i ffilm pelydr-X (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, UDA).

MAPK Assay Gweithgaredd

Cafodd celloedd eu trin ymlaen llaw ag acteoside am 2 awr ac yna eu hysgogi gyda RANKL am-30 funud ychwanegol. Penderfynwyd ar weithgareddau MAPK gan ddefnyddio citiau assay imiwnometrig, megis y pecyn assay p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), pecyn assay ensymau p-ERK (Assay Designs), a phecyn ELISA brechdan p-SAPK/JNK ( Technoleg Signalau Cell, MA, UDA). Roedd yr holl weithdrefnau'n dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, a chafodd amsugnedd ei fesur gan ddarllenydd microplate.

Assay Symud Symudedd Electrofforetig (EMSA)

Perfformiwyd adweithiau rhwymo DNA-protein am 30 munud ar dymheredd yr ystafell, gyda phrotein 10-15 mg mewn byffer 20 ml yn cynnwys 1 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml poly (dI-dC), 5 y cant glyserol ,1 mM DTT, PMSF 1 mM, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM o [a-32P] dCTP-label oligonucleotides, a'r darn Klenow o DNA polymeras. Gwahanwyd y samplau ar geliau polyacrylamid 6 y cant, a gafodd eu sychu a'u hamlygu i ffilm pelydr-X (Eastman Kodak Co.) am 12-24 awr yn 270uC. Roedd y dilyniannau preimio oligonucleotid yn benodol ar gyfer NF-yn 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 a 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{30 }}.

Assay Luciferase NF-kB

Trawsnewidiwyd macroffagau RAW264.7 mewn 24-platiau ffynnon â0.8 mg fector gohebydd kB-luciferase gan ddefnyddio 2 ml o Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Ar 24 h ar ôl trawsgludiad, ysgogwyd y celloedd â RANKL ym mhresenoldeb ac absenoldebacteosidam 24 h. Cafodd celloedd eu hailddarparu mewn byffer lysis gohebydd 100 ml (Promega, Madison, SyM, UDA). Rhoddwyd yr un faint o samplau protein mewn 96-microblatiau ffynnon a'u cymysgu â swbstrad luciferase. Mesurwyd luminescence trwy ddefnyddio luminometer microplate (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, yr Almaen). Yn yr arbrawf hwn, defnyddiwyd peptid atalydd NF-B athraidd (BIOMOL, Butler Pike, PA, UDA) fel atalydd kB positif.

Mesur Cytocinau

Cafodd celloedd BMM neu RAW264.7 eu hysgogi gyda RANKL ym mhresenoldeb acteosid mewn 24-blatiau meithrin ffynnon. Ar ôl 48 h o ddeori, casglwyd ac aseswyd supernatants meithrin gan ELISA gan ddefnyddio pecynnau OptEIATM penodol TNF-a-, IL-1b- ac IL-6-yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Adwaith cadwynol trawsgrifio-polymeras gwrthdro Gwrthdroi Amser Real (RT-PCR)

Pennwyd mynegiant mRNA o farcwyr osteoclastig, megis c-Fos, NFATc1, a TNF-a, gan RT-PCR amser real. Yn gryno, echdynnwyd cyfanswm RNA o macroffagau gyda Trizolreagent yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Invitrogen). Cafodd cDNA ei syntheseiddio ag 1 mg o gyfanswm RNA gan ddefnyddio SuperScriptReverse Transcriptase II a paent preimio (Invitrogen). Defnyddiwyd Power SYBRGreen PCR Master Mix (Cymhwysol Biosystems, Foster City, CA, UDA) i ganfod y casgliad o gynnyrch PCR yn ystod beicio gyda system canfod dilyniant ABI 7500 (AppliedBiosystems). Ar ôl dadnatureiddio ar 95uC am 10 munud, roedd PCR

Mesur ROS Mewngellol

Paratowyd hydoddiant stoc o 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate(DCFH-DA) (579- mM; Calbiochem, Darmstadt, yr Almaen) yn DMSO a'i storio ar 220uC yn y tywyllwch. Yn gryno, cafodd BMMs (106 cell/ml mewn 6-blatiau ffynnon) eu meithrin â 50 ng/MLM-CSF am 24 h ac yna eu trin â chrynodiadau amrywiol (0–10 mM) o acteosid 2 h cyn ysgogiad gyda 100 ng/mlRANKL. Ar ôl 1 h o gyd-deoriad, deorwyd y celloedd hyn gyda 25 mM DCFH-DA am 30 munud. Cofnodwyd fflworoleuedd gwyrdd o 29,79-dichlorofluorescein (DCF) ar 515 nm (FL 1) gan ddefnyddio system FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, UDA), a 10,000 o ddigwyddiadau eu cyfrif fesul sampl.

Sefydlu Osteoporosis a Achosir gan Ovariectomi

Defnyddiwyd llygod ICR benywaidd (6 wythnos oed) ar gyfer yr astudiaeth hon. Derbyniodd llygod lawdriniaeth ffug (Sham, n=10) neu lawdriniaeth ovariectomized (OVX, n=20) o dan anesthesia. Wythnos ar ôl llawdriniaeth, rhannwyd y llygod OVX ar hap yn 2 grŵp o 10 llygod yr un: OVX dwyochrog ac OVX dwyochrog wedi'i ategu â 200 ml PBS sy'n cynnwys acteoside 1 mM ar lafar (grŵp AC). Llafaracteosidyn cael ei roi unwaith bob 3 diwrnod am 8 wythnos ar ôl llawdriniaeth, a'r un faint o PBS yn cael ei roi i'r grwpiau Sham ac OVX. Ar ôl 1 diwrnod o'r weinyddiaeth ddiwethaf, aberthwyd llygod ac yna dadansoddwyd paramedrau biocemegol mewn serwm a 3-strwythur esgyrn dimensiwn.

Penderfynu Paramedrau Biocemegol Serwm

Casglwyd samplau gwaed trwy dyllu cardiaidd a chasglwyd serwm trwy allgyrchiad. Roedd samplau serwm yn cael eu storio ar 280uC ar gyfer dadansoddiadau o baramedrau biocemegol. Amcangyfrifwyd lefelau serwm IL-1b ac IL-6 gan ddefnyddio'r pecyn ELISA fel y disgrifir uchod, tra bod gweithgaredd ffosffatase alcalïaidd (ALP) yn cael ei bennu trwy ddefnyddio assay colorimetrig biocemegol sy'n mesur faint o p. -nitrophenol a gynhyrchir o swbstrad ffosffad p-nitrophenol, fel y disgrifir mewn man arall [27]. I amcangyfrif biofarcwyr ffurfiant esgyrn ac atsugniad, pennwyd lefelau serwm OC, calsiwm a TRAP5b hefyd yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwyr.

Dadansoddiadau o Strwythur Esgyrn a Pharamedrau Morffometrig

Cafodd femora llygod (grwpiau Sham, OVX, ac AC) eu dyrannu a'u llenwi â halwynog ffisiolegol ar gyfer profion mecanyddol. Mesurwyd cryfder mecanyddol y ffemwr fel y disgrifir mewn man arall [28]. Cofnodwyd y llwyth torri asgwrn fel y grym brig mewn newtonau ar y pwynt y mae siafft ganol toriad y forddwyd dde. Yn ogystal, dadansoddwyd ffemwr ysgafn pob anifail yn histomorphometrically gan ddefnyddio system tomograffeg microgyfrifiadur (micro-CT) (system pelydr-X microfocus SkyScan 1076, Kontich, Gwlad Belg). Yn gryno, cafodd yr esgyrn mewn storfa fformaldehyd 4 y cant eu sychu'n arwynebol ar feinwe papur cyn eu lapio mewn ''cling-film'' plastig neu mewn paraffilm, i atal sychu yn ystod sganio. Rhoddwyd pob asgwrn wedi'i lapio â phlastig mewn tiwbiau ewyn plastig/polystyren a gafodd eu gosod yn fertigol yn llorweddol yn siambr sampl sganiwr 1076 ar gyfer delweddu micro-CT. Cyflawnwyd y sganio gan ddefnyddio foltedd ffynhonnell 100 kV a cherrynt ffynhonnell 140 mA gyda chydraniad o 35 mm. Ail-grewyd modelau tri dimensiwn o esgyrn trabeciwlar y forddwyd gan ddefnyddio fersiwn SkyScan CT Analyzer 1.11. Y paramedrau strwythurol megis dwysedd mwynau asgwrn trabeciwlaidd (BMD, g/cm3), cyfaint esgyrn y cant (cyfaint esgyrn (BV) / cyfaint meinwe (TV), y cant), trwch (Tb.Th, mm), gwahaniad (Tb.Sp Yna mesurwyd , mm), a rhif (Tb.N, 1/mm).

Assay Gwahaniaethu Osteogenig a Mwynau

Cafodd celloedd mêr esgyrn wedi'u meithrin mewn {{{{10}}}blatiau meithrin ffynnon eu trin â DAG (10 nM dexamethasone, asid asgorbig 50 mM, a 20 mM b-glyseroffosffad) ym mhresenoldeb acteosid 10 mM. Ar ôl 2 wythnos o wahaniaethu, gosodwyd y celloedd â rhew-oer70 y cant (cyfrol / cyf) ethanol am 1 awr a'u staenio â 0.2 y cant alizarin coch Sin distyll dŵr am 30 munud ar dymheredd ystafell. Ar ôl i'r celloedd gael eu cadw a'u sychu yn yr aer, gwerthuswyd y platiau meithrin celloedd gan ficrosgopeg ysgafn gan ddefnyddio microsgop gwrthdro (Nikon TS100, Japan). I fesur faint o liw coch, cafodd y staen ei guddio â 10 y cant acetyl pyridinium clorid trwy ysgwyd am 20 munud a mesurwyd yr amsugnedd ar 560 nm. Mesurwyd faint o galsiwm a adneuwyd yn yr haenau celloedd hefyd gan ddefnyddio Kit Calsiwm (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn ogystal, pennwyd mynegiant marcwyr mRNA asgwrn-benodol, megis ffactor trawsgrifio cysylltiedig â rhediad-2(Runx2), osterix, sialoprotein asgwrn (BSP), ac OC gan RT-PCR amser real. Dyluniwyd paent preimio oligonucleotide o'r marcwyr hyn gyda meintiau cynnyrch yn llai na 200 bp gan ddefnyddio PrimerExpress Software 3.0 (Biosystemau Cymhwysol) fel y disgrifir mewn man arall[27].

Dadansoddiad Ystadegol

Oni nodir yn wahanol, mynegir yr holl ddata fel y gwyriad safonol cymedrig6 (SD) o 3 arbrawf annibynnol neu fwy. Defnyddiwyd ANOVA un ffordd ar gyfer cymariaethau lluosog gan ddefnyddio meddalwedd SPSS fersiwn 12.0. Ystyriwyd bod gwerth-p ,0.05 yn ystadegol arwyddocaol.

Canlyniadau

Mae Acteoside yn Atal Ffurfiant Osteoclast gan Macrophages mewn modd sy'n dibynnu ar ddos

I wirio effaith acteoside ar wahaniaethu BMM i osteoclastau, cafodd y celloedd eu meithrin â chrynodiadau amrywiol (0–20 mM) o acteosid am 7 diwrnod ym mhresenoldeb 50 ng/ml M CSF a 100 ng/ml RANKL . Gostyngodd Acteoside nifer yr osteoclastau mewn modd sy'n dibynnu ar ddos. Pan fydd y celloedd yn pretreated gyda 10 mM acteoside am 2 f, gostyngodd y nifer osteoclast 43 y cant o'i gymharu â chelloedd a ategwyd â M-CSFand RANKL (Ffig. 1 A). Mae Ffig. 1B yn dangos y gwahaniaethiad osteoclast wedi'i gyfryngu gan RANKL a'i ataliad trwy driniaeth gyfunol ag acteosid. Yn gyson â'r canlyniad hwn, gostyngodd pretreatment acteoside y gwahaniaethu a symbylwyd gan RANKL o gelloedd RAW264.7 a ffurfiant osteoclast (Ffig. 1C a D). Pan gymharwyd potensial gwrth osteoclastig acteoside ar BMMs â photensial gwrth-osteoclast nifer o gyfansoddion ffenolig ar yr un crynodiad (10 mM), dangosodd luteolin y gweithgaredd uchaf (Ffig. 2A). Fodd bynnag, gostyngodd luteolin, quercetin, neu apigenin ei hun hyfywedd y celloedd (Ffig. 2 B). Roedd yr holl gyfansoddion yn atal gwahaniaethu osteoclastig gan RAW264.7 macroffagau gyda'r gweithgareddau cymharol canlynol: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=acteoside (Ffig. 2C). Roedd luteolin, quercetin, neu apigenin ei hun hefyd yn dangos bod y celloedd yn llai hyfyw (Ffig. 2D). Mewn cyferbyniad, achosodd triniaeth quercetin ostyngiad sylweddol mewn hyfywedd yn y celloedd BMM a RAW264.7 yn unig, pan oedd y celloedd hyn yn agored i 10 mM o bob cyfansoddyn am 2 ddiwrnod gyda 50 ng / ml M-CSF, 100 ng / ml RANKL, neu'r ddau (data heb ei ddangos). Pan fydd angen crynodiad y cyfansoddion hyn i atal 50 y cant o

cyfrifwyd ffurfiant osteoclast mewn BMMs (IC50) gan ddefnyddio cromliniau gweithgaredd crynodiad, yr IC50 o acteoside, quercetin, luteolin, apigenin, ac EGCG oedd 5.1, 2.3, 2.6, 4.8, a 6.6 mM, yn y drefn honno (Ffig. 2E). Roedd y canlyniad hwn yn debyg i'r achos yr archwiliwyd macroffagau RAW264.7. Roedd y data hyn yn awgrymu bod gan luteolin a quercetin weithgareddau gwrth-clastogenig uwch nag acteosid. Mewn cyferbyniad, cafodd quercetin yn yr IC50 hefyd effaith wenwynig ysgafn ar y celloedd (data heb ei ddangos).

ActeosideYn atal Adsugniad Esgyrn gan MacrophagesActeoside hefyd yn atal atsugniad esgyrn RANKL-gyfryngol mewn modd dos-ddibynnol, fel y'i mesurwyd gan system model in vitro (Ffig. 3 A). Cafodd atsugniad esgyrn ei atal yn sylweddol pan gafodd BMMs eu deor ag acteosid 1 mM (Ffig. 3 B). Roedd triniaeth acteosid 10 mM bron yn gyfan gwbl wedi'i wanhau wrth i BMMs ffurfio pydew wedi'i achosi gan RANKL. Yn yr un modd, gostyngodd acteoside atsugniad esgyrn mewn celloedd RAW264.7 a symbylwyd gan RANKL (Ffig. S2A a B). Mae galluacteosidi atal atsugniad esgyrn yn dibynnu ar amseriad y driniaeth o'i gymharu ag ysgogiad RANKL. Ychwanegodd Acteoside(10 mM) 4 diwrnod ar ôl nid oedd ysgogiad RANKL yn lleihau ffurfio pyllau mewn BMMs, tra'i fod yn atal nifer yr osteoclastau a ffurfiwyd (Ffig. 3C). Roedd y canlyniad gwahanol hwn yn rhannol oherwydd ardal y pwll a ffurfiwyd eisoes ar ôl 4 diwrnod o ffurfio ysgogiad RANKL (Ffig. 3D).

ActeosideDown-Rheoleiddio Llwybrau Signalau RANKL Cynnar

Mae RANKL yn ysgogi actifadu 3 MAPK adnabyddus a NF-kB mewn rhagflaenwyr osteoclast, ac mae angen yr actifadu hwn ar gyfer gwahaniaethu osteoclast cynnar. Er mwyn deall y mecanweithiau posibl y mae acteoside yn eu defnyddio i atal osteoclastogenesis, fe wnaethom ymchwilio i effaith acteoside ar MAPKs ac actifadu NF-B mewn macroffagau. Cafodd celloedd BMM a RAW264.7 eu rhag-drin ag acteosid 10 mM am 2 h ac yna eu hysgogi gyda 100 ng / ml RANKL am 30 munud. MAPK phosphorylation ei archwilio gan blotio Western a dadansoddiad imiwnometrig.RANKL ysgogwyd phosphorylation o p38, ERK, a JNK inBMMs (Ffig. 4 A) a RAW264.7 celloedd (Ffig. 4 B). Ataliodd Acteosidesid y codiadau hyn a achoswyd gan RANKL mewn p-p38, p-ERK, a p-JNK. Mae'r canlyniad yn cael ei gefnogi gan dadansoddiad imiwnometrig, sy'n bod pretreatment gyda 10 mM acteoside sylweddol atal y lefelau MAPKs phosphorylated yn y macroffagau ( Ffig. 4 C ). Cynyddodd triniaeth RANKL y rhwymiad DNA o NF-kB, tra bod acteoside yn atal actifadu a achosir gan RANKL o rwymo NF-kB-DNA (Ffig. 5 A). Roedd yr ataliad hwn yn fwy amlwg mewn BMMs nag yng nghelloedd RAW264.7. Lleihaodd Acteoside hefyd p65 a symbylwyd gan RANKL a ffosfforyleiddiad IkBa mewn BMMs a chelloedd RAW264.7 (Ffig. 5B ac C). Roedd ychwanegu 10 mMacteoside bron yn gyfan gwbl yn atal diraddio ac actifadu IkBa mewn BMMs (Ffig. 5B). Er mwyn cadarnhau ymhellach bod actifadu NF kB yn gysylltiedig â gweithredu acteoside, cafodd lluniadau hyrwyddwr kB-luciferase eu trosi'n dros dro i gelloedd RAW264.7. Roedd gan y celloedd a ddeorwyd â 100 ng/ml RANKL 3-gweithgaredd hyrwyddwr kB plygu uwch, a wanhawyd yn sylweddol gan acteosid 10 mM (Ffig. 5D).

Mae Acteoside yn Atal Cynhyrchu cytocinau llidiol a Mynegiant TNF-a, c-Fos a NFATc1in Macrophages wedi'u Hysgogi gan RANKL

Mae TNF-a, IL-1b, ac IL-6 yn bwysig mewn ffurfiant a swyddogaeth osteoclast, sy'n cael ei gyfryngu gan macroffagau wedi'u hysgogi gan signalau NF-kB mewnRANKL. Ysgogodd RANKL gynhyrchu'r cytocinau hyn, a gostyngwyd y cynhyrchiad hwn yn sylweddol gan pretreatment acteosid 10 mM mewn BMMs (Ffig. 6 A). Yn yr un modd, gwanhaodd acteoside y cynhyrchiad cytocinau a achosir gan RANKL, ac eithrio IL-6, mewn macroffagau RAW264.7 (Ffig. S3). Er mwyn deall mecanweithiau moleciwlaidd gweithredu acteoside mewn osteoclastogenesis, fe wnaethom archwilio ymhellach effaith acteoside ar fynegiant TNF-a, c-Fos, a NFATc1. Uwch-reoleiddio RANKL fynegiant mRNA o'r ffactorau hyn mewn celloedd BMMs a RAW264.7 (Ffig. 6B a C). Roedd cyn-driniaeth ag acteosid 10 mM yn atal mynegiant y ffactorau hyn a achosir gan RANKL yn sylweddol yn y ddau.

BMMs a chelloedd RAW264.7. Roedd pretreatment aceoside hefyd yn lleihau'n gryf y lefelau protein o c-Fos a NFATc1 mewn BMMs wedi'u hysgogi gan RANKL (Ffig. 6D). Mae’r canlyniadau hyn yn awgrymu hynnyacteosidyn is-reoleiddio RANKL gan gymell cyfryngwyr ffurfio osteoclast ar y lefelau genyn a phrotein.

Mae Acteoside yn Lleihau Cynhyrchu ROS Mewngellol mewnBMMs mewn Modd Dibynnol ar Ddôs

Gan ei bod yn hysbys bod cydberthynas rhwng cynhyrchu ROS mewngellol ag osteoclastogenesis wedi'i ysgogi gan RANKL, gwnaethom ymchwilio i weld a yw acteosid yn atal cynhyrchu ROS yn ystod gwahaniaethu osteoclast wedi'i gyfryngu gan RANKL gan ddefnyddio llifyn athraidd, sy'n sensitif i ocsidiad, DCFH-DA. Dangosodd dadansoddiad cytometreg llif fod y signal fflworoleuedd cymedrig toDCF penodol yn BMMs yn ôl pob golwg wedi'i newid i'r dde ar ôl ysgogiad gydaRANKL, o'i gymharu â'r celloedd rheoli heb eu trin (Ffig. 7 A). Roedd y newid hwn yn debyg i'r achos y gwelwyd macrophages RAW264.7 ar ôl ysgogiad RANKL (data heb ei ddangos). Roedd trin BMMs ag acteoside yn lleihau dwyster signal y DCF mewn modd sy'n dibynnu ar ddos. Pretreatment gyda acteosid 10 mM bron yn gyfan gwbl gostwng y lefelau o ROS mewngellol a gynhyrchir yn ystod gwahaniaethu osteoclast i'r lefelau rheoli heb ei drin (Ffig. 7 B).

Gweinyddu Acteoside Llafar yn Atal Newid Marcwyr Biocemegol Osteoporotic a Cholled Esgyrn mewn Llygod Ovariectomized

Er mwyn archwilio effaith acteosid ar golled esgyrn, fe wnaethom baratoi model anifail osteoporotig trwy ofariectomi. Nid oedd gwahaniaeth arwyddocaol ym mhwysau'r corff rhwng OVX a Shammice yn ystod y cyfnod arbrofol (data heb ei ddangos). Roedd gan y grŵp lefelau serwm sylweddol uwch o IL-1b ac IL-6 na'r grŵp Sham (Ffig. 8). Cafodd y cynnydd a achosir gan ofariectomi yn y cytocinau llidiol hyn eu gwanhau gan weinyddu acteosid trwy'r geg (grŵp AC). Cynyddwyd lefelau serwm marcwyr trosiant esgyrn fel ALP, calsiwm, TRAP5b, ac OC yn sylweddol yn y grŵp OVX. O'r marcwyr osteoporotig hyn, mae'n debyg bod y lefelau uwch o galsiwm, TRAP5b, ac OC mewn llygod OVX wedi'u rhwystro gan driniaeth acteosid, ond ni newidiwyd lefel serwm ALP gan y driniaeth. Roedd y llwyth torri asgwrn uchaf cyfartalog i ganol y siafft femoral dde yn sylweddol is yn y grŵp OVX nag yn y grŵp Sham (Ffig. 9A). Cododd triniaeth aceoside y toriad mwyaf posibl wrth gefn i un y grŵp Sham. Pan gafodd asgwrn cortigol y ffemwr ei rannu a'i arsylwi gan ficrosgopeg optig, roedd y nodweddion osteoporotig a ddangosir yn y grŵp OVX bron yn gyfan gwbl wedi diflannu mewn llygod AC (Ffig. 9B). Er mwyn gwirio effaith acteoside ar y model osteoporosis a achosir gan OVX, dadansoddwyd paramedrau morffolegol BMD ac esgyrn yn nhrafectws y ffemwr procsimol ysgafn gan ficro-CT. Fel y dangosir yn Ffig. 9C, canfuwyd newid i'r bensaernïaeth trabeciwlar femoral mewn llygod OVX, tra bod triniaeth ag acteosid wedi lleihau'r newid hwn. Datgelodd canlyniadau'r dadansoddiad micro-CT fod BMD, mesur o gryfder esgyrn, wedi'i leihau'n ddramatig yn OVXmice (Ffig. 9D). O'i gymharu â'r grŵp Sham, dangosodd llygod OVX hefyd newidiadau sylweddol mewn BV / Teledu, Tb. Sp, a Tb. N, ond nid Tb.Th. Roedd triniaeth acteosid y geg o lygod OVX yn atal y newid yn BMD yn sylweddol yn ogystal â BV/TV a Tb.N.