Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls cliciwch yma i Rhan 2

I-Fang Wang, 1,2 Yihan Wang, 2 Yi-Hua Yang, 1,3,4 Guo-Jen Huang, 5,6 Kuen-Jer Tsai, 3,4,* a Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Sefydliad Graddedig Meddygaeth Adfywio Niwral, Coleg Gwyddoniaeth Feddygol a Thechnoleg, Prifysgol Feddygol Taipei, Taipei 11031, Taiwan

2Sefydliad Bioleg Foleciwlaidd, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3 Sefydliad Meddygaeth Glinigol, Coleg Meddygaeth, Prifysgol Genedlaethol Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwan

Canolfan Ymchwil Meddygaeth Glinigol 4, Ysbyty Prifysgol Cenedlaethol Cheng Kung, Coleg Meddygaeth, Prifysgol Genedlaethol Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwan

5 Adran a Sefydliad Graddedig y Gwyddorau Biofeddygol, Coleg Meddygaeth, Prifysgol Chang Gung, Taoyuan 33302, Taiwan

6Canolfan Ymchwil Niwrowyddoniaeth, Ysbyty Coffa Chang Gung, Linkou 33302, Taiwan

7 Cyswllt arweiniol

*Gohebiaeth: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Gall cistanche wella cof

CRYNODEB

Mae amrywiad ffenotypig yn rhagofyniad sylfaenol ar gyfer esblygiad celloedd ac organebau trwy ddetholiad naturiol. Er bod rôl mynegiant genynnau stochastig mewn amrywiaeth ffenoteipaidd o gelloedd sy'n union yr un fath yn enetig wedi'i hastudio'n dda, nid oes llawer yn hysbys am y berthynas rhwng mynegiant genynnau stochastig ac amrywiadau ymddygiad unigol mewn anifeiliaid. Rydym yn dangos bod miRNA (miR{0}}f-3p) penodol yn cael ei uwchreoleiddio yn hippocampus cyfran o lygod wedi'u mewnfridio unigol ar dasg drysfa ddŵr Morris. Yn arwyddocaol, mae miR{2}}f-3p yn rheoleiddio morffoleg niwronau, swyddogaeth a dysgu gofodol yn gadarnhaol, acofgallu llygod. Yn fecanyddol, mae miR{0}}f-3p yn atal cyfieithiad o MEF2A, rheolydd dysgu negyddol/cof. Yn olaf, rydym yn dangos bod uwch-reoleiddio hippocampal miR{0}}f-3p canlyniadau o ffosfforyleiddiad ar hap o AMP cylchol hippocampal (cAMP)-rhwymo elfen ymateb (CREB) mewn unigolion. Mae'r canfyddiad hwn o fodiwleiddio dysgu gofodol acoftrwy echel signalau hippocampal ar hap ar ysgogiad niwronaidd yn dangos sut mae amrywiad mewn mynegiant genynnau meinwe yn arwain at ymddygiad amrywiol anifeiliaid.

RHAGARWEINIAD

Mae amrywiad ffenoteipaidd ymhlith unigolion yn rhoi mantais esblygiadol gan ei fod yn darparu'r amrywiaeth poblogaeth y mae detholiad naturiol yn gweithredu arno (Pavlicev et al., 2011). Mae cefndiroedd genetig a ffactorau amgylcheddol yn cyfrannu at greu amrywiad naturiol o'r fath (Bendesky a Bargmann, 2011). Yn arbrofol, mae llygod mewnfrid wedi cael eu defnyddio’n aml i astudio sail moleciwlaidd a chellog ffenoteipiau ac ymddygiadau cyfartalog er mwyn lleihau effeithiau gwahaniaethau genetig ymhlith yr unigolion a brofwyd (Casellas, 2011). Fodd bynnag, dangoswyd amrywiad yn helaethrwydd trawsgrifiadau meinwe rhwng llygod isogenig unigol. Mae genynnau sy'n arddangos lefelau mynegiant hynod amrywiol yn aml yn gysylltiedig â swyddogaeth imiwnedd, ymatebion straen, a rheoleiddio hormonaidd, hy, prosesau sy'n sensitif i giwiau amgylcheddol (Vedell et al., 2011). Mae rhai o'r astudiaethau hyn hefyd wedi dangos bod gwahaniaethau mewn mynegiant genynnau neu signalau cellog, gyda neu heb ddylanwad ffactorau amgylcheddol megis llyfu mamau, y ddarpariaeth maetholion yn y groth, neu wytnwch a achosir gan straen yn erbyn tueddiad (Bale, 2015; Danchin et al ., 2011;Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), arwain at wahaniaethau mewn ffenoteipiau ac ymddygiad (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

dysgu gofodol acofgellir rhannu ffurfiant a reolir gan yr ymennydd yn ddwy system: (1) llywio egocentrig sy'n defnyddio hunan-symudiad a chiwiau mewnol a (2) llywio allocentrig sy'n ymwneud yn bennaf â'r hipocampws a strwythurau ymennydd cyfagos sy'n cael ei ysgogi gan giwiau distal y tu allan i'r organebau (Ekstrom et al., 2014). Gallu dysgu gofodol acofcaniatáu i’r rhan fwyaf o rywogaethau anifeiliaid addasu eu hymddygiad yn raddol i addasu mewn amgylcheddau sy’n amrywio yn ofodol ac yn amser, sy’n hanfodol ar gyfer eu goroesiad. Gellir asesu hyn mewn anifeiliaid labordy trwy gymhwyso patrymau ymddygiadol fel drysfa ddŵr Morris (MWM) (Vorhees a Williams, 2014). Yn nodedig, dangoswyd bod cnofilod mewnfrid sy'n union yr un fath yn enetig yn arddangos amrywiad ffenoteipaidd mewn dysgu gofodol acof(Tsai et al., 2002), ond roedd mecanweithiau sylfaenol yr amrywiad ymddygiadol hwn yn parhau i fod yn anhysbys.

Mae ffurfio atgofion newydd yn broses gymhleth sy'n gofyn am drawsgrifiad genynnol sy'n ddibynnol ar weithgaredd, synthesis protein newydd, a

Ffigur 1. Cydberthynas rhwng yr amrywiad o ddysgu gofodol acofgallu a miR{0}}f-3p sefydlu

(A) Tasg MWM o lygod gwyllt wedi'u mewnfridio C57BL/6J. Panel chwith: perfformiadau MWM o lygod GLN (smotiau) a llygod PLN (sgwariau). O'r cyfanswm o 289 o lygod a brofwyd, roedd 180 yn gategori GLNand109asPLN.Rightpanel:probetestoftheMWMtassk(n{6}}and30ineachgroup).Caiff y cymedraurhannu o'r pedwar pedwarant a'r rhanbarth llwyfan eu cymharu yn yr histogram. P, man y llwyfan coll; T, parth targed heb P; R, parth dde; O, parth gyferbyn; L, parth chwith. (B) RT-qPCR dadansoddiad o fynegiant miRNA. Dadansoddwyd a normaleiddiwyd lefelau mynegiant cymharol o chwe miRNA sydd wedi'u lleoli o fewn y clwstwr miR-466-669 a miR-132-3p, fel rheolaeth gadarnhaol wedi'i gyfoethogi gan yr ymennydd, gyda rheolaeth fewnol U6 snRNA o hippocampus llygoden GLN a PLN (n=9–18 fesul grŵp). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3t.

wedi'i diwnio'n fanwl rwydweithio niwronaidd penodol felcofengrams i wneud cysylltiadau niwronau newydd a phlastigrwydd parhaus (Asok et al., 2019). Mae engramau hippocampal, sef poblogaethau prin o niwronau yn y gyrus dantate (DG), yn cynrychioli ensembles o niwronau sy'n dangos mwy o weithgarwch ar ôlcofffurfiad. Er bod y niwronau DG engram yn arddangos patrwm hynod wahanol o fynegiant genynnau (Rao-Ruiz et al., 2019), mae'r mecanweithiau moleciwlaidd engram-benodol sy'n sail i'r rhain.cofmae cydgrynhoi yn parhau i fod yn anhysbys i raddau helaeth. Mae'n hysbys bod ffactorau a llwybrau signalau amrywiol naill ai'n rheoleiddio dysgu a dysgu mewn ffordd gadarnhaol neu negyddolcofmae prosesau wedi'u nodi (Abraham et al., 2019; Humeau a Choquet, 2019). Yn eu plith, mae'r ffurf actifedig o AMP cylchol (cAMP) - protein elfen-rhwymo elfen ymateb (CREB) yn ysgogi trawsgrifio genynnau mewn ymateb i gynyddiadau o Ca2 a mwy mewngellol sy'n dibynnu ar weithgaredd mewn niwronau (Kandel, 2012). Ar y llaw arall, mae gweithgaredd trawsgrifio ffactor 2 y gwersyll/PKApathwayrepressesmyocyteenhancer factor 2 (MEF2) trwy atal allforio niwclear ei gyd-repressor, HDAC5, a mewnforio niwclear cyd-ysgogydd NFAT (Belfield et al., 2006). At hynny, yn wahanol i CREB, mae gweithgaredd MEF2A yn cyfyngucofffurfio (Cole et al., 2012). Ar wahân i'r ffactorau protein, mae microRNAs (miRNAs) hefyd yn ymwneud â rheoleiddio swyddogaethau niwronaidd, gan gynnwys dysgu a chof (McNeill a Van Vactor, 2012). Mae miRNAs yn fach (22 nt)rana nad ydynt yn codio sydd yn bennaf yn gweithredu fel rheolyddion ôl-trawsgrifio mynegiant genynnau trwy baru sylfaen dilyniant-benodol gyda'u safleoedd adnabod yn y 30 rhanbarth heb eu cyfieithu (30 UTRs) o mRNAs penodol (Daugaard a Hansen, 2017). Mae miRNAs yn cymryd rhan mewn ystod o lwybrau signalau mewn niwronau ôl-mitotig, ac maent yn cyfryngu prosesau cellog sy'n dibynnu ar weithgaredd, gan gynnwys twf dendritig a changhennog, ffurfio synaps, ac aeddfedu. Trwy reoleiddio mynegiant genynnau, maent hefyd yn chwarae rhan bwysig mewn ffurfiau hirhoedlog o blastigrwydd synaptig sy'n sail iddyntcofffurfio, adalw, a chyfuno (Chen a Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

Yn y canlynol, rydym yn cyflwyno tystiolaeth ar gyfer cysylltiad achosol rhwng mynegiant genynnau meinwe stochastig ac amrywiad ymddygiad unigol mewn anifeiliaid. Yn benodol, rydym yn dangos bod gweithrediad stochastig echel hippocampal CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A echel yn modiwleiddio amrywiad unigol y dysgu gofodol acofgallu mewn llygod inbred.

CANLYNIADAU

Amrywiad unigol o ddysgu gofodol acofmae gallu yn cael ei gydberthynas ag anwythiad miR-466f-3p o glwstwr miRNA penodol

Nodi miRNAs sy'n ymwneud â rheoleiddio dysgu acofWrth ffurfio, defnyddiwyd tasg MWM i wahaniaethu rhwng llygod math gwyllt C57BL/6J mewnfrid â gallu dysgu a chof da neu wael (Ffigur 1A). Diffiniwyd llygod a gwblhaodd y dasg o fewn 30 s yn y (6ed) sesiwn diwethaf fel ''dysgwyr da'' (GLN), tra bod llygod na allai ddod o hyd i'r llwyfan o fewn 30 s yn y sesiwn diwethaf yn cael eu hystyried yn ''dysgwyr gwael' ' (PLN). Fel y dangosir yn Ffigur 1A (panel chwith), roedd 62 y cant o'r llygod yn perthyn i'r grŵp GLN (180 o 289 o lygod), gan ddangos gostyngiad amlwg mewn cuddni dianc o 98.1 s (sesiwn 1af) i 21.8 s (6ed sesiwn). Mewn cyferbyniad, dim ond yn gymedrol y gostyngwyd hwyrni dianc y 38 y cant o'r llygod sy'n weddill, y grŵp PLN (109 o 289 o lygod), rhwng y sesiwn gyntaf a'r chweched sesiwn (o 111.8 s yn y sesiwn 1af i 82.1 s yn y 6ed sesiwn) . Dangosodd y prawf archwilio, sy'n nodi bod y llygod yn wir wedi dysgu'r dasg dros y chwe sesiwn, hefyd fod llygod GLN wedi aros yn hirach yn rhanbarth y platfform na llygod PLN (Ffigur 1A, pâr chwith o fariau yn y panel dde).

Nesaf, dadansoddwyd RNAs o hippocampus llygod GLN a PLN gan hybridization microarray miRNA (n=4 pob grŵp). Yn gyffredinol, gwelsom wahaniaethau cymharol fach ym mhroffiliau mynegiant miRNAs hippocampal o lygod GLN a PLN. Fodd bynnag, fe wnaethom nodi bod y 10 miRNAs uchaf yr oedd lefelau mynegiant yn uwch ar eu cyfer mewn llygod GLN na llygod PLN (data heb ei ddangos) i gyd yn deillio o'r un clwstwr miRNA sy'n benodol i gnofilod, miR-466-669, a leolir yn intron 10 o y genyn mSfmbt2 (gweler isod). Yn seiliedig ar ddadansoddiad adwaith cadwyn polymeras polymeras meintiol gwrthdro (RT-qPCR) o lefelau mynegiant miRNAs dethol yn y clwstwr, dewiswyd miR{8}}f-3p ar gyfer ymchwiliad pellach (Ffigur 1B). Mynegiad cyfartalog y miRNA hwn oedd 1.5-plyg yn uwch yn hippocampus llygod GLN o gymharu â llygod PLN. Yn nodedig, roedd lefelau cyfartalog miR{13}}f-3p hippocampal yn debyg ymhlith y grŵp PLN, grŵp rheoli cawell cartref (HC) a grŵp rheoli nofio (Ffigur 1C), gan eithrio effeithiau cysylltiedig ag ymarfer corff yn ystod nofio a chefnogi ymhellach y syniad bod miR-466f-3p wedi'i ysgogi yn ystod dysgu gofodol acofffurfiad.

Yn Ffigur 1C, mae’r data’n datgelu bod lefelau mynegiant miR hippocampal-466f-3p o dros 42 y cant o lygod GLN o leiaf 1.5-plyg yn uwch na lefel mynegiant cyfartalog Llygod rheoli HC, tra bod y lefelau mewn 15 y cant o lygod PLN yn hanner lefelau llygod HC. Roedd gan tua 25 y cant o lygod GLN a 55 y cant o lygod PLN lefelau tebyg o miR-466f{{10}}p (0.8- i 1.2- plyg mewn perthynas â HC). Mae plot gwasgariad cydberthynas Pearson yn dangos cydberthynas bositif rhwng lefelau miR-466f{-3p a chanran hyd ar y platfform yn ystod y prawf archwilio yn Ffigur 1D. Fe wnaethom hefyd berfformio miR-466f-3p-3p ac U6 RNA niwclear bach (snRNA) hybrideiddio in situ (ISH) o dafelli ymennydd llygod GLN a PLN (Ffigur 1E). Cadarnhaodd dadansoddiad ystadegol o'r signalau miR- 466f{-3p trwy ISH fod anwythiad miR-466f- 3p yn wir yn fwy yn y DG o lygod GLN o gymharu â

Llygod PLN, ond ni ddarganfuwyd unrhyw wahaniaeth pan gymharwyd y signalau snRNA U6 (histogram ar y dde, Ffigur 1E). Er nad oedd signalau miR{2}}p yn gyfartal ymhlith y celloedd gronynnog unigol yn DG, roeddent yn dal i gynyddu'n sylweddol ac yn hollbresennol yn hipocampws llygod GLN o gymharu â llygod PLN. Felly, nid dim ond mewn cyfran fach o gelloedd y digwyddodd yr anwythiad miR{4}}f-3p, ee yr engram niwronau. Mae'r data hyn yn dangos bod cysylltiad agos rhwng uwch-reoleiddio miR-466f{-3p yn ystod tasg MWM a gwell dysgu gofodol acofgallu ymhlith cyfran sylweddol o lygod GLN.

Fe wnaethom hefyd ddadansoddi lefelau mynegiant cyfartalog sawl miRNAs ymennydd-benodol yn ôl RT-qPCR. Yn eu plith, cafodd miR{2}}p ei uwchreoleiddio yn hippocampus llygoden ar ôl tasg MWM, ond ni welsom wahaniaethau sylweddol rhwng y grwpiau GLN a PLN (pâr bar VII, Ffigur 1B). Roedd lefelau mynegiant miR-335-5p a miR-22 yn debyg ymhlith y grwpiau GLN, PLN, a HC (Ffigur S1A). Felly, yn wahanol i miR{7}}f-3p, nid yw mynegiant hippocampal o'r miRNAs hyn yn ystod hyfforddiant MWM yn cydberthyn â'r dysgu gofodol acofgallu'r llygod.

miR{0}}f-3p upregulation yn hyrwyddo alldyfiant niwrit a ffurfio asgwrn cefn dendritig

I gadarnhau bod miR{0}}f-3p yn wir wedi'i fynegi mewn niwronau, gwnaethom berfformio miRNA ISH wedi'i gyfuno â staenio imiwnfflworoleuedd (IF) o NeuN a MAP2 mewn niwronau hippocampal cynradd. Dangosodd y canlyniadau, yn debyg i miRNAs eraill (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR{5}}f-3p yn bennaf yn y rhanbarth soma niwronaidd, gyda rhai signalau ychwanegol yn y dendrites (Ffigur S2A). Deall sail foleciwlaidd a chellog y cysylltiad rhwng miR{8}}f-3p{9}}p wedi'i uwchreoleiddio â dysgu acofffurfiant, rydym yn gyntaf dros dro gorfynegi miR-466f-3p ynghyd â polypeptid ymasiad dsRed dan reolaeth hyrwyddwr ubiquitin o'r pFUGW- miR-466f-3p- dsRed plasmid i niwronau hippocampal cynradd DIV10 (Ffigur S2B). Trwy miRNA ISH, fe wnaethom gadarnhau bod y signal miR-466f-3p yn gryfach yn y grŵp gorfynegiant miR-466f-3p o gymharu â rheolaeth fector neu miR mutant{{ 12}}f-3grŵp p (saethau, Ffigur S2B). Ochr yn ochr, rydym hefyd wedi sefydlu llwyfan i archwilio effaith colli swyddogaeth miR-466f{-3p drwy ataliad miR-466f-3p gan ddefnyddio miR-sponge a leolir yn y 30 UTR o EGFP mRNA a fynegir o pFUGW-miR-sbwng- EGFP plasmid (Ffigur S2C). Roedd y gohebydd EGFP yn y plasmid sbwng yn ddangosydd o effeithlonrwydd trawsnewid ac yn synhwyrydd o weithgaredd miRNA cellog (Kluiver et al., 2012). Mewn cyfran sylweddol o'r celloedd HEK293T a drosglwyddwyd, gostyngodd y signal EGFP ar gyd-fynegiant â miR-466math gwyllt-466f-3p, ond nid gyda miR mutant-466f{{32} }}p, oherwydd ataliad ar gyfieithiad mRNA EGFP trwy rwymo miR-466f-3p i miR- sbwng yn y 30 UTR (cymharer y pedair delwedd chwith a dwy ei raglen, Ffigur S2C) . Mewn cyferbyniad, ni welsom signal EGFP gostyngol wrth gydfynegiant y sbwng rheoli amgodio wyth copi o ddilyniant wedi'i sgramblo o pFUGW-SCR- sbwng-EGFP plasmid gyda naill ai miR{{-466f-3p neu ei mutant (cymharwch y pedwar delwedd cywir a dau histogram).

Fel y dangosir yn Ffigur 2A, arweiniodd mynegiant ectopig o miR-466f-3p at newidiadau morffolegol yn y niwronau, yn fwyaf nodedig alldyfiant niwrit gwell o'i gymharu â niwronau rheoli a drosglwyddwyd gyda'r fector dsRed-expressing pFUGW- dsRed neu mutant miR-466f-3p-mynegi plasmid pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Dangosodd data meintioli nad oedd nifer cyfartalog y gangen dendritig fesul niwron yn arwyddocaol wahanol rhwng y grŵp gorfynegi miR-466f-3p-gor-fynegi (bar II) a rheolaeth fector neu mutant (barrau I a III) (ar y dde histogram uchaf, Ffigur 2A). Fodd bynnag, cynyddodd cyfanswm hyd cymedrig dendrit a hyd cymedrig dendritau cynradd ar orfynegiant miR{-466f{-3p (cymharer bar II â barrau I a III, histogram dde is yn Ffigur 2A). Yn gyfochrog, fe wnaethom atal miR-466f{-3p{-466} mewndarddol rhag defnyddio miR-sponge. Fel y gwelwyd, nid oedd gwahaniaeth arwyddocaol mewn rhif cangen dendritig rhwng miR-466f{-3p-atal a grwpiau rheoli (cymharer bar IV â barrau I a V, histo-gram uchaf dde, Ffigur 2A) , ond dangosodd y grŵp miR-466f-3p-ataliad ostyngiad nodedig yng nghyfanswm hyd y dendrit cymedrig yn ogystal â hydoedd cymedrig dendritau cynradd ac eilaidd o gymharu â grwpiau eraill (cymharer bar IV â barrau I a V, histogram isaf dde Ffigur 2A). Ymhellach, dangosodd staen IF fod gorfynegiant miR- 466f{{-3p{{-3p{{-3p), ond nid ataliad, hefyd yn cynyddu dwysedd pigau dendritig (Ffigur 2B, paneli uchaf a histogram chwith isaf). Fe wnaethom hefyd berfformio cyd-staenio ar gyfer protein dwysedd postsynaptic 95 (PSD-95) a chyfrif dwysedd pigau dendritig colocalized i sefydlu union nifer y synapsau cynhyrfus (Ffigur 2B, histogram de isaf), a ddatgelodd fod miR{{40} }}f-3p cynyddodd gorfynegiant ddwysedd meingefnau cadarnhaol PSD o gymharu â grwpiau rheoli eraill. Fodd bynnag, ni wnaeth ataliad miR{44}}f{-3p newid yn sylweddol ddwysedd meingefnau positif PSD mewn perthynas â grwpiau rheoli (Ffigur 2B, histogram de is). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos, yn absenoldeb symbyliad niwronaidd, nad yw ataliad miR-466f{{{-3p{{{-3}p) yn unig yn effeithio ar ddwysedd synapsau cynhyrfus neu gyfanswm asgwrn cefn dendritig.