RHAN 1: Mae Echdynion Cistanche yn Lliniaru'r Niwrowenwyndra a Achosir gan Hydrogen Perocsid mewn Modelau Cellog Neuroblastoma Mutant Newydd a drosglwyddir gan DJ-1

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com

1. RHAGARWEINIAD

Mae'r prif glefydau niwroddirywiol yn cynnwysAlzheimerclefyd, clefyd Parkinson (PD), clefyd Huntington, ac eraill. Ymhlith yr anhwylderau hyn, mae cyfradd mynychder PD (clefyd Parkinson) yn ail yn y byd ac yn cyflawni 1 y cant -2 y cant ymhlith pobl dros 60 oed (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). Fel prif nodwedd niwrolegol PD, mae'r niwronau dopaminergig yn y substantia nigra pars compacta yn dirywiol cynyddol (Glizer & MacDonald, 2016), sy'n cyd-fynd ag ymddangosiad cynhwysiadau ‐synuclein o'r enw cyrff Lewy (Zhang, An, Zhang, a Pu , 2010). Yn pathogenesis PD, mae cryndodau gorffwys, anhyblygedd, bradykinesia, ac annormaleddau ystumiol yn cael eu diagnosio fel prif symptomau PD yn y clinig. Er nad yw union fecanweithiau dirywiol cynyddol niwronau dopaminergig yn ddealladwy, naill ai achosion amgylcheddol gan gynnwys dod i gysylltiad â phryfleiddiaid, cyfryngau niwrowenwynig, a metelau trwm, neu achosion genetig fel treigladau Parkin (Kitada et al., 1998), ‐synuclein (Polymeropoulos et al., 1997), a DJ‐1 (Biosa et al., 2017; Bonifati et al., 2003), a chredir eu bod yn arwain at achosion o PD. Hyd yn hyn, mae nifer y treigladau missense, treigladau ffrâm-shift, a dileu darnau mawr a achosir gan dreigladau genynnau DJ-1 yn fwy na 10 (Andres-Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). O fewn protein DJ-1, mae amnewid Leucine166Proline (L166P) yn sefyll allan yr un mor bwysig. Yn ogystal, dangoswyd hefyd bod straen ocsideiddiol yn digwydd mewn PD (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) a'i fod yn ymwneud â'i pathogenesis (Hague et al., 2003).

Genyn DJ-1 sy'n cynnwys wyth exon wedi'u dosbarthu dros 24 kb, yn lleoli ar gromosom 1p36 mewn bodau dynol (Bonifati et al., 2003), ac yn amgodio protein sydd wedi'i gadw'n fawr sy'n cynnwys 189 o asidau amino. Roedd y protein yn perthyn i'r teulu ThiJ/PfpI, mae'n bodoli ar ffurf homodimer. Celloedd glial o fewn y cortecs a substantia nigra a striatum yw'r prif a geir mewn ardaloedd o brotein DJ-1 (Olzmann et al., 2007). Yn y celloedd hyn, mae DJ-1 yn chwarae'r rolau canlynol, megis oncogene (Nagakubo et al., 1997), rheoliad trawsgrifio (Kim et al., 2005; Niki, Takahashi-Niki, Taira, Iguchi-Ariga, & Agria, 2003 ), straen gwrthocsidiol (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), hebryngwr (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete, & Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, & Fink, 2006), a proteas (Abou‐Sleiman, Healy, Quinn, Lees, a Wood, 2003).

Triniaeth ar gyfer clefydau niwroddirywiol: dyfyniad cistanche

Cistancheyn feddyginiaeth Tsieineaidd draddodiadol ac fe'i defnyddiwyd yn bennaf i drin afiechyd androleg ar hyd yr oesoedd. Y prif gynhwysion gweithredol oCistancheyn glycosidau ffenyl gan gynnwys 34 o gyfansoddion, megis acteoside, echinacoside, ac ati. Effeithiau ffarmacolegolDetholion Cistanchecynnwys gwella gweithrediad rhywiol, gwrth-heneiddio, cynyddu gallu dysgu a chof, niwroddiogelwch, imiwnofodyliad, gwrthfatig, gwrthisgemig, ac amddiffyn yr afu (Tu et al., 2011). Asid caffein yw un o brif fetabolion Cistanche (Yan, 2018).

Mae'r modelau cellog o PD a ddefnyddir yn gyffredin yn cynnwys celloedd PC12 a achosir gan ïon 1-methyl-4-phenyl pyridinium (Abou-Sleiman et al., 2003) a chelloedd niwroblastoma a achosir gan hydrogen perocsid (H2O2) (SH-SY5Y) (Zhang et al. ., 2009). Fodd bynnag, nid yw nodweddion patholegol nodweddiadol PD yn bresennol yn y modelau hyn. Er mwyn datblygu model cellog o PD sy'n fwy perthnasol yn ffisiolegol, yn yr astudiaeth hon fe wnaethom sefydlu celloedd SH-SY5Y a ysgogwyd gan H2O2 L166P a C106S DJ-1 a drosglwyddwyd, ac ymchwilio i effeithiauDetholion Cistanchea chyfansoddion bioactif allweddol, gan gynnwys acteoside, echinacoside, asid caffeic, aCyfanswm glycosidau Cistanchear y ddau fodel hyn, am y tro cyntaf.

Cistanche echdynnu gwrth-neurodegenerative clefydau

2. DEUNYDD S A DULLIAU

2.1|Plasmidau, cyffuriau, cemegau a chelloedd

FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 plasmidau, a gwrth-DJ-1 gwrthgyrff poly-clonaidd eu cyflenwi yn garedig gan Dr Hiroyoshi Ariga, Ysgol Graddedig Gwyddorau Fferyllol, Prifysgol Hokkaido. Prynwyd cyfrwng hanfodol lleiaf dadhydradedig (MEM) a chyfrwng F-12 gan Gibco. Roedd Lipofectin o Invitrogen. FastDigest Xho I a FastDigest EcoR Roeddwn i'n dod o Fermentas. Daeth y pecyn paratoi plasmid di-endocsin o fiotechnoleg. Daeth llinell gell SH-SY5Y o Fanc Cell Academi Gwyddorau Meddygol Tsieineaidd. Daeth pecyn adweithydd assay protein BCA gan Pierce. Roedd pilenni PVDF yn dod o Millipore. Daeth gwrthgorff polyclonaidd gwrth-FLAG o GeneTex.Detholion Cistanche, gan gynnwys acteoside, echinacoside, asid caffeic, a glycosidau cyfanswm Cistanche, eu cyflenwi gan yr Adran Meddyginiaethau Naturiol, Ysgol Gwyddorau Fferyllol, Prifysgol Peking.

2.2|Plasmidau ymhelaethu, echdynnu, a puro....

Ar ôl meithrin celloedd Escherichia coli JM109 mewn cyfrwng hylif LB tan OD600=0.5, paratowyd celloedd cymwys gan ddefnyddio'r dull calsiwm clorid. Yna trawsnewidiwyd yr E. coli cymwys â DNA plasmid gan ddefnyddio'r dull sioc gwres, ac ar ôl hynny cafodd y trawsnewidyddion eu meithrin ar blatiau LB sy'n cynnwys ampicillin am 16-24 awr ar 37 gradd. Yna dewiswyd cytref monoclonaidd a drawsnewidiwyd yn llwyddiannus a'i feithrin mewn cyfrwng hylif LB yn cynnwys 50 ug/ml ampicillin am 12 awr ychwanegol ar 37 gradd . Cafodd y plasmidau eu tynnu a'u puro gan ddefnyddio pecyn paratoi plasmid di-endotocsin yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

2.3|Adnabod plasmid

Roedd plasmidau a dynnwyd yn destun treuliad ensymatig, ac ar ôl hynny archwiliwyd y plasmidau a'r darnau wedi'u treulio gan ddefnyddio electrofforesis gel agarose 1 y cant. Cafodd y gel canlyniadol ei staenio mewn hydoddiant EB am 20-25 munud ar dymheredd yr ystafell a thynnwyd llun ohono.

2.4|Trawsnewidiad plasmid i gelloedd SH-SY5Y

Trawsnewidiwyd DNA plasmid wedi'i buro i gelloedd SH-SY5Y wedi'u meithrin mewn cyfrwng MEM / F-12 sy'n cynnwys serwm buchol ffetws 10 y cant. Yna dewiswyd celloedd wedi'u trawsyrru mewn cyfrwng sy'n cynnwys 400 ug/ml G418, ac ar ôl hynny defnyddiwyd 200 ug/mL G418 i gynnal y llinell gell wedi'i thrawsnewid yn sefydlog.

2.5|Canfod celloedd wedi'u trawslifo yn ôl blot Gorllewinol

Cafodd celloedd SH-SY5Y wedi'u trawsgludo eu gosod mewn byffer RIPA. Ar ôl centrifugio'r lysate, pennwyd cyfanswm crynodiad y protein yn y supernatant gan ddefnyddio pecyn adweithydd assay protein BCA. Yna roedd symiau cyfartal o echdyniad protein yn destun electrofforesis gel SDS-polyacrylamid 12.5 y cant a'i drosglwyddo i bilen PVDF. Cafodd y bilen PVDF ei rhwystro gyda 5 y cant o laeth sych di-fraster mewn hydoddiant TBST a'i brosesu ar gyfer imiwn-ganfod. Defnyddiwyd gwrth-FLAG a gwrth-DJ-1 fel gwrthgyrff sylfaenol, ac IgG wedi'i gyfuno â HRP oedd y gwrthgorff eilaidd. Defnyddiwyd system canfod cemioleuedd uwch i ganfod y proteinau targed.

2.6|Adnabod imiwnocytocemegol o gelloedd a drawslifwyd

Cafodd celloedd SH-SY5Y wedi'u trawsnewid eu gosod gyda hydoddiant paraformaldehyde 4 y cant, wedi'u treiddio â 0.3 y cant o hydoddiant Triton X-100, a'u rhwystro â serwm gafr 10 y cant. Yna deorwyd y celloedd wedi'u blocio yn gyntaf gyda gwrthgorff polyclonaidd gwrth-FLAG a gwrth-DJ-1, ac yna gyda gwrthgorff eilaidd gwrth-rabbit gafr cyfun FITC. Cafodd y cnewyllyn cell eu staenio â Hoechst 33342, a delweddwyd y celloedd o dan ficrosgop fflworoleuedd gwrthdro (IX-71, Olympus).

2.7| Assay hyfywedd celloedd

Platiwyd celloedd SH-SY5Y heb eu trosglwyddo a'u trawsgludo i 96- echdynion, gan gynnwys acteoside, echinacoside, asid caffeic, a chyfanswm glycosidau Cistanche (pob un o 10, 20, a 40 ug/mL, yn y drefn honno), ac ychwanegwyd y cafodd celloedd eu deor am 6 awr cyn y driniaeth gyda 0.2 mM H2O2 am 1 awr ychwanegol. Cafodd y cyfrwng ei daflu, a chafodd hyfywedd celloedd ei asesu gan ddefnyddio MTT fel y disgrifir uchod.

2.8|Effeithiau darnau Cistanche ar hyfywedd celloedd

ychwanegwyd darnau, gan gynnwys acteoside, echinacoside, asid caffeic, a chyfanswm glycosidau Cistanche (pob un o 10, 20, a 40 ug/mL, yn y drefn honno), a deorwyd y celloedd am 6 awr cyn eu trin â 0.2 mM H2O2 am 1 awr ychwanegol. Cafodd y cyfrwng ei daflu, a chafodd hyfywedd celloedd ei asesu gan ddefnyddio MTT fel y disgrifir uchod.

2.9|Dadansoddiad ystadegol

Mynegir data fel cymedr ± SD tri arbrawf annibynnol. Dadansoddwyd gwahaniaethau rhwng grwpiau gan ddefnyddio ANOVA un ffordd a'r dull LSD gyda meddalwedd SPSS 22.0. Ystyriwyd bod gwerthoedd p < 0.05="" yn="">

Cistanchellysieuyn

3|CANLYNIADAU

3.1|Cafodd plasmidau eu trawsnewid a'u puro'n llwyddiannus. Ar ôl mynegiant ar wahân yn E. coli JM109, cafodd plasmidau eu tynnu a'u harchwilio gan ddefnyddio electrofforesis gel agarose 1 y cant ar ôl treulio gydag ensym cyfyngu (Ffigur 1). Holltwyd y plasmidau 6.2-kb i ddarnau DNA llinol 5.4- a 0.8-kb, a gadarnhaodd fod plasmidau L166P a C106S DJ-1 wedi'u mynegi a'u puro'n llwyddiannus.

3.2|Canfod celloedd wedi'u trawslifo trwy blotio'r Gorllewin. Fel y dangosir yn Ffigur 2, canfuom fandiau FLAG-L166P DJ-1 a FLAG-C106S DJ-1 tua 70 kDa. Mae'r lefelau uchel o brotein wedi'i dagio â FLAG yn y celloedd SH-SY5Y wedi'u trawsgludo yn dangos bod mutants L166P a C106S DJ-1 wedi'u mynegi'n gryf yn eu trawslifyddion priodol.

3.3|Adnabod imiwnocytocemegol o gelloedd a drawslifwyd. Mae'n dangos y signalau fflwroleuol cryf o gelloedd SH-SY5Y a drosglwyddir ar ôl deori â gwrthgyrff gwrth-DJ-1 neu wrth-FLAG. Mae hyn yn cadarnhau'r lefelau uchel o L166P a C106S DJ‐1 a fynegwyd yn y trawslifyddion.

3.4|Roedd celloedd wedi'u trawsyrru yn fwy sensitif i H2O2 na chelloedd heb eu trosglwyddo. Ar ôl deori am 1 awr ym mhresenoldeb crynodiadau graddedig o H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} }.5, ac 1 mM, yn y drefn honno), gostyngwyd hyfywedd celloedd SH-SY5Y a drosglwyddwyd â L166P neu C106S DJ-1 yn ddibynnol ar ddos ​​o'i gymharu â chelloedd heb eu trosglwyddo

3.5|Roedd echdynion Cistanche yn atal gostyngiadau a achosir gan H2O2 SH-SY5Y dos hyfywedd celloedd yn dibynnu ar driniaeth âDetholion Cistanche, gan gynnwys acteoside, echinacoside, asid caffeic, a chyfanswm glycosidau Cistanche (pob un yn 10, 20, a 40 ug/mL, yn y drefn honno).

Cistanche