Rhan 1 Gwahaniaethu Cemegol A Genetig ar Systenni Llysieulyfr yn Seiliedig ar UPLC-QTOF/MS A Cod Bar DNA
Mar 03, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
Haniaethol
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), a elwir yn ''Ginseng yr anialwch'', yn cael effaith iachaol drawiadol ar gryfder a maeth, yn enwedig mewn atgyfnerthu arennau i gryfhau yang. Fodd bynnag, mae gwreiddiau dau blanhigyn Cistanches Herba, Cistanche deserticola a Cistanche tubulosa, yn amrywio o ran gweithredu ffarmacolegol a chydrannau cemegol. Er mwyn gwahaniaethu ar darddiad planhigion Cistanches Herba, defnyddiwyd system ddull gyfun o dechnoleg gemegol a genetig -UPLC-QTOF/MS a chodio bar DNA - yn gyntaf yn yr astudiaeth hon. Dangosodd y canlyniadau y cafwyd tri chyfansoddyn marcio posibl (isomer o campneoside II, cistanoside C, a cistanoside A) i wahaniaethu rhwng y ddau darddiad gan ddadansoddiadau PCA ac OPLS-DA. Galluogodd codau bar DNA i wahaniaethu rhwng dau darddiad yn gywir. Dangosodd NJ tree fod dau darddiad wedi'u clystyru'n ddau glwst. Mae ein canfyddiadau'n dangos bod gan ddau darddiad Cistanches Herba wahanol gyfansoddiadau cemegol ac amrywiadau genetig. Dyma'r gwerthusiad cyntaf yr adroddwyd amdano o ddau darddiad Cistanches Herba, a bydd y canfyddiad yn hwyluso rheoli ansawdd a'i gymhwysiad clinigol.
Rhagymadrodd
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), a elwir yn ''Ginseng yr anialwch'', yn tarddu o goesau suddlon sych oCistanche deserticolaYC Ma aCistanche tubulosa(Schrenk) Wig yn ôl y Pharmacopoeia Tseiniaidd (argraffiad 2010), ac mae'n boblogaidd am ei tonifying yr aren-yin, bod o fudd bywyd hanfod ac ymlacio coluddyn. Ar hyn o bryd,Cistanches Herbayn cael ei ddosbarthu'n bennaf mewn anialwch cras a chynnes yng ngogledd-orllewin Tsieina, yn enwedig yn nhaleithiau Xinjiang a Mongolia Fewnol. Fodd bynnag, mae'r ddau darddiad oCistanches Herbayn wahanol o ran eu gweithgaredd ffarmacolegol a'u cydrannau cemegol. Mae Tu et al. ymchwilio i addurniad tair rhywogaeth Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) a chanfod hynnyC. tubulosadangosodd yr effaith isaf yn y model llygoden diffyg Yang [1]. Roedd Zhang et al. cymharu gweithgaredd ffarmacolegol rhwngC. deserticola, C. tubulosa,aC. salsa,a chanfuwyd bod gan y rhywogaethau hyn swyddogaethau meddyginiaethol megis goddefgarwch gwrth-blinder a hypocsia, ond nid i'r un graddau [2]. Adroddodd ymchwil flaenorol y gydran gemegol a dangosodd y gwahaniaeth yn y gydran gemegol a'r cynnwys ar gyfer tarddiad planhigionCistanches Herba[3]. O ran y cymhwysiad clinigol a chylchrediad y farchnad, fel tonic,C. tubulosawedi'i ddefnyddio'n draddodiadol fel asiant sy'n hybu cylchrediad y gwaed ac wrth drin analluedd, anffrwythlondeb, lumbago, gwendid y corff yn Japan [4-8]. O ganlyniad, mae'n arwyddocaol iawn gwahaniaethu rhwng dau darddiadCistanches Herbaar gyfer rheoli ansawdd a chymhwysiad clinigol. Fodd bynnag, nid oes unrhyw ffocws ymchwil ar wahaniaethu o ddau darddiadCistanches Herba. Mae llawer o ddulliau yr ymchwiliwyd iddynt, gan gynnwys microsgopeg, uwchfioled, a chanfod isgoch, dull ailadrodd dilyniant rhyng-syml wedi'u defnyddio i nodi'r genws oCistanches, ond nid yn unig am ddau darddiad yn arbennig [9–20]. Yma, gwnaethom ddefnyddio technegau cemegol a moleciwlaidd ar y cyd i wahaniaethu rhwng dau darddiad Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS (cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad ynghyd â sbectrometreg màs amser hedfan pedwarplyg) a chodio-bar DNA. Mae UPLC-QTOF/MS yn darparu gwybodaeth yn gyflymach ac yn fwy effeithlon o gymharu â thechnegau eraill. Mae detholusrwydd a sensitifrwydd uchel UPLC-QTOF/MS wedi arwain at ei gymhwyso ar gyfer dadansoddiadau meintiol ac ansoddol, yn ogystal â dadansoddi metabolion ac adnabod cyfansoddion cymhleth mewn Meddygaeth Tsieineaidd Draddodiadol [21-22]. Mae dadansoddiad prif gydrannau (PCA) ac amcanestyniad orthogonol i ddadansoddiad gwahaniaethol strwythur cudd (OPLSDA) hefyd yn cael eu datblygu i nodi cyfansoddion marcio posibl. Mae codau bar DNA, sef technoleg marcio moleciwlaidd haws a mwy cyffredinol, yn defnyddio darn DNA i adnabod rhywogaethau neu genera. Mae'n wrthrychol, yn fwy cywir, ac yn haws ei berfformio na dulliau adnabod traddodiadol a thechnolegau marcio moleciwlaidd eraill. At hynny, mae codau bar DNA wedi'u cymhwyso'n llwyddiannus i adnabod anifeiliaid a phlanhigion, gan gynnwys planhigion meddyginiaethol [23-26]. Pwrpas yr ymchwil hwn yw sefydlu system dull gwyddonol, cyfun UPLC-QTOF/MS a chodio bar DNA, ar gyfer gwahaniaethu rhwng dau darddiad planhigion oCistanches Herba.
Cistanches gwreiddiau cyfan
Defnyddiau a Dulliau
Datganiad moeseg Rydym yn cadarnhau nad oedd yr astudiaethau maes yn cynnwys rhywogaethau dan fygythiad neu warchodedig. Mae cyfesurynnau GPS wedi'u cynnwys yn y wybodaeth sampl, gweler tabl 1."
Deunyddiau planhigion ac adweithyddion
Casglwyd coesynnau suddlon o Cistanches Herba o'r rhanbarthau anialwch gwyllt ym Mongolia Fewnol, Taleithiau Qinghai, Rhanbarth Ymreolaethol Xinjiang Uygur, Gweriniaeth Pobl Tsieina (Tabl 1) ym mis Mai 2012. Casglwyd samplau'r ymchwil i gyd mewn rhanbarthau anialwch gwyllt, nid mewn tir preifat, lle nad oedd angen caniatâd penodol. Cadarnhawyd hunaniaeth botanegol y coesau gan Dr. Linfang Huang. Rhoddwyd sbesimenau talebau i'r Sefydliad Datblygu Planhigion Meddyginiaethol. Defnyddiwyd cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC) - gradd acetonitrile (Merck KGaA, Darmstadt, yr Almaen) ac asid fformig (Tedia, UDA) ar gyfer dadansoddiad UPLC. Roedd dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio'n cael ei buro gan ddefnyddio system Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, UDA). Roedd pob cemegyn arall o radd ddadansoddol.
Paratoi sampl
Trosglwyddwyd samplau Cistanches Herba (1.0 g, 65-rhwyll) i fflasg gonigol 50-mL, ac ychwanegwyd 50 mL o 70 y cant o fethanol. Ar ôl socian am 30 munud, perfformiwyd ultrasonication (35 kHz) ar dymheredd ystafell am 30 munud. Ar ôl centrifugio ar 10,000 rev/munud am 10 munud, cafodd y supernatant ei storio ar 4uC a'i hidlo trwy bilen 0.22-mm cyn ei chwistrellu i'r system UPLC-QTOF/MS i'w ddadansoddi.
UPLC-QTOF/MS
Ar gyfer dadansoddiad UPLC, defnyddiwyd y systemau/paramedrau canlynol: System Waters Acquity (Waters) wedi'i chyfarparu â phwmp dosbarthu toddyddion deuaidd, auto-samplydd a synhwyrydd PDA wedi'i gysylltu â gorsaf ddata Waters Empower 2; ultrasonication (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co, Zhejiang, Tsieina); a model cydbwysedd dadansoddol electronig AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zurich, y Swistir). Defnyddiwyd colofn Dyfroedd UPLC BEH C18 (1.7 mm, 2.16100 mm, Dyfroedd) a cholofn warchod Dyfroedd C18 (yr un deunydd, dyfroedd) a'u cynnal ar 30uC. Y cyfnod symudol oedd 0.1 y cant hydoddiant dyfrllyd asid ffurfig (A) ac acetonitrile (B) gyda rhaglen graddiant fel a ganlyn: 0-3 mun, 10-22 y cant B; 3–4 mun, 22–23 y cant B; 4–6 mun, 23–35 y cant B; 6–8 mun, 35–37 y cant B; 8–11 mun, 37–42 y cant B; 11– 12 mun, 42–48 y cant B; 12–15 mun, 48 y cant –50 y cant B ar gyfradd llif o 0.3 mL/munud. Cyfaint y pigiad oedd 5 ml.
Perfformiwyd y dadansoddiad UPLC/MS ar system QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manceinion, DU) gyda ffynhonnell ïoneiddiad electrochwistrellu (ESI) a weithredir yn y modd ïon negatif. Defnyddiwyd N2 fel y nwy dadhydradu. Gosodwyd tymheredd y daddymiad ar 45{{1{{0}}uC ar gyfradd llif o 800 L/h, a gosodwyd tymheredd y ffynhonnell ar 120uC. Gosodwyd y folteddau capilari a chôn i 2500 a 40 V, yn y drefn honno. Casglwyd data rhwng 50-1200 Da gydag amser sganio o 0.1- ac oedi rhyng-sganio o 0.01- dros gyfnod dadansoddi o 15-munud. Defnyddiwyd Argon fel y nwy gwrthdrawiad ar bwysedd o 7.06661023 Pa. Casglwyd yr holl ddata MS gan ddefnyddio'r system LockSpray i sicrhau cywirdeb màs ac atgynhyrchu. Defnyddiwyd yr ïon [MH]- o leucine-enkephalin ar m/z 554.2615 fel y màs clo yn y modd ESI negyddol.
Dadansoddi data
Dadansoddwyd data UPLC-QTOF/MS ar gyfer samplau Cistanches Herba i nodi newidynnau gwahaniaethol posibl. Cyflawnwyd y gwaith o ganfod, alinio a hidlo data crai ES gan ddefnyddio rheolwr cymwysiadau Marker Lynx, fersiwn 4.1 (Waters, Man chester, UK). Roedd y paramedrau a ddefnyddiwyd fel a ganlyn: amser cadw (tR) o 0–15 munud, màs o 50–1200 Da, goddefgarwch amser cadw o 0.02 munud, a goddefiant màs o 0.02 Da. Defnyddiwyd tri sampl ddyblyg a gasglwyd o bob lleoliad daearyddol (n=3). Defnyddiwyd cyfanswm o 6, 339 o newidynnau i greu'r model.
Cod bar DNA: echdynnu DNA, mwyhau PCR a dilyniannu
Cafodd samplau a gymerwyd o goesynnau cigog sych o C. deserticola a C. tubulosa (30 mg) eu rhwbio am 2 funud ar amlder o 30 r/s. Echdynnwyd DNA yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Tiangen). Yn benodol, addaswyd y protocol fel bod clorofform yn cael ei ddisodli gan gymysgedd o glorofform: alcohol isoamyl (24:1 yn yr un cyfaint), a hydoddiant byffer GP2 gydag isopropanol (yr un cyfaint). Rhoddwyd y powdr wedi'i rwbio i mewn i diwbiau eppendorf 1.5 ml, ychwanegwyd 700 ml 65uC GP1 wedi'i gynhesu ymlaen llaw ac 1 mL b-mercaptoethanol i'w gymysgu gan ddefnyddio fortecs am 10-20 s, a'i ddeor am 60 munud ar 65uC; Ychwanegu cymysgedd 700 ml o glorofform: alcohol isoamyl (24:1), centrifuge am 5 munud ar 12000 rpm (,134006g); Supernatant pibed i diwb newydd, ychwanegu 700 ml isopropanol, cymysgu am 15-20 munud; Peipio'r holl gymysgedd i golofn sbin CB3 a centrifuge am 40 s ar 12000 rpm; Gwaredu'r hidlif ac ychwanegu 500 ml GD (ychwanegu ethanol meintiol anhydrus cyn ei ddefnyddio), centrifuge ar 12000 rpm am 40 s; taflu'r hidlydd ac ychwanegu 700 mL PW (ychwanegu ethanol meintiol anhydrus cyn ei ddefnyddio) i olchi'r bilen, centrifuge am 40 s ar 12000 rpm; Gwaredu'r hidlydd ac ychwanegu 500 mL PW, centrifuge am 40 s ar 12000 rpm; Gwaredu'r hidlydd a'r centrifuge am 2 funud ar 12000 rpm i gael gwared â byffer golchi gweddilliol PW; Trosglwyddo'r golofn troelli CB3 i mewn i diwb eppendorf glân 1.5 ml, a'i sychu ar dymheredd yr ystafell am 3-5 munud; Centrifuge am 2 funud ar 12000 rpm i gael y cyfanswm DNA. Roedd preimio ar gyfer adwaith cadwyn polymeras (PCR) yn seiliedig ar ddilyniannau a adroddwyd yn flaenorol [4,5]. Roedd cymysgeddau adwaith PCR yn cynnwys 2-templed DNA mL, 8.5- mL ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., China), 1/{{57 }}mL preimio ymlaen/cefn (F/R) (2.5 mM), mewn cyfrol derfynol o 25 mL. Cynhaliwyd ymhelaethiad PCR fel y disgrifiwyd gan Kress et al. [4]. Y paent preimio o adwaith PCR oedd fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) a rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). Cafodd cynhyrchion PCR eu gwahanu a'u canfod gan electrofforesis gel agarose 1 y cant. Cafodd cynhyrchion PCR eu puro yn dilyn protocol y gwneuthurwr a'u dilyn yn uniongyrchol.
Prif gyfansoddyn effeithiol cistanche: Acteoside
Canlyniadau
Aseiniad brig petrus gan UPLC-QTOF/MS Dangosir cromatogramau cynrychioliadol o C. deserticola a C. tubulosa o wahanol ardaloedd cynhyrchu yn Ffigur 1. Roedd y cromatogram olion bysedd yn dangos tebygrwydd ymhlith samplau Cistanches Herba. Canfuwyd cyfanswm o 23 copa màs cymwysedig a nodwyd 16 copa trwy gyfateb yr amseroedd cadw a sbectra màs â'r rhai a adroddwyd yn flaenorol (Tabl 2) [29-35]. Cafodd copaon 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22, a 23 eu nodi'n betrus fel cistanoside F, asid mussaenoside, cistanbuloside C1/C2, campneoside II , isomer o campneoside II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-39-aL-rhamnopyranoside, cistanoside C, 29-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside B, a cistancinenside A, yn y drefn honno . Penderfynwyd bod cyfansoddion cemegol yn bennaf yn glycosidau ffenylethanoid (PhGs), tra bod un cyfansoddyn, asid mussaenoside, yn polysacarid iridoid. PhGs yw'r prif gyfansoddion gweithredol o ran trin diffyg arennau, ac effeithiau gwrthocsidiol a niwro-amddiffynnol [36]
PCA o C. deserticola a C. tubulosa
Defnyddiwyd PCA i wahaniaethu rhwng samplau o rywogaethau planhigion gwahanol. Mae PCA yn ddull dadansoddi data aml-amrywedd heb oruchwyliaeth sy'n ceisio delweddu'r tebygrwydd a / neu'r gwahaniaethau o fewn data aml-amrywedd cyfansoddiad metabolyn eilaidd [37]. Gyda'i gilydd, roedd y model PCA dwy gydran yn cyfrif am 46.04 y cant o'r amrywiad (PC1, 36.43 y cant; PC2, 9.61 y cant ). Mae Ffigur 2 yn dangos bod 24 o samplau wedi'u clystyru'n ddau grŵp yn y sgoriau PCA a gafodd eu plotio yn ôl tarddiad y rhywogaeth, sy'n dangos bod cyfansoddiad cemegol C. deserticola a C. tubulosa yn wahanol iawn.
Prif gyfansoddyn effeithiol cistanche: Echinacoside
